Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Клинико-морфологические проявления поражения стекловидного тела при хламидийной инфекции

Суетов Алексей Александрович

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ПОРАЖЕНИЯ СТЕКЛОВИДНОГО ТЕЛА ПРИ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.01.07 - глазные болезни 03.03.04 -клеточная биология, цитология, гистология

2 9 АП? 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005567939

Санкт-Петербург 2015

005567939

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Бойко Эрнест Витальевич

доктор медицинских наук профессор Чепур Сергей Викторович

Официальные оппоненты:

Беликова Елена Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства России»

Прошин Сергей Николаевич, доктор медицинских наук профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской федерации.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт глазных болезней»

Защита состоится «8» июня 2015 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.09 на базе Федерального государственного бюджетного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М Кирова» Министерства обороны Российской Федерации по адресу 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке и на сайте www.vmeda.org ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им.С гл. Лебедева, 6).

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Куликов Алексей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Особенности жизненного цикла и механизмов взаимодействия с организмом хозяина обуславливают широкое распространение возбудителей хламидиозов с преобладанием форм с бессимптомным хроническим течением заболевания (Лозняк А.Л., 2001; Лобзин Ю.В., с соавт., 2003; Stephens R.S., 1999). Наибольшее эпидемиологическое и клиническое значение в настоящий момент имеют два вида хламидий, принадлежащих к разным родам и отличающихся друг от друга, -Chlamydia trachomatis (С. trachomatis) и Chlamydophila pneumoniae (C.pneumoniae). Согласно различным эпидемиологическим исследованиям, инфицированность людей возбудителем урогенитального хламидиоза С. trachomatis варьирует от 8 до 19% в разных выборках, в среднем составляя около 13 %, а доля серопозитивных лиц к возбудителю C.pneumoniae среди взрослого населения превышает 60 % (Ильин И.И., 1993; Blasi F., 1998; Henru-Suchet G., 1998; Лобзин Ю.В., с соавт., 2000; Гранитов В.М., 2002). При этом по данным D.A. Cohen (1999) до 90 % инфицированных возбудителем С. trachomatis не имеют симптомов заболевания.

Клиническая значимость указанных возбудителей обусловлена способностью проникать в различные ткани и органы, в том числе распространяясь из первичного очага инфекции в составе фагоцитов крови (гематогенной диссеминации), обходить барьеры иммунологической защиты, персистировать, не вызывая продолжительное время видимых клинически проявлений. Патологические изменения в инфицированных тканях связаны как с самим возбудителем, так и с особенностями иммунного ответа, усугубляющего течение инфекции (Roan N.R., 2008). Прежде всего, C.trachomatis является причиной урогенитального хламидиоза в виде хронических уретритов, орхитов, простатитов у мужчин, циститов, сальпингоофоритов и связанных с этим бесплодием, хронической тазовой воспалительной болезнью и эктопической беременностью (до 40 %) у женщин (World Health Organization Task Force on the Prevention and Management of Infertility, 1997; Cunningham K.A., 2008). Возбудитель C.trachomatis и вызванные им аутоиммунные реакции являются причиной поражения суставов при синдроме Рейтера. По данным M.Hammerschlag (2000), возбудитель C.pneumoniae, обуславливающий респираторный хламидиоз, является причиной до 20 % внегоспитальных пневмоний. Разработка и внедрение новых методов диагностики с высокой чувствительностью и специфичностью позволили изучить роль хламидий в различных заболеваниях у человека. Исследования J.Ramirez (1996), А.Б.Сумарокова (1999), J.Grayston (2000), Ю.Г.Белоцерковской (2008) и других авторов показали патогенетическую роль возбудителя C.pneumoniae в развитии как синуситов, фарингитов, бронхитов, бронхиальной астмы, так и атеросклеротического поражения сосудов сердечнососудистой системы. Кроме того, по мнению M.Koskiniemi (1996), H.Ikejima (2006) и других исследователей возбудитель C.pneumoniae способен инфицировать клетки нервной ткани, возможно, участвуя наряду с другими инфекционными агентами

(вирусы герпеса, Эпштейна-Барра, цитомегаловирус) в патогенезе таких хронических дегенеративных заболеваний центральной и периферической нервной системы, как рассеянный склероз и болезнь Альцгеймера. Возбудители хламидиозов способны инфицировать структуры органа зрения (Майчук Ю.Ф., 1993; Балашевич Л.И., 1998). Хорошо изучены такие клинические формы офтальмохламидиоза, как трахома и паратрахома. На долю трахомы до сих пор приходится 15 % случаев слепоты в мире (Mariotti S.P., et al., 2009).

Стекловидное тело (СТ), составляющее свыше 80 % объема глазного яблока, выполняет многие важные функции в норме, а также вовлекается в патологические процессы в заднем сегменте глаза (Вит В.В., 2003; Jaffe N.S., 1969). Такие изменения СТ, как деструкция и задняя отслойка СТ, принято рассматривать как состояния, при которых происходят нарушения в клеточных и неклеточных компонентах СТ и сетчатки, участвующих в биосинтезе и поддержании пространственной организации макромолекул СТ (Балашова Л.М., 2001; Sebag J., 1989). Главными причинами тому служат возрастные, дисметаболические, посттравматические или воспалительные изменения в заднем сегменте глаза (Sebag J., 2001; Els S., 2006; Hata Y., et al., 2011). В то же время, некоторые клетки СТ и сетчатки сходны по особенностям своего происхождения, строения и функционирования с клетками-мишенями возбудителей хламидиозов в других органах (например, суставах, центральной нервной системе), что создает предпосылки для изучения возможной роли возбудителей хламидийной инфекции в патогенезе дистрофических изменений СТ (Newman Е.,1996; Sarthy V.,2001; Sibilia J., 2002; Levitt D., 2009).

Таким образом, значительная инфицированность населения возбудителями хламидиозов, тропность возбудителей к определенным типам клеток, в том числе и в тканях органа зрения, появляющиеся новые данные о возможном участии хламидий в хронических воспалительных и дегенеративных процессах различных локализаций (сердечно-сосудистая система, нервная система, суставы), а также недостаточно изученные аспекты возможного участия скрытых инфекций в патогенезе возрастных изменений СТ определяют необходимость исследования возможного влияния возбудителей хламидиозов на СТ.

Степень разработанности темы исследования

В последние годы были описаны инфекционно-воспалительные процессы, связанные с возбудителями хламидиозов в заднем сегменте глаза (Ченцова О.Б.,2001; Бойко Э.В., с соавт.,2008). Имеются данные, что С. trachomatis может вызывать не только передние и задние увеиты, но и увеоретиниты, склериты и эписклериты. В отдельных работах возбудитель идентифицирован методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) в склере, сосудистой оболочке, сетчатке и зрительном нерве (Околов И.Н., с соавт., 2005; Бойко Э.В., с соавт., 2008). В исследовании, выполненном в клинике офтальмологии ВМедА им. С.М.Кирова, в группе из 50 пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки (РОС) элементарные и ретикулярные тельца хламидий методом ПИФ и полимеразной цепной реакции (ПЦР) были выявлены у 74 % пациентов в субретинальной жидкости и у 90 % пациентов в

конъюнктивальных соскобах, суммарно хламидийные включения обнаружены 94% пациентов выборки (Бойко Э.В., с соавт., 2008). Имеются данные об идентификации иммуногистохимическими методами и методом ПЦР возбудителя С. pneumoniae в неоваскулярных мембранах при возрастной макулярной дегенерации (ВМД) (Kalayoglu M.V., 2005; Shen D., et al., 2009). Указанные данные о выявлении возбудителей хламидиозов становятся актуальными на фоне того, что при РОС, по данным М.Т.Азнабаева (2006), а также и при ВМД, по данным P.L.Penfold (2001), важную роль в патогенезе играют воспалительные реакции, на что указывает обнаружение провоспалительных цитокинов и клеток в СРЖ и стекловидном теле при РОС и в неоваскулярных мембранах при ВМД. Появляющиеся данные требуют более детального изучения возможного участия возбудителей хламидиозов в развитии возрастных и патологических процессов в органе зрения и в стекловидном теле в частности, поскольку это может в определенной степени изменить подходы к лечению некоторых заболеваний заднего сегмента глаза.

Цель исследования - изучение клинико-морфологических проявлений поражения стекловидного тела при хламидийной инфекции органа зрения в эксперименте на животных и возможной взаимосвязи возрастных дистрофических изменений стекловидного тела с хламидийной инфекцией у человека.

Задачи исследования:

1. Изучить в эксперименте на кроликах возможность моделирования хламидийного поражения стекловидного тела.

2. Исследовать клинические формы изменений стекловидного тела при инфицировании сероваром L2 Chlamydia trachomatis и сероваром TWAR Chlamydophila pneumonia.

3. Провести в условиях эксперимента на животных анализ патоморфологических изменений стекловидного тела и их взаимосвязи с использованным для заражения видом возбудителя, определить, в каких клетках, связанных с метаболизмом стекловидного тела, могут локализоваться возбудители хламидийной инфекции.

4. Изучить частоту выявления ДНК C.trachomatis, антигенов C.trachomatis и C.pneumoniae в конъюнктиве и специфических антител в крови при возрастных дистрофических изменениях стекловидного тела, корреляционную связь между ними.

5. Изучить содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-ip и ФНО-а в сыворотке крови и слезе у лиц с дистрофическими изменениями стекловидного тела и у лиц с наличием возбудителей в конъюнктиве или специфических антител в сыворотке крови.

Методология и теоретическая база исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием морфологических, клинических, инструментальных, аналитических и статистических методов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В эксперименте на кроликах доказана возможность инфицирования клеток стекловидного тела возбудителями ОгасЬотат Ь2 и С.рпеитотае Т\¥АИ. с развитием инфекционно-воспалительного процесса в острой и хронической форме.

2. Независимо от способа инфицирования хламидийное поражение стекловидного тела может варьировать от бессимптомного до ярко выраженного как клинически, так и патоморфологически.

3. В развитии возрастных дистрофических изменений стекловидного тела у человека возбудители хламидийной инфекции могут выступать сопутствующим фактором, что подтверждается высокой частотой выявления возбудителей СМгасЬотайэ в конъюнктиве, антител к возбудителям СЛгасЬота^э и С.рпеитошае в сыворотке крови и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и слезе.

Научная новизна исследования

Впервые произведено моделирование поражения стекловидного тела возбудителями хламидийной инфекции СЛгасЬотайв Ь2 и С.рпеитотае XXVАЯ с длительным периодом наблюдения.

Хламидийные включения идентифицированы в клетках стекловидного тела и клетках Мюллера сетчатки, обеспечивающих гомеостаз стекловидного тела.

Впервые установлено, что у лиц с возрастными дистрофическими изменениями стекловидного тела выше частота выявления антигенов и ДНК возбудителей С.ГгасЬота^ и С.рпеитошае в конъюнктиве, антител к хламидиям в сыворотке крови.

Получены экспериментальные и клинические данные о возможной роли возбудителей хламидийной инфекции в развитии дистрофических изменений стекловидного тела.

Теоретическая и практическая значимость работы

Дополнены новыми данными существующие представления о патогенезе дистрофических изменений стекловидного тела, в частности выявлена возможность инфицирования клеток в составе стекловидного тела и внутренних слоев сетчатки возбудителями СЛгасЬота^ и С.рпеитотае, что обосновывает необходимость дальнейшего изучения роли персистирующих инфекций в развитии заболеваний заднего сегмента глаза.

Полученные данные эксперимента на кроликах и клинического исследования у людей позволяют предположить возможную роль хронической хламидийной инфекции в развитии возрастных дистрофических изменений стекловидного тела.

Рекомендовано лабораторное обследование в отношении хламидийных инфекций, включающее одновременное использование различных методов диагностики (ПЦР, ПИФ, ИФА), при наличии деструкции стекловидного тела и его задней отслойки, сопряженных с высоким риском развития регматогенной отслойки сетчатки, витреоретинальной пролиферации.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, практических рекомендаций, списка литературы. Материал изложен на 167 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 49 рисунков. Список литературы включает в себя 220 источников, из них 57 отечественных, 163 зарубежных.

Тема диссертации утверждена Учёным советом НИЛ и НИЦ Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова, протокол № 10 от 16 июня 2010 года. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен на заседании Комитета по вопросам этики при Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (Протокол №133 от 29 января 2013 года, Санкт-Петербург).

Соответствие диссертации Паспортам научных специальностей

В соответствии с формулой специальности 14.01.07 — «глазные болезни (медицинские науки)», включающей в себя изучение болезней, патологии глаза, век и слезных органов, разработку методов их диагностики, лечения и профилактики, в диссертационном исследовании изучено развитие патологических изменений стекловидного тела глаза в ответ на введение возбудителей хламидиозов в условиях эксперимента, при клиническом исследовании у людей с возрастными изменениями стекловидного тела изучены особенности изменений стекловидного тела и их взаимосвязь с лабораторными показателями хламидийной инфекции.

В соответствии с формулой специальности 03.03.04 — «клеточная биология, цитология, гистология (медицинские науки)», включающей в себя изучение происхождения, строения, развития и функционирования клеток и тканей, их взаимодействия в процессе жизнедеятельности как в норме, так и при различных патологических нарушениях, произведен анализ формирования дистрофических и компенсаторно-приспособительных изменений в клетках стекловидного тела и клетках внутренних слоев сетчатки в условиях экспериментального моделирования хламидийной инфекции органа зрения у животных.

Апробация работы

Предзащита проведена на расширенном заседании кафедр офтальмологии, кафедры оториноларингологии ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и Центра медико-биологической защиты Научно-исследовательского испытательного института (военной медицины) Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (протокол № 8 от 24 ноября 2014 года).

Реализация результатов работы

Результаты работы опубликованы в рецензированных научных изданиях. Материалы диссертации доложены и обсуждены на V Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы офтальмологии — 2010» (Москва, 15 июня 2010 г.); научно-практической конференции «Опухоли и опухолеподобные заболевания органа зрения» (Москва, 1-3 ноября 2010 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 2 статьи в зарубежных периодических изданиях.

Личный вклад автора

Личное участие автора исследования заключалось в разработке совместно с Э.В.Бойко и Д.С. Мальцевым (2012) модели хламидийного поражения органа зрения в эксперименте на животных. Автор самостоятельно осуществлял клиническое наблюдение за животными, участвовал в заборе материала для проведения лабораторных и морфологических исследований, подготовке материала и проведении гистологических исследований совместно с гистологами ФГУ «ГосНИИИ военной медицины» МО РФ, анализе клинических признаков и морфологических изменений в органе зрения вследствие экспериментального инфекционного процесса. Автор самостоятельно осуществлял отбор пациентов для клинического исследования, их офтальмологическое обследование, которое включало рефрактометрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, проведение проб Норна и Ширмера-2, фото- и видеорегистрацию изменений стекловидного тела и сетчатки, ультразвуковое исследование органа зрения. Автор самостоятельно исследовал уровень специфических антител у обследуемых лиц методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа сыворотки крови и выполнял статистический анализ всех полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика материала и методов исследования

Экспериментальная часть исследования.

Биологические модели. Экспериментальная часть исследования выполнена на 16 кроликах (32 глаза) породы Шиншилла весом 2,5-3,0 кг в возрасте от 1 до 2 лет, которых заражали штаммами возбудителей серовар L2 Chlamydia trachomatis и серовар TWAR Chlamydophila pneumoniae. Возбудителей, культивированных на куриных эмбрионах, применяли в форме суспензии с фосфатно-солевым буферным раствором (рН=7,2) с концентрацией 107 колониеобразующих единиц (КОЕ).

Протокол заражения. Перед инфицированием животным проводили иммуносупрессию (в течение 5 суток вводили преднизолон внутримышечно 30 мг/кг), после чего исследовали образцы конъюнктивальных соскобов и сыворотку крови на возможное носительство хламидийной инфекции (Зацепина Н.Д.,1982). Заражение осуществляли по схеме (таблица 1). Под эпибульбарной анестезией после скарификации конъюнктивы в области нижнего свода суспензию инсталлировали в объеме 0,1 мл, после чего дополнительно вводили 0,1 мл суспензии культуры субконъюнктивально. Интравитреальное введение 0,1 мл суспензии культуры возбудителей осуществляли через плоскую часть цилиарного тела, используя иглу шприца 30 G. В группе контроля вводили по указанному протоколу транспортную среду, использованную для приготовления суспензии.

Лабораторный и клинический контроль. Производили в установленные сроки (перед заражением, через 1 час после введения культур возбудителей, на 2, 4, 9, 23, 28, 38, 50, 73, 128 сутки). Для лабораторного контроля инфицирования тканей производили забор соскобов из верхнего и нижнего конъюнктивальных сводов, а

также выполняли пункцию ушной вены с забором 2,5 мл крови. Биоматериал из конъюнктивы исследовали методами бактериоскопии, в реакции прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), а также производили посев на культуру клеток. Сыворотку крови исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Таблица 1 - Структура групп животных в эксперименте, метод заражения и сроки выведения животных из исследования

Условия эксперимента Группа животных (возбудитель)

1 группа (C.trachomatis L2) 2 группа (C.pneumoniae TW AR) 3 группа (контроль)

Биообъекты (кролики)

1 | 2 | 3 1 4 1 5 | 6 | 7 | 8 1 9 1 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16

Путь введения возбудителя (транспортной среды) OU - Инсталляция (после скарификации конъюнктивы) + субконъюнктивально

OD и/в OD и/в OD и/в OD и/в OD и/в OD и/в

Срок выведения животных, сутки 128 56 72 128 56 128 72 128 72 ' 128

Примечание: и/в - интравитреальное введение

При клиническом наблюдении животных объем офтальмологического исследования включал биомикроскопию и биомикроофтальмоскопию с асферическими линзами 60 дптр, 78 дптр, офтальмоскопию с налобным бинокулярным офтальмоскопом, фото- и видеорегистрацию результатов, ультразвуковое исследование оболочек глаза в А- и В-режиме.

Выраженность воспалительного процесса в конъюнктиве и роговице кролика, а также степень воспаления в передней камере и структурах заднего сегмента глаза оценивали при биомикроскопическом исследовании в баллах по шкале M.J. Hogan и D. BenEzra et al (1991). Изменения оптических свойств CT подразделяли в соответствии с классификацией степеней помутнения стекловидного тела, выявляемых офтальмоскопически (Nussenblatt R.B., et al., 1985).

Выведение животных из эксперимента с забором материала для патоморфологического исследования осуществляли в сроки, представленные в таблице 1.

Морфологические исследования. После энуклеации выполняли префиксацию глазных яблок инъекцией 0,5 мл жидкости Карнуа в переднюю камеру, затем глазное яблоко фиксировали в жидкости Карнуа в течение 1 часа, после чего рассекали в сагиттальной плоскости. Осуществляли гистологическую проводку с заливкой материала в парафин по стандартному протоколу. Из парафиновых блоков готовили серии срезов толщиной 4 мкм, из которых изготавливали парные препараты. Один из парных срезов окрашивали гематоксилином и эозином. Световую микроскопию производили на лабораторном микроскопе Leica МТ 2500, при этом оценивали структурные изменения в тканях глаза, более детально исследуя CT и его пограничные структуры, изменения в них, их локализацию и степень выраженности, производилась фоторегистрация. Парный срез окрашивали методом ПИФ с

использованием диагностического набора «ХламоСкрин» (НИАРМЕДИК, Россия). Наличие, локализацию, форму возбудителей определяли при люминисцентной микроскопии на лабораторном микроскопе Leica МТ 2500 с дополнительной секцией ртутной лампы. Выявленные локализации возбудителей при иммуногистохимическом анализе сопоставляли с морфологическими изменениями в тканях глаза. Дополнительно проводили морфометрический анализ с применением программного пакета Leica Image Manager.

Клиническая часть исследования

Всего в клинической части исследования участвовали 144 добровольца: 69 мужчин, 75 женщин в возрасте от 40 до 50 лет (средний возраст составил 46,12±2,86 лет), удовлетворяющих условиям включения и исключения из исследования. Обследуемые были включены последовательно в основную исследуемую группу (с наличием ДСТ, в том числе ЗОСТ хотя бы в одном из глаз), либо в группу сравнения (без ДСТ). Основная группа состояла из 46 человек (23 мужчины, 23 женщины, средний возраст 47,51±2,52 лет) с клиническими признаками ДСТ. Подгруппа основной группы с подтвержденной при биомикроскопии и ультразвуковом исследовании ЗОСТ включала 19 человек (10 мужчин, 9 женщин, средний возраст 49,11±0,81 лет). Группа сравнения состояла из 98 человек (46 мужчин, 52 женщины, 45,33±2,83 лет) без клинических признаков ДСТ при биомикроскопии и УЗ-исследовании. От каждого участника исследования было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании, само исследование одобрено локальным этическим комитетом.

Дистрофические изменения CT классифицировали как деструкцию CT (ДСТ), ДСТ с неполной и полной задней отслойкой CT (ЗОСТ). Под ДСТ принято понимать нарушение организации макромолекулярного каркаса CT вследствие различных причин, сопровождающееся утолщением, огрублением волокон, фракционированием витреального геля (ликвификация и синерезис), визуализируемых при биомикроскопии и ультразвуковом исследовании. Клинически ДСТ определяли по наличию признаков разжижения (ликвификации) CT с фибриллярной дегенерацией, когда при его биомикроскопическом исследовании выявляли темные, оптически пустые полости, преимущественно в центральных отделах витреума, вне которых были заметны утолщенные, склеенные и хаотично перемещающиеся в жидкой водянистой субстанции CT при изменении взгляда обследуемого фибриллы. ЗОСТ определяли при биомикроскопии по наличию уплотненной подвижной ЗГМ и кольца Вейса. Подтверждение ДСТ и ЗОСТ производили при ультразвуковом исследовании.

Критерий включения: возраст участников от 40 до 50 лет включительно.

Критерии исключения:

• Общие и глазные воспалительные заболевания, в том числе инфекционные, в период исследования и в течение 1 месяца перед исследованием.

• Травмы, опухоли органа зрения, предшествующие внутриглазные хирургические вмешательства или лазерное лечение.

• Эндокринологические заболевания, прежде всего, сахарный диабет.

Офтальмологическое исследование. Включало автоматическую рефрактометрию, ультразвуковую биометрию, биомикроскопию стекловидного тела с линзами 78, 120, 132 дптр и исследование изменений периферии сетчатки методом непрямой бинокулярной офтальмоскопии после расширения зрачка 0,5% раствором тропикамида. Для детальной характеристики изменений стекловидного тела проводили ультразвуковое исследование в В-режиме при частоте 12МГц (ультразвуковой аппарат Medison SonoAcer R3 с датчиком LN 5 - 12/40). Основываясь на классификации A.Oksala (1978), критерием ДСТ являлось наличие множественных полиморфных подвижных включений в СТ, а ЗОСТ - эхо-плотной подвижной мембраны, ограниченно распространенной (неполная ЗОСТ) или распространяющейся до основания СТ (полная ЗОСТ) (Sebag J.,1989; Kicova N., et al., 2012).

При офтальмологическом исследовании учитывали наличие жалоб на плавающие помутнения, «мушки», а также односторонний или двусторонний их характер. При сборе анамнеза учитывали перенесенные ранее конъюнктивиты и их формы. Измеряли рефракцию, размер переднезадней оси глаза (ПЗО), оценивали состояние конъюнктивы, а именно наличие признаков хронического воспаления: слабая инъекция, отделяемое, наличие фолликулов в переходных складках конъюнктивы (фолликулез). Также учитывали наличие признаков роговично-конъюнктивального ксероза (РКК) в виде нарушения стабильности слезной пленки по совокупности результатов проведения пробы Норна и пробы Ширмера-2. Исследовали наличие у пациентов периферических витреохориоретинальных дегенераций (ПВХРД) и хориоретинальных дегенераций (ПХРД).

Для изучения частоты и характера хламидийных поражений, а также иммунных реакций исследовали наличие возбудителей в конъюнктиве методами прямой иммунофлуоресценции (ПИФ), полимеразной цепной реакции (ПЦР), содержание специфических иммуноглобулинов IgA и IgG к С. trachomatis, IgG к С. pneumoniae в сыворотке крови, а также уровни провоспалительных цитокинов ИЛ-ip и ФНО-а в слезе и сыворотке крови.

Порядок забора материала для исследования. Слезу в объеме 250 мкл собирали из конъюнктивального мешка пациентов с помощью хлопкового зонда в сухую стерильную микропробирку. Забор соскобов производили нейлоновым зондом из верхнего и нижнего конъюнктивального свода после эпибульбарной анестезии. Взятие крови осуществляли в одно и то же время утром натощак из локтевой вены обследуемых пациентов в стерильных условиях в 2 пробирки (по 5 мл), из которых затем отделяли сыворотку для анализа. Для транспортировки материалы замораживали при -20 °С.

Лабораторные методы диагностики, использованные в исследовании.

В экспериментальной и клинической части исследования были применены следующие методы лабораторной диагностики возбудителей хламидийной инфекции.

Бактериоскопия соскобов из конъюнктивы. Соскобы фиксировали смесью Никифорова в течение 30 секунд, затем окрашивали по Романовскому-Гимзе и микроскопировали. Особое внимание обращали на присутствие внутриклеточных включений, лимфоцитов, полинуклеаров, плазматических клеток, признаки клеточного распада и дегенерации.

Реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ). Соскобы на предметном стекле высушивали, после чего обрабатывали родоспецифическими антителами к хламидийному липополисахариду, меченными флюоресцеинизоцианоатом. Для реакции использовали диагностические наборы «ХламиСлайт» (Лабдиагностика, Россия) и «ХлаМоноСкрин» (НИАРМЕДИК, Россия). Результаты оценивали при количестве клеток в соскобе не менее 50.

ПЦР-исследование соскобов с конъюнктивы. Проводили методом Real Time PCR с использованием диагностических наборов AmpliSens.

Культуральное исследование. Посев производили на смешанную культуру клеток L929+VERO+LLC-MK2 с последующей окраской родоспецифическими флюоресцирующими антителами диагностического набора «ХламиСлайт» (Лабдиагностика, Россия).

Иммуноферментный анализ (ИФА). В эксперименте в сыворотке крови определяли титр антител Ig М и IgG к родовым антигенам Chlamydia (SeroELISA, Savyon) с использованием фотометра АИФ-М/340 (ПО «Витязь», РБ) при длине волны 450 нм. В клинической части исследования использовали тест-системы для экспресс-диагностики ImmunoComb® Chlamydia Bivalent IgG и Monovalent IgA (С. trachomatis & С. Pneumoniae, Orgenics), диагностически значимым титром антител IgG к С. trachomatis считали 1/8, а к С. pneumoniae титр более чем 1/16, в соответствии с инструкцией изготовителя систем. Определение содержания цитокинов ИЛ-ip и ФНО-а в сыворотке крови (СК) и слезе (С) пациентов проводили методом ИФА согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Protein contour», Санкт-Петербург, Россия). Учет результатов осуществляли с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пкг/мл.

Статистическая обработка результатов исследования.

Статистическую обработку результатов исследования производили параметрическими и непараметрическими методами анализа с помощью ППП Statistica for Windows v.6.0. При описательной статистике количественные данные приведены в виде числа наблюдений, долей в процентах, медианы (минимум-максимум) и сравнивались с использованием t-критерия Стьюдента и х2-критерия Пирсона. Количественные данные в таблицах и диаграммах представлены в виде М±а (медиана±стандартное отклонение). Категорированные переменные в сравниваемых выборках были проверены с использованием U-критерия Манна-Уитни, точного критерия Фишера (одностороннего и двустороннего) и критерия Колмогорова-Смирнова. При построении диаграмм автор представлял данных в форме квартилей с указанием медианы. Корреляция между исследуемыми факторами была оценена с

помощью непараметрического коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми считали результаты с уровнем значимости р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты экспериментального исследования. Первые проявления инфекционно-воспалителыюго процесса были отмечены у животных на 2-3 сутки наблюдения, при этом выраженность реакции оказалась неодинаковой у различных животных, выявлены три формы инфекционно-воспалительного процесса.

1. Бессимптомная форма: животные № 2 (OS), №5 (OU), №6 (OS); животные № 11 (OU), №12 (OU). Проявления инфекционно-воспалителыюго процесса ограничились преходящей конъюнктивальной инъекцией, слабо выраженным хемозом и незначительным количеством слизисто-гнойного отделяемого из конъюнктивального мешка. Реакция со стороны структур заднего сегмента глаза не развивалась, к 73 суткам наблюдения отмечали при биомикроскопическом и ультразвуковом исследовании элементы ДСТ.

2. Форма с умеренно выраженными проявлениями инфекционно-воспалительного процесса: животные № 2 (OD), №4 (OU), №6 (OD); животные № 8 (OS), №9 (OU). В отличие от бессимптомной формы на фоне конъюнктивита в передней камере на 14-24 сутки выявляли клетки, но без преципитации, в СТ отметили развитие инфильтрации его кортикальных слоев, которая на 25-34 сутки постепенно уменьшилась. На 50 сутки после заражения развилась ДСТ, в большей степени в центральных отделах и в кортикальных слоях. В 2 наблюдениях имелись признаки частичной ЗОСТ, интравитреальный путь инфицирования не привел к более тяжелому поражению структур глаза.

3. Тяжелая форма с вовлечением структур переднего и заднего сегмента глаза: животные №1 (OU) и №3 (OU) при инфицировании С. trachomatis и животные №7 (OU), №8 (OD), и №10 (OU) при инфицировании С. pneumoniae. При инфицировании С. trachomatis к 12-14 суткам изменения в СТ были расценены как витреит на фоне заднего увеита с последующим развитием пролиферативных процессов в СТ и в 2 случаях отслойки сетчатки. При инфицировании С. pneumoniae на 12-23 сутки наблюдали легкую опалесценцию влаги передней камеры глаза, в то же время в заднем сегменте глаза развился периферический хориоретинит с множественными ретинальными и интраретинальными инфильтратами. На фоне поражения структур глазного дна в СТ на 8-14 сутки развилась экссудация, при этом плавающие включения, нити и хлопья экссудата распределялись неравномерно, локализуясь преимущественно в кортикальном слое СТ. В дальнейшем во всех наблюдениях прозрачность СТ восстанавливалась практически до исходного уровня на фоне фибриллярной дегенерации, ликвификации, наблюдаемых с 50-73 суток эксперимента. Кроме того, в 2 глазах с интравитреальным путем инфицирования, а также на одном парном глазу (без интравитреального введения возбудителей) на 7380 сутки была выявлена неполная ЗОСТ с остаточной фиксацией к диску зрительного нерва, ретинальным сосудам. Тяжелая форма поражения развилась не только в глазах

с интравитреальным введением возбудителей, но и при введении хламидий в конъюнктивальный мешок.

При лабораторном контроле возбудителей выявляли во всех образцах биоматериалов, забранных в период наблюдения. При проведении ИФА образцов венозной крови титр антител ^М к антигену хламидий начал повышаться с 3-х суток после инфицирования, увеличение титра антител к антигену хламидий выявили на 20 сутки. Таким образом, животные в эксперименте впервые перенесли хламидийную инфекцию.

Морфологические исследования

Бессимптомная форма инфекции. В СТ его фибриллярные структуры образовали участки пониженной плотности и участки агломерации волокон. В кортикальном слое СТ, на расстоянии до 250-400 мкм до внутренней пограничной мембраны сетчатки (ВПМ), с локализацией преимущественно у цилиарных отростков цилиарного тела, в основании СТ, препапиллярно и над ретинальными сосудами выявляли гиалоциты без признаков синтетической активности, единичные фибробласты, лимфоциты (преимущественно периваскулярно в сетчатке и некоторые в стекловидном теле). ВПМ была неравномерно уплотненной, местами с локальным отделением от нее задней гиалоидной мембраны (рис.1). В сетчатке, помимо слабо выраженной лимфоцитарной инфильтрации, присутствовали макрофаги. Явных изменений в клетках сетчатки и ее гистоархитектонике не выявлено.

Форма с умеренно выраженными проявлениями инфекционно-воспалителыюго процесса. Фибриллы СТ были утолщены, конденсированы в грубые волокна, окруженные участками разрежения. Внутренняя пограничная мембрана была неравномерно уплотнена, в некоторых участках от нее была частично отслоена задняя гиалоидная мембрана (ЗГМ) с отхождением до 35-100 мкм и распространенностью до 100-150 мкм (рис.2).

В области основания и преретинальном слое СТ выявлена слабая лимфоцитарная инфильтрация с наличием моноцитов. Количество гиалоцитов у основания было увеличено, в клетках не наблюдали признаков синтетической активности, в некоторых клетках выявляли признаки кариопикноза и цитолиза. Кроме того, в сетчатке наблюдали на фоне инфильтрации лимфоцитами, моноцитами и макрофагами (больше периваскулярно во внутренних слоях сетчатки) признаки дистрофических изменений. В частности, выявили изменение хода опорных волокон клеток Мюллера, нарушение гистоархитектоники внутренних слоев сетчатки.

Тяжелая форма с вовлечением структур переднего и заднего сегмента. У животных, инфицированных СЛгасЬотайв, при окраске гематоксилином и эозином остатки СТ в виде уплотненной пролиферативной ткани, пропитанной лимфоцитами, фибробластами и клеточным детритом, располагались за хрусталиком, в ретрогиалоидном пространстве прокрашивался эозинофильный экссудат. Клеточная инфильтрация была особенно выражена в препапиллярном отделе СТ и у его основания, где сохранилась витреоретинальная фиксация. В сетчатке наблюдали диффузную инфильтрацию лимфоцитами и макрофагами (особенно около диска

зрительного нерва и в области сосудов), нарушение гистоархитектоники с изменением хода опорных волокон клеток Мюллера. Во внутренних слоях сетчатки были выявлены новообразованные сосуды и элементы глиоза, что отражало течение пролиферативного процесса, особенно в местах сохранившегося витреоретинального контакта. В различных отделах сетчатки присутствовали очаговые повреждения по типу «фолдинга», основой которому служили измененные в результате гидропической дистрофии наружные сегменты палочек и колбочек, в основании таких участков находили плазматические клетки (рис.3). В хориоидее наблюдали полнокровие сосудов и обильную инфильтрацию лимфоцитами.

В

ч

Рисунок 1 - Бессимптомная форма инфекции СЛгасЬотаЙБ Ь2, 128 сутки после инфицирования: А - отслойка ЗГМ (черные стрелки) и лимфоциты во внутренних слоях сетчатки (белая стрелка); Б - инфильтрация внутренних слоев сетчатки и преретинального витреума (черные стрелки). В - На фоне дезорганизации волокон стекловидного тела (стрелка) гиалоцит (Г) с дольчатым ядром без ядрышек, гомогенной слабо окрашенной цитоплазмой без включений и вакуолизации. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.400 (А), ув.800 (Б), ув. 1000 (Б).

Рисунок 2 - Форма с умеренно выраженными проявлениями инфекционно-воспалительного процесса С.рпеитошае Т\¥АЯ, 128 сутки после инфицирования. А. Конденсация фибрилл СТ, частичная ЗОСТ (белая стрелка), лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация СТ и сетчатки (черные стрелки). Б. Фибробласты (белые стрелки) и гиалоциты (черные стрелки). В. Гиалоцит с хамидийным включением (черная стрелка). Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. 400 (А), ув.ЮОО (Б).

У животных, инфицированных С.рпеитошае, в заднем сегменте наблюдали лимфоцитарно-макрофагальную инфильтрацию СТ, при этом его преретинальные слои были уплотнены, в трех случаях была подтверждена частичная ЗОСТ. В наружных и внутренних слоях сетчатки выявлена лимфоцитарная инфильтрация и

умеренно выраженные нарушения ее гистоархитектоники в форме очагов «фолдинга», сходных с таковыми при инфицировании С^гасИотаЦз, истончение и снижение клеточности наружного и внутреннего ядерного слоя сетчатки, а также изменение хода опорных волокон Мюллера в хориоретинальных очагах.

Рисунок 3 - Тяжелое поражение инфекцией С.trachomatis L2. А. Макропрепарат, 128 сутки после инфицирования, пролиферативная витреоретинопатия (черная стрелка). Б. Витреоретинальная пролиферация с лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией СТ и сетчатки (черные стрелки) и нарушение гистоархитектоники с «фолдингом» (белая стрелка). Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.200. В. Плазматическая клетка в основании участка «фолдинга» (черная стрелка). Окраска: гематоксилин и эозин. У в. 1000.

При иммуногистохимическом исследовании возбудителей выявляли в форме крупных внутриклеточных образований (ретикулярных телец), расположенных рядом с ядром, мелких внеклеточных образований (элементарные тельца), а также в форме внутриклеточных колоний из элементарных телец. Указанные формы обнаружены в конъюнктиве, в СТ (преимущественно преретинально, в области основания стекловидного тела, между отростками цилиарного тела, в зоне витреоретинального контакта), во внутренних слоях сетчатки (в клетках нейроглии и клетках Мюллера), в наружных слоях сетчатки (в пигментном эпителии сетчатки) (рис.4). Включения в заднем сегменте глаза были выявлены не только в глазах с интравитреальным путем инфицирования, но и в глазах с введением возбудителей в конъюнктиву.

Рисунок 4 - Хламидийные включения у животных с субклинической формой инфекции С.ИасЬотаПз. А. Во внутренних слоях сетчатки (черные стрелки) и в СТ (белые стрелки). Б. Ретикулярные тельца в клетках СТ (черные стрелки). В. Внеклеточные хламидийные включения (белые стрелки) в СТ. Окраска: ИГХ. Ув. 1000.

В группах установлено сходство по клеточному составу стекловидного тела в сроки 56-128 суток после заражения (рис.5).

« 70*4

§ &0% X

О)

3 50% О

& 40% О

зо% 20% 10%

Г

205,501). 6 05 128

1% 14 1* 4% 5% ■ я. 6% 5% 1 8% ■

74% В1% - 8%

4% 7% 3% 6% 5% 8% 5% 9% .

■ 3% 1% 1% и» 35% «к

12% 11%

200, бОЭ 128

1 ГРУППА (С.ТКАСНОМАТга)

Клетки в

стекловидном теле

■ Глиальные клетки

■ ПЭС

■Гиалоциты

■ Фибробласты

■ Нейтрофилы

■ Макрофаги

■ Моноциты

■ Лимфоииты

Глаз

Срок выведения, сутки

Форма поражения

С/К

с/к

с/к

с/к

и/в

я^т -1% ■

110и,120и 128

90и 128

5»

800 56

яю

и/в

I

ш

I

с/к

700 705

128

4*

1000 июз 72

2 ГРУППА (С.Р^иМОМАЕ) Клетки в

стекловидном теле

■ Глиальные клетки

■ ПЭС

■Гиалоциты

■ Фибробласты

■ Нейтрофилы

■ Макрофаги

■ Моноциты

■ Лимфоциты

Глаз

Срок выведения, сутки

Форма поражения

Рисунок 5 - Соотношение клеток в стекловидном теле в глазах с разной формой поражения (Б - бессимптомная; У - умеренная; Т - тяжелая), в разные сроки забора материала и с разными способами заражения.

В сроки 56 и 128 суток после инфицирования при бессимптомной и умеренной форме поражения соотношение клеток значимо не отличается, преобладают

гиалоциты (74-87 % от числа клеток) и лимфоциты (5-13 %). При тяжелой форме как на 56, так и на 72 и 128 сутки значимо выше содержание фибробластов (12-23 %), из воспалительных клеток больше не только лимфоцитов, но и нейтрофилов, макрофагов и моноцитов.

При статистическом анализе установлено отсутствие значимого влияния транспортной среды на тяжесть клинических проявлений патологического процесса (р=0,011). Не выявлено связи между видом возбудителя и тяжестью клинических проявлений поражения в сроки 20 суток и более после заражения (%2=0,1678<3,84, р<0,01; рис.6). При анализе с помощью критерия Колмогорова-Смирнова установлено, что интравитреальное введение возбудителей значимо влияло на тяжесть клинических проявлений поражения органа зреиия (р<0,05).

13

_ 12

111

,3 ю

1 »

I »

I 7 | 6

| 5

9 4

I з

I 2

Рисунок 6 - Тяжесть клинических проявлений в различные сроки наблюдения у животных, инфицированных разными возбудителями.

Различие в степени тяжести поражения между глазами, в СТ которых не выявили хламидийных включений, и глазами, в которых в СТ при морфологических исследованиях установили наличие возбудителей, достоверно (р=0,04).

Результаты клинического исследования

Характеристика общей выборки участников исследования. Выборку добровольцев из 144 человек составили 75 женщин и 69 мужчин, средний возраст составил 46,12±2,86 лет, значимого отличия в возрасте не выявлено (р=0,343). Среднее значение клинической рефракции составило -0,63±0,82 дптр (диапазон колебаний от -3,0 дптр до +1,0 дптр). Среднее значение ПЗО составило 24,93±0,28 мм (диапазон значений от 23,5 до 25,4 мм).

У 21 обследуемого (15 %) в анамнезе имелись указания на периодическое (до 56 раз в год) покраснение глаз и появление гнойного или слизисто-гнойного отделяемого из конъюнктивального мешка. При осмотре небольшое количество отделяемого из конъюнктивального мешка, слабая инъекция конъюнктивы обнаружены у 32 пациентов из выборки. Признаки роговично-конъюнктивального ксероза (РКК) по результатам проведения пробы Ширмера-2 у 124 обследуемых и пробы Норна у 144 участников были выявлены у 32 обследуемых.

О С.pneumoniae TWAR (N=12) во всю 1 р-16

р<-01 р=.42

1 р= 036

1

<8? оо

(Х.01

оо во ОО в

оооо

ООО ООО вОО оо ООО оооо

о ввоо ©оо оо о ОО ООО ОО ООО

2 сутки 4 сутки 10 сутки 20 сутки 50 сутки

© • интравитреальное введение

У 35 (24%) обследуемых выявили различные типы ПХРД и у 16 (11%) обследуемых участки ПВХРД, из них у 11 решетчатую дегенерацию сетчатки, при этом у 3 человек (3 глаза) на участках дегенерации выявлены сквозные дефекты сетчатки.

Изменения стекловидного тела в исследуемой группе (Таблица 2). В группе с ДСТ субъективные проявления изменений в стекловидном теле в форме плавающих одной или множества «мушек», присутствовали у 36 (76,1 %) человек, а субъективные проявления ЗОСТ, в том числе в виде «кольца», «восьмерки», «паутины» у 13 (68,4 %) человек с ЗОСТ.

Таблица 2 - Изменения стекловидного тела в исследуемой группе

Показатель N пациентов (п глаз) Мужчины/Женщины Возраст Рефракция, дптр

Изменения в стекловидном теле

ДСТ: ЗОСТ: • неполная; • полная. 46(92) 19(27) 5(7) 14(20) 25/21 9/10 2/3 7/7 47,51±2,52 49,11±0,81 -0,59±0,8 -0,42±0,78

Субъективные проявления изменений СТ

А) ДСТ Б) ЗОСТ 36 13 19/17 7/6

Результаты лабораторного обследования в общей выборке обследуемых. (таблица 3). Титр 1§А к С-ЬгасИотайв не превышал 1/16, что может свидетельствовать о хроническом течении хламидиоза с большей иммунореактивностью, либо о возможной реактивации хламидийной инфекции в возможных местах ее локализации.

Средние значения содержания провоспалительных цитокинов ИЛ-1Р и ФНО-а в сыворотке крови и слезе в общей выборке находились в пределах нормы (в соответствии с нормами, указанными фирмой-производителем диагностических наборов), распределение у мужчин и женщин, а также у пациентов разных возрастов не имело значимых отличий (р>0,05). Установлено, что содержание цитокинов оказывалось в исследуемых жидкостях значимо более высоким в случае выявления возбудителей в соскобах при ПЦР-исследовании (р<0,001).

Таблица 3 - Общие результаты лабораторного исследования

Признаки Количество пациентов (в %)

Положительный результат ПЦР 12(8,3)

Положительный результат ПИФ 34 (23,6)

Наличие антител к возбудителям 70 (48.6)

Наличие антител к СЛгасЬютаНз 27(18,8)

Наличие антител ^О к С.рпеитошае 59 (41)

Одновременное наличие антител к С-ЦасЬотаНэ и С.рпеитотае 16(11,1)

Наличие антител ^А к С.П-асЬота^ 21 (14,6)

При сопоставлении выявляемых антител к возбудителям с содержанием цитокинов также выявлен более высокий уровень цитокинов у пациентов, у которых одновременно выявляли антитела к обоим типам возбудителей (рис.7).

Median: Вех: 2S%, 7Е%: г: №»i-Outlier Mm, Ncn-CUlie; Max

Выявление антител IgG

Рисунок 7 - Уровень цитокинов и выявление антител IgG к C.trachomatis/C.pneumoniae. О - антител не выявлено; 1 - наличие антител IgG к одному из возбудителей; 2 - наличие антител IgG к С.trachomatis и C.pneumoniae одновременно.

Сравнение группы с ДСТ и подгруппы с ЗОСТ с группой сравнения.

Средний возраст обследуемых в группе с ДСТ и в подгруппе с ЗОСТ был значимо выше, чем в группе сравнения (Таблица 4). При этом все случаи ЗОСТ выявлены у пациентов в возрасте 48-50 лет, а наиболее часто ЗОСТ присутствовала при возрасте обследуемых 49-50 лет.

Значимых отличий между группами в распределении по полу, рефракции, значениям ПЗО и частоте РКК выявлено не было (р>0,05). Частота выявления признаков хронического воспаления конъюнктивы в группе с ДСТ, в том числе и у пациентов с ЗОСТ оказалась значимо выше в сравнении с группой сравнения.

При сравнении результатов лабораторного выявления ДНК C.trachomatis при ПЦР-исследовании установлено значимо более частое обнаружение в конъюнктивальных соскобах у пациентов с ДСТ (р=0,046), в то же время частота выделения ДНК возбудителя в подгруппе с ЗОСТ достоверно не отличалась от группы сравнения (р=0,12).

Значимо чаще как в группе с ДСТ, так и в подгруппе с ЗОСТ определяли наличие антител IgG к C.trachomatis (р=0,02), а также IgG к C.pneumoniae у пациентов с ДСТ (р=0,03). Частота выявления антител IgG к C.trachomatis оказалась выше частоты выявления ДНК возбудителя в конъюнктиве при ПЦР-исследовании как в группе с ДСТ, так и в группе сравнения. Хотя титр антител к C.pneumoniae более 1/16 выявлен у 41 % всей выборки, но значимо более высокими частота и уровень антител были в группе с ДСТ (р<0,05). Антитела к обоим возбудителям одновременно присутствовали у 6 человек в группе сравнения, 9 человек в группе с ДСТ и у 6 человек с ЗОСТ. В целом, титр антител IgG к C.trachomatis и IgG к C.pneumoniae как в группе с ДСТ, так и в группе с ЗОСТ не превышал 1/64, что свидетельствует о

перенесенной ранее инфекции или ее хронической форме. Частота выявления антител ^А к СЛгасЬотаНв у обследуемых с ДСТ, в том числе и в подгруппе с ЗОСТ значимо не отличалась от группы сравнения (Таблица 5).

Таблица 4 - Сравнение групп и подгрупп обследуемых людей по основным отслеживаемым параметрам

Показатели Всего N=144 Группа сравнени я п=98 Группа с ДСТ Р, Группа сравнения и группа с ДСТ Р, Группа сранения и подгруппа с ЗОСТ

Всего п=46 Пациенты с ЗОСТ п=19

Демографические показатели

Возраст, средний± а 46,12±2,86 45,33±2,83 47,74±2,17 49,11 ±0,81 0,04 <0,001

Женщины, случаи (%) 75 (52,1) 52 (53,1) 23 (50) 9 (47,4) 0,60 0,66

Мужчины, случаи (%) 69 (47,9) 46 (46,9) 23 (50) 10(52,6)

Глазные факторы, среднее± о

Рефракция, дптр -0,63±0,82 -0,64±0,81 -0,59±0,85 -0,58±0,78 0,71 0,86

ПЗО, мм 24,93±0,28 24,91 ±0,29 24,96±0,26 24,95±0,23 0,54 0,45

РКК, случаи (%) 32 (22,2) 21 (21,4) 11 (24) 5 (26,3) 0,83 0,76

Изменения конъюнктивы конъюнктивиты, случаи (%) 32 (22,2) 17(17,3) 15 (32,6) 11(57,9) 0,04 <0,001

Примечание: а -стандартное отклонение

При сравнении уровня антител в группах установлено значимо более высокое содержание специфических антител ^А и к СЛгасИотайв и к С.рпеитотае у пациентов в группе с ДСТ и подгруппе с ЗОСТ (р<0,05; Рис.8).

ГруппасДСТи группа сравнения 0 AHTHTenafgAKC.tractiomatis Р=0,049 Антитела IgGuCpneumoniae Р=0.01Г [ö] Антитела tgG к C.traclromatis P-0.D37 Подгруппа с ЗОСТ и группа сравнения 0 AHTHTfiratgAKC-trachomatis Р<0,001 iS Антитела IgG к C.pnetjmoniae Р-0.0? ■ Антитела IgG к C.trachomatis Рч0,ОО1

Группа с ДСТ Подгруппа с ЗОСТ Группа сравнения

Рисунок 8 - Титры антител IgA и IgG к C.trachomatis и IgG к С.pneumoniae в группах обследуемых.

Средние значения содержания цитокинов ИЛ-1(3 и ФНО-а в слезе и сыворотке крови в общей выборке (N=144) находились в пределах нормы, но при ДСТ уровень цитокинов оказался значимо выше как в слезе, так и в сыворотке крови в сравнении с группой сравнения (р<0,05). В подгруппе с ЗОСТ значимо высокий уровень цитокинов был только в сыворотке крови, в слезе отличий от группы сравнения не обнаружено (р=0,16 и р=0,25 для ИЛ-1Р и ФНО-а соответственно).

Таблица 5 - Результаты лабораторного исследования в группах и подгруппах

Лабораторные показатели Всего N=144 Группа сравнения п=98 Группа с ДСТ Р, Группа сравнения и группа с ДСТ Р, Группа сравнения и подгруппа

Всего п=46 Пациенты с ЗОСТ п=19

ПЦР (соскобы с конъюнктивы), N обследуемых

ДНК С.ПасЬотайз, случаи (%) 12 (8,3) 5 (5,1) 7(15,2) 3 (15,8) 0,046 0,12

ПИФ (соскобы с конъюнктивы), N обследуемых

ЬРБ хламидий в конъюнктиве, случаи(%) 34 (23,6) 16(16,3) 18(39,1) 9 (47,4) 0,003 0,005

Выявление антител (сыво зотка крови), N обследуемых

^А к С.НасЬотаиэ, случаи (%) 21 (14,6) 11 (11,2) 10 (21,7) 5(36,8) 0,08 0,06

^О к С.ПасЬотаиз, случаи (%) 27 (18,8) 13 (13,3) 14 (30,4) 7 (36,8) 0,02 0,02

ДО к С.рпеитошае, случаи(%) 59 (41) 34 (34,7) 25 (54,3) 11 (57,9) 0,03 0,05

Уровень цитокинов, среднее* о, пкг/мл

ИЛ-1Р Сыворотка крови 39,4±10,4 37,8±9,6 42,5±11,3 44,2±10,9 0,03 0,01

Слеза 88,9±9,4 88,17±9,14 90,6±9,9 93,8±9,4 0,02 0,16

ФНО-а Сыворотка крови 44,0±9,4 42,8±8,8 46,5±10,2 49,1±9,7 0,01 0,02

Слеза 92,2±11,0 91,4±11,35 93,7±10,3 97,1± 10,9 0,03 0,25

Примечание: а -стандартное отклонение

Корреляционная связь отслеживаемых в исследовании факторов с дистрофическими изменениями стекловидного тела. При проведении анализа всей выборки (п=144) выявлена умеренная прямая корреляционная связь ДСТ и ЗОСТ с возрастом (г=0,47 и г=0,444 соответственно, р<0,001; Таблица 6). Также выявлена слабая прямая корреляционная связь ЗОСТ с частотой воспалительных изменений конъюнктивы, определенных при осмотре (г=0,335, р<0,001).

Значения коэффициентов корреляции ДСТ и ЗОСТ с наличием в сыворотке крови антител к возбудителям находились в диапазоне от 0,2 до 0,4 (р<0,05; Таблица 6). Достоверная прямая корреляционная связь обнаружена также между частотой ДСТ и уровнем (значениями титра) антител (г=0,21, р<0,05).

Более слабая корреляционная связь ДСТ и ЗОСТ установлена с уровнем цитокинов ИЛ-1Р и ФНО-а в сыворотке крови, а также частоты ДСТ с частотой

выявления ДНК СДгасИотаПэ в конъюнктиве, и частоты ЗОСТ с уровнем цитокинов ИЛ-ф и ФНО-а в слезе. Значимой корреляционной связи не установлено между частотой ЗОСТ и выявлением ДНК С.ЦасЬотайв в конъюнктиве, а также между частотой ДСТ и содержанием цитокинов в слезе.

Таблица 6 - Корреляция изменений стекловидного тела и отслеживаемых в исследовании лабораторных показателей _

Лабораторный показатель Коэффициент корреляции Спирмена

ДСТ ЗОСТ

г Р R Р

ДНК C.trachomatis в конъюнктиве (ПЦР) 0,171 <0,05 0,105 0,21

LPS хламидий в конъюнктиве (ПИФ) 0,285 <0,001 0,315 <0,001

Ig А к C.trachomatis 0,315 <0,001 0,301 <0,001

Ig G к C.trachomatis 0,219 <0,01 0,405 <0,001

Ig G к C.pneumoniae 0,207 <0,05 0,264 <0,01

Ig G к C.trachomatis и C.pneumoniae (одновременно) 0,237 <0,01 0,389 <0,001

ил-ip Сыворотка крови 0,237 <0,01 0,224 <0,001

Слеза 0,117 0,163 0,185 0,023

ФНО-а Сыворотка крови 0,184 0,027 0,209 0,012

Слеза 0,119 0,155 0,185 0,026

Таким образом, возбудители хламидийной инфекции способны инфицировать клетки стекловидного тела и внутренних слоев сетчатки в эксперименте, а в условиях клинического исследования выявлена слабая прямая корреляционная связь лабораторных показателей, характеризующих инфицирование человека хламидийной инфекцией и наличие слабо выраженного воспалительного процесса, с наличием возрастных изменений стекловидного тела (ДСТ и ЗОСТ).

ВЫВОДЫ

1. Субконъюнктивалыюе и интравитреальное введение серовара L2 Chlamydia trachomatis и серовара TWAR Chlamydophila pneumoniae позволяет создать модель хламидийного поражения стекловидного тела с развитием в нем инфекционно-воспалительного процесса.

2. Инфекционно-воспалительный процесс в стекловидном теле, обусловленный введением как серовара L2 Chlamydia trachomatis, так и серовара TWAR Chlamydophila pneumoniae, варьирует от тяжелого воспаления (витреит, панувеит, пролиферирующий витреоретинит) до бессимптомной формы поражения с развитием дистрофических изменений в стекловидном теле на фоне персистенции хламидий.

3. Изменения структуры стекловидного тела при тяжелой форме воспаления опосредованы неспецифической воспалительной реакцией и пролиферативными процессами, а при более часто наблюдаемом бессимптомном течении развитием на фоне слабой лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации дистрофических изменений стекловидного тела. При этом возбудители Chlamydia trachomatis и

Chlamydophila pneumonia инфицируют клетки стекловидного тела (гиалоциты), а также участвующие в метаболизме стекловидного тела клетки Мюллера сетчатки.

4. Высокая частота выявления у лиц с возрастными дистрофическими изменениями стекловидного тела (деструкция и задняя отслойка стекловидного тела) ДНК C.trachomatis, хламидийных включений в конъюнктиве и специфических антител IgA и IgG к C.trachomatis и C.pneumoniae в сыворотке крови, а также наличие между изменениями стекловидного тела и лабораторными показателями хламидийной инфекции слабой прямой корреляционной связи (0,2<г<0,4 при р<0,05) может свидетельствовать об участии хламидийной инфекции в качестве сопутствующего фактора при развитии возрастных дистрофических изменений стекловидного тела у человека.

5. Участие возбудителей хламидийной инфекции в развитии дистрофических изменений стекловидного тела в качестве сопутствующего фактора может быть обусловлено слабо выраженным воспалительным процессом, на что указывает более высокое содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-lß и ФНО-а в сыворотке крови и слезе у лиц с деструкцией и задней отслойкой стекловидного тела (р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При лабораторном обследовании пациентов на наличие хламидийного поражения органа зрения необходимо проведение нескольких дополняющих друг друга методов диагностики (ПИФ, ПЦР, ИФА), а также исследование содержания ключевых провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и слезе. В рутинной клинической практике указанные методы обследования могут быть рекомендованы в случаях наличия риска осложнений дистрофических процессов в стекловидном теле и пограничных структур сетчатки (в комплексе мероприятий по профилактике дистрофической отслойки сетчатки). С учетом стимуляции воспалительных процессов хламидийной инфекцией и ее способностью инфицировать структуры витреоретинального соединения, при наличии пролиферативных процессов в заднем сегменте глаза также рекомендуется лабораторное исключение хламидийной инфекции, либо, в случае выявления, проведение курса антибактериальной терапии в соответствии с существующими рекомендациями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Boiko, E.V. Chronic Ocular Chlamydia trachomatis Infection in Rabbits: Clinical and Histopathological Findings in the Posterior Segment / E.V. Boiko, A.L.Pozniak, D.S.Maltsev, A.A.Suetov, I.V.Nuralova // Investigative Ophthalmology & Visual Science. - 2014. - Vol.55 (2). - P.1176-1183.

2. Boiko, E.V. High Frequency of Latent Conjunctival C.trachomatis, M.hominis, and U.urealyticum Infections in Young Adults with Dry Eye Disease [Электронный ресурс] / E.V.Boiko, A.L.Pozniak, D.S.Maltsev, A.A.Suetov, I.V.Nuralova // Journal of Ophthalmology. - 2014. - Vol. 2014 (2014). - Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1155/2014/154627.

3. Бойко, Э.В. Дистрофические изменения стекловидного тела при офтальмохламидиозе / Э.В. Бойко, A.A. Суетов, Д.С. Мальцев // Вестник офтальмологии. - 2012. - №6. - С.45-49.

4. Бойко, Э.В. Роль Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в поражении структур заднего сегмента глаза / С.В. Чепур, Э.В. Бойко, A.JI. Позняк, И.В. Нуралова, Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2012. - №3. - С. 79-82.

5. Бойко, Э.В. О развитии полиорганного хламидийного поражения при первичном локальном заражении глаза в эксперименте / Э.В. Бойко, А.Л. Позняк, И.В. Нуралова, Д.С. Мальцев, A.A. Суетов, B.C. Агеев / Архив патологии. - 2011. -№6.-С. 15-18.

6. Бойко, Э.В. Особенности поражения структур заднего отрезка глаза при экспериментальной хламидийной инфекции / Э.В. Бойко, С.В. Чепур, А.Л. Позняк, И.В. Нуралова, A.A. Суетов, Д.С. Мальцев, B.C. Агеев, А.Ю. Шестаев // Вестник офтальмологии. - 2010. - № 1. - С.27-32.

7. Бойко, Э.В. Клинико-морфологические особенности хориоретинита, вызванного Chlamydia pneumoniae в эксперименте / Э.В. Бойко, С.В. Чепур, А.Л. Позняк, И.В. Нуралова, A.A. Суетов, Д.С. Мальцев, B.C. Агеев // Вестник офтальмологии. - 2010. - № 4. - С. 20-25.

8. Бойко, Э.В. Особенности поражения сетчатки при экспериментальной хламидийной инфекции глаз / Э.В. Бойко, А.Л. Позняк, И.В. Нуралова, Д.С. Мальцев, A.A. Суетов, B.C. Агеев // Архив патологии. - 2010. - №4. - С. 43-46.

9. Бойко, Э.В. Отслойка ЗГМ: понятие, распространенность, классификация, клиника и возможные причины / Э.В. Бойко, A.A. Суетов, Д.С. Мальцев // Офтальмологические ведомости. - 2009. - Т.З, № 3. - С. 38-45.

10. Суетов, A.A. Влияние воспалительных заболеваний глаз на развитие отслойки задней гиалоидной мембраны и периферических витреохориоретинальных дистрофий / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. — СПб.-2008.-С. 110-111.

11. Суетов, A.A. Моделирование поражения органа зрения хламидийной инфекцией в эксперименте / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. - СПб. - 2009. - С. 112-113.

12. Суетов, A.A. Наблюдения поражения структур органа зрения культурой С. trachomatis L2 в эксперименте на кроликах / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. - СПб. - 2009. - С.77.

13. Суетов, A.A. Изучение патогенеза отслойки задней гиалоидной мембраны и периферических витреохориоретинальных дистрофий / Д.С. Мальцев, A.A. Суетов // Итоговая конференция ВНОКС ВМедА. - СПб. - 2008. - С. 75-76.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IgA, IgG, IgM - иммуноглобулины классов А, G и М

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСТ - деструкция стекловидного тела

ЗОСТ - задняя отслойка стекловидного тела

ИЛ-lß — интерлейкин-lß, провоспалительный цитокин

ИФА — иммуноферментный анализ

ПЗО - переднезадняя ось глаза

ПИФ - реакция прямой иммунофлюоресценции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РКК - роговично-конъюнктивальный ксероз

CT - стекловидное тело

ФНО-а - фактор некроза опухоли а, провоспалительный цитокин

Подписано в печать 18.02.2015 Формат 60x84'/,6 Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 100 Заказ № 13/01 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)