Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Средства регуляции ферментативных систем детоксикации среди ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений

Актуальностьпроблемы Все живые существа наделены гемсодержащими ферментами, относящимися к суперсемейству цитохрома Р-450, в состав которого входит более 300 изоформ, способных катализировать, по крайней мере, 60 типов энзиматических реакций с участием сотен тысяч химических структур [161].

Главным биологическим назначением изоформ цитохрома Р-450 является регуляция уровня небелковых липофильных сигнальных молекул -регуляторов важнейших физиологических процессов (гормоны, жирные кислоты витамины А, простагландины, лейкотриены, биогенные амины), в метаболизме которых участвует цитохром Р-450-зависимая монооксигеназная ферментная система [159,161]. Кроме того, различные изоформы цитохрома Р-450 участвуют в детоксикации многих ксенобиотиков [5, 96, 99, 156, 112]. Наконец, цитохром Р-450 является универсальным хеморецептором и хемоанализатором широкого круга химических структур [30, 32, 144].

Следовательно, суперсемейство цитохромов Р-450 - одно из ключевых звеньев регуляции гомеостаза. Многочисленные патологические процессы сопряжены с изменением в организме соотношения различных изоформ гемопротеида [31, 32, 12, 103, 123, 147, 157].

Трудно переоценить значение фармакологической регуляции уровня эндогенных сигнальных молекул и процессов биотрансформации ксенобиотиков посредством воздействия на цитохром Р-450-зависимую монооксигеназную систему путем её активации (ферментативная индукция), или ингибирования (образование устойчивых, долгоживущих ферментсубстратных комплексов с цитохромом Р-450).

Таким образом, целенаправленный поиск новых оригинальных малотоксичных средств селективной регуляции активности монооксигеназной системы является актуальной проблемой фармакологии.

Совместными работами кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета и Проблемной лаборатории синтеза лекарственных веществ Томского политехнического университета установлено, что ряд ациклических и гетероциклических соединений мочевины взаимодействуют с микросомальным цитохромом Р-450 с образованием ферментсубстратных комплексов, а также обладают индуцирующими свойствами в отношении монооксигеназной системы печени [4, 61, 68, 50].

Основная часть работы выполнена на кафедре фармакологии Сибирского государственного университета (Томск). Отдельные фрагменты - на базе Института молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН (Новосибирск) и кафедре общей химии Алтайского технического университета.

Цель исследования - Изучение влияния (активирующего или ингибирующего) различных классов ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений на монооксигеназную систему печени; разработка и экспериментальная проверка новой оригинальной методологии внеэкспериментальной оценки свойств соединений разных классов, отличающихся по структуре, размерам и форме молекулы, как лигандов цитохрома Р-450, и конструирования новых лигандов с рассчитанным уровнем сродства к гемопротеиду (целенаправленный поиск активаторов и ингибиторов монооксигеназной системы печени).

Задачи исследования :

1. Скрининг индукторов метаболизма ксенобиотиков среди различных классов азотсодержащих соединений ациклической и гетероциклической структуры по их влиянию на монооксигеназную систему печени.

2. Углубленное изучение наиболее активных ферментиндуцирующих препаратов с установлением типа индукции и исследованием их влияния на II фазу микросомальной биотранформации.

3. Исследование процессов взаимодействия азотсодержащих соединений - аминов, амидов, мочевин, азепинов, изоинДолов, барбитуратов, имидазолов, триазолов, гликолурилов с цитохромом Р-450 микросом печени крыс.

4. Построение с помощью оригинального КССА-метода фронтальных многоугольников количественных моделей влияния структурных параметров исследованных соединений на процессы комплексообразования с цитохромом Р-450. На основе полученных данных сконструировать и синтезировать лиганды цитохрома Р-450 с желаемыми значениями Kg, оценить качество прогноза.

5. Изучение влияния соединений, полученных de novo, на основные параметры монооксигеназной системы печени крыс и активность ферментов II фазы биотрансформации в сравнении с фенобарбиталом.

Научная новизна: Впервые проведен скрининг ферментиндуцирующей активности среди 182 ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений с последующим анализом взаимосвязи их биологической активности и физико-химических свойств; проведено углубленное изучение ферментиндуцирующих свойств и установлен тип ферментативной индукции наиболее перспективных соединений (бензгидрилмочевин, азепинонов, имидазолинонов, гликолурилов).

Исследованы процессы комплексообразования ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений с микросомальным цитохромом Р-450. С помощью оригинального КССА-метода «фронтальных многоугольников» построены количественные модели взаимосвязи структуры исследованных соединений со степенью их сродства к цитохрому Р-450.

На основе полученных закономерностей сконструированы, синтезированны, и экспериментально исследованы новые производные мочевины (фенил-а-этил-М'-ацетилмочевина, фенил-а-изобутилмочевина, М-фенил-М'-бензилгликолурил) с заранее рассчитанным сродством к микросомальному гемопротеиду, оказывающие активирующее или ингибирующее влияние на каталитическую активность монооксигеназной системы печени.

Научно-практическая ценность работы: Получены малотоксичные соединения (М-фенил-М'-бензилгликолурил, фенил-а-дифенилметилмочевина и дибензгидрилмочевина) перспективные для регуляции монооксигеназной системы печени, в низких дозах они превосходят эталонный индуктор фенобарбитал по ферментиндуцирующим свойствам, а в более высоких дозах вызывают длительное ингибирование каталитической активности цитохрома Р-450 1п У1УО.

Предложена и экспериментально проверена новая методология внеэкспериментальной оценки свойств соединений разных классов, отличающихся по структуре, размерам и форме молекулы, как лигандов цитохрома Р-450, и конструирования новых лигандов с рассчитанным уровнем сродства к гемопротеиду, а также целенаправленного поиска активаторов и ингибиторов монооксигеназной системы печени.

Получено 6 авторских свидетельств и патентов на изобретения.

Апробация работы: Материалы исследований доложены на следующих научных форумах: 8

III И IV Национальные Конгрессы «Человек и лекарство» (Москва, 1996; 1997); XII Интернациональный Конгресс по фармакологии (Монреаль-Квебек), 1994); Всероссийской конференция молодых ученых «Математическое моделирование в естественных науках» (Пермь, 1998); VI Всесоюзный Съезд фармакологов (Ташкент, 1988); I Съезд Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); VII Международная конференция по биохимии и биофизике цитохрома Р-450 (Москва, 1991); Всесоюзные конференции по цитохрому Р-450 (Новосибирск, 1987; Ялта, 1989); конференции по физиологии пищеварения (Тернополь-Львов, 1986; Томск, 1989); конференции по поиску биологически активных соединений (Купавна, 1989, 1990, 1992); Межреспубликанская конференция по фармакологии (Волгоград, 1989); Региональная конференция фармакологов Сибири и Дальнего Востока (Томск, 1987); Научно-практические конференции Сибирского государственного медицинского университета (1990, !988, 1989, 1990, 1991); II, III итоговые конференции научно-производственного объединения фармакологов (Томск, 1988, !990).

Публикации по теме диссертации.

По теме диссертации опубликовано 39 работ в отечественных и зарубежных журналах, материалах конгрессов, съездов, конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав с изложением результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц, 20 схем, 20 рисунков, список литературы содержит 84 отечественных и 121 иностранных источника.

208 6. ВЫВОДЫ:

1. В результате скрининга индукторов монооксигеназной системы среди 182 азотсодержащих соединений различных классов ациклической и гетероциклической природы и анализа их структур, у веществ, проявляющих ферментиндуцирующую активность, установлены следующие особенности: наличие фенилалкиламидной группы Ph-C-CO-N- (характерно для барбитуратов, пиримидинов); присутствие одновременно 2-х фенилалкилами-ноацильных групп Ph-C-N-C = 0 (характерно для ациклических мочевин, бенз-гидриламидов, производных изоиндола, хиназолинонов, моно- и бициклических мочевин); наличие 1,2-дифенилэтанового фрагмента Ph-C-C-Ph- (характерно для бициклических и моноциклических мочевин, производных имидазола); присутствие бензгидрильной или бифенильной групп в ациклической или циклической форме; наличие связей с явно выраженными электронакцепторными свойствами гетероатома

2. Активные представители ациклических мочевин (бензгидрилмочевина и ее мета-хлор-замещенное производное), азагетероциклов (азепины, гликолу-рилы, имидазолинон) вызывают у крыс значительное увеличение содержания цитохрома Р-450 и повышение активности НАДФН-зависимой цитохром-Р-450-редуктазы в микросомах печени, ускорение метаболизма субстратов, изменение иммунохимических и электрофоретических свойств микросомальных белков характерное для ФБ-типа индукции. Указанные ациклические мочевины и азагетероциклы повышают активность микросомальной глутатион-S-трансферазы печени крью.

3. Исследованные азотсодержащие соединения взаимодействуют с мик-росомальным фенобарбиталиндуцированным цитохромом Р-450 печени крыс, образуя фермент-субстратные комплексы с дифференциальными спектрами поглощения, характерными для I или 11 типа связывания. Тип комплексообразо-вания исследованных соединений с фенобарбиталиндуцированным цитохро-мом Р-450 определяется наличием в структуре их молекул атома азота с непо-деленной электронной парой, стеденью её делокализации (величиной заряда атома азота) и стерическими параметрами молекул.

4. С помощью нового КССА-метода «фронтальных многоугольников» разработана методология внеэкспериментальной оценки свойств соединений разных классов, отличающихся по структуре, размерам и форме молекулы, как лигандов цитохрома Р-450 и конструирования новых лигандов с рассчитанным уровнем сродства к гемопротеиду. Построены количественные модели взаимосвязи структурных параметров исследованных азотсодержащих соединений и степени их сродства {Ks) к фенобарбиталиндуцированному цитохрому Р-450 микросом печени крыс с хорошей прогнозирующей способностью.

5. На основе полученных количественных моделей "структура - константа диссоциации", с использованием наиболее значимых молекулярных фрагментов исследованных соединений, сконструированы новые лиганды мик-росомального фенобарбиталиндуцированного цитохрома Р-450 печени с заранее рассчитанным уровнем сродства (Ks) к гемопротеиду: фенил-а-этил-N'ацетилмочевина, фенил-а-изобутилмочевина, М-фенил-М'-бензилгликолурил и осуществлен их синтез.

6. Полученные de novo соединения образуют ферментсубстратные комплексы с фенобарбиталиндуцированным микросомальным цитохромом Р

450 по I или II типу с низкими значениями Ks, что подтверждает прогноз их свойств, сделанный методом фронтальных многоугольников. Данные соединения, а также отобранные ранее лиганды с высоким сродством к микросомальному гемопротеиду: фенил-а-дифенилметилмочевина, дибензгидрилмочевина и м-нитробензоиланилид дифеновой кислоты ингибируют in vitro каталитическую активность фенобарбиталиндуцированного микросомального цитохрома Р-450 печени крыс в отношении метаболизма аминопирина, бензфетамина, 7-пентоксирезоруфина.

7. В условиях in vivo фенил-а-этил-М'-ацетилмочевина, фенил-а-изобутилмочевина и м-нитробензоиланилид дифеновой кислоты являются короткодействующими ингибиторами монооксигеназной системы, без последующей активации антитоксической функции печени. М-фенил-М'-бензилгликолурил, фенил-а-дифенилметилмочевина и дибензгидрилмочевина при введении крысам, в зависимости от дозы и схемы введения, вызывают либо продолжительное ингибирование каталитической активности монооксигеназной системы печени, либо её значительную активацию характерную для ФБ-типа индукции, повышают активность микросомальной глутатион-8-трансферазы и УДФ-глюкуронилтрансферазы печени.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Идея регуляции гомеостаза путем воздействия на уровень и каталитическую активность цитохрома Р-450 существует относительно давно. Так, А. Соп-пеу (1967) более 30 лет назад предлагал использовать феномен индукции цитохрома Р-450. В настоящее время известно, что цитохромы Р-450 в виде различных молекулярных изоформ, на основе нуклеотид/аминокислотной последовательности, объединены в различные семейства и подсемейства и составляют суперсемейство цитохромов Р-450, различающихся по своей субстратной специфичности и биологической роли. Анализ литературных данных свидетельствует, что цитохромы Р-450, участвуя в биотранформации различных физиологически важных эндогенных веществ (гормоны, витамины, биогенные амины, простогландины, холестерин), а также ксенобиотиков, являются важным регуляторным звеном, необходимым для контроля и поддержания жизненно важных процессов в организме. Наибольщее содержание цитохромов Р-450 различных семейств наблюдается в печени, которая занимает ведущее место в биотранформации как ксенобиотиков, так и эндогенных субстратов.

По современным представлениям перспективной представляется регуляция гомеостаза путем влияния на цитохром Р-450-зависимую монооксигеназ-ную систему с помощью низкомолекулярных органических веществ. В этом аспекте существуют два возможных подхода :

Во-первых, - обратимое увеличение уровня различных форм гемопро-теида в гепатоцитах путем его генетической индукции. Выявлено большое количество индукторов цитохрома Р-450, которые, в зависимости от механизма действия и способности вызывать экспрессию определенного подсемейства генов, кодирующих синтез индуцибельных форм Р-450, делятся на индукторы МХ-, ФБ-, РОЫ- и клофибратного и других типов. Наиболее изученными в качестве потенциальных лекарственных средств на различных моделях патологии печени с нарушениями её антитоксической функции, безопасными (с точки зрения стимуляции метаболизма проканцерогенов и промутагенов), а так же и клинически апробированными (фенобарбитал, зиксорин, бензонал) являются индукторы ФБ-типа. Введение их сопровождается значительным (в десятки раз) увеличением содержания цитохромов Р-450 подсемейства ИВ в микросомах печени лабораторных животных и человека. При этом многократно возрастает скорость метаболизма различных субстратов, поскольку цитохромы данного подсемейства обладают широкой субстратной специфичностью, обусловленной гибкостью их субстратсвязывающего центра. Следовательно, индукторы ФБ-типа могут быть использованы для восстановления нарушенной антитоксической функции печени, при различных заболеваниях (интоксикации промышленными ядами, инфекции, лекарственные поражения, холестаз), а также с целью ускорения биотрансформации некоторых лекарственных средств, что может приводить к снижению их токсичности или усилению фармакологического действия (пролекарства). Кроме того, индукция ФБ-типа может быть использована для регуляции уровня в организме некоторых эндогенных веществ, таких как стероидные гормоны, глюкокортикоиды, арахидоновая кислота.

К сожалению, выбор индукторов ФБ-типа невелик, при этом фенобарбитал и бензонал обладают различными видами побочного действия, зиксорин -недостаточно эффективен и вызывает задержку оттока желчи.

Во-вторых, - обратимое ингибирование каталитической активности отдельных форм цитохрома Р-450 различными ксенобиотиками, которые, взаимодействуя неизмененной молекулой с субстратсвязывающим центром (конкурентный тип) или с гемовой группой (неконкурентный тип), препятствуют окислению субстратов цитохрома Р-450. Напомним (см. обзор литературы), что ци-тохромы Р-450 принимают непосредственное участие в синтезе и контроле уровня эндогенных регуляторных соединений в организме, а развитие ряда заболеваний (нарушения гормонального обмена, холестеринозы, аллергии, онкозаболевания) может быть связано с изменением соотношения и каталитической активности различных изоформ Р-450 в печени и других тканях. Кроме того, как известно, метаболизм проканцерогенов и химический канцерогенез у экспериментальных животных и человека в значительной степени связан с каталитической активностью различных форм этого гемопротеида. Очевидно, ксенобиотики ингибирующие каталитическую активность цитохромов Р-450, перспективны для клинического применения в качестве средств регуляции гомеостаза.

Таким образом, поиск вьюокоэффективных и малотоксичных средств регуляции гомеостаза - индукторов и ингибиторов монооксигеназной системы является актуальной задачей фармакологии.

Согласно литературным данным [165, 166, 15, 203, 117, 1 18, 1 19, 173, 151, 197, 183] значительное количество веществ, влияющих на монооксигеназ-ную систему печени (индукторов и ингибиторов), относится к азотсодержащим соединениям ациклической и гетероциклической структуры.

В ходе совместных исследований кафедры фармакологии СГМУ и Проблемной научно-исследовательской лаборатории синтеза лекарственных веществ ТПУ было синтезировано более 300 ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений разнообразной структуры - производных мочевины, амидов, аминов, обладающих широким спектром биологической активности. Эти соединения были использованы нами для изучения их влияния на систему цитохрома Р-450 печени экспериментальных животных.

Проведен скрининг ферментиндуцирующей активности более 180 соединений в отношении монооксигеназной системы печени белых беспородных мышей-самцов. Известно, что о состоянии мононоксигеназной системы печени и каталитической активности отдельных изоформ цитохрома Р-450 in vivo можно судить по продолжительности действия различных ксенобиотиков - типичных субстратов цитохрома Р-450. Для оценки влияния азотсодержащих соединений на монооксигеназную систему печени мы использовали гексобарбитал, ускорение метаболизма которого характерно для ФБ-типа индукции. Продолжительность сна животных под влиянием гексобарбитала является мерой его окисления [72, 114]. Таким образом, по изменению продолжительности гексо-барбиталового сна животных можно судить о характере влияния ксенобиотиков на монооксигеназную систему печени.

Исследование влияния ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений различных классов на монооксигеназную систему экспериментальных животных (мышей и крыс) свидетельствует, что в каждом из изученных классов присутствуют соединения, вызывающие достоверное укорочение продолжительности гексобарбиталового сна и увеличение содержания микросо-мального цитохрома Р-450, т.е. проявляющие ферментиндуцирующую активность в отношении монооксигеназной системы печени. При этом, в исследованных рядах изменение структуры азотсодержащего или углеводородного фрагментов сопровождалось изменением (повышением или снижением) активности соединений. Сравнение фрагментарного состава молекул изученных соединений позволяет выделить у них некоторые особенности структуры, важные для проявления ферментиндуцирующей активности: а) наличие фенилалкиламидной группы Ph-C-CO-N- в структуре активных барбитуратов, пиримидинов; б) присутствие одновременно 2 фенилалкиламиноацильных групп Ph-C-N^ = 0 в структуре ациклических мочевин, бензгидриламидов, производных изоиндола, хиназолинонов, моно- и бициклических мочевин; в) 1,2-дифенилэтановый фрагмент Ph-C-C-Ph- в структуре активных би-циклических и моноциклических мочевин, производных имидазола; г) наличие бензгидрильной или бифенильной групп в ациклической или циклической форме; д) наличие связей с явно выраженными электроакцепторными свойствами гетероатома; е) среди соединений, проявляющих активность, отсутствуют соединения с выраженными гидрофильными свойствами.

Поскольку укорочение продолжительности действия гексобарбитала под влиянием ксенобиотиков позволяет предположить ФБ-тип индукции, мы исследовали каталитическую активность и иммунохимические свойства микросо-мального цитохрома Р-450 печени после введения крысам некоторых наиболее перспективных ациклических (бензгидрилмочевина и мхлорбензгидримочевина) и гетероциклических (азепиноны, изоиндолы, гликолу-рилы, имидазолиноны, хиназолиноны) азотсодержащих соединений в сравнении с фенобарбиталом.

Ациклические мочевины - бензгидрилмочевина (БГМ) и ее мета-хлор-замещенное производное (мета-хлорБГМ), так же как и фенобарбитал, вызывают достоверное увеличение содержания микросомального цитохрома Р-450 в печени крыс. Иммунохимический анализ и исследование каталитической активности в отношении метаболизма алкоксирезоруфинов показывает, что БГМ и мета-хлорБГМ, так же как и ФБ, вызывают статистически значимое увеличение содержания формы цитохрома Р-4502В1/2В2, что характерно для ФБ-типа индукции.

Вместе с тем, мета-хлорБГМ, судя по увеличению содержания цитохро-ма Р-4501А1/1А2 и повышению скорости метаболизма 7-этоксирезоруфина, проявляет одновременно и все признаки индуктора МХ-типа.

Таким образом, замещение индуктора ФБ-типа — бензгидрилмочевины по мета-положению вызывает появление свойств индуктора МХ-типа.

Проведенными ранее исследованиями галобифенилов было показано, что они, в зависимости от геометрии молекулы (взаимного расположения фе-нильных планов), проявляют свойства индукторов ФБ- или МХ-типа [80].

В то же время наши конформационные расчеты оптимальной геометрии бензгидрилмочевин показывают, что введение заместителя в мета-положение бензгидрилмочевины существенным образом не изменяет геометрию как бенз-гидрильного, так и карбамидного фрагментов. Следовательно, качественное изменение индуцирующих свойств бензгидрилмочевины при введении заместителя в мета-лоложение не определяется в явной форме геометрией молекулы.

Среди исследованных азагетероциклов, наиболее выраженное, сравнимое с фенобарбиталом, индуцирующее действие на монооксигеназную систему печени крыс оказывают азепины, гликолурилы, а также имидазолинон (Схема 6,7; табл. 16-20). Производные изоиндола менее активны. Хиназолин не влияет на продолжительность сна.

Введение крысам активных соединений сопровождается достоверным увеличением содержания цитохрома Р-450 и повышением активности НАДФН-зависимой цитохром-Р-450-редуктазы в микросомах печени. Наиболее заметное увеличение содержания гемопротеида наблюдается под воздействием азагетероциклов (азепинонов, гликолурилов, имидазолинона). Дигидроизоиндоли-ноны слабее влияют на содержание цитохрома Р-450. При введении хиназоли-на не наблюдается увеличения содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс.

Влияние гетероциклов 1-Х (Схема 6-7) на каталитическую активность мик-росомального цитохрома-Р-450 печени исследовали в отношении метаболизма следующих субстратов: аминопирина, анилина и алкоксирезоруфинов.

Азагетероциклы I—VI, так же как и фенобарбитал, вызывают значительное возрастание скорости 0-деалкилирования 7-пентоксирезоруфина. При этом введение азепинов сопровождается ускорением деалкилирования и 7-этоксирезоруфина.

Проведенный иммунохимический и электрофоретический анализ микро-сом печени крью, получавших соединения 1-Х, также свидетельствует об интенсивном образовании в печени крыс формы цитохрома Р-450, соответствующей по своим каталитическим, иммунохимическим свойствам и молекулярной массе основной фенобарбиталиндуцируемой форме CYP2B1 и, следовательно, фе-нобарбиталовом типе индукции; наиболее активны соединения I-VI. Азагетеро-циклы 1-111, судя по ускорению метаболизма 7-этоксирезоруфина и результатам иммунохимического анализа, очевидно проявляют и свойства индукторов МХтипа. Исключение составляет хиназолинон X, действие которого на моноокси-геназную систему мышей, повидимому, является видоспецифичным.

Гетероциклы I-VI, также как и фенобарбитал, вызывают активацию мик-росомальной глутатион-8-трансферазы.

Практически в каждом из исследованных классов ациклических и гетероциклических азотсодержащих соединений присутствуют вещества, проявляющие свойства ингибиторов цитохрома Р-450. Согласно литературным данным, ингибирование цитохрома Р-450 ксенобиотиками обусловлено их взаимодействием с активными центрами гемопротеида и образованием ферментсубстрат-ных комплексов [151, 152, 188]. Кроме того, известно, что первоначальный период после введения индукторов ФБ-типа характеризуется ингибированием мо-нооксигеназных активностей печени экспериментальных животных вследствие образования ферментсубстратных комплексов ксенобиотиков с цитохромом Р-450. Ряд авторов [49, 124, 174] в механизме действия индукторов ФБ-типа выделяют этап прямого взаимодействия с гемопротеидом и наличие в их действии периода ингибирования цитохрома Р-450, который затем сменяется индукцией.

Дальнейшие исследования процессов взаимодействия азотсодержащих соединений с микросомальным цитохромом Р-450 печени методами in vitro убедительно показали, что соединения как ациклической, так и гетероциклической природы взаимодействуют с микросомальным цитохромом Р-450 печени, образуя спектрально регистрируемые ферментсубстратные комплексы с характерными дифференциальными спектрами поглощения. При этом, тип комплек-сообразования определяется структурными параметрами соединений: их сте-рическими и донорно-акцепторными характеристиками. Углеводороды - дифе-нилметан и дифенил, не содержащие атомов азота с неподеленной электронной парой, дают спектральные изменения I типа, что свидетельствует об их связывании с апопротеиновой частью гемопротеида. Введение в состав молекулы атомов азота с НЭП как в ациклической (амины, амиды, мочевины), так и в гетероциклической форме (азепины, имидазолы, триазолы) приводит к появлению спектральных изменений II типа, в результате их взаимодействия с гемо-вой частью фермента. Однако, азотсодержащие соединения - барбитураты, пиримидины, некоторые производные бензилмочевины, дифениламина, фенок-сазины, гликолурилы, молекулы которых также содержат НЭП, являются субстратами I типа. Как уже было отмечено выше, данные экспериментальные факты обусловлены делокализацией НЭП и стерическим экранированием НЭП, что может препятствовать эффективному взаимодействию с ионом FeA"A гема.

В каждом из исследованных классов азотсодержащих веществ содержатся субстраты I и II типа с высокими (Ks=10"''-10"®M) значениями сродства к микросомальному фенобарбиталиндуцированному цитохрому Р-450 печени, что обусловливает перспективность поиска ингибиторов цитохрома Р-450 в данных рядах ксенобиотиков.

Таким образом, в результате проведенного исследования влияния азотсодержащих соединений различных классов на монооксигеназную систему печени экспериментальных животных методами In vivo и In vitro установлено:

1. Ряд ациклических и гетероциклических ксенобиотиков: бензгидрилмо-чевины, гликолурилы, азепины, имидазолиноны, изоиндолы, судя по их влиянию на содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени, его каталитические и иммунохимические свойства, являются индукторами ФБ-типа.

2. Азотсодержащие ксенобиотики различных классов взаимодействуют с микросомальным фенобарбиталиндуцированным гемопротеидом с образованием спектрально регистрируемых ферментсубстратных комплексов. В зависимости от структуры, данные соединения взаимодействуют как с гемом, так и с апопротеином.

3. Ферментиндуцирующая активность исследованных азотсодержащих соединений, а также их способность взаимодействовать с микросомальным ци-тохромом Р-450 изменяются в зависимости от структуры и физико-химических свойств соединений. Вместе с тем, выявленные отдельные закономерности носят частный характер и не позволяют обнаружить взаимосвязи "структура-свойство", объединяющие весь массив веществ

Одним из способов оптимизации и повышения эффективности поиска новых БАВ является выявление количественных закономерностей влияния структуры и физико-химических свойств веществ на их биологическую активность (КОСА) и конструирование новых БАВ на основе установленных соотношений "структура-активность". Эффективность установления КОСА для структурно разнородных соединений в основном зависит от взаимного соответствия сравниваемых параметров и от выбора метода анализа. Известно, что конечный эффект действия любого БАВ в значительной степени определяется сродством его молекул к специфической биомакромолекуле. Следовательно, структурные параметры молекул БАВ (донорно-акцепторные характеристики, основность, лабильность или жесткость конформации) необходимо соотносить с молекулярными характеристиками биологической активности, например, с параметрами взаимодействия со специфическими рецепторами или участками ДНК, но не с параметрами, характеризующими реакцию целого организма на БАВ. Кроме того, выраженность и продолжительность действия БАВ зависит от его фарма-кокинетических характеристик: биодоступности и продолжительности нахождения в организме.

Согласно полученным нами экспериментальным данным, ряд азотсодержащих соединений сокращает продолжительность гексобарбиталового сна, а их структурные аналоги пролонгируют снотворное действие гексобарбитала, что возможно, обусловлено ингибированием ими цитохрома Р-450. Кроме того, на примере структурно близких ациклических мочевин (Рис. 16): бензил мочевины, бензгидрилмочевины и флуоренилмочевины было показано, что незначительное изменение структуры может сопровождаться изменениями в фармакокине-тике и в ферментиндуцирующей активности соединений. Следовательно, использование продолжительности гексобарбиталового сна (как реакции целого организма) в анализе взаимосвязи «структура - активность (ответ целого организма)» не позволяет выявить общие закономерности и количественные соотношения между структурой исследованных ксенобиотиков разных классов и их способностью влиять на монооксигеназную систему печени экспериментальных животных.

В тоже время при исследовании комплексообразования различных ли-гандов с цитохромом Р-450 отсутствует необходимость учета различных факторов, характерных для целого организма (скорость и полнота всасывания, динамика концентраций, скорость выведения). Константы диссоциации, как показатели прочности образующихся фермент-субстратных комплексов являются прямым отражением взаимодействия «лиганд-молекула цитохрома Р-450», которое можно считать аналогом «лиганд-рецепторного» межмолекулярного взаимодействия. На этой основе возможно построение строгих количественных моделей «структура-свойство (К5)».

Чрезвычайно важным в КССА-анализе является выбор метода построения количественных соотношений «структура-активность». Известно довольно много методов установления КССА. Молекулы исследованных нами соединений различаются по фрагментарному составу, конформации и объему, что не позволяет проводить КССА-анализ классическими методами (Фри-Вильсона и Хэнша) и в рамках гипотезы о биологическом эффекте как результате лиганд-рецепторного взаимодействия по типу «ключ - замок» требует учета трехмерной структуры молекул [73, 74].

В своей работе для построения КССА мы использовали метод фронтальных многоугольников (ФМ) [73, 74], в котором комплементарность рецептору молекул различной структуры трактуется как локальное трехмерное подобие. Поэтому метод ФМ применим к сериям соединений разных классов, молекулы которых заметно отличаются по размерам и форме.

Отличительная черта метода ФМ состоит в замене реального рецептора набором участков структуры (мультиплетов), содержащих центры активности (Ь4А). Мультиплеты представляют собой «отпечатки», снятые с приблизительно планарных периферийных граней молекулы, в значительной степени обладающей заданным видом биологической активности. С другой стороны, отдельные мультиплеты должны быть комплементарны участкам рецептора и в совокупности могут рассматриваться как его модель, получаемая более простым и менее субъективным путем, чем при построении воображаемого рецептора.

С использованием метода ФМ мы проанализировали данные о влиянии структурных параметров исследованных нами соединений на величины Кв их комплексов с фенобарбиталиндуцированным цитохромом Р-450 микросом печени крыс и построили количественные модели «структура - константа диссоциации» обладающие хорошей прогнозирующей способностью.

Построение с помощью метода ФМ удовлетворительных КССА-моделей в широком ряду структурно разнообразных соединений стало возможным благодаря наличию сходных локальных участков структуры, несмотря на существенные разлия в их молекулярной структуре в целом. Сходство в данном случае подразумевает не только локальное геометрическое подобие, но и подобие в распределении электронной плотности, а также достаточно близкое совпадение характеристик заместителей - их объема и гидрофобных свойств. С этих позиций молекулы индукторов ФБ-типа можно рассматривать как структурно разнообразные в целом, но имеющие сходные локальные участки структуры, комплементарные одному и тому же «гипотетическому» рецептору.

Очевидно, что исследование влияния структурных параметров соединений на их биологическую активность в значительной степени обусловлено возможностью использования выявленных закономерностей для направленного поиска и создания новых БАВ, иными словами для решения обратной задачи изучения взаимосвязи структура - свойство, т.е. дизайна новых соединений, обладающих желаемыми характеристиками (биологическими или физико-химическими).

В методе ФМ определяется вклад (вес W\) каждой из жёстких субмолекул (мультиплетов) данного соединения в величину его биологической активности, т.е. в значение рКл (табл. 28). Веса Wi обладают свойством аддитивности, поэтому используют набор молекулярных фрагментов с наиболее высокими И//,. Задача конструирования состоит в сочленении фрагментов таким образом, чтобы: а) в целевой молекуле достигалась значительная сумма весов фрагментов, являющаяся прогнозом биологической активности; б) окружение каждого фрагмента в целевой молекуле было близко к окружению этого фрагмента в соединении из исходного ряда.

Для решения задачи конструирования мы использовали эффективный алгоритм, позволяющий учесть оба приведенных выше условия оптимальности (структурное и биологическое).

Исходными рядами послужили наборы соединений, являющихся субстратами цитохрома Р-450 I и II типа, образующие с микросомальным гемопротеи-дом устойчивые фермент-субстратные комплексы.

На основе полученных количественных моделей «структура-константа диссоциации» для исследованных азотсодержащих соединений с использованием их молекулярных фрагментов, с помощью эффективного алгоритма [77] были сконструированы и затем синтезированы соединения 1-1II (Схема 18) -субстраты микросомального цитохрома Р-450 печени с заранее рассчитанным уровнем сродства (Ks) к гемопротеиду. Проведенное спектральное исследование фермент-субстратных комплексов I-III с цитохромом Р-450 в указанных условиях эксперимента, сравнение рассчетных и экспериментальных значений констант диссоциации, сконструированных de novo веществ I-III (табл. 31-32), указывают на перспективность метода фронтальных многоугольников, как эффективного способа создания новых субстратов цитохрома Р-450 и внеэкс-периментальной оценки их свойств.

Отклонение экспериментально определенных pKs от значений pKs' составляет в среднем 0,48, что позволяет считать вполне удовлетворительным качество прогноза активности при выполненном de novo дизайне субстратов цитохрома Р-450.

Следует отметить, что дифференциальные спектры поглощения характерные для комплексов соединений II III, не наблюдаются в случае предварительного добавления метирапона или клотримазола в обе кюветы спектрометра в насыщающих концентрациях. Поскольку метирапон [89, 145] и клотримазол [172], известны как лиганды гемовой части цитохрома Р-450, избирательно связывающиеся с изоформой IIB1 в фенобарбиталиндуцированных микросомах печени крыс, полученные результаты свидетельствуют о конкуренции за связывание с активным центром гемопротеида между исследуемыми лигандами II, III и метирапоном или клотримазол ом. Отмеченное обстоятельство, а также весьма низкие значения Ks ферментсубстратных комплексов соединений II и III, на наш взгляд, позволяют сделать вывод об избирательном характере их взаимодействия с основной фенобарбиталиндуцированной изоформой цитохрома P-450IIB1.

Предварительное добавление субстрата I типа - гликолурила I в насыщающей концентрации в кюветы спектрометра приводит к исчезновению спектральных изменений I типа, характерных для гексобарбитала. Последний известен как лиганд апопротеиновой части гемопротеида, метаболизм которого катализируется изоформой IIB1 [45].

Мы провели экспериментальную оценку влияния сконструированных и полученных de novo соединений I-III (Схема 20), а также и некоторых, исследованных ранее лигандов IV-VI (Схема 20), с высоким уровнем сродства к микро-сомальному гемопротеиду на метаболизм субстратов I и II типа in vitro. В условиях in vitro предварительное добавление соединений I-VI в насыщающих концентрациях приводило к значительному снижению каталитической активности микросомального фенобарбиталиндуцированного цитохрома Р-450 в отношении 7-пентоксирезоруфина, бензфетамина, аминопирина. При этом субстраты I типа - гликолурил I и арилалкилмочевина IV, как лиганды апопротеиновой части фермента, ингибировали метаболизм субстратов I типа - 7-пентоксирезоруфина и аминопирина, не влияя на метаболизм субстрата II типа - бензфетамина. В тоже время субстраты II типа - арилалкилмочевины II, III, дибензгидрилмочевина V и ацетанилид VI, являющиеся лигандами гемовой части ингибировали метаболизм субстратов как II типа (бензфетамин), так и I типа (пентоксирезоруфин, аминопирин). Согласно литературным данным 7-пентоксирезоруфин и бензфетамин являются «маркерными» субстратами для основной фенобарбиталиндуцированной изоформы цитохрома Р-450 IIB1 [45,

137, 143]. Таким образом, ингибирование in vitro соединениями I-VI метаболизма данных субстратов также свидетельствует о достаточно избирательном характере связывания иследованных соединений с цитохромом Р-450.

В условиях in vivo соединения I-VI, судя по их влиянию на продолжительность снотворного действия и фармакокинетику гексобарбитала, при однократном внутрибрюшинном введении в дозах 0,11-0,34 мМ/кг ингибиторуют каталитическую активность цитохрома Р-450. При этом ингибирующее влияние на мо-нооксигеназную систему соединений II, III, VI носит кратковременный характер и в дальнейшем (через 12 ч после их введения) не обнаруживается. Очевидно, данный факт обусловлен быстрым выведением этих соединений из организма экспериментальных животных, что подтверждается сравнением динамики концентраций и ингибирующего влияния короткодействующего ингибитора III и более длительно действующего IV (Рис. 24, табл. 40).

В отличие от II, III и VI, соединения I, IV, V при однократном внутрибрю-шинном введении оказывают более продолжительное ингибирующее воздействие на каталитическую активность цитохрома Р-450 в дозе 0,34 мМ/кг - до 24 ч. Кроме того, их влияние на монооксигеназную систему печени носит двухфазный характер, что согласуется с литературными данными. Уже через 24 ч после введения I, IV, V в диапазоне доз 0,036-0,34 мМ/кг наблюдается увеличение уровня цитохрома Р-450. При этом для соединений I, IV, V в дозе 0,036 мМ/кг, в отличие от 0,11 и 0,34 мМ/кг, не наблюдается столь выраженного и длительного периода ингибирования. Поэтому мы использовали дозу 0,036 мМ/кг как оптимальную при курсовом (3-кратном) введении веществ 1, IV, V для активации мо-нооксигеназной системы.

При 3-кратном внутрибрюшинном введении в дозе 0,036 мМ/кг, судя по значительному увеличению скорости метаболизма 7-пентоксирезоруфина и бензфетамина, соединения I, IV, V проявляют свойства индукторов фенобарби-талового типа. При этом они вызывают увеличение параметров монооксигеназ-ной системы, превосходящее влияние фенобарбитала в аналогичной дозе и сравнимое с его воздействием в дозе 0,34 мМ/кг. Однако их индуцирующее влияние на монооксигеназную систему является менее продолжительным, чем фенобарбитала и через 7 суток после введения практически не обнаруживается.

При оценке средств активации систем детоксикации, помимо влияния на монооксигеназную систему значительный интерес представляет их влияние на ферменты фазы II биотрасформации, так как окончательная детоксикация ксенобиотиков происходит именно на этом этапе. При введении веществ I, IV, V, судя по ускорению коньюгации динитрохлорбензола, на 2-3 сутки наблюдается заметная активация микросомальной глутатион-8-трансферазы. Существенно (в 1,5-2 раза) ускоряется микросомальный метаболизм р-нитрофенола, конью-гация которого осуществляется УДФ-глюкуронилтрансферазой. С этим согласуется и заметное уменьшение продолжительности хлоралгидратного сна крыс.

Важно отметить, что соединения I-VI являются малотоксичными. При внутрижелудочном введении в дозе 1500 мг/кг они не вызывают гибели белых беспородных мышей-самцов.

Выше (см. обзор литературы 2.2.3.) мы обобщили литературные данные о роли взаимодействия и образования ферментсубстратных комплексов ксенобиотиков с цитохромами Р-450 как первичном и необходимом этапе в механизме фенобарбиталового типа индукции, механизмах ингибирования каталитической активности цитохромов Р-450, а также клинических перспективах применения индукторов и ингибиторов. С этих позиций, предварительный отбор ксенобиотиков по признаку сродства к гемопротеиду, исследование взаимосвязи «структура-сродство к гемопротеиду» с последующим конструированием и получением (на основе имеющихся данных) новых соединений с высоким аффинитетом к цитохрому Р-450 представляется нам одним из путей оптимизации поиска средств регуляции систем детоксикации печени (индукторов и ингибиторов монооксигеназной системы)

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлены малотоксичные азотсодержащие соединения I-VI различной химической структуры - ингибиторы и индукторы цитохрома Р-450 печени крыс. Часть этих веществ -I, II, III были сконструированны на базе КССА полученных методом фронтальных многоугольников для ряда азотсодержащих соединений. Другие - IV, V, VI представляли интерес для исследований in vivo, как лиганды цитохрома Р-450 с низкими значениями Ks. Данные соединения образуют прочные ферментсуб-стратные комплексы I или II типа с фенобарбиталиндуцированным микросомальным цитохромом Р-450 с низкими значениями Ks {10'A-WA М/л) и ингиби-руют его каталитическую активность in vitro и in vivo.

Соединения II, III, VI являются короткодействующими ингибиторами мо-нооксигеназной системы, применение которых не вызывает последующей активации антитоксической функции печени и, на наш взгляд, могут представлять

207 значительный интерес для модуляции эффектов анестетиков, анальгетиков и ряда других фармакологических средств. Влияние на монооксигеназную систему печени соединений I, IV, V носит двухфазный характер и, в зависимости, от дозы, схемы введения и поставленной задачи, данные соединения могут быть использованы как для продолжительного ингибирования каталитической активности монооксигеназной системы печени (011-0,34 мМ/кг), так и для её активации без выраженной стадии ингибирования (0,036 мМ/кг).