Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Особенности гистоархитектоники структур глазного дна при офтальмохламидиозе

На правах рукописи

Мальцев Дмитрий Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ ГИСТОАРХИТЕКТОНИКИ СТРУКТУР ГЛАЗНОГО ДНА ПРИ ОФТАЛЬМОХЛАМИДИОЗЕ

14.01.07 - глазные болезни 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 МАП 2013

Санкт-Петербург 2013

005059853

Работа выполнена в ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Бойко Эрнест Витальевич доктор медицинских наук, профессор Чепур Сергей Викторович

Официальные оппоненты:

АЛЕКСЕЕВ Владимир Николаевич доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой офтальмологии №1 ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

СОТНИКОВ Олег Семенович доктор биологических наук, кандидат медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией функциональной морфологии и физиологии нейрона Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный - педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится <¿2» июня 2013 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.09 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «3_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук КУЛИКОВ Алексей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Хламидии - облигатные внутриклеточные бактерии, обладающие бифазным жизненным циклом (Goellner S. et al., 2006). Наибольшее эпидемиологическое значение при этом отводят С. trachomatis и С. pneumoniae, которые, широко распространены среди населения и склонны к развитию хронических заболеваний. Так, С. trachomatis - самый распространенный сексуальнотрансмиссивный агент на планете (Позняк А.Л., 2003; Исаков В.А. с соавт., 2010), глазными штаммами которого инфицировано до 600 миллионов человек стран Африки, Азии, Южной Америки, эндемичных по трахоме (Лобзин ГО.В. с соавт., 2003). Кроме того, сероэпидемиологические исследования указывают, что С. pneumoniae ответственна за 20 % внегоспитальных пневмоний и 5% бронхитов (Mairie T.J. et al., 2003), а серопозитивность к данному возбудителю достигает 50% среди взрослого населения (Hammerschlag MR 2000).

В последнее время произошли радикальные изменения в представлениях о систематике и биологии хламидий, а также об эпидемиологическом значении хламидийной инфекции (Everett K.D.E., 1999). Детальное изучение биологических свойств хламидий обнаружило способность этих возбудителей преодолевать барьеры иммунологической защиты и неспецифической резистентности, а также переходить в персистирующую форму (Roan N.R., Starnbach MR, 2008). Указанные особенности способствуют развитию хронических воспалительных процессов и ремоделированню тканей в месте локализации возбудителя (трахома), а также включению в патогенез аллергических (бронхиальная астма) и аутоиммунных механизмов (синдром Рейтера). С другой стороны, способность к гематогенной диссеминации в составе макрофагов объясняет обнаружение возбудителя за пределами первичных очагов инфекции., например, при болезни Альцгеймера и атеросклерозе (Gerard Н С. el а)., 2006). Установлена корреляция инфекции С. pneumoniae и С trachomatis с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями глазного дна. Морфологические исследования С. pneumoniae обнаруживают в неоваскулярных мембранах при возрастной макулярной дегенерации (Kalayoglu M.V. et al., 2005). Кроме того, лииополисахаридный антиген хламидий обнаруживают в 74% образцов СРЖ и 90% конъюнктивальных соскобов у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки. (Бойко Э.В. с соавт., 2008). При этом, ряд авторов указывают на роль воспаления в патогенезе возрастной макулярной дегенерации (Shen D. et al., 2009; Anderson D.H. et al., 2010), и регматогенной отслойке сетчатки (Азнабаев МЛ . с соавт., 2006). Таким образом, наличие признаков воспаления при возрастной макулярной дегенерации (ВМД) и отслойке сетчатки и их связь с хламидийной инфекцией предполагает значимую роль последней в патогенезе данных заболеваний. Определение роли хламидий в генезе дистрофических изменений заднего сегмента глаза позволит не только расширить представления о патогенезе ВМД и отслойки сетчатки, но и, возможно, заподозрить участие хламидийной инфекции в патогенезе других заболеваний органа зрения.

Все вышесказанное диктует необходимость проведения исследования, направленного на изучение способности С. pneumoniae и С. trachomatis вызывать изменения в структурах заднего сегмента глаза и их морфологического субстрата.

При инфекционных процессах в заднем сегменте глаза одним из ключевых патогенетических звеньев является поражение пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), что наблюдают, например, при герпетическом ретините (Greven СМ. et al., 1995). При этом обнаружение возбудителей в клетках ПЭС коррелирует с тропностыо агентов к культуре клеток in vitro. Поэтому изучение возможности поражения ПЭС in vitro С. pneumoniae и С. trachomatis позволит не только подтвердить морфологические данные, но и детализировать патогенез инфекционного процесса.

Цель исследования - совершенствование диагностики заболеваний органа зрения на основе изучения гистоархитектоники структур глазного дна при офтальмохламидиозе.

Задачи

1. Определить клинико-морфологические особенности хламидииного поражения заднего сегмента глаза.

2. Установить возможную локализацию возбудителя в тканях заднего сегмента глаза.

3. Изучить возможность и морфологические признаки персистирования возбудителя в структурах заднего сегмента глаза,

4. Изучить гематогенную диссеминацию возбудителей в структуры глазного дна.

5. Определить возможность и особенности поражения пигментного эпителия сетчатки C.pneumoniae а С.trachomatis in vitro.

Научная новизна. Впервые исследовано поражение хламидийной инфекцией нейроэпителия и пигментного эпителия сетчатки, сосудистой оболочки. Изучены морфологические проявления персистирования возбудителя в структурах заднего сегмента глаза и оценено клиническое значение этих проявлений. Также впервые дана оценка проявлений хламидииного поражения структур заднего сегмента глаза с установлением клинико-морфологической корреляции и продемонстрирована гематогенная диссеминация экстраокулярно локализованного возбудителя в структуры заднего сегмента глаза. Кроме того, в работе оценены возможности прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) in situ в диагностике офтальмохламидиоза.

Практическая значимость. Изученные в эксперименте изменения сетчатки и сосудистой оболочки при офтальмохламидиозе соответствуют клиническим наблюдениям и позволяют расширить представления о патогенезе заболеваний заднего сегмента глаза. Полученные данные указывают на потенциальную роль хламидийной инфекции в развитии значимых дегенеративно-дистрофических заболеваний органа зрения, таких как отслойка сетчатки, ВМД и некоторых других. Доказанная возможность гематогенной диссеминацин объясняет корреляционную связь между серопозитнвностью к

отдельным видам хламиднй и изменениями витреоретинохороидального комплекса. Показана потенциальная возможность использования ПИФ in situ в клинической практике в процессе обследования и лечения пациентов с подозрением на хламиднйное поражение структур заднего сегмента глаза. Положения, выносимые на защиту

1. Структуры глазного дна восприимчивы к хламидийной инфекции, при их поражении последовательно происходят, характерные для острого и хронического воспалительного процесса, клинико-морфологические изменения тканей. Диапазон этих процессов может варьировать от ярко выраженных аутоиммунных увеитов до стертых субклинических ретинитов.

2. В структурах заднего сегмента глаза хламидийная инфекция способна поражать клетки нейроэпителия сетчатки, пигментные эпителиоциты, клетки сосудистой оболочки, что подтверждено методом ПИФ in situ.

3. Для патогенеза хламндийного поражения структур заднего сегмента глаза характерна гематогенная диссеминация и перснстирование возбудителей, что соответствует биологическим свойствам С.pneumoniae и С. trachomatis.

Внедрение результатов исследования.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на пленарном заседании военно-научного общества курсантов и слушателей Военно-медицинской академии им С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 12 апреля 2010 г.); V Всероссийской научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы офтальмологии - 2010" (Москва, 15 июня 2010 г.); научно-практической конференции "опухоли и опухолеподобные заболевания органа зрения" (Москва, 1-3 ноября 2010 г.); XI Всероссийской научно-практической конференции "Федоровские чтения" (Москва, 21-24 июня 2011 г.).

Публикации. По теме работы опубликовано 11 работ, из них 7 в изданиях, рецензируемых ВАК.

Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в моделировании хламидийной инфекции у экспериментальных животных; наблюдении за инфицированными животными; выполнении гистологических исследований; получении клеточной культуры пигментного эпителия сетчатки ее инфицировании и регистрации изменений. Анализ данных, статистическая обработка результатов и написание работы проведены лично автором.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 54 рисунками, Работа состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 198 источников, из которых 29 опубликовано в отечественных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика материала и методов исследования Биологические модели. Работу проводили с использованием штаммов TWAR С. pneumoniae и L2 С. trachomatis, инфекционная активность которых

была проверена на белых мышах, и на культуре клеток L929+VERO+LLC-MK2 (культура фибробластов мыши (L929), почечного эпителия зеленой мартышки (VERO) и почечного эпителия макаки -резус (LLC-MK2)). Для инфицирования использовали суспензию оболочек желточных мешков инфицированных куриных эмбрионов. В работе использовали кроликов-самцов породы шиншилла массой 3,7-4,0 кг в возрасте от 1,2 до 1,4 лет. Животных содержали в условиях вивария, в изолированных клетках при температуре 20 °С, при свободном доступе к корму и воде. Было сформировано 4 подгруппы животных (Таблица 1). В подгруппах 1А и 1Б животных инфицировали С. trachomatis (п=5), в группах 2А и 2Б - С. pneumoniae (п=5), неинфицированные животные составили группу контроля. Факт инфицирования доказывали определением титра антител в крови и микробиологическим исследованием соскобов с конъюнктивы (ПИФ и культуральный метод). Через 128 сут после инокуляции возбудителем наркотизированных животных умерщвляли методом воздушной эмболизации.

Т^0лцца_1 - Способы инфицирования экспериментальных животных

Подгруппа

1А

1Б

2А

2Б

Глаз

OD

OS

OD

OS

OD

OS

4>D"

OS

Возбудитель

С. pneumoniae. TWAR

C. pneumoniae, TWAR

C. trachomatis. 1.2

C. trachomatis. L2

Субконъюнктивальное введение (0,1 мл) и инсталляция

Интравитреальное введение 0,05 мл

СУСПОИЗИИ

Инфицирование белых мышей производили интраперитонеальным введением 0,1 мл суспензии оболочек желточных мешков зараженных куриных эмбрионов. В первой группе (4 животных) производили введение культуры С. pneumoniae, во второй группе (4 животных) - культуры С. trachomatis, 4 животных составили группу контроля. Животных выводили из эксперимента через 72 часа после инфицирования. Для получения клеточной культуры пигментног о эпителия сетчатки (ПЭС) использовали 10 свежеэнуклеированных глаз кроликов породы шиншилла возрастом от 0,9 до 1,6 лет. После предварительной обработки, удаления структур переднего сегмента и стекловидного тела глазной бокал заполняли раствором коллагеназы [«Биолот», Россия] 1,5 мг/мл в растворе трипсина-версена [«Биолот», Россия]. Инкубацию проводили в течение 60 мин при температуре 37 °С. Отделившиеся клетки собирали н центрифугировали при 200 g в течение 2 мин, осадок ресуспендировали средой DMEM/F12 (1:1), содержавшей 10% сыворотки крупного рогатого скота [«Биолот», Россия]. Полученную суспензию разливали по кульгуральным планшетам из расчета 24000 кл/см2. Культуральные планшеты [«JctBiofil», Канада] инкубировали при 37 °С в среде с 5 % содержанием углекислого газа. В качестве контрольной культуры использовшш

смешанную культуру клеток L929+VERO+LLC-MK2, которую высевали и инкубировали в аналогичных условиях. Клеточную культуру ПЭС оценивали через 24,48 и 72 часа, после внесения стандартной инфицирующей дозы (ОД мл суспензии оболочек желточных мешков в разведении 10"), 50 % и 10 % инфицирующей дозы. Определяли клеточную пролиферацию, вакуолизацию цитоплазмы и количество хламидийных включений.

Методика офтальмологического обследования. Офтальмологическое обследование экспериментальных животных проводили непосредственно перед инфицированием, через 1 час после инфицирования, а также на 2, 4, 9, 23, 28, 38, 50, 73, 128 сут. В офтальмологическое обследование входили прямая офтальмоскопия (прямой офтальмоскоп KaWe Piccolight Е56), обратная офтальмоскопия и биомикроскопия (щелевая лампа Topcon SL-1E с линзой MaxFild 78D), ультразвуковое исследование проводили на УЗ-аппарате Compu-Scan-AB в А- и B-режиме, фоторегистрацию выполняли на фундус-камере Carl Zeiss Fl 50. Офтальмоскопию и фоторегистрацию проводили в условиях наркотизации животных тиопенталом-натрия в дозировке 150 мг внутримышечно и медикаментозного мидриаза с использованием 1 % раствора мидриацила [Santen, Финляндия].

Методика микробиологического обследования. Соскобы с конъюнктивы фиксировали высушиванием и до микробиологического исследования хранили при t=4° С. Для выделения возбудителей на клеточной культуре производили забор материала с каждого глаза в отдельный флакон со стерильной транспортной средой MEM (1 мл) с гентамицином (2 мг/мл) и 5 % сыворотки крупного рогатого скота. Для проведения реакции прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) использовали родоспецифичные антитела к липополисахариду клеточной стенки, меченные флюресциенизотиоцианоатом -«ХламоСкрин» [«Ниармедик Плюс», Россия], согласно рекомендованному протоколу. Возбудителей выделяли пассажем биологического материала на клеточной культуре L929+VERO+LLC-MK2. Индикацию возбудителей методом ПИФ производили через 48 час после заражения. Титр антихламидийного IgM определяли методом иммуноферментного анализа при помощи наборов Chlamydia Trachomatis IgM ELISA и Chlamydia pneumonia IgM ELISA [GenWay, США]. В качестве вторичных антител использовали козьи анти-кроличьи IgM HRP-конъюгированные антитела [Abeam, Великобритания]. Фотометрическую оценку результатов анализа выполняли на микропланшетном фотометре Immunochem-2100.

Методика морфологических исследований. После энуклеации, глазные яблоки кроликов рассекали и фиксировали 10 %-ым нейтральным формалином в течение 24 час по разработанной методике. Глазные яблоки белых мышей фиксировали без рассечения, кроме того, в случаях интраперитонеального введения производили осмотр органов брюшной полости. Подготовку гистологических препаратов производили по стандартному протоколу. Фиксацию препаратов клеточной культуры осуществляли 96% раствором этанола в течение 5 мин, после удаления кулмуральной среды и промывания

раствором Хэнкса. В качестве красителей для рутинного метода окраски использовали гематоксилин Карраци и 0,75 % раствор эозина. Дополнительно препараты импрегнировали серебром по Давенопорту. Световую микроскопию препаратов клеточных культур производили после окраски азур-эозином по Романовскому. Для ПИФ in situ использовали набор «ХламоСкрин» [«Ниармедик Плюс», Россия]. Инкубацию в течение 20 мин производили во влажной камере при 37 °С, дополнительную инкубацию в течение 5 мин - в фосфатно-солевом буфере (pH 7,3-7,4) при 20 °С. Микроскопию проводили на микроскопе Leica 2500МТ, используя секцию ртутной лампы и светофильтры при увеличении xioo, Х200, -400, х800, ><1000. Фазовоконтрастную микроскопию проводили на микроскопе OLYMPUS СХ41 при увеличении х200, х400, х800. Метод использовали для идентификации мембран и границ раздела клеточных структур.

Метод заданных балльных оценок и морфометрического анализа. В

работе использовали метод заданных балльных оценок в виде числового шкалирования. Для этого отдельным клиническим и морфологическим признакам присваивали определенное количество баллов в зависимости от выраженности признака. Балльную оценку производили после морфометрического анализа всего материала и оценки всего диапазона выраженности каждого оцениваемого признака. При оценке морфологических признаков определяли границы пиков распределения, которым присваивали балльные значения. После оценки баллы суммировали, а суммы баллов сравнивали. Относительные оценки (отношение суммы к возможному максимуму) использовали для сравнения клинических и морфологических оценок между собой.

Все морфологические признаки были разделены на две группы: проявления воспалительного процесса и изменения гистоархитектоники. Оценивали воспалительные изменения конъюнктивы (количество воспалительных клеток на участке 100 мкм в 5 полях зрения при увеличении *200), стекловидного тела (10 полей зрения при увеличении *200), внутренних слоев сетчатки (5 полей зрения при увеличении х200), ДЗН (5 полей зрения при увеличении х-200), васкулит сосудов сетчатки (доля пораженных сосудов), фолдинг (распространенность). Изменения гистоархитектоники локального характера оценивали по критериям: отслойка ЗГМ, толщина наружно ядерного слоя, толщина внутреннего ядерного слоя, толщина плексиформного слоя, высота клеток ПЭС, глубина смещения пигмента клеток ПЭС в нейроэпителий! максимальный размер клеточных элементов со сниженными тинкториальными свойствами, толщина хороидеи.

Для оценки пролиферации клеточных культур подсчитывали количество клеток в одном поле зрения при 200-кратном увеличении. Вакуолизацию цитоплазмы оценивали, как процент клеток, вакуолизация которых превышает среднее значение для неинфицированной культуры. , Количество инфицированных клеток оценивали как долю (в процентах), клеток, содержащих одно или более включений по результатам ПИФ.

Статистическая обработка данных. В работе использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для оценки межгруппозых различий морфометрнческих признаков, балльных оценок и сравнения образцов клеточных культур, а также точный критерий Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

Особенности протекания инфекционного процесса. Наиболее ранние проявления инфекционно-воспалительного процесса после инфицирования С. pneumoniae наблюдали на 3-5 сут в виде умеренного конъюнктивита с незначительным слизистсмгнойным отделяемым. Реакция в месте введения С. trachomatis была более ранней (2-3 сут) и сопровождалась развитием фолликулярного конъюнктивита в 4 случаях. Умеренная реакция во всех подгруппах стихала в течение 7-9 сут, с сохранением остаточной инъекции до 28 сут.

Во всех подгруппах на 9 сут на крайней периферии глазного дна регистрировали диффузное снижение прозрачности витреума и появление подвижных помутнений в его преретинальных слоях. Максимальное снижение прозрачности было зафиксировано на 20 сут, прозрачность восстанавливалась к 40 сут с сохранением остаточной преретинальной инфильтрации. Только в 1 случае (инфицирование С. pneumoniae) не была зарегистрирована отслойка задней гиапоидной мембраны (ЗГМ). При инфицировании С. trachomatis в 4 случаях наблюдали раннюю (4 сут) интенсивную экссудацию в стекловидное тело со снижением прозрачности других оптических сред к 16-23 сут. Таким образом, к 23 сут в 4 случаях офтальмоскопия сетчатки была невозможна. Наблюдение случаев тяжелого течения инфекционного процесса при помощи УЗИ, показало развитие отслойки ЗГМ, появление интравитреальных ЭХО-плотных включений в сроки от 14 до 23 сут, отслойку сетчатки (23-32 сут), а на поздних сроках (73-128 сут) - набухание хрусталика и уменьшение передне-заднего размера глаза, что свидетельствовало о субатрофии органа зрения.

На фоне инфильтрации стекловидного тела в раннем периоде (9-23 сут) наблюдали появление хориоретиналъных очагов в 10 случаях, как при инфицировании С. pneumoniae, так и С. trachomatis. Хориорепшальные очаги желтоватого оттека имели нечеткие контуры и в различной степени проминировали в стекловидное тело. В среднем наблюдали по 5-7 очагов на I глазу, средний размер очага составлял Vio ~ "Vio диаметра диска зрительного нерва (ДЗН). Через 60-80 сут в центре очагов выявляли участки атрофии в виде побледнения, распространявшегося к периферии. Дальнейшая атрофия сопровождалась уплощением, появлением краевой пигментации и четкости контуров. Хориоретинальной атрофии сопутствовало уменьшение количества экссудата в стекловидном теле. Также в 5 случаях наблюдали появление ретинальных очаговых изменений (начиная с 9 сут) в виде мелких белесых точек без заметного офтальмоскопически изменения толщины сетчатки. Данные очаги были многочисленны (20 -30 и более на одном глазу) и имели точечный размер. В ходе наблюдения старые очаги могли редуцироваться баз заметных остаточных изменений сетчатки и появляться новые. Однако, обшей

тенденцией было уменьшение количества очагов к исходу эксперимента, вплоть до полного отсутствия.

По результатам обследования до заражения в крови экспериментальных животных отсутствовали антитела и к С. pneumoniae, и к С. trachomatis. На ранних сроках (6 сут после инфицирования) было зарегистрировано нарастание титра антител. Исследование конъюнктивальных соскобов при помощи ПИФ и посев содержимого конъюнктивальной полости на клеточную культуру верифицировали инфицирование соответствующими возбудителями у всех животных.

Воспалительные изменения вспомогательных органов затрагивали тарзальную конъюнктиву и область лимба, что находило отражение в повышении количества лимфоцитарного инфильтрата. При инфицировании С. trachomatis характерным было появление псевдофолликулярных структур, образованных скоплением большого количества полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов в подслизистой ткани.

В стекловидном теле воспалительная инфильтрация лимофцитарно-макрофагального характера была зафиксирована преретинально. Интенсивная инфильтрация сопровождалась появлением воспалительных клеток не только на периферии, но и над центральными участками сетчатки. Скопление лимфоцитарного инфильтрата сопровождалось локальной конденсацией фибриллярных структур. Отслойка стекловидного тела, идентифицированная при офтальмологическом обследовании, была обнаружена и при микроскопии. При инфицировании С. trachomatis на участках интенсивной инфильтрации преретинального витреума наблюдали появление плотной фиксации ЗГМ к сетчатке. В таких зонах утолщенная ЗГМ была интенсивно инфильтрирована лимфоцитами с включениями глиальных клеток.

В сетчатке воспалительная инфильтрация была наиболее выражена во внутренних слоях: слое нервных волокон, слое ганглионарных нейронов, внутреннем плексиформном слое. Воспалительный инфильтрат имел тенденцию к диффузному расположению. Наиболее выраженную инфильтрацию обнаруживали в области диска зрительного нерва. Степень инфильтрации ДЗН значительно варьировала среди зараженных животных. Поражение сосудов (преимущественно центральных отделов глазного дна) коррелировало с инфильтрацией витреоретинального комплекса При инфицировании С. trachomatis инфильтрация сетчатки и васкулит носили более выраженный характер. Инфильтрат достигал внутреннего ядерного слоя, смещая ядра биполярных нейронов и фоторецепторов. Васкулит, наиболее интенсивный в центральных отделах и области ДЗН, был зафиксирован и на периферии сетчатки. Его проявления заключались в инфильтрации сосудистой стенки и периваскулярного пространства лимфоцитами и в полнокровии сосудов. В местах плотной фиксации витреума отмечали большое количество глиоцитов и элевацию сетчатки (вследствие тракционных воздействий), заметную по изгибу ядерных слоев (Рис. 2А).

При инфицировании С. pneumoniae и С. trachomatis (Рис. 2В, 2Г) были обнаружены хорноретинальные очаги размером до 1000 мкм, отделенные от зубчатой линии сетчаткой нормального строения. По направлению к центру очага уменьшалась толщина и клеточность наружных слоев, что вело к истончению нейроэпителия до 50 мкм. Внутренний ядерный слой терял упорядоченное расположение клеток, которые контактировали с наружным ядерным слоем. По краям очага наблюдали гипертрофические изменения в пигментном эпителии и смещение фрагментов пигмента в нейроэпителий. В центре очага ядерные слон были недифференцируемы, наблюдали резко выраженные дистрофические изменения в пигментном эпителии, вплоть до его полного отсутствия. На всем протяжении очага сосудистая оболочка была атрофирована. Задняя гиалоидная мембрана над очагом была отслоена, а преретинальные слои стекловидного тела включали единичные клетки воспалительного инфильтрата.

Кроме очаговых изменений, были зарегистрированы признаки диффузного поражения. При инфицировании С. pneumoniae и С. trachomatis на обширных участках средней периферии наблюдали неравномерность толщины сетчатки, связанную со скоплением гомогенного эозинофильного материала в субретинальном пространстве, воспалительную инфильтрацию внутренних слоев сетчатки. ЗГМ на участке изменений была отслоена с сохранением точек остаточной фиксации. В подлежащей сосудистой оболочке наблюдали увеличенное количество лимфоцитарного инфильтрата.

При инфицировании С. pneumoniae в 4 случаях на крайней периферии сетчатки обнаружили локальные утолщения протяженностью до 150 мкм, вследствие формирования в наружных слоях сетчатки ячеистых структур со сниженными тинкториальнымн свойствами (признаками гидропической дистрофии), которые располагались среди клеток наружных слоев нейроэпителия (Рис. 1А). По направлению от периферии очага к центру снижалась клеточность наружного ядерного слоя с формированием его дефекта. Во внутреннем ядерном слое в прилежащих к очагам зонах выявляли нарушение упорядоченного расположения ядер биполярных нейронов со смещением клеток в наружный плексиформный слой. Внутренние слои (слой ганглнонарных нейронов и нервных волокон) были умеренно инфильтрированы. В области очагов пигментный эпителий был гипертрофирован, продукты деструкции эпителиоцитов, содержащие пигментные включения, смещались в нейроэпителий.

В 2 случаях при инфицировании С. pneumoniae гидропически измененные клетки имели тенденцию к группировке и формированию полости, отграниченной наружной пограничной мембраной (НПМ) и сообщающейся с субретинальным пространством (Рис. 1Б). При этом наблюдали истончение и дефект наружного плексиформного, наружного ядерного слоев и слоя палочек и колбочек. Во внутренних слоях наблюдали смещение клеточного компонента, гнпохромию ганглионаров, появление воспалительного инфильтрата. В наружных слоях обнаруживали фрагменты клеточного детрита и скопления

пигмента. Пигментный эпителий в области измененной сетчатки имел признаки гипертрофии. В ряде случаев в области таких изменений обнаруживали участки фиксации ЗГМ к сетчатке.

В 1 случае при инфицировании С. pneumoniae наблюдали обширные изменения гидропического характера, распространявшиеся на 2500-3000 мкм в сторону центральных отделов сетчатки (Рис. 1В). Гидропированные структуры наблюдали в слое палочек и колбочек, наружных ядерном и плексиформном слоях, что вело к увеличению толщины сетчатки до 300 мкм. Наблюдали снижение клеточностн обоих ядерных слоев, гипертрофию и друзоподобные образования подлежащего пигментного эпителия (Рис. 1Г). Отдельные фрагменты пигмента обнаруживали в нейроэпителии. Сосудистая оболочка на участке изменений сетчатки истончалась, вплоть до контакта между пигментным эпителием и lamina fusca.

В случаях тяжелого инфекционно-воспалительного процесса при инфицировании С. trachomatis были обнаружены участки инвагинации наружных слоев до уровня внутреннего плексиформного слоя (Рис. 2Б). В слое палочек и колбочек на участках инвагинаций были обнаружены гидропически измененные мембранные структуры с оптически не дифференцируемым содержимым. Количество таких ячеистых структур нарастало в области инвагинаций, и они заполняли собой полость складки наружного ядерного слоя. Размер инвагинатов варьировал от 30 до 600 мкм. Аналогичные изменения были описаны в литературе как фолдинг и служат признаком тяжелого поражения сетчатки (Xu Н. et al., 2008). Микроскопическое исследование при большом увеличении позволило выявить дефект НПМ, клеточный детрит, изменение характерной структуры хроматина, гипохромию ядер и отсутствие концевых фрагментов фоторецепторов, выраженные дистрофические изменения пигментного эпителия на участках фолдинга. Импрегнация серебром выявила нарушения структуры внеклеточного матрикса, наиболее выраженные на участках элевации ядерных слоев.

По результатам ПИФ специфическое свечение хламидийного антигена обнаружили во вспомогательных органах - конъюнктиве и внутренних оболочках глазного яблока. Локализация антигена С. trachomatis в конъюнктиве соответствовала псевдофолликулам. Включения хламидийных телец были обнаружены в различных слоях сетчатки: в слое палочек и колбочек, в наружном ядерном слое, внутреннем ядерном слое, слое ганглионарных нейронов (Рис. 1Д, 2Д). Также хламидийные включения выявили в сосудистой оболочке (Рис. 1Е). Исследование очаговых изменений сетчатки не выявило повышенного скопления возбудителя в этих зонах. Кроме того, хламидийные включения были обнаружены в клетках пигментного эпителия (Рис. 2Е) на участках отслоенной и пораженной фолдингом сетчатки. Наиболее часто возбудителя выявляли в пигментном эпителии в случаях тяжелого поражения.

Рисунок 1 - Изменения витреоретинохороидальиого комплекса у животных,

инфицированных С. pneumoniae. А. Гвдропически измененные клеточные структуры (Г) и скопления пигмента (Г1) в толще нейроэпителия. Ув. к!OCX), окр. гематоксилин-эозин.; Б. Очаг гидропических изменений (И) с утолщением сетчатки. Ув. *200, окр. гематоксилин-эозин. В. Протяженный очаг на крайней периферии сетчатки. Ув. х50, окр. гематоксилин-эозин. Г. Друзоподобные изменения (Д) пигментного эпителия. Ув. хЮОО, окр. гематоксилин-эозин. Д. Специфическое свечение хламидийного антигена в нейроэпителии. Ув. хЮОО, окр. гематоксилин-эозин - ПИФ. Е. Специфическое свечение хламидийного антигена в сосудистой оболочке. Ув. х 1 ООО, окр. гематоксилин/эозин - ПИФ. Примечание: ВЯ - внутренний ядерный слой, №1 - наружный плексиформный слой, НЯ - наружный ядерный, ПЭ- пигментный эпителий, СО - сосудистая оболочка, В - стекловидное тело, СК - склера.

Рисунок 2 - Изменения витреоретинохорондального комплекса у животных,

инфицированных С. trachomatis. А. Воспалительная инфильтрация (ВИ) витреоретинального комплекса. Ув. х200, окр. гематоксилин-эозин. Б. Фолдинг (Ф). Ув. >¡200, окр. гематоксилин-эозин. В. Атрофическнй хориоретннальный очаг. Ув. х!00, окр. гематоксилин-эозин. Г. Атрофический хориоретннальный очаг. Ув. *400. окр. гематоксилин-эозин. Д. Специфическое свечение хламидийного антигена в нейроэгоггелии. Ув. хЮОО, окр. гематоксилин-эозин - ПИФ. Е. Специфическое свечение хламидийного антигена в пигментном эпителии. Ув. хКХХХ окр. гематоксилин-эозин - ПИФ. Примечание: ВЯ -внутренний ядерный слой, НЯ - наружный ядерный, ПЭ- пигментный эпителий, СО -сосудистая оболочка, В - стекловидное тело, СК - склера, CP - субретинальное пространство на фоне экссудативной отслойки сетчатки.

Формирование оценочных систем, результаты морфометрического анализа и сравнения балльных оценок.

Для оценки клинической тяжести процесса учитывали выраженность конъюнктивита, воспалительных изменений заднего сегмента глаза, прозрачность оптических сред и УЗИ-картину поражения (Таблица 2). Таблица 2 - Распределение балльных оценок за клинические 1

Признак

■ признаки

Реакция конъюнктивы (острая и хроническая)

L Балл

Реакция конъюнктивы на 7 сут (отсутствует, инъецирована сосудами, гиперемия, гной)_

Реакция конъюнктивы на 128 сут (отсутствует, инъецирована сосудами, гиперемия, гной)

Реакция стекловидного тела (остраяи хроническая)

0-3

0-3

Экссудат в стекловидном теле на 7 сут (отсутствует, легкий, облакомадный" диффузный)______

Экссудат в стекловидном теле на 128 сут (отсутствует,^легктШГоблаков11дний, диффузный)_

ЗГМ (отсутствует, частичпая, полная с тстаточной фиксацией, полная)" Изменения сетчатки и сосудистой оболочки

Ретинит (отсутствует, легкий (ретпнальных очагов < 10), умеренный (очагов < 25), выраженный (очагов > 25). при оценке всего глазного дна на 14 сутки

0-3

0-3 0-3

(1-1 0-3

_Призшш1 тяжелого увеита

Нарушение прозрачности роговицы (нет, краевое, с захватом оптической зоны, jorajibiioe)______

Увеличение хрусталика (отсутствует, <10 %,11-25~%, > 25 %) Отслойка сетчатки, в т.ч. по УЗЙ (отсутствует, частотная, не болсч>~50% протяженности УЗ-среза глазного дна, полная)

Уменьшение ПЗО (отсутствует, <5 %, 6-i5 %, >15"%) ............

Максимальное количество баллон:

0-3 "0-3 0-3

6-У

31

По результатам морфометрического анализа проводили шкалирование" полученных значений показателей с определением границ пиков распределения, которым присваивали балльные значения (Таблица 3).

Таблица 3 - Распределение оценок за морфологаческие нр,1знакн воспаления

Распространенность

Баллы

6 (вариант нормы)

1

Локализация воспалительной инфильтрации, количество клеток

2 &

о И

от 0

20

105

до 5

35

120

щ

от 0

30

60 100

до 5

35

90

7 id"

S3 о

от О

30

5

35

55 . 100 ;

75 105"

120 , 140 ! 120 : 135

Г) "=t

15

75

до 5

40

95

__________________изменений __

Васкулит, | Фолдинг,

доля пораженных _<Х)судов_ от ! до

доля протяженности среза сетчатки с изменениями до

0

0,1

от 0

0,15 ! 0,25 ! 0,7

0,45

<ш"

0,60 | ' 0.75 Г

0,8

0,95

1,0

0,1

0.8

Примечание: в промежутках между выделенными пнти значения щмзнаков не рэшределёнй

Последствия инфекционного поражения сетчатки и сосудистой оболочки в рамках клинических наблюдений и экспериментальных моделей определяются степенью альтерации структур, а не распространенностью изменений.

В результате морфологического анализа очаговых изменений гистоархитектоники сетчатки и сосудистой оболочки были выделены и нормированы ключевые гистологические признаки, также послужившие основой для оценки морфологических проявлений инфекционного процесса (Таблица 4).

Таблица 4 - Распределение балльных оценок за морфологические признаки структурных изменений сетчатки и сосудистой._

Признак Баллы

3 2 1 0 (вариант нормы) 1 2 3

от до от до от до от ДО от до от до

Контакт ЗГМ наличие (+) /отсутствие (-) - + -

Толщина нейроэпителия, мкм 30 40 65 75 119.5±6.8 130 145 160 220

Толщина наружного ядерного слоя, мкм 0 6 10 16 18 22 26.1+2.2 30 36 42 48 50 56

Толщина внутреннего ядерного слоя, мкм 6 12 14 18 23.1±2.8 28 34 40 58

Толщина наружного плексиформног о слоя, мкм 0 4 6 8 14 16 21.2+1.9 24 30 34 40 44 50

Максимальный размер клеток нейроэпителия, мкм : ( 0 4 8 10 13 19 24

Смещение пигмента в нейроэпителий, мкм В 0 12 20 32 62

Высота клеток ПЭС, мкм 0 4 6 8 11.2+1.3 14 16 18 20 22 24

Толщина хороидеи, мкм 0 5 10 15 124.1±70.4 I

Максимальное количество баллов: 19(43)

Примечание: в промежутках между выделенными пиками значения признаков не распределены

Средние значения были определены на основании обследования контрольной группы животных. Для стандартизации результатов, а также в связи с преимущественно периферической локализацией очаговых изменений, норма признаков характеризует морфологические параметры

витреоретинохороидального комплекса от экватора до зоны не ближе 500 мкм до зубчатой линии. Указанные признаки в случае очаговых изменений носили однонаправленный характер. В случае сочетания очаговых изменений различного вида на одном глазу суммирование производили по очагам обоих видов.

При оценке всех исследуемых морфометрических параметров установлено, что выраженность изменений, вызываемых С. pneumoniae, не имела достоверных отличий от С trachomatis при использовании стандартного способа заражения В то же время интравитреальное введение сопровождалось более выраженным воспалительным процессом во всех структурах при инфицировании С. trachomatis (Таблица 5) по сравнению с инфицированием С. pneumoniae. Кроме того, независимо от способа инфицирования, С. trachomatis вызывала более выраженные изменения нейроэпителия по сравнению с С. pneumoniae (р<0.001).

Таблица 5 - Морфометрический анализ изменений структур глазного дна Воспалительная инфильтрация, _ количество клеток/поле зрения

Конъюнктива

Стекловидное тело

Сетчатка

дзн

Распространенность

Васку лит,

доля пораженных сосудов

Фолдинг,

доля протяженности среза сетчатки с изменениями

1А

27.2il.6-1

67.4i32.4-

53.8il7.6-

25.6±6.1 "

0.35±0.18 '

0*

1Б

27.3Ü.1

67.3i22.5

64.2il.8-

24.5i7.8

0.46±0.16

0*

2А

82.9i44.3

ГГ

113.5±27.2 1

117.7Ü4.9

ТХ

61.5±34.5 '

0.7±0.19 '

0.26Ш.41

2Б

24.9±2.2 1

76.4±4.9 '

115.0±13.7 1

19.4±7.3 1

0.48i0.01

0.444i0.51

Примечание:

1 - достоверные различия между подгруппами животных, инфицированных идентичным видом возбудителя, при использовании разных способов инфицирования, р<0.05;

2 - достоверные различия между подгруппами животных, инфицированных различными видами возбудителей, при использовании идентичного способа инфицирования, р<0.05.

Тяжесть поражения, вызываемого С. pneumoniae, не имела достоверных различий при использовании различных способов введения. В то же время, интравитреальное введение С. trachomatis по сравнению со стандартным способом заражения данным видом возбудителя статистически достоверно сопровождалось более выраженными патологическими изменениями конъюнктивы, стекловидного тела, сетчатки и ДЗН (Таблица 5).

При оценке клинических признаков среди инфицированых животных выявлен спектр различных по тяжести инфекционных процессов: от легких субклинических до тяжелых с исходом в субатрофию. При этом во всех подгруппах наблюдали случаи легкого течения процесса.

При использовании интравитреального способа введения тяжесть поражения по клинической оценке (14±1].55 против 7.25±0 5 р=0 033) была выше при инфицировании С. trachomatis. Подобные различия отсутствовали при использовании стандартного способа инфицирования (12.5±10 07 против р—0.08). Не было обнаружено достоверных различий в цинических оценках среди животных, инфицированных С. pneumoniae. Интравитреадьное введение С. trachomatis, при отсутствии значимой разницы в клинических оценках, сопровождалось более интенсивными морфологическими изменениями структур глазного дна (Таблица 6).

Таблица б - Оценки тяжести инфекционных процессов

I Клиническая оценка

Подгруппа

1А 1Б

2А_ 2 Б

7.25*0.50 -6.67±0.82

14.0±11.55 :

Примечание:

12.5± 10.07

Морфологическая оценка

15.5±J,91 "

18.(Н3.03

27.75±7.23

• 24.33±5^961

- достоверные различия между подгруппами животных инфицированных идентичным видом возбудителя, при использовании разных спосооов инфицирования, р<0.05;

" - достоверные различия между подгруппами животных инфицированных различными видами возбудителей, при использовании идентичного способа инфицирования, р<0.05.

Сравнение клинических и морфологических оценок инфекционных процессов слабой и средней тяжести показало преобладание морфологических признаков над клиническими (Рис. 3).

0.7

К S 2 2

§0.5

Щ a Si"

S 3 Й

1 I I03

ф S g» х s о f

ч. „

о

I г^п

1

1Б

I

ЯЙЙ ЧЛ-

v

-

Ill

ПН|

2А

Подгруппы

* Клиническая оценка

О Морфологическая оценка

процессов3 ~ Сраюение иип™™х- и морфологических проявлений инфекционных

в случае же тяжелых процессов оценки соответствовали друг другу 1 аким образом, даже в случае клинически легкого процесса формируются существенные изменения гистоархитектоники структур глазного дна

В целом, наблюдаемый разброс тяжести заболеваний, наиболее выраженный при инфицировании С. trachomatis, соответствует большому разбросу вариантов процесса в рамках других экспериментальных моделей и объяснимо индивидуальными внутривидовыми различиями.

Результаты интраперитоиеального введения возбудителя. Гибель белых мышей после интраперитоиеального введения возбудителя наблюдали на 4-5 сут, поэтому выведение животных из эксперимента при интраперитонеальном инфицировании проводили не позднее 72 час после инокуляции. На вскрытии в брюшной полости наблюдали большое количество фибринозного экссудата, полнокровие сосудов, увеличенную печень и селезенку (Таблица 7).

Таблица 7 - Результаты вскрытия животных и выявления возбудителей в тканях глаза после интраперитонеального инфицирования ________________________________

Признак Экспериментальные группы

Контроль Зараженные

С. pneumoniae С. trachomatis

Количество животных с изменениями органов брюшной полости, особей 0/4 4/4 4/4

Количество глазных яблок с наличием возбудителя в тканях по результатам ПИФ in situ, глаз 0/8 5/8 2/8

Примечание: в числителе - количество положительных результатов, в знаменателе -количество животных (глаз) в группе

Морфологическое исследование тканей заднего сегмента глаза выявило умеренные признаки воспалительного процесса в сосудистой оболочке и внутренних слоях сетчатки при инфицировании С. pneumoniae (Рис. 4А). Воспалительный инфильтрат был представлен преимущественно лимфоцитами.

V 4

U:-,:' * > »

L х «Ч. 4 ч

* ■ ч *

Рисунок 4 - Изменение гистоархитектоники сетчатки при инфицировании белых мышей С. trachomatis. А. Смешанный воспалительный инфильтрат витреоретинального комплекса. Ув. *1000, окр. гематоксилин-эозин. Б. Специфическое свечение антигена С. trachomatis во внутренних слоях сетчатки. Ув. xlOOO, окр. ПИФ.

В 2 случаях наблюдали повышенную концентрацию инфильтрата в области диска зрительного нерва. На фоне воспалительных изменений выявляли отдельные элементарные и ретикулярные тельца в сосудистой оболочке, сетчатке и стекловидном теле (Рис. 4Б). При инфицировании

С trachomatis признаки воспалительного процесса в структурах заднего сегмента (инфильтрация сосудистой оболочки) выявляли в случаях как положительных, так и отрицательных результатов ПИФ in situ Однако все случаи положительных результатов ПИФ in situ сопровождались обнаружением хороидальной воспалительной инфильтрации

Результаты исследований клеточной культуры пигментного лгшгелин сетчатки. Возбудитель был обнаружен в клетках пигментного эпителия сетчатки кролика уже через 24 час после заражения культуры (Рис 5А. 5Б).

Рисунок 5 - Выявление возбудителей в клеточной культуре ПЭС кролика

А. Специфическое свечение антигена С. pneumoniae в культуре ПЭС. Ув. *1000, окр. ПИФ. Б. Специфическое свечение антигена С. trachomatis в культуре ПЭС. Ув. х 1 ООО, окр. ПИФ.

Инфицирование клеточной культуры ПЭС и контрольной культуры сопровождалось достоверным снижением пролиферации культуры на сроке 48 час и позже. Различий в степени угнетения пролиферативной активности культуры ПЭС при инфицировании С. trachomatis или С. pneumoniae обнаружено не было, в то время как пролиферация контрольной культуры была достоверно ниже при инфицировании С. trachomatis (Рис. 6А) Достоверных различий в цитопатических эффектах С. trachomatis на оба вица клеточных культур выявлено не было. В то же время, при заражении С. pneumoniae количество вакуолизированных клеток в культуре ПЭС было выше, чем в контрольной культуре (Рис. 6Б).

f

50

45 і 40 A

.» л

35 ........................................................Г"

зо • • ./ . i

25 / - й«

20 ............. -................ ................

».........................

5 - • "

О ч- "

О 24 48 72

'---- """

|А

і___

24 48 72

Срок после инфицирования, час. Срок после инфицирования, час.

rDC-C.tr ПЭС-С.рп Гв~| ПЭС-СЛг ПЭС-С.рв

KK-C.tr — - -КК-С.рп І______І KK-C.tr — -КК-С.рп

Рисунок 6 - Изменения клеточных культур при инфицировании С. pneumoniae и С. trachomatis. А. Динамика пролиферативной активности. Б. Динамика вакуолизации клеток.

По результатам ПИФ после внесения одной инфицирующей дозы, количество включений, формируемых С. trachomatis, было достоверно больше, чем С. pneumoniae для обоих видов клеточных культур. При этом достоверных различий между культурами на сроке 72 час при инфицировании С. trachomatis выявлено не было, в то время как количество включений, формируемых С. pneumoniae, было больше в культуре ПЭС (Рис. 7А). При внесении 50 % инфицирующей дозы общая тенденция к распространенному инфицированию клеток С. trachomatis сохранилась. Статистически значимые различия между культурами в количестве пораженных С. trachomatis клеток отсутствовали. Также средний уровень инфицированное™ был сходным для культуры ПЭС и контрольной культуры при инфицировании С. pneumoniae (Рис. 7Б). При внесении 10 % инфицирующей дозы, статистически значимых различий между различными видами клеточных культур и возбудителями выявлено не было.

J 1 1»

✓ j

8

50 ' ......................................................= 12

45

40 .........................................

35

30 :................................

25 - в 6

і 20 ......... -............

S 15 t* .

H

| 0 24 48 72 1 U 24 48 72

Срок после инфицирования, час. ' срок после инфицирования, час.

m ПЭС-С.1Г ПЭС-С.рп Пв ! --ПЗС-С.їг ПЭС-С.рп

! J KK-C.tr — - -КК-С.рп L_J KK-C.tr — ••КК-С.рп

Рисунок 7 - Изменения клеточных культур при ішфіщмрованіш С. pneumoniae и С. trachomatis. А. Динамика поражения культур при стандартной инфицирующей дозе. Б. Динамика поражения культур при 50 % инфицирующей дозе.

Таким образом, при высоких инфицирующих дозах чувствительность клеточной культуры ГГЭС к С. trachomatis выше, чем к С. pneumoniae, и сравнима с чувствительностью контрольной культуры. В то же время чувствительность культуры ПЭС к С. pneumoniae выше, чем контрольной культуры. Снижение инфицирующей дозы обуславливает сходную чувствительность клеточных культур как к С. trachomatis, так и к С. pneumoniae.

Большая чувствительность клеточных культур к С. trachomatis соответствует более выраженным щтгопатическим эффектам данного возбудителя, чем С. pneumoniae. В то же время, степень вакуолизации клеток при инфицировании С. pneumoniae была достоверно выше в культуре ПЭС, что указывает на большую чувствительность клеток пигментного эпителия к данному возбудителю. При инфицировании контрольной культуры угнетение пролиферации было более выражено после инфицирования С. trachomatis -39,2 %, а при инфицировании С. pneumoniae составило 14,5 %. В культуре ПЭС степень угнетения пролиферации была сходной для С. trachomatis и для С. pneumoniae и составила 31,5 % и 26,1 %, соответственно. Таким образом, по результатам оценки цитопатических эффектов и угнетения клеточной пролиферации, чувствительность культур к С. trachomatis выше, чем к С. pneumoniae. В то же время, чувствительность культуры ПЭС к С. pneumoniae сопоставима или выше, чем к С. trachomatis.

Результаты проведенных исследований подтверждают, что поражение сетчатки хламидийной инфекцией характеризуется васкулитом, воспалительной инфильтрацией и отеком нейроэпителия, альтерацией пигментного эпителия, что составляет картину ретинита, наблюдаемого при инфекционных процессах другой этиологии (Khairallah М. et al., 2009; Zhang М. et al., 2005). Изменения гистоархитектоники сетчатки при этом связаны с гидропическимн изменениями клеточных элементов, что ведет к фолдингу в случае С. trachomatis и ретинальным очагам при инфицировании С. pneumoniae. Также при инфицировании и С. pneumoniae и С. trachomatis были выявлены атрофические хориоретинальные очаги.

Аналогичные фолдингу изменения описаны в работах, посвященных аутоиммунному поражению сетчатки (Xu Н. et al., 2008), что позволяет предполагать наличие аутоиммунного компонента в тяжелом хламидийном поражении структур заднего сегмента глаза. Это подтверждается рядом экспериментальных моделей с другими возбудителями (Mei Н. et al. 2009) и данными о патогенезе гематогенных форм офтальмохламидиоза у человека (Межевова Ю.И., 2005).

Гидропические очаги при инфицировании С. pneumoniae связаны с поражением нейронов и глиальных клеток нейроэпителия и в исходе могут обуславливать атрофические изменения. Кроме того, обнаружение друзоподобных структур, на фоне сообщений о корреляции инфекции С. pneumoniae с ВМД (Shen D. et al., 2009) и фактами обнаружения ее антигена

в образцах хороидальных неоваскулярных мембран (Kalayoglu M.V., 2005), может говорить в пользу связи инфекции с ВМД.

В соответствии с критериями клинического значения хориоретинальных дистрофий (Meguro A. et al., 2012; Kothari A. et al., 2012), риск развития осложнений для гидропических очагов можно оценить как высокий. Атрофические очаги характеризуются низким уровнем риска развития отслойки сетчатки, аналогично изменениям при токсоплазмозе, что связывают с вовлечением в воспалительный процесс сосудистой оболочки (Balasimdaram M B. et al., 2010; Holland G.N. et al., 2004).

Как и в случае некоторых других инфекционных процессов в заднем сегменте глаза, обнаружение возбудителя в пигментном эпителии сетчатки коррелирует с высокой чувствительностью клеток ПЭС- к возбудителю in vitro (Shukla S.Y. et al., 2009, Nie Y. et al., 2007). Это, в совокупности с изменениями эпителиоцитов на участках гидропических изменений, позволяет говорить о патогенетической роли поражения ПЭС в генезе гидропических очаговых изменений и фолдинга. До настоящего времени, не было работ, описывающих поражение ПЭС хламидийной инфекцией, тем не менее, Fujimoto Т. с соавторами сообщили о влиянии хламидин на клетки ПЭС, что в эксперименте приводило к прогрессированию хороидальной неоваскуляризации (Fujimoto Т. et al., 2010).

Как и при других инфекционных процессах, вызываемых «ретинотропными» инфекционными агентами, поражение зрительного нерва неспецифично и отражает общую тяжесть состояния (Yashiro S. et al., 2011). Этому соответствует высокая (до 36 %) частота вовлечения зрительного нерва при гематогенном офтальмохламидиозе (Межевова И.Ю., 2005). Вероятно субклиническое поражение присутствует чаще, что продемонстрировано в эксперименте.

Поражение сосудистой оболочки, как это описано при токсоплазмозе (Commodaro A G. et al., 2009), наблюдали только в присутствии изменений сетчатки (атрофические очаги), что связано с развитием хориоретинита. В случае гидропически измененных очагов и фолдинга, вовлечение сосудистой оболочки было относительно ограниченным, что указывает на развитие изолированного ретинита.

Как в эксперименте по интраокулярному инфицированию, так и при интраперитонеальном заражении, наблюдали распространение возбудителя по всем внутренним оболочкам, что связано с его гематогенной диссеминацией. Это соответствует неспецифической склонности хламидийной инфекции к поражению хороиден (Семенов А.В. и соавт., 2005) и развитию хориоретинальных очагов (Межевова И.Ю., 2005). Тенденция к увеапьной локализации, объясняет реализацию аутоиммунных механизмов, что соответствует мнению об аутоиммунном компоненте в патогенезе инфекционных хориоретинитов (Nussenblatt R.B. et al., 1989). Склонность С. pneumoniae к очаговому поражению сетчатки, объясняется большей тропность этого возбудителя к нервной ткани (Gérard Н.С., 2005).

Идентификация возбудителей не выявила их преимущественной локализации в области специфических изменений. С подобным явлением столкнулся M.G. Davidson с коллегами и объясняет отсутствие возбудителя в очагах хориоретанита поздними сроками морфологического исследования (Davidson M.G. et al., 1993).

Как и в случае с хламидийными процессами иной локализации, ряд морфологических особенностей обуславливают слабую выраженность клинических проявлений. В клинических условиях это может способствовать скрытому течению процесса с нарастанием структурных изменений витреоретинохороидального комплекса. Такая тенденция подтверждается описанным распределением хламидийных поражений заднего сегмента глаза по степени тяжести (исключительно тяжелые и средней степени тяжести), что не указывает на отсутствие легких форм (Межевова И.Ю., 2005). Их клинические проявления таковы, что данная категория пациентов не обращается к офтальмологу, а в случае обращения, клинические признаки инфекции могут быть не идентифицированы. Трудности в выявлении увеитов хламидийной этиологии также создает низкая выраженность клинических изменений переднего сегмента(Ченцова О.Б. и соавт., 2003; МежевоваИ.Ю., 2005).

Способность вызывать субклинические хронические инфекционные процессы хорошо известна для всех представителей порядка Chlamydiales (Лобзин Ю.В. и соавт., 2003). Для морфологической картины подобного процесса характерны признаки воспаления и связанные с ними дистрофические изменения тканей (Вайншенкер Ю.И. и соавт., 2009). Такие явления обнаружены и в сетчатке, что ведет к развитию ее дистрофических изменений. Сопровождающие процесс изменения стекловидного тела увеличивают риск исхода дистрофических изменений в развитие отслойки сетчатки. Учитывая известные особенности экстраполирования экспериментальных данных на патологические процессы органа зрения у человека, дистрофические изменения сетчатки (в виде известных клинических состояний), вызванные хламидийной инфекцией, объясняют корреляционную связь между серопозитивностью к отдельным видам хламидий и отслойкой сетчатки.

ВЫВОДЫ

1. Как С. trachomatis, так и С.pneumoniae способны вызывать поражение структур заднего сегмента глаза, которое может проявляться различными по тяжести инфекционно-воспалительными процессами, варьирующими от субклинических ретинитов до тяжелых увеитов с аутоиммунным компонентом. При этом независимо от клинического варианта процесса всегда имеется морфологический субстрат с нарушением гистоархитектоники витреоретинохороидального комплекса.

2. Инфицирование C.pneumoniae и C.trachomatis структур заднего сегмента глаза сопровождается неспецифическими признаками воспаления, появлением ретинальных гидропических очагов, дистрофических хориоретинальных очагов, изменениями пигментного эпителия в случае

легких процессов и признаками интенсивного воспаления с аутоиммунным компонентном - в случае тяжелых процессов.

3. Антигены C.trachomatis и С.pneumoniae при офтальмохламидиозе можно обнаружить в сетчатке, пигментном эпителии и клетках сосудистой оболочки, используя ПИФ in situ.

4. В течение 128 суток после инфицирования возбудителя можно обнаружить -в структурах заднего сегмента глаза, на фоне значительного снижения

клинических проявлений инфекционного процесса и развития дистрофических изменений тканей.

5. Обнаружение возбудителей в заднем сегменте глаза после ннтраперитонеального введения культур C.pneumoniae и C.trachomatis свидетельствует о возможности гематогенной диссеминации данных возбудителей из первичного очага в структуры глазного дна.

6. Инфицирование клеток пигментного эпителия сетчатки в культуре различными видами хламидий сопровождается цитопагическими эффектами, которые могут обеспечивать патогенетические механизмы поражения структур заднего сегмента глаза при экспериментальном офтальмохламидиозе.

Практические рекомендации

Для определения хламидийной этиологии поражения сетчатки может быть использован метод ПИФ in situ. Метод может применяться в клинической практике для исследования интраоперационного и диагностического материала стекловидного тела, сетчатки, пигментного эпителия и сосудистой оболочки. Возможны отрицательные результаты применения метода, которые при наличии серопозитивности сыворотки крови не должны исключать хламидийную природу поражения витреоретинального комплекса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мальцев, Д.С. Дистрофические изменения стекловидного тела при офтальмохламидиозе. / Э.В. Бойко, A.A. Суетов, Д.С, Мальцев // «Вестник офтальмологии». - 2012. - JNs6. - С. 45-49.

2. Мальцев, Д.С. Роль Chlamydia trachomatis н Chlainydophila pneumoniae в поражении структур заднего сегмента глаза / C.B. Чепур, Э.В. Бойко, АЛ. Позняк, И.В. Нуралова, Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2012. - № 3. - С. 79-82.

3. Мальцев, Д.С. О развитии нолиорганного хламидийиого поражения при первичном локальном заражении глаза в эксперименте / Э.В. Бойко, АЛ. Позпяк, И.В. Нуралова, Д.С. Мальцев, A.A. Суетов,

B.C. Агеев / Архив патологии. — 2011. - JY» 6. - С. 15-18.

4. Мальцев, Д.С. Особенности поражения структур заднего отрезка глаза при экспериментальной хламиднйнон инфекции / Э.В. Бойко,

C.B. Чепур, АЛ. Позняк, И.В. Нуралова, A.A. Суегов, Д.С. Мальцев, B.C. Агеев, А.Ю. Шестаев // Вестник офтальмологии. - 2010. - № 1. - С. 2732.

5. Мальцев, Д.С. Клинико-морфологические особенности хориоретинита, вызванного Chlamydia pneumoniae в эксперименте / Э.В. Бойко, С.В. Чепур, АЛ. Позняк, И.В. Нуралова, A.A. Суетов, Д.С. Мальцев, B.C. Агеев // Вестник офтальмологии. - 2010. - JV« 4. - С 2025.

6. Мальцев, Д.С. Особенности поражения сетчатки при экспериментальной хламидийной инфекции глаз ! Э.В. Бойко, АЛ. Позняк, И.В. Нуралова, Д.С.Мальцев, A.A. Суетов, В.С.Агеев // Архив патологии. - 2010. - №4. - С. 43-46.

7. Мальцев, Д.С. Отслойка ЗГМ: понятие, распространенность, классификация, клиника и возможные причины / Э.В. Бойко, A.A. Суетов, Д.С. Мальцев, B.C. Агеев // Офтальмологические ведомости. - 2009. - Т 3, №3.-С. 38-45.

8. Мальцев, Д.С. Влияние воспалительных заболеваний глаз на развитие отслойки задней гиалоидной мембраны л периферических витреохориоретинальных дистрофий / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. - СПб. - 2008 - С. 110-111.

9. Мальцев, Д.С. Моделирование поражения органа зрения хламидийной инфекцией в эксперименте / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. - СПб. - 2009 - С. 112-113.

Ю.Мальцев, Д.С. Наблюдения поражения структур органа зрения культурой С. trachomatis L2 в эксперименте на кроликах / Д.С, Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. - СПб. - 2009 - С. 77.

П.Мальцев, Д.С. Изучение патогенеза отслойки задней гиалоидной мембраны и периферических витреохориоретинальных дистрофий / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА - СПб -2008 - С. 75-76.

Подписано в печать 29.04.13 г.

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Формат 60x84/16 Заказ № 291

Типография BMA, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.