Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Особенности экспресси изоформ цитохрома Р-450, активирующих проканцерогены у дрозофилы

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

Л л имени К.Н.Блохииа

.' ч

На правах рукописи

Шпиг-гльман Владимир Самуилович УДК 616-006-02161*.015.3

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ИЗОФОРИ ЦИТОХРОКА Р-4 50, ЛКТИВИРУШЦНХ ПРОКАНЦЕРОГЕ1Ш У ДРОЗОФИЛ!!.

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинехих наук

Носква 1993

Работа выполнена в онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина Академии медицинских наук Российской Федерации. Научный руководитель: руководитель лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН, доктор медицинских наук,

проф. Г.А.БелицхиЙ.

Официальное оппоненты: доктор биологических наук,

проф. В.О.Уваров; доктор биологических наук, проф. В.А.Кобляков. Ведущая организация: Российский Государственный медицинский

Университет.

Защита диссертации состоится * * / Ф 1995 р.

в 14.00 часов на заседанми специализированного совета К.001.17.01. Онкологического научного центра АНН РФ (115478, Москва, Каширское шоссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН. Автореферат разослан "Аь " уО^Ь/ЬО-1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета д.м.н.« проф. В.с.Турусов

1.Актуальность проблемы. Одной из наиболее дрепких систом дологического окисления является возникшая более 300 млн пет назад гистама микросоиных монооксигенаэ с гемопротеидом - цитохромои Р-4Ь0 а качестве терминального звона.

Универсальность данной системы и исключительная важность наполняемых 'ею реакций делают ситему цитохрома Р--4Я0 одним из фундаментальных объектов изучения организации клеточных форм жизни |& различных ое этапах. Генетическую регуляцию реакций системы (Нтохрома Р-450 удобнее всего изучать на простых смстеиах, в тон 1исл0 ка дрозофиле, геном которой изучен наиболее детально. >5цетеоротическая н прикладная значимость такого рода изучения >чевндна, так как оно дает.воэножность поникания ряда допросов филогенетического развития системы в процессе эволюции ьидой, а гакжа путей биотрансформации ксенобиотиков. 3 число последних гаходятся и химические канцерогенные соединения, которые данной :истоной превращаются из проханцврогенных неактивных форм и шеокораактионыа генотоксическив метаболиты, непосредственно »суцоствляюяиа первую стадию химического канцерогенеза - 'инициацию. Гжа одно эта делает восьми важной прикладну» сторону изучения !роцеесов генетической регуляции системы микросонкнх монооксигеназ.

Изучоииа роли стероидных гормонов о экспрессии системы !отзболизиа проканцерогянов, которому в данной работе уделяется ¡пачитольпоа вникание, может послужить основой для понимания гзхаикзков полового диморфизма в возникновении индуцированных ¡пухолей у кивотиых и человека.

Дрозофила, как объект такого род« исследований представляет болыаой интерес еще и той, что является превосходный и постоянно совершенствуем!,)« объектом экспрессного выявления генотокенкантов окружающей среды, обладающих канцерогенными свойствами. Тек более существенным являются исследования сравнительного плана, дающие материал для коррекции данных при экстраполяции их с модельных объектов (микроорганизмы, насекомые, клеточные' культуры эукариот) на • клекопитоюаих к человека.

Наконец, подобные исследования крайне необходимы для поникания такого явления как резистентность х инсектицида»« у насекомых, что представляет несомненный интерес для сельскохозяйственной и санитарно-эпидемиологической практики.

Краткосрочные тосты Для выявления геиотохенчеекмх проканцврогоиоо, разработанные на плодовой нун'ке (^>rosoph¿^a шХаподавЬаг), весьма информативны, удов»:.^ и дешевы. Одним из их ограничений является низкая чувствительность этого вида к мутагенному действие полициклических • ароматических углеводородов (ПАУ) м ароматически» аминов. Эту особенность можно объяснить том, что метаболизм этих соединений у дрозофилы отличен от такового у млекопитающих: в результате образуется преимущественно некутйгенные метаболиты. Низкая чувствитолыюсть. дрозофилы к ПАУ и ароматическим аминам в краткосрочных тестах по выявлении генотоксических проканцерогонов связана со слабой их метаболической активацией на ц.'.тохроие Р-450. Индукция цитохрома Р-450' или создание линий дрозофилы с высоким уровнем метаболической активации канцерогенов расширили бы спектр соединений тестируемых на дрозофиле и могли бы стать основой д.~.я создания аналитической батареи, состоящей из тестерных линий чувствительных к разным классам канцерогенов.

2. Основные задачи исследования заключались в следующем:

- Изучить аффект различных индукторов цитохрома Р-450 на развитие i3.пeIanogaster на разных стадиях развития дрозофилы.

- Изучить особенности регуляции экспрессии изофори цитохрома Р-430, метаболиэируючих канцерогены у линий лрозофили, различных по базольиой активности никросомных монооксигеназ: а) исследование индукции под действием индукторов различных классов; б) исследование гормональной индукции.

- Нследооать влияние эндогенных гормонов на экспреесио различии* Изоформ цитохроиа Р-4 50 с помодье линий, несущих тегшературо-чувствитальНуа мутацию в гене отвечающей за синтез основного стероидного горкома насекомых - экдиэона.

- Сконструировать новые линии D.aalanogastc:t■t несущие в гомоэиготнон состоянии гены ответственные эя высокий уровень метаболической активации канцерогенов и набор маркерных генов, используемый а теста на соматический иозаиципн.

. - Выяснить их чувствительность к нутагенному действии канцерогенных и неканцерогенных ИЛУ и ароматических аминов в сравнении с традиционно используемыми в скрининге линиями О.пв.2длодагг£ог,несуцими наркерм у и вп3.

3.Научная новизна. Впервые изучено действие индукторов цитохрома Р-450 на развитие дрозофилы и показано, что индукторы фгнобарбкталового типа резко замедляют разьитие личинок и куколок.'

Впервые била исследована индукция различных иэофорн цитохрома Р-450 и связанных с ними активностей под действием широкого спектра индукторо; ¿«нобарбиталового и метилхопантренового типа у чувствительных и рэзнстентных к пестицидам линий дрозофилы.

Впервые показано, что у дрозофилы аа метаболическую резистентность ] пестицидам и эа активацию проканиерогенных ПАУ отвечают одни и те же иэофоркы цитохрома Р-450 (подсемейство Р-450В).

В работа впервые изучена роль экзогенных и эндогенных гормонов !:асекокых в экспрессии различных изоформ цитохрома Р-450 и выявлено что горкой линьки насекомых - экдИэон индуцирует изоформы цитохрома Р-450 связанные с резистентностью к пестицидам и чувствительностью к ПАУ..

б

Сконструированы новые тестерные линии дрозофилы насушив в гоноанготном состояния на II и ITI хромосоме весь комплекс генов ответственных за высокий уровень изоформ иктохрома Р-450, метаболизируюших ПЛУ и ароматические амины и на X хроносоне маркерные гоны yellow и singed.

4 .Научно-практ.и.чвскля пначияоеть работы. Теоретическая значимость заключается в выяснении особенностей базальной экспрессии и индукции различных изоформ цитохрома Р-450 у резистентных л чувствительных лини дрозофилы под действием индукторов разных классов, включая гормоны насекомых.

Практическая значимость, работы заключается в конструкции линий D.malanogastßr, пригодных для скрининг«* ПЛУ и ароматических аминов, а также содержащих ати вещества сложных сносей.

Результаты работы могут иметь значение для оптимизации мониторинга генотоксических загрязнений окружающей среды и могут быть внедрены в практику скрининга в виде методических рекомендаций и научных публикаций.

5. Апробация работы состоялась 6 октября 1994 г. на совместной научной конференции лаборатории методов скрининга канцерогенов, отделения эпидемиологии опухолей, лаборатории канцерогенных веществ, лаборатории ингибиторов канцерогенеза и лаборатории механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенJaa ОНИ АМН РФ. Основные положения диссертации обсуждались на конференциях лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР, Ученом Совете НИИ канцерогенеза, Международной конференции "Биохимия и биофизика цитохрома Р-450 (Москва,1991), Международном Симпозиуме "Микроссмы и окисление лекарств" (Торонто, 1994).

в.QfobOM работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, использованных в работа, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. В работу включено 13

таблиц, 12 рисунков, включая в фото. Указатель литературы содержит 14 3 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНЗД^ ДИССЕРТАЦИИ

1.Материалы и методы исследования.. Основные химические соединения, использованные в работе как мутагены, субстраты и кофакторы нихросомного охмеления, растворители и ингредиенты питательных и физиологических сред к буферов были высокой степени чистоты. В работе использованы линии дрозофилы двух видов близнецов: D.aixulans и D.melanoyastcr. D.si/sulans: дикая линия Turku и 49 мутантныя линий, любезно предоставленные к.б.н. Е.М.Ховлновой (Институт молекулярной генетики АН СССР,Москва). D.inelanogastor: дикая линия Oregon R, полученная из банка линий Москлвского Государственного Университета: резистентная к пестицидам линия 91R, была лобазно предоставление Dr. F.E.Wurgler (University of Zurich, Switzerland); тенпературо-чувстзительная дефицитная по синтезу окднэона мутантная линия ecd* была получена из Mid-Anerican Drosophila Stock Center, Bowling Green State University, Ohio (USA), а также 2 линии используемые в тоста по индукции'соматического нозаицизма (у и (/ зп3) из разведения лаборатории нетодов скрининга Канцерогенов ОНЦ РАМН. Дл- генетического конструирования была использована линия с инверсиями запирающими кроссинговер (М, In(2L)Cy»In(2L) 22D1-2; 33F5-34Al/rn(2LR)bv/V1« In(2LR) 21C3-D1; 60Dl-2+In(21Л) 40F? 59D4-E1 : Xn(3L)Dkln(3L)69D3-E1; 70C13-Dl/In(3R)Mo=*In(3R)93D; 98F2-6) полученная из Института Биологии Гена (Посква), несуцая доминантные маркеры на второй (Су/Ри, загнутые гпарх крылья, коричневые глаза) и третьей хроносоме (D/Sb, ¡.лстопыреиныа на 45° крылья, короткие щетинки).

Мутагенность исследуемых соединений в соматических тканях определяли по частоте пятен yellow и singed в F^ при транс-положение

• t>.

маркерных генов (y++/+v ял3). Для изучения токсического действия ДДТ на имаго дрозофилы использовали стандартные сцинтиляционные пузырьки, на дно которых наносилось необходимое количество ДДТ. Для исследования токсического действия БП по 20 мух ссаживали в стандартный стаканчик с питательной средой содержащей необходимое количество БП.

При предобработке дрозофил индукторани наносили 200 мкл водного раствора или эмульсии ь 101 ДМСО (водного раствора v/v) соответствующего индуктора на поверхность культуры дрозофилы.

Выделение миьросомалыюй фракции из мух проьодили методой дифференцмиального центрифугирования (Арчикоп, 1973). Полученные супернатант я осадок михросои держали во льду и использовали для дальнейших исследований в течение I ч. Для спектрофотометрических и спектрофлуоромотрических методов исследования использовали соответственно приборы Aminco DW2a (США) н Hitachi-850 (Япония). Содержание цитохрома Р-450 измеряли о соответствии с методикой Onura f. Sato (1964). Активность бензпирен-гидроксилаэы и 7-этоксикумарин-О-деатилазы измеряли флуориметрически по Dehnen et al.(1973) и Patil et al.(1979), соответственно. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия стьодонта.

Электрофорез микросонных белков дрозофилы в полиакриламнднон геле выполняли по Laemmli .( 1970 ). Процедура имнуноблотинга проводилась в соответствии с H.Towbln et al. Денситометрия иммуноблотов на LKB денситометре проводилась для количественного анализа спектра изофорн цитохрома Р-450. Гемопротеиды идентифицировали по Thomas et al.(1976).

СПИСОК- СОКРАЩЕНИЙ:

АА

2-ААФ 4-ААФ

- ароматические амины

- 2-ацетиламинофлсорен

- 4-ацетилаиинофлоорен

- а-нафтофлавон

- аминофиллин

- бензо[а]антрацен

- бенэ(а)пирен

- бенз(е)пирен

АНФ АФ БА БП

Б(е)П

БПГ - бенэпиренгиДроксйлаза

БНФ - в-нафтофлавон

20ГЭ - 20-гидроксиэкдизон

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСК - додецилсульфат натрия

ДСН-ПАГЭ - электрофорез в полиакриламидном голе в присутствии ДСН.

ДТТ - дитиотреит

HMÖ - микросомные конооксигеназм

МоАт - моноклональные антитела

НАДф Н - никотинамид адениндинуклеотид фосфат

восстановленная соль На

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ППБ - пиперонил бутоксид

ПФД - перфтордекалин

ТСО - трангс-стильбеноксид

ТСРОВОР - (1.4-бис[2-(дихлоропи]3илилокси)]бонзон

ТФД - трифенилдиоксан

ФБ - фенобарбитал На

ЗДТА - этилендиаминтстраацетат

ЭКОД . - 7-этоксикумарин-О-деэтилаза

ЮГ - овешльный гормон III

2. результаты и обсуждение.

2.1. Исследование влияния, индукторов иитохрона P-4SQ на развития ррэофилн.

Одним из теоретически возможных способов псоыкиния увствительности дрозофилы в скрининге ароматических прокайцярогенов сллотся индукция цитохрома P-4S0, однако еще в 1935 году Vogel et 1.[13].показали, что молодые личинки дрозофилы чувствительны к оксическому действию ФБ. Это ограничивало возможности применения В, как индуктора ннкросомных монооксигсиаз, для повышения уэптпитольностн дрозофилы в исследованиях мутагенных соединений, оэтоиу, важно было исследовать ноханнэн токсического действия ФВ и ругих ннлуктороэ цитохрома Р-4 50 и их влияние на развитие дрозофилы а разных стадиях.

Наибольший токсический эффект ФБ на развивающихся личинок был биарухгсн при обработке личинок первого возраста.

D отлична от ФБ, гексобарбитал не задерживал развитие дрозофилы Табл. 1). Эти данные делают маловероятной связь токсического эффекта ФБ его возможный гипнотическим либо каким-нибудь другим воздействием на ервнуо систему.

Эффекты <>5 на развитие дрозофилы, очевидно, связаны с его способностью индуцировать систему ММО. Уровень активностей ММО индуцированный у личинок гексобарби'галом значительно ниже индуцированного ФЬ. Связь токсического действия ФБ с его способностью индуцировать ММО подтверждается токсическим эффектом других мощных индукторов подсемсйотва цитохрома Р-4 50 2В у млекопитающих - ПФД И ТСО (Табл. 1). В этом аспекте интересно также сравнить действие ТФД И ТСР080Р на развитие дрозофилы. оба соединения известны как сильные индукторы фенобарбиталового типа у грызунов. ТФД индуцирует активности ММО у ирис, но не у мышей. ТСРОВОР, наоборот, является индуктором ДЛЯ лышей, но не для крыс. В провиденных экспериментах развитие личинок сильно задерживалось ТФД, ко не ТСРОВОР (Табл. 1). Кроме того, БНФ и БА известные как очень слабые индукторы активностей ММО у О.яшЛаподавквг, не влияли на развитие личинок.

Таблица 1. Влияние гексобарбитала и индукторов цитохрома Р-450 на развитие дрозофилы.

Обработкаг

% выживания личинок от яиц до куколок

% яиц раз- % нераз-вившихся вившихся в имаго куколок

Задержка вылета, в днях®

Контроль (23)с

Гексобарбитал (8)

НехоЬагЫЪа1 (8)

ФБ 2.5% (6>

ПФД 5% (8)

ТСО 1% (8)

ТФД 0.1% (8)

ТСРОЗОР 0.1% (8)

БНФ 1% (8)

БА 1% - (8)

(8) 91.0+4.4

ФБ 2.5%+ ППБ (7)

ФБ 2.5%+ 20ГЭ (7)

ФБ 2.5% + АФ (7)

91.3+1.8° 89.0+1.9 83.6+2.3 38.2+8.1* 52.9+2.8 55.7+8.4® 38.9+.4 .5 82.8+3.3 83.3+4.4 85.0+3.0 83.3+5.6

14

53 .4+6.7 83.4+2.9®'? 81.2+3.2®'"

85.7+3.4 80.9+5.7 87.2+6.0 33.1+6.75 49.1+3.95 49.4+7.8* 37.3+5.0 77.8+2.9 82.7+3.1 81.3+3.5 .1±4.2

26.7+6.5Г

5.4+1.4 10.2+4.1 8.5+2.1 13.4+4.8 6.8+0.4 12.5+5.3 4.4+1.8 6.4+2.5 6.9+2.4 4.0+1.8

„ 54.4+10.0®'? 70.3+4.1®'" 15.1+2.6 63.4+4.2®'" 22.6+3.5®

0 0 4 2 2 4 0 0

0

4

1 1

ППБ 0.1

а - См. "Материалы и Методы"

Ь - В сравнении с контролем

с - В скобках - количество экспериментов

а - Каждое значение: среднее + Стандартная Ошибка

е - р<0.01,£ - р<0.001, к контролю по {¡-критерию Стьюдента.

д - р<0.01,Л - р<0.001, к обработанным только ФБ по С-критерию

Стьюдента..

Предположенная ответственность повышенного уровня активностей HMO в Сектах индукторов уитохрома Р-450 на развитие личинок согласуется с кпэанын частичным ингибированием летального эффекта ФВ с поморье гибитора цитохрома Р-450 у насекомых - ППБ, внесенного о питательную эду на следующий день после барбитурата (Табл. 1).

. Усиленный метаболизм эндогенных субстратов, в первую очередь гормона 1ьки насекомых, абсолютно необходимого на различных стадиях развития :акомых, может являться механизмом лежащим в »снопе действия 1УКТоров цитохрома Р-450 на :аэвитие дрозофилы. Е частности, мишенью "ут являться гормон линьки экдизон и его актиянии дериват погэ, габалнэируюцнеся В систене цитохрома Р-450. Зт;> гппотеиа утверждается экспериментами, в которых добавление в культуру, (добработанную ФБ, как 20ГЭ, так и аминофиг.лина, усиливаю,qero его »тез,.значительно ускоряло развитие личинок и повыпало их выживаемость |бл. 1).

Таким образом, эффект индукторов цитохрома Р-4 50 на развитие >эофилы, очевидно, связан с относительным дефицитом гормона линьки :еконых а клетках личинок и куколок из-ла ускоренной деградации этого >мона индуцированной системой ИМО.

3.2. Изучение индуцибс;льности различных и-зофорн цитохрома Р-450 >.ро?ллодгдд{:вг пол впияниен и других индукторов юбдрбиталового и метилхолантрянового типа.

Известно, что различные изоформы цитохрома Р-450 отличаются >стратной специфичностью. У дикой линии Oregon R обработанной ФБ были |дены различные типы кинетики индукции для активностей БПГ и ЭКОД. '¡юность ЭКОД, в отличие от БПГ, оказалась менее индуцибельна, и ее 1зень падал до контрольного уже через 48 часов после отмены индуктора блица 2). Можно предположить, что за активности ЭКОД и БПГ отвечают личные изоформы цитохрома Р-450, индуцированные 4>Б, и форма, ёчающая за ЭКОД, отличается пониженной стабильностью белка или мРНК.

Таблица 2. Кинетика фенобарбиталовой индукции активностей ММО в гомогенатах из нух чувствительной и резистентной к инсектицидам линий (Oregon R и 91R).

Дни экспозиции на ФБ Дни после экспозиции на ФБ

Актив- Обра- 1 2 3 ,1 2 .

нооть боткч

ЭКОДа

БПГ

ЭКОД'

БПГ

Control 0.1 wg/nl 1.0 r.g/nl 10.0 яд/ml . Control C.l iag/ml 1.0 rig/ml 10.0 ng/ml

1 Control

о. 1 sr.g/ml 10.0 тг.д/nl Control 0.1 r.g/ml 10.0 mg/nl

15.7+0, 1Г, .5+0, 1С. 1+1, 16.5^1, 19.8+0. 29.2+0, 4S.4+1. 53.7+0,

27.3+1, 24.4+0, 23.3+0. 3 8.8+1. 35.1+1. 6 2 . 4 + 5. 6C

15 21 26

32 21 28 72 59

24

25

33 39 46

121

Oregon R ,1+0.9 14.1+0

7+0.8^ 22.3+1 29.6+0

+0.1

5+1.3d

7+1.2d

2i л<3

4+2.4

35.1+1. 22.3+2.. 2+0.9C 54.5+4.2° 3+10.lc81.7+2.1°. 4 +3.7 114.9+6.8° SIR

5+1.3 24.6+1.2

9+1.4 , 3+1.4 0+2.3 3+3.9 4+10.4®

14 . 2±,2.7 16.1+0.3 12.9+1.0 21.4+1.4 27.4+0.6 40.7+0.7®

12.5+0.1 12.8+1.0 12.6+0.7 13.0+0.7 22.1+0.6 21.7+0.8 43.5+2.6

65.2+1.4 102.5+4.1° 41.6+2.6

22.9+2.5 33.5+1.3" 39.1+0.5 50.4+4.4 126.4+8.5®

а - Измерялась в пкмолях 7-гидроксикумарина/мин. на тд белка; Ь - Каждое значение: срелнее ± Стандартная Ошибка (из как минимум четырех отдельных экспериментов);

с ~ Измерялась в гг'колях з-гидроксибензо(а)пирена/мин. на вд белка; <3 - р<0.05 к контролю по С-критерию Стьюдента; в - р<0.01 к контроле по ^критерию Стьюдента.

В нескольких исследованиях, включая настоящее, показана более высокая индуцибельность системы цитохрома Р-450 ФБ у чувствительных к инсектицидам линий насекомых в сравнении с резистентными. Так как сана молекула ФБ, а не ее производные, индуцирует систему ММО у млекопитающих, возможно, что ФБ не способен индуцировать эту систему у резистентных линий из-оа его ¡повышенной деградации (резистентные к инсектициден линии обладают повышенным базальным уровнем активностей ММО). Другим объяснением этого явления может быть модификация механизм« контролирующего индукцию у резистентных к инсектицидам линий. В отличи« от ФБ, БП оказался значительно более эффективным индуктором системы цитохрома Р-450 у резистентной к инсектицидаь линии 91R чем у дихой Oregon R (Табл. 3). Было обнаружено, что содержание связанной о резистентностью к инсектицидам изоформы цитохрома Р-450 с иол. массой 56,000 значительно увеличивалось после обработки БП мух линии 91R (но i Oregon R). Это может быть связано с начальным эвеном индукции которое

отличается у ФЕ и БП. Как уже было сказано, у млекопитающих сака молекула ФБ, а на ее дериваты, ответственна за индукцию ММО. Напротив, ПАУ индуцируют эту систему своими метаболитами, обраэуюшимися в систлм* цитохрома Р-450. Таким образом, если это перко для дрозофилы, высокий баэальный уровень активностей НМО у мух резистентной к инсектицидам линии приводит к снижение уровня ФБ и повышенно уровня метаболитов БП, обладающих индуцирующими свойствами.

Таблица 3. Эффект различных индукторов на активности ККО в нинросомах из Drosophila aolexnogastor.

Линия Обра- Кол-во ботха экспериментов Активности ЭК0Да БПГЬ

Oregon R Контроль 9 47+1 144+7

ФБ 1 ng/mlc 7 107+4<J 504+27^

TCO 10reg/ralc 4 105+6° 348+18

ТФД 0.1reg/mlc 4 52+6 180+27

ТСРОВОР 0.1mg/nle 4 104+4 529+53

БП 0.2 ng/nl° 4 56+5 226+18

91R Контроль 7 105+4 233+15

ФБ 1 ид/ml 8 142111' 514+13Î

БП 0.2 ng/nl 6 232+24 447+19

а - Измерялась в пкмолях 7-гндроксикумарина/мин. на год белка, каждое значение: среднее + Стандартная Ооибка;

Ь - Измерялась в пкмолях 3-гидроксибензо(а)пнрвна/мин. на вд белка,

каждое значение: среднее + Стандартная Ошибка}

с - Обработка в твчение--72' чесов;

(1 - р<0.001 к контролю по ¿-критерию Стьюдента.'

в - Обработка в течение 20 часов

£ - р<0.01 к контролю по ^критерию Стьюдента.

Очень интересно, что ТФД и ТСРОВОР по-разному действовали на систему цитохрона Р-450. ТСРОВОР известен, ка мощный индуктор изоформ подсомойстпа цитохрома Р-450 2D (CYP20) у мыаей, но не у крыс. ТФД, напротив, является высоко ахтивным индуктором этих изоформ у крыс, но не у мыаей. В настоящем исследовании, ТСРОВОР на влиял на систему цитохрома Р-450 у линии Oregon R- (Табл. 3). Такким образом, индуцибельность системы ММО у D.raelanograster более похожа на индуцибельность у крыс чем у мышей. В связи с тем, что существует.множество примеров показывающих различия в канцерогенной активности соединений у этих двух видов

грызунов, эта находка может быть принята во внимание при сопоставлении ценных скрининга генотоксических проканцероганов на дрозофиле с их канцерогенным действием на грызунов.

Нмнуноблотаналиэ показал, что у чувствительной х инсектицидам линии

ТФД и, в меньшей степени, ТСО индуцировали изоферменты цитохрома Р-(50 с мол. массой 56,000 и 54,000, уровень которых конститутивно высок, у [»озистентной линии. Таким образом, у чувствительной линии индукторы ^онобарбиталового типа повыпали содержание изоформ цитохрома Р-450, :п«.-)чнных с резистентность» к инсектицидам.

индукции ...Г'п наа.ф<?рн ццтсхррнл ,Р-.4,Р0....у. лрух

При сравнении активностей ННО у мух резистентной к инсектицидам пинии D.aelartogaster 91R с мухами дикой линии Oregon R, было обнаружэно, что для первых БП является более сильным индуктором (Табл. 3). суооствует по крайней мере два bojmowhux объяснения »того фоыомока. У ■ млекопитающих БП индуцирует систему цитохрома Р-450 cûchmh йотаболитмш, которые связываются с белковым продуктом Ah локуса. Если подо:5нуй механизм существует у дрозофилы, то простейшим объясненная гхаыгзнпэЯ • индуцибельности у 91R, как уже упоминалось, ножат быть усь;л<ж1№г. наработка активных производных БП на высоком конститутивной уроино активностей НКО. Косвенные доказательства этого предположения представлены в Таблицо 4.

Относительно нечувствительная к действие БП линия Oregon К Р.melanogaster становится хорошо индуцируемой после предобработки Тйк.:п мощным индуктором ММО у дрозофилы как ФБ. Таким образом, индухц«.»с БП у V.melanogaster зависит от первоначального уровня активноетай КЖ>. -'гак ус как и у млекопитающих. Однако, другие известные индуктора F-

450 1А1 у млекопитающих такие как 2,3,7,8-тетрахлоррДибекго-р-ди;а:сип (TCDD), бенэо(а)антрацен и 3-метилхо^антрен не индуцировали НИО.у дрозофилы. Возможно, что БП индуцирует систему цитохрома Р-450 у

дрозофилы иначе чем у млекопитающих. Можно также предположить, что механизм индукции БП системы ММО у D.aelancxjaster похож на механизм индукции стероидами. Это возможно если исходить иэ некоторого стереохимического сходства молекулы БП с молекулой экднэона, Последний хорошо известен как индуктор системы ММО у насекомых. В этон случае можно предполагать наличие мутации в экдизон-зависимом локусе, регулирующем систему цитохрома Р-450 у 91R. Такая мутация может привести К повышению сродства этого локусп или ого продукта к БП, обеспечивая, таким образом, у этой линии высокую индуцибольность снствны НМО БП. Такой гипотетический нутантный локус может играть существенную роль в механизме метаболической резистентности дрозофилы к постицидам. Эта «лея может быть косвенно подтверждена результатами показывающими, что БП индуцирует связанные с резистентностью к инсектицидам изоформы цитохрома Р-450 - P-450B.

Хорошо известно, что за токсические, мутагенные и канцерогенные эффекты БП отвечают его метаболиты. У млекопитающих их образование связано с мэофорнаки подсемейства цитохрома Р-4 50 1А1, которые индуцируются БП.

Таблица 4. Действие БП на активности ММО в микросомах иэ предобработлнных ФБ мух линии Oregon R D.melAnogaster.

Группа Кол-во Обработка Активности

экспери- 1ый день 2ой день ЭКОДа БПГ

ментов пкмоль/мин на ид белка

Контроль 4 - _ 36+5^ 181+10

ФБ 4 ФБ, lmg/nl 59+6^ БЮ+б!*!

ФБ+БП 4 ФБ, Irag/nl БП, 0.lmg/nl 124+8 'в 733+80,а

а - Измерялась в пкмолях 7-гидроксикумарина; . Ь - Измерялась в пкмолях 3-гидроксибенэо(а)пирена; с - Каждое значение: среднее + Стандартная Ошибка; а -р<0.05 к контролю по С-критерию Стьюдента;

е - р<0.05 к предобработанной только ФБ группе по С-критерию Стьюдента;

Возможно, что у линии 9^ изоформы цитохрома Р-450В вовлечены в биоактивацию БП до его токсичных производных. Высокий базальный и индуцированный уровень форм Р-450В у 91И скорее всего ответственней за повышенную токсичность БП для этой линии по сравнению с другими.

Таким образом, было обнаружено, что одни и те же иэофорны цитохрома »'-450, относящиеся к группе Р-450В, возможно, ответственны и за резистентность к инсектицидам, и за чувствительность К БП. На основании >гого факта можно сдалать вывод, что линии О.ав1аподаеСвг резистентные к инсектицидам должны использоваться для скрининга проканцерогенов.

Кы показали, что экзогенный гормон линьки насекомых - экдизон (в отличие от ювенильного гормона) индуцирует изофорны цитохрома Р-450, ¡.-вязанные с резистентностью к инсехтицидам - Р-450В, у чувствительной иинии 0.та1апсдаи1аг (Таблица 5).

Таблица 5. Эффект 20-гидроксиэкдизона и ювенильного.сорион» на активности ММО и содержание цитохрома Р-450В у ку;; линии Oregon В.

Обработ-а Кол-во

Активность

Р-450В

экспериментов

ЭКОД

Ь

БПГ

Р-450Л + Р-450В

Контроль 4 /0-гидрокси- 4 экдизон

Пвенильный 4 г ормон

38 + 1° 79 + 2*

48+4

107+6 29С+1С

190+3

o.irt 0. it-

0.10

а - См. "Материалы и Методы".

Ь - Измерялась п пкмолях ?-гидроксикумарина/кин. но ид б.злка| с - Измерялась в пкнолях 3-гидроксибе!1зо(а)пи»зна/нин. на сд белка; с1 - Средние денситометрические данные полученные двойным сканированием иммуноблота показанного на Рис. 9. о - Каждое значение: среднее + Стандартная Ошибка; f - р<о.оо1 к контролю по Ь-критерию Стьюдента?

к л

На неперннссивной температуре (29°С), при которой л»' г O.лю2anogaster, несущие в гомозиготном состоянии кутгщкк у с; Л ¿гес?* к ХИЕО), перестают синтезировать экдизон, наблюдалось знач'и*.г.&дише содержания связанных с резистентностью иэофорн цитохрома Р-450 -(Табл. 6). однако, у линии 1КЕ0 остаточный уровень цитохроиа Р-450В бал

ьетэ, чем у ocrl1. Возможно, это результат более высокой стабильности у азистоитннх линиС описанной выше МРНК гена CYP6A2.

аблица 6. Эффект непермиссионой температуры на активности ИМО и одержамиа цитохрома Р-4 50В у мух различных линий D.ttelanogastar.

иния Тем-а кол-во Активность Р-450В

пера- зкспери- экод" БПГ Р-450А + Р-450В

тура ментоа

cd1 20°С 9 46+2® 150+6 0.13d

29°С 7 29+1 86+4 0.07

RED 20°С 12 67+3 39 + 2 201+14 0.28

29°С 10 116 + 5 0.15

1R 20°С 5 119+12 216+18 о.зй

29°С 4 107+11 236+23 0.39

regon R 20°С 6 40+4 149+7 0.10

29°С 4 41+6 159+12 0.11

- См. "Материалы и Методы".

- Измерялась в пкмолях 7-гидроксикумарина/мин. на шд белка»

- Измерялась в пкмолях 3-гндроксибензо(а)пирена/нин. на од белк«;

- Средние денситомотрические данные полученные двойным сканированием инуноблота показанного на Рис. 10.

- Каждоа значение: среднее + Стандартная Ошибка;

- р<0.001 к контролю по С-крнтерию Стьюдента»

Действие температурного сдвига на систему цитохрома Р-450 у линий и IRED кажется специфичным, так как он не выявляется у обеих линий з несущих ген ocd (Oregon R и 91R) (Таблица б). Это может означать, что ■«догонный экдизон поддерживает конститутивную экспрессию связанного с >зистентностыо к инсектицидам цитохрома Р-450В в обеих (чувствительной резистентной) линиях D.nelanogaster.

Механизм такой поддержки остается неясным. Хорошо известно, что :hobhjm механизмом плейотропных эффектов экдизона является активация >аннихи генов и грлнс-регулирующее действие их продуктов. Таким }разом, по крайней мере один из этих генов может быть экдиэон-1висимым. Возможно также, что гормон линьки насеконых играет важную >ль в механизмах резистентности к инсектицидам, что подтверждается ¡зультатами представленными в Таблице 7.

'•лица 7. Токсичность ДДТ (0.5 год/д.'аяв) на нух различных линий Ч.МЕЬЛХОС.ЖТЕИ.

Пиния Количество % мух выживших после 6

экспериментов часов экспозиции на ДДТ + БЕ

огедоп К 20 10 30+4

29 7 38+7

•ПК 20 9 85+3

29 9 88 + 2

20 10 24+3

29 9 16+2 а

1ВЕ0 20 10 73+4

29 8 48+5 а

а - р<0.001 к 20°С по (г-критерию Стьюдента

ЗЖПРЧМИЕ

Приведенные резучьтлты показывает существование значительны:: различий в нндуцибельности системы ККО различными индукторами фонобарбигаяоиого и метилхолантренового типа у резистентных и чувствительных к инсектицидам линий Р.то1аподавЬаг.

Эндогенные факторы экспрессии изоформ Цитохрона Р-4П, недостаточн изученные у млекопитающих, у дрозофилы не были ранее исследованы вообс Наши исследования по влияние экзогенных и эндогенных горнонов наезкош на экспресс»;» изоформ иитохрома Р-450 указывает на важную роль горкоме линьки насекомых - экдиэона э поддержании экспрессии изоформ цитохром; Р-450, связанных с резистентностью к пестицидам и чувствительностью к проканцерогенам, у чувствительных н резистентных к пестицидам линий дрозофилы. Таким образом, показана ключевая роль гормона линьки насекомых в механизмах чувствительности к проканцерогенаи и метаболической резистентности к инсектицидам.

Кроме того, было показано, что разруоение экдизона является естественным физиологическим барьером ограничивающим воэиожноетт' индукции у личинок цитохрона Р-450, а значит и возмо,.г,сс1 л чоэодвмия чувствительности личинок дрозофилы к лроканц:;рогеннын ПЛУ и

С другой стороны, изучение системы цитохрома Р-450 у лиг.ий резистентных к инсектицидам' является теоретическим обоснованней

более высокой чувствительности этих линий х токсическому и мутагенному действие полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и ароматических аминов. Это показывает принципиальную возможность оптимизации скрининга канцерогенов на дрозофиле с помощью линий, несущих гены ответственные за высокий уровень метаболической активации проканцерогенов у резистентных к инсектицидам линий D.r^e^aпogastor. Прежде тестирование на этом объекте ограничивалось низкой чувствительностью О.вю1аподавьог к мутагенному действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и ароматических аминов, ч.-о связано с отличным от млекопитающих метаболизмом этих соединений, в результате которого образуются преимущественно немутагенные метаболиты.

Применение полученных линий в практике скринига канцерогенов может существенно улучвить выявление генотоксических сойств ПАУ и эроиатнчэских аминов, а также генотоксического эффекта сложных смесей, содержащих подобные соединения.

Таким образом в рамках выполненного исследования были реяены как теоретические, так и практические задачи: в фундаментальном плане является важным, что развитие дрозофилы контролируется< в том числе, и системой цитохрома Р-450, а гормон линьки насекомых является основным фактором поддержки баэального уровня изоформ цитохрома Р-450, связанных с чувствительностью к проканцерогенам и резистентностью к пестицидам. Для прикладных исследований существенным является показанный нами факт, что ПАУ, и в их числе БП, являются хорошими индукторами активиру! дих их иооформ цитохром Р-450В у резистентной к инсектицидам линии, что явилось основой для создания новых тестерных линий.

1. Чувствительность дрозофилы к иутагоннону и токсическому действие НАУ определяется активностью цитохрома Р-450, о частности ого иэоформ { молекулярной массой 54,0 и 56,0 кДа, принадлежащих к подсемейству Р-150Р.

2. Впервые показано, что эндогенным индуктором иэоформ цитохрона Р-4*.>ов у дрозофилы является гормон линьки насекомых экднэои, разрупаюцийс при участии этих изофорн.

3. Развитие дрозофилы контролируется балансом ферментной октисности питохрома Р-4 50. Превышение критического уровня ферментной активности приводит к замедление развития и гибели личинок.

4. Индукторы цитохрома Р-450 замедляют развитие дрозофилы, что связано с относительным дефицитом гормона линьки насекомых в клетках личинок и куколок иэ-эл ускоренной деградации этого гормона индуцированными ферментами системы микросомных нонооксигеназ.

5. Показано, что одни и те же изоформы цитохрома Р-450 относящиеся к группе Р-450В ответственны и за чувствительность к бенэо(а)пирену, н за резистентность к инсектицидам.

6. Основным различием резистентных и чувствительных к ннсектнцидап линий дрозофилы являатсл уровень изофорн Р-450В: у резистентных он более висок, чей у чувствительных, что обуславливает более интенсивное разрушение проникших в клетку инсектицидов.

7. У чувствительной к инсектицидам линии дрозофилы Индукторы фенобарбиталового типа индуцируют активности КМО и изоферканты цитохрона Р-450 с мол. массой 56,000 и 54,000, уровень которых конститутивно высок у резистентной линии.

8. Впервые показано, что бенз(а)пирен является значительно более эффективным индуктором системы цитохрома Р-450 у рсзистачгаяй к инсектицидам линии чем у дикой, что делает первую более пригодной, лпа конструирования тестерных линий, направленных на обнаружение проканцерогенов типа ПАУ, чем вторую.

9. Впароыз обнаружено, что.дрозофил», подобно крысе, чувствительна к нндуцнрухлцаму действии трифонилдиоксана, но, в отличие от ныгм, оказалась нечувствительной к действие иидуктора Полпндг». Таким образом, система натаболизка ксенобиотиков у дрозофилы ближе к крысиной, чан к кыаиной, что следует принимать во внимание при сравнении результатов тестирования канцерогенов на дрозофила с реэультатгжи, полученными в опытах на грызунах.

Ю.Сконструнрованны и переданы на испытания тостврные линии D.polanogaater у/Ви wen3/R1/H2, несущие в гомозиготном сосгояннн нл П и III хромосомах весь комплекс гонов, ответственных за высокий /ропэнь метаболической активации промутагенов и маркерные нутантные гчны увИоы м singad на X хромосома.

Список работ, опубликованных ПО томядиссертации:

1. Фукс С.О., Шпигельнан B.C., Сафавв Р.Д., Хованова E.H., Белицкнй *.А. Предобработка бенз(а)пиреноя мутантной линии Drosaphila slmulana :ризодит к индукции абберрантной изоформы цитохрома Р-4 50 с повышенной гпособностьо мвтаболизировлть бонз(а)пирон//Болл.Оксп.Биол.н Мед..-1991. •■7.62.-Н°8. -С. 195-197.

2. Шпигольман B.C., Фукс С.Ю., Сафаев Р.Д..Белицкий f.А. ¡пвцифичность генотоксического действия канцерогенных ароматических :оединаний на nus-ггутантов дроэофилы//Билл.Эксп.Биол,и Мед.- 1991.-Г.62.-М°11.-С.521-523.

3. Fuchs,S.Yu., Spiegolman V.S., Safaev R.D., Belit3ky G.A. Drug setaboli2ing епгур.ез in Droaophlla 3inuZans/Cytochror5a P-450: lio'-hönistry and Biophyslcn1*, Archalcov A.I., Bachraanova G.I.,eds.,

INCO-TNC Joint Stock CO-., itoscow, 1992, P.513 - 515.

4-. Fuchs S.Yu., Safaev R.D., Khovanova Е.И., Ugnivenko H.G., ¡piegelman V.S., Lytcheva T.A., Khitrovo I.A., Belitsky G.A. "A )rosophlla simulans mutant strain sensitive to benzo(a)pyrene and 2-icatylaninofluorene". Mutation Res., 1992, v.268, 155-163.

5. Fuchs S.ïu., Spiegalman V.S. , Safaav R.D., Belitsky G.A. "Xenoblotica-metabolizing enzymes and benzo(a)pyrene netabolisn in ths baitzc(a)pyrene-sensitiva mutant strain of Drosophila simulans Mutation Res., 1992, y.269, 185-191.

6. Fuchs.S.ïu., Spiagelman,V.S., Belitsky,G.A."The effect o£ tha cytochrome p-450 system inducers on the dovalopxnent of Drosophila Bolanogastsr" Journal ot Biochemical Toxicology, 1993, v.8, 83-88.

7. S.Vu. Fuchs, V.S. Spiagelnan, R.I.Abdrjashitov„ G.A.Belitsky. "The induction of cytochrona p-450 foras with ban20(a)pyrono in two species of Drosophila: the role in susceptibility to DOT and benzofaJpyrene" Kxperia.Oncol., accepted. (In English).

6. S.Yu. Fuchs, V.S. Spiegeloan, G.A.Belitsky. "The inducibilityc various cytochrome p-450 isozymes by phénobarbital and soma other x^nobiotics in Drosophila stelanogastar." Biochesa.Pharmacol., Vol. 47, Ho. 10, pp. 1867-1873, 1994.

9. V.S. Spiagalman, S.Vu. Fuchs, G.À. Balitsky. "Molting horoona induces insecticide resistance-related forcts'of cytochro»a p-450 in Drosophila RBlanogaster." In: "10th International Syaposiun on Microsomes and Drug Oxidation", Toronto, July 18-21, 1994, p. 389.

Автор выражает сердечную благодарность научному" руководители доктч медицинских наук, проф. Геннадию Альтеровичу Белицхому за ценные соео-в процессе исследования.

Приношу глубокую благодарность канд.над.наук С.Ю.Фуксу, канд.биол.наук В.П.Шелепову и канд.иед.наук О.А.Павлишу га критичг.схг замечания при обсуждении результатов и методическую помощь.