Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Индивидуальный профиль изоферментной активности цитохрома Р450 и особенности метаболизма ксенобиотиков у крыс с различной резистентностью к гипоксии

г-..

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

СЧ!

БАЯНОВ АНДРЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ ПРОФИЛЬ ИЗОФЕРМЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТО-ХРОМА Р450 И ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ У КРЫС С РАЗЛИЧНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К ГИПОКСИИ

14.00.25 - ФАРМАКОЛОГИЯ

14.00.16-ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ТОМСК-1997

Работа выполнена в Новосибирском медицинском институте

Научный руководитель :

доктор медицинских наук, профессор Грек O.P.

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Хазанов В.А. кандидат биологических наук, Новожеева Т.П.

Ведущая организация :

Алтайский медицинский университет

Защита состоится "_"__ 1997 г. в _час.

на заседании диссертационного совета К.001.33.01 при Научно-исследовательском институте фармакологии ТНЦ РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии ТНЦ РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биол. наук

Е.Н. Амосова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной картине этиопатогенеза большинства заболеваний и патологических состояний ведущую роль занимает гипоксия (Лукьянова Л.Д.., 1989; Тицжин B.C. и др., 1994; Hochachka P.W., 1982, 1988), что позволяет рассматривать ее как основной, универсальный повреждающий фактор, воздействующий на организм (Меерсон Ф.З., 1981, 1988; Грек O.P., 1981, 1986; Биленко М.В., 1989; Романова В.Е., 1988; Anuncii L. et al., 1989; Costa L.. et al., 1993 ). Популяционные, линейные и видовые исследования на животных показали, что индивиды обладают различной резистентностью к гипоксическому воздействию: от низкой до высокой (Березовский В.А., 1978, 1981; Горчакова Л.А., 1987; Данияров С.Б. и др., 1994; Хачатурьян М.Л. и др., 1994; Козин C.B. и др., 1994), идентифицируемой как на клеточном уровне (Дудченко A.M. и др., 1990, 1994; Власова И.Г., Лукьянова Л.Д., 1990; Уголев А.Т. и др., 1991), так и на уровне функциональных параметров систем жизнеобеспечения и их регуляции (Лукьянова Л.Д., 1994; Крапивин C.B. и др., 1994; Пермяков И.А. и др., 1994; Ярыгин В.Н. и др., 1994; Агаджанян H.A. и др., 1995; Малышев А.Ю. и др., 1996) Индивидуальная резистентность животных к гипоксии, обусловленная комплексом ге-но- и фенотипических признаков (Березозский В.А., 1978; Галанцев В.П. и др., 1988, 1994; Власова И.Г. и др., 1990; Шарапов В.Н., 1993, 1996; Hochachka Р., 1986; Perramon A. et al., 1983), предопределяет индивидуальный характер протекания кислород-зависимых процессов, включая микросо-мальный метаболизм ксенобиотиков в печени (Березовский В.А., 1981; Горчакова Л.А., 1987; Лукьянова Л.Д. и др., 1982; Дудченко A.M., 1988; Шарапов В.И., Колпаков М.А. и др., 1993).

Экспериментально показано, что для животных с различной резистентностью к гипоксии характерны индивидуальные особенности лекарственного метаболизма s печени при воздействии острой, хронической гипоба-рической гипоксии, острого инфаркта миокарда (Попова O.A., 1984; Корниц-кая А.И., 1990; Горчакова Л.А., 1987; Шарапов В.И., 1993; Колпаков М.А., 1995), обратимой ишемии печени (Рыбакова Т.А. и др., 1994); выявлены ре-ципрокные взаимоотношения процессов окисления и ацетилирования лекарственных веществ (Колпаков М.А., 1995).

Вместе с тем в работах зарубежных и отечественных исследователей убедительно доказано, что межиндивидуальные различия в способности метаболизировать ксенобиотики, в том числе и лекарственные вещества, главным образом обусловлены полиморфизмом экспрессии и каталитической активности отдельных изоформ Р450 (Гуляева Л.Ф. и др., 1994; Festing

1

M.F., 1990; Lou Y.S., 1990; Gonzales F.J., 1990, 1991; Kalow W., 1991; Meyer U.A., 1992; Guengerich F.P., 1992,1994; Daly A.K. eta!., 1993).

Однако в субпопуляциях низко- и высокоустойчивых к гипоксии животных до сих пор не определялась и не подвергалась сравнительному анализу изоферментная активность Р450 в условиях нормоксии и при воздействии различных возмущающих факторов окружающей среды, в том числе и гипоксии. Выявление индивидуальных особенностей активности отдельных изоформ Р450 у особей с различной резистентностью к гипоксическому воздействию позволит разрабатывать индивидуальные рациональные фарма-копрофилакгические и фармакокоррекционные схемы, прогнозировать и предупреждать ранние и отдаленные последствия экспозиции ксенобиотиками в остром и реабилитационном периодах после гипоксического воздействия.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Новосибирского медицинского института по теме: " Разработать и внедрить новые методы прогнозирования, профилактики и лечения на основе фундаментальных исследований общих патогенетических механизмов хронических заболеваний - гипоксии, ишемии, воспаления " в рамках государственной проблемы 10.07 -" Фармакологическая коррекция гипоксических состояний ". Определение изоферментной активности Р450 осуществлялось на базе Института молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН (директор - Академик РАМН Ляхович В.В.).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. У крыс с различным фенотипом резистентности к гипоксии изучить изоферментную активность Р450 и выявить закономерности ее изменения при различных режимах острого гипоксического воздействия, индукции ФБ.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ :

1. Изучить каталитическую активность Р450 1А1, 1А2 и 2В1 печени в условиях нормоксии у крыс с различной резистентностью к гипоксии.

2. Изучить динамику срочной адаптивной реакции изоферментной системы Р450 печени после воздействия острой гипобарической гипоксии в зависимости от индивидуальной резистентности к гипоксии.

3. Изучить метаболическую активность Р450 1А1, 1А2 и 2В1 в восстановительном периоде после тотальной ишемии печени у крыс с различной устойчивостью к гипоксии.

4. Изучить индуктивный эффект фенобарбитала на некоторые изо-формы Р450, амидопириндеметилазу и анилингидроксилазу в субпопуляциях низко- и высокорезистентных к гипоксии крыс.

2

5. Изучить скорость метаболизма амидопирина, анилина и специфичных для Р450 1А1,1А2 и 2В1субстратов при комбинированном воздействии индукции фенобарбиталом с острой гипобарической гипоксией, ишемией печени в зависимости от исходной резистентности крыс к гипоксии.

6. Определить целесообразность предварительной индукции фенобарбиталом монооксигеказной системы печени перед острым гипоксическим, ишемическим воздействием, с учетом индивидуальной резистентности к гипоксии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Показано, что динамика срочной адаптивной реакции организма на острое гипоксическое воздействие, ишемическое повреждение печени включает в себя изменение каталитической активности изоформ Р450 1А1, 1А2 и 2В1 печени, а значит и скорости метаболизма специфичных для них ксенобиотиков.

2. У особей с конституционально различной резистентностью к гипоксии впервые выявлены межиндивидуальные различия метаболической активности Р450 1А1, 1А2 и 2В1 в условиях нормоксии, острой гипобарической гипоксии, обратимой ишемии печени.

3. Впервые выявлены межиндивидуальные различия индуцибельности фенобарбиталом некоторых изоформ Р450 печени крыс с различной устойчивостью к гипоксии.

4. Впервые показан дифференцированный подход в фармакопрофи-лактике фенобарбиталом изменения активности изоформ Р450 1А1, 1А2 и 2В1 в восстановительном периоде после воздействия острой гипоксии и ишемии печени, с учетом индивидуального фенотипа резистентности к гипоксии.

5. Впервые установлены межиндивидуальные различия реактивности изоформ Р450 1А1, 1А2 и 2В1 печени низко- и высокоустойчивых к гипоксии крыс на комбинированное воздействие индукции фенобарбиталом с острой гипобарической гипоксией, обратимой ишемией печени.

6. Теоретически обоснована роль некоторых структурно-функциональных параметров и средовых факторов в формировании межиндивидуальных различий активности изоформ Р450 1А1, 1А2 и 2В1 как в нормальных, так и в условиях различных воздействий.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

1. Разработана концепция сопряженности индивидуальной резистентности к гипоксии с индивидуальным профилем изоферментной активности Р450 печени.

з

2.Получениые данные позволяют рассматривать гипоксию как фактор, принимающий участие в регуляции активности изоформ Р450 1А1, 1А2 и 2В1.

3. Выявленные данные позволяют рассматривать различные режимы острого гипоксического воздействия, индукцию фенобарбиталом и их комбинацию как факторы, усиливающие различия изоферментной активности Р450 между высоко- и низкоустойчивыми животными.

4. Экспериментально обоснована нецелесообразность предварительного использования фенобарбитала для коррекции активности Р450 1А1, 1А2 и 2В1 в восстановительном периоде после воздействия острой гипоба-рической гипоксии у крыс.

5. Экспериментально обоснована целесообразность профилактического применения фенобарбитала для коррекции активности Р450 1А2 и 2В1 после ишемического воздействия на печень у высокоустойчивых - и нецелесообразность - у низкоустойчивых к гипоксии крыс.

6. Полученные данные служат предпосылкой для разработки индивидуальных фармакотерапевтических схем коррекции гилоксических состояний с учетом индивидуальной активности изоформ Р450 у особей с различной резистентностью к гипоксии.

7. Выявленные данные позволяют с большой вероятностью предполагать и предупреждать ранние и отдаленные последствия от воздействия ксенобиотиками в постгипоксическом и после печения фенобарбиталом периодах у низко- и высокорезистентных к гипоксии индивидов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Особи с различной резистентностью к гипоксии обладают индивидуальным характером метаболизма ксенобиотиков в печени, обусловленным различием изоферментных активностей Р450.

2. Под воздействием возмущающих факторов внешней и внутренней среды метаболизм субстратов, специфичных для Р450 1А1.1А2 и 2В1 изменяется неоднозначно, в зависимости от индивидуальной резистентности к гипоксии.

3. Острая гипобарическая гипоксия, индукция ФБ усиливает исходные различия изоферментной активности Р450 между животными с различной резистентностью к гипоксии.

4. Целесообразность фармакопрофилактики фенобарбиталом изменений изоферментной активности Р450 в восстановительном периоде после острой гипоксии, ишемии печени определяется индивидуально, с учетом резистентности особи к гипоксии.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ :

Результаты исследования используются на кафедре фармакологии Новосибирского медицинского института на практических семинарах и в лекционных курсах "Общая фармакология ", "Основы фармакокинетики", "Снотворные и противоэпилептические средства".

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на I Съезде Российского Научного общества фармакологов, Волгоград, 1995, на итоговых научных конференциях молодых ученых, Новосибирск, 1995, 1996, на Научной сессии сотрудников Новосибирского медицинского института, Новосибирск, 1995

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, 6 - на стадии опубликования в центральной печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста. Состоит из введения и 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, обсуждение полученных результатов и выводы. Список литературы включает 108 отечественных и 200 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 10 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ : Лабораторные животные

Эксперименты выполнены на 250 крысах-самцах породы Вистар массой 200-250 г в зимне-весенний период. Животные были получены из вивариев Института цитологии и генетики СО РАН и Медицинского института г.Новосибирска. Перед проведением опытов крыс адаптировали к местным условиям не менее 3-4 недель и содержали в стандартных условиях вивария на обычном рационе питания, при свободном доступе к воде.

Резистентность животных к гипоксии определяли по методу Березовского В.А. (1978) при подъеме на "высоту" 11 500 м со скоростью 50 м/с в барокамере Кравченко. Если в течение первых трех минут после экспозиции в данных условиях у животных регистрировались судороги и(или) второй атональный вдох, то крыс относили к группе низкоустойчивых (НУ), если более, чем через 10 минут - к группе высокоустойчивых (ВУ). Остальные животные были отнесены к группе среднеустойчивых и исключались из опытов. Эксперименты на животных проводились не ранее, чем через 3 недели после разделения на группы, согласно рекомендации Хачатурьяна М.Л., Серова P.A., (1994).

Экспериментальные модели Моделирование обратимой ишемии печени in vivo Тотальную ишемию печени создавали путем наложения на 30 минут микрозажима на сосудистую ножку органа (портальную вену и печеночную артерию) с предварительным отделением желчного протока. Операция проводилась с соблюдением правил асептики и антисептики, под этаминаловым наркозом (40 мг/кг массы тела животных ), либо в комбинации с эфирным наркозом. Исследования проводились на 1,3,7,14,21 сутки после ише-мии/реперфузии печени.

Моделирование острой гипобарической гипоксии Острая гипобарическая гипоксия создавалась в барокамере Кравченко объемом 128 л. Подъем животных осуществляли до "высоты" 9000 м, со скоростью 50 м/с без остановок. Экспозиция животных в данных условиях осуществлялась в течение 1,5 часов. Забор материала производился через 30 минут после спуска.

Моделирование индукции МОГ системы печени Индукцию МОГ системы печени осуществляли индуктором фенобар-биталового типа. Натриевую соль фенобарбитала (ФБ) вводили внутрибрю-шинно 1 раз в сутки в дозе 50 мг/кг массы тела животных з течение 4 дней. Через 24 часа после последней инъекции животных декапитировали под легким этаминаловым наркозом (контроль индукции), либо подвергали дальнейшему воздействию: острой гипобарической гипоксии или острой циркуля-торной гипоксии печени, с последующим изучением активности МОГ.

Оценке изоферментной активности цитохрома Р450 in vitro Активность изоферментной системы цитохрома Р450 (Р450) печени животных определялась по концентрации общего Р450, каталитической активности Р450 1А1,1А2,2В1 и скорости микросомального метаболизма амидопирина, анилина.

Забор материала осуществлялся в одинаковых для обеих групп животных условиях, после декапитации крыс под легким эфирным наркозом. Печень перфузировали охлажденным физиологическим раствором через нижнюю полую вену.

Микросомальную фракцию печени выделяли дифференциальным центрифугированием (Арчаков А.И., 1983).

1. Концентрация общего Р450 и цитохрома В5 определялась в соответствии с методом, описанным Omura Т., Sato R. (1964 ). Исследования

б

проводили с использованием дифференциального спектрофотометра "Hitachi-557" (Япония).

2. Каталитическая активность Р450 1А1, 1А2 и 2В1 определялась по скорости О-деалкилирования специфичных для данных изоформ субстратов: этокси-, метокси- и пентоксирезоруфина, соответственно (Гуляева Л.Ф., Ля-хович В.В. и др., 1994; Kelley М. et al., 1990; Rutten А. et а!., 1992, Archacov А., 1992) по методу Burke M.D. et al. ,1985. Измерения проводили на спектоф-луориметре "Hitachi-MPF-4", при длинах волн возбуждения 530 нм и эмиссии 585 нм, с записью на самописце "Hitachi-056".

3. Скорость N-деметилирования амидопирина определялась по количеству образовавшегося фармальдегида, идентифицируемого цветной реакцией по методу Nash Т.(1953). Скорость р-гидроксилирования анилина определялась по количеству образующегося р-аминофенола (Ymai Y. et а!.,1966) с помощью цветной реакции. Оптическая плотность окрашенных растворов определялась на спектрофотометре "СФ-46" (Россия).

Концентрацию белка в микросомальной фракции в одних экспериментах определяли по Lowry O.H.et al.,1951, используя в качестве стандарта кристаллический бычий сывороточный альбумин, в других - по Флоресу (Гос. Фармакопея СССР, 1990), используя универсальный реагент НТС-Р-001 для определения белка в биологических жидкостях.

Все экспериментальные данные подвергали статистической обработке с вычислением средней арифметической (X), ошибки средней арифметической (т).

Достоверность различий (Р) рассчитывали при помощи критерия Стьюдента (t). Различия считали значимыми при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Способность живой системы адекватно регулировать и изменять активность клеточного метаболизма определяет способность адаптироваться к изменениям окружающей и внутренней среды и, в частности, к гипокс.иче-скому фактору (Лукьянова Л.Д., 1989,1994; Гапанцев В.П. и др., 1994; Hochachka P.W. et al., 1986, 1994). Полиферментный комплекс, ответственный за метаболизм эндо- и ксенобиотиков, является наиболее быстрой адаптивной системой у животных, реагирующей на изменения окружающей среды (Гуляева Л.Ф. и др., 1994; Schenkman J.B. et al., 1991), и гипоксический фактор ,в частности (du Souich Р. et al., 1990; Jones D.Р.,1981; Letarte L. et al., 1984; Woodrooffe A.J.M. et al., 1995) , что в большей степени обусловлено высоким сродством Р450 и его изозимов к кислороду (Грек О.Р., 1981,1986; Белоусова В.В.,Дудченко А.Н., 1991,1994; Jones D.Р.,1989).

7

В условиях острых гипоксических воздействий активность одних изо-форм Р450 может снижаться и даже угнетаться (Park G.R. et al., 1992, 1994; Jones D.P. et al., 1989; Jiang X,- M. et al.,1994; du Souich P. et al., 1990; Webster L. et al., 1985; Mets B. et al., 1993; Szumura-Oleksiak J., 1992), других -значительно повышаться (Никоноров А.А., 1989; Шугалей B.C. и др., 1991; Tingberg N. et al., 1989), хотя молекулярные механизмы и биологический смысл различной реактивности изоформ Р450 печени на тот или иной вид нехимического воздействия остается неизученным.

Вместе с тем доказано, что гено- и фенотипический признак - устойчивость особи к гипоксии - предопределяет индивидуальную стратегию адаптации, в том числе и МОГ системы печени, к гипоксическому воздействию (Березовский В.А., 1978; Лукьянова Л.Д. и др., 1989,1994; Шарапов В.И, 1991; Колпаков М.А., 1995; Grek O.R., 1993).

Неисследованными остаются срочная и длительная адаптивная реакция отдельных изоформ Р450 печени на гипоксию у особей с конституционально низкой и высокой резистентностью и адаптабельностью к ней.

1. Характеристика изоферментной активности Р450 печени низко- й высокорезистентных к гипоксии крыс в норме и при различных режимах ги-поксического воздействия Исследование изоферментной активности Р450 печени крыс в условиях нормоксии показало преобладание у НУ особей концентрации Р450 и каталитической активности Р450 1А1, в то время как у ВУ - каталитической активности Р450 1А2 (табл. 1), что согласуется с результатами, отражающими именно в группе НУ большую концентрацию Р450 и скорость 4-гидроксилирования антипирина (Шарапов В.И.,1993; Колпаков М.А.,1995), осуществляемого преимущественно Р450 1А1 (Горенков Р.В. и др.,1994; Teunissen M. et al., 1983).

Таблица 1

Нормальный профиль изоферментной активности Р450 у НУ и ВУ крыс

(Х + гп, п=15 -18 )

Измеряемый показатель НУ ВУ Р

В5 (1) 0,721+0,02 0,63 + 0,09 >0,05

Р450 (1) 0,935 + 0,11 0,71 + 0,02 <0,05

ЭРОД (2) 59,14 + 8,08 39,45 +5,04 <0,05

МРОД (2) 20,94 + 1,95 32,63 + 3,3 <0,01

' ПРОД (2) 5,13 + 0,67 6,69+1,07 >0,05

Примечание. Р - достоверность различий между группами ; 1- концентрация цитохромов 8 нмоль/мг белка; 2 - этокси-, метокси-, пентоксирезору-фин-О-деалкилазная активность в пкмоль резоруфина/мг белка/мин

Исходя из того, что реакция на острую гипоксию усиливает метаболические различия мехеду животными (Лукьянова Л.Д., 1994; Шарапов В.И., 1993), полученные данные позволили предположить, что исходные различия активности отдельных изоформ Р450 у животных с различным фенотипом резистентности к гипоксии могут усиливаться в условиях острой гипоксии (ОГГ) и других стресс-индуцирующих условиях, отождествляя тем самым "готовность " к более высокому уровню метаболизма специфичных для данных изоформ ксенобиотиков при различных экстремальных воздействиях.

При исследовании изоферментной активности Р450 в условиях ОГГ эта гипотеза подтверждается: у НУ особей увеличивается активность именно Р450 1А1, а у ВУ - Р450 1А2 (Табл. 2).

Таблица 2

Влияние острой гипобарической гипоксии на изоферментную активность Р450 у НУ и ВУ крыс (X + т, п=6 )

Измеряемый по- Группа Контроль Гипоксия

казатель животных

В5 (1) НУ 0,69 + 0,035 0,78 + 0,1

ВУ 0,77 + 0,02 0,75 + 0,02

Р450 (1) НУ 0,935 + 0,11 1,41 +014 &

ВУ 0,71 +0,016 0,8 + 0,09*

ЭРОД (2) НУ 30,27 + 3,29 45,45 +5,46 &

ВУ 24,07 + 2,71 28,18 + 2,22*

МРОД (2) НУ 16,89 + 1,56 14,76 + 2,27

ВУ 28,48 + 1,61* 41,68+ 3,96*&

ПРОД(2) НУ 7,04 + 0,89 7,76 + 0,45

ВУ 9,34 + 1,81 7,09 + 0,77

Примечание . * - достоверность различий между группами (Р<0,05), & -достоверность различий между опытом и контролем (Р<0,05 ); 1 - концентрация цитохромов в нмоль/мг белка; 2 - этокси-, метокси, пентоксирезоруфин-О-деалкилазная активность в пкмоль резоруфина/мг белка/мин

Данная закономерность оказалась справедлива и для метаболизма анилина, каталитическая деградация которого осуществляется преимущественно Р450 2Е1 (Wrighton S. etal., 1987; Levin W., 1988): исходно более высокая скорость р-гидроксилирования анилина у НУ возрастает и в условиях ОГГ, в то время как у ВУ - остается на исходном уровне (Шарапов В.И., 1993; Колпаков М.А., 1995).

э

К тому же, согласно концепции перекрестной адаптации (Меерсон Ф.З., 1981, 1988), генетически детерминированная толерантность к гипоксии расширяет адаптационные возможности и увеличивает диапазон неспецифической резистентности организма ко многим неблагоприятным воздействиям (Галанцев В.П., 1988, 1994). Это позволяет сопоставлять срочную адаптивную реакцию изоферментной системы Р450 печени крыс на ОГГ со срочной адаптивной реакцией на другие стресс-индуцирующие воздействия. Сравнимые с нашими результатами литературные данные показывают, что уже на 1 сутки холодового воздействия отмечается индукция Р450 1А1 (Gromova O.A. ei ai., 1992), срочная индукция изоформ Р450 подсемейства 1А регистрируется у крыс с ограничением питания и голодающих (Susumu А. et al„ 1989; Horbach G.Y. et al„ 1990; Ueng Т.Н. et al„ 1993).

Таким образом, проявляющиеся в условиях нормоксии и ОГГ различия в активности изоформ Р450 подсемейства 1А у низко- и высокорезистентных к гипоксии крыс, характеризуют индивидуальный характер адаптации к экспозиции специфичными для данных изоформ ксенобиотикам в условиях острой гипоксии, стресс-индукции и обусловлены различием регуляторных факторов, формирующих срочные и длительные адаптивные признаки: стресс-лимитирующих систем, энергетического обмена и транспортных систем кислорода (Лукьянова Л .Д., 1989, 1994; Пермяков И.А. и др., 1991, 1994; Тор-шин В.И., 1994; Агаджанян H.A. и др., 1995).

Исследование изоферментной активности Р450 в динамике после обратимой ишемии печени показало принципиально различную реактивность одноименных изоформ Р450 крыс в зависимости от исходной резистентности к гипоксии." у ВУ - угнетение активности Р450 1А1, 1А2 и 2В1 в течение 3 недель постишемического периода, что повышает вероятность интоксикационного эффекта при использовании специфичных для данных изоформ лекарственных веществ, в то время как у НУ - снижение активности лишь Р450 1А1 и значительную активацию Р450 1А2 (на 100-200%) и 2В1 (в 1,5раза) (табл. 3).

Таким образом, подтверждается концепция экономичной стратегии адаптации ВУ особей к гипоксии посредством ограничения метаболической активности клетки (Дудченко А.М. и др., 1994; Кадаралиев А.К.. и др., 1994; Колпаков М.А., 1995; Hochachka P.W., 1986,1994).

Вместе с этим, существенных различий между НУ и ВУ животными в степени угнетения активности анилингидроксилазы и амидопириндеметила-зы в постишемическом периоде выявлено не было (Рыбакова Т.А. и др., 1994).

Проведенные рядом изыскателей гистоморфологические исследования показывают неравномерность кровоснабжения печеночной дольки, что

10

Таблица 3

Динамика изменения изоферментной активности Р450 после тотальной обратимой ишемии печени у крыс с различной устойчивостью к гипоксии (X + т, п=6-8)

Измеряемый показатель контроль 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки

ЦХ В 5 НУ ВУ 0,721+0,02 0;63 ±0,09 0,772+0,044 0,545 + 0,08 0,731+0,03 0,678 ±0,08 0,812 ±0,07 1,13 + 0,04 0,927 ± 0,079 0,641 ±0,052 0,627 ± 0,036 0,635 ± 0,037

ЦХ Р 450 ГО' ВУ 0,824 ± 0,044 0,789 ±0,11 0,682 ± 0,052 & 0,504 + 0,012 0,529 + 0,05 & 0,407 + 0,044 & 0,961 ±0,012 & 1,029 + 0,053 & 0,789 + 0,037 0,571 ±0,04* 0,576 + 0,031 & 0,776 ± 0,069*

ЭРОД НУ ВУ 74,59 + 0,76 57,42 ± 7,59* 46,95 ± 4,1 & 53,78 ± 9,3 44.57 + 4,33 & 33.58 ±4,72 & 76,63 + 1,65 77,26 + 3,34 & 66,2 + 1,6 & 42,18 ± 2,2*& 49,36 ± 2,2 & 60,21 ±6,27

МРОД НУ ВУ 29,19 ±0,76 39,35 + 5,11* 23,18+ 1,07 & 16,38 + 0,43*& 29,57 ±4,09 17,75 ± 0,88*& 72,85 ±1,83 & 58,74 + 2,83*& 63,1 + 6,8 & 34,54 + 3,66* 40,18 ±2,64 & 25,17 ±1,01*&

ПРОД НУ ВУ 5,25 ± 0,68 6,42 ±0,46 7,45 + 0,46 & 4,94±0,18*& 6,11+0,3 3,9 + 0.1*& 7,66 ± 0,37 & 7,68 + 1,37 7,08 + 0,94 4,05 ± 0,43*& 5,04 ±0,42 4,07±0,23*&

Примечание: * -Р<0,05 между НУ и ВУ особями

& - Р<0,05 между опытом и контролем

обуславливает различную зональную чувствительность гелатоцитов к гипок-сическому повреждению (Lemasters J.J. et al., 1981): перицентральная зона является наиболее чувствительной, в то время как перипортальная - менее, за счет более высокой оксигенации (Сокирченко И.А., 1990; Jones D. et al., 1984) и локализации преимущественно в этой зоне антиоксидантных ферментов (Jungermann К,, 1982). Вместе с тем, известно, что зональное распределение в печеночной дольке характерно и для изоформ Р450 (Митрофанова Е., 1990; Wolf С. et al., 1984; Foster J.R., 1986; Bars R.G. et a!., 1989).

Это позволило нам сформулировать гипотезу, согласно которой у низко- и высокорезистентных к гипоксии особей межиндивидуальные различия реактивности одноименных изоформ Р450 могут быть обусловлены различием их зональной локализации в печеночной дольке и, следовательно, неодинаковой оксигенацией и повреждаемостью при воздействиях, непосредственно ограничивающих поступление кислорода в печень.

Таким образом, в восстановительном периоде после обратимой ишемии печени изоферментная система Р450 печени крыс изменяет свою активность неоднозначно, в зависимости от исходной резистентности животных к гипоксии: у ВУ особей происходит угнетение активности Р450 1А1,1А2 и 2В1 в течение трех недель восстановительного периода, что повышает вероятность интоксикационного эффекта при использовании специфичных для данных изоформ лекарственных веществ в реабилитационном периоде. Срочная адаптивная реакция НУ особей на данное воздействие характеризуется, с одной стороны, снижением активности Р450 1А1, с другой - значительной активацией Р450 1А2 и 2В1, что повышает вероятность образования канцерогенных аддуктов при экспозиции в реоксигенационном периоде специфичными для данных изоформ ксенобиотиками-проканцерогенами.

2. Сравнительная характеристика изоферментной активности Р450 у индуцированных ФБ низко- и высокорезистентных к гипоксии крыс в условиях нормоксии и при различных режимах острого гипоксического воздействия

Изучение изменения изоферментной активности Р450 под воздействием ФБ у животных с различной резистентностью к гипоксии позволяет, с одной стороны, определить межиндивидуальную адаптабельность системы Р450 крыс Вистар к химическому воздействию - индукции ФБ, с другой - реализацию антигипоксического эффекта ФБ (Новожеева Т.П., Саратиков А.С., 1993; Рыбакова Т.А., 1990; Altura В.Т. et al., 1975, 1984; Pulido J.S. et al., 1989; Murakami Y. et al, 1992) на уровне активности некоторых изоформ Р450 при воздействии гипоксического фактора, с учетом фенотипических особенностей резистентности к гипоксии.

12

2.1. Влияние ФБ-индукции на изоферментную активность Р450 у крыс

с различной резистентностью к гипоксии Более чем двухкратное различие индуцибельности фенобарбиталом Р450 2В1 у ВУ и НУ, с преобладанием у последних и значительное ускорение N-деметилирования амидопирина (табл. 4), позволяет предполагать межиндивидуальные генотипические различия экспрессии Р450 2В1, специфически осуществляемой ФБ (Grichanova A. et al., 1992; Waxman D.J. et al., 1992; Eagling V.A. et al., 1994; Monostory K. et al., 1992). Подтверждением чего являются исследования, показавшие возможность селекционного отбора в породе Вистар гомозиготных особей RR, чувствительных к ФБ и особей гг, нечувствительных к нему (Vasiliou V. et al., 1989), бимодальное распределение особей породы Вистар по длительности гексеналового сна, взаимосвязь данного явления с резистентностью к гипоксии и генетической неоднородностью породы (Березовский В.А., 1978; Горчакоза Л.А., 1987; Шарапов В.И., 1993; GutV., 1974; Vessel E.S., 1968,1974).

Немаловажен факт обнаружения нами повышения в ответ на индукцию ФБ активности Р450 подсемейства 1А, что подтверждается данными (Baron J. et al., 1981; Szabo L„ 1992; Wortelboer H.M., 1991; Sadar M. et al., 1994), и отсутствие изменения скорости р-гидроксилирования анилина в обеих группах животных.

Таблица 4

Влияние индукции ФБ на изоферментную активность Р450 НУ и ВУ крыс (X + m,n = 12-15 )

Измеряемый пока- Группа Контроль ФБ - индукция

затель животных

В5 НУ 0,721+0.02 1,05 + 0,06

ВУ 0,63 + 0,09 0,88 + 0,08

Р450 НУ 0,935 + 0,11 2,75 +0,15 &

ВУ 0,71+0,016* 2,65 + 0,16 8.

ЭРОД НУ 59,14 + 8,08 316,1+31,7 &

ВУ 39,45 ± 5,04* 424,6 + 44,8 &*

МРОД НУ 20,94 + 1,95 69,47 + 13,1 &

ВУ 32,63 + 3,3* 69,34 + 12,3 &

ПРОД НУ 5,13 + 0,67 885,13 + 121,9 &

ВУ 6,69+1,07 546,19 ± 39,9 &*

Амидопирин- НУ 2,01+0,04 4,547 + 0,59 &

деметилаза (1) ВУ 1,85 + 0,03* 3,964 + 0,54 &

Анилин- НУ 0,35 + 0,01 0,408 + 0,01

гидроксилаза (2) ВУ 0,31 + 0,01* 0,384 + 0,01 &

Примечание. * - достоверность различий между НУ и ВУ, & - достоверность различий между опытом и контролем (Р<0,05 ); 1- скорость N-деметилирования амидопирина в нмоль НСНО/мг белка/мин; 2- скорость анилин-р-гидроксилирования в нмоль р-нитрофенола/мг белка/мин

Выясняя возможные механизмы неспецифической активации ФБ Р450 1А1 и 1А2, мы полагаем, что курсовое введение ФБ может вызывать в печени состояние "функциональной гипероксии", в некоторой степени эквивалентное реперфузионному воздействию после ишемии органа, за счет значительного усиления ФБ гемодинамики и повышения содержания кислорода в воротной вене печени (Бурбелло А.Т. и др., 1989; Altura В.Т. et al., 1984; Murakami Y. et al., 1992; Vickers et al., 1989). Именно в условиях гипероксии обнаружена индукция Р450 1А1 и 1А2 печени (Nasraoni А, 1990; Okaraoto Т. et al., 1993).

А выявленные в наших исследованиях межиндивидуапьные различия индуцибельности ФБ Р450 1А1, с преобладанием в 2 раза у ВУ, и Р450 1А2, с преобладанием в 1,5 раза у НУ, позволяют говорить о дифференцированной адаптабельности особей к воздействию специфичными для данных изо-форм ксенобиотиками в условиях повышенной оксигенации печени.

2.2. Изучение изоферментной активности Р450 печени крыс при комбинированном воздействии ФБ-индукции с обратимой ишемией печени, ОГГ

Исследование влияния острого ишемического воздействия на печень на фоне индукции Р450 ФБ показало резкое падение уже в 1 сутки реперфу-зии активности Р450 1А1 и 1А2 до исходного уровня в обеих группах животных (табл. 5), что подтверждает неспецифический характер активации ФБ данных изоформ Р450 и значимую роль изменения константного уровня кислорода во внутренней среде в регуляции активности Р450 1А1 и 1А2. В то же время, каталитическая активность Р450 2В1 и амидопириндеметилазы не изменялась; значительный спад активности регистрировался только на 3 сутки, что, очевидно, обусловлено деградацией синтезированного под воздействием ФБ Р450 (Адрианов Н.В. и др., 1982, 1989; Цырлов И.Б. и др., 1987) и низкой чувствительностью данной изоформы к изменению константного уровня кислорода.

С другой стороны, изучая возможность использования ФБ с профилактической целью для предотвращения угнетения МОГ активности печени в постишемическом периоде (Рыбакова Т.А., 1990; Шарапов В.И., 1993; Ново-жеева Т.П., 1993; Захарова М.В., 1994), нами показан его выраженный про-тективный эффект на активность Р450 1А1, 1А2, 2В1 и амидопириндемети-

14

Таблица 5

Изменение изоферментной активностиР450 з динамике после тотальной ишемии печени у ФБ-индуцированных крыс с различной устойчивостью к гипоксии ( X + т, п=8 )

Измеряемый показатель Группа животных контроль ФБ-ндукция 1 сутки 3 сутки 7 сутки

В5 НУ ВУ 0,69 + 0,03 0,77 + 0,02 1,05 + 0,06 0,89 + 0,08 0,92 + 0,04 0,85 + 0,06 0,534 + 0,06 & 0,494 +0,03 & 0,698 + 0,06 & 0,735 + 0,04

Р450 НУ ВУ 0,94 + 0,11 0,71+0,02* 2,58 + 0,21 2,57 + 0,36 1,61 +0.06& 1,35 + 0,05 &* 0,488 + 0,06 & 0,437 + 0,04 & 0,487 + 0,04 & 0,449 + 0,04 &

ЭРОД НУ ВУ 30,27 + 3,29 24,07 + 2,71 417,94 + 31,8 546,25 + 74,8 49,56 + 2,54 & 44,04 + 2,98 & 107,5 +8,75 & 75,84 + 9,31 &* 36,42 + 2,1 & 26.22 + 1,2 &*

МРОД НУ ВУ 16,89 + 1,56 28.48 + 1,61* 112,89 + 3,3 102,81 +6,8 39,12 + 1,60 & 41,16 + 2,69 & 36,87 + 1,6 & 54,41 +2,29 &* 23,64 + 0,86 & 21,78 + 1,04 &

ПРОД НУ ВУ 7,04 + 0,89 9,34 + 1,81 1364,52 + 280 701,61 +54,4* 668,01 +49,2 & 615,40 + 39,0 47,5 + 7,52 & 49,78 + 5,06 & 50,42 + 1,41 & 45,88 + 1,47 &*

Примечание : & - достоверность различий ( р < 0,05 ) по сравнению с ФБ-индуцированными неоперированными животными

* - достоверность различий ( р < 0,05 ) между НУ и ВУ животными

лазы с нормализацией данных показателей на 2 недели раньше, чем без использования индуктора (рис.1).

1

5,0

4,0

3,0

2,0-

1,0-

0

Контроль Ж 1 3 7 сути:

Рис.1. Изменение N-амипошргещеметилазной активности печени в пост -

шемшзском периоде у ®-ивдуцированих крыс

Хотя, если учесть, что активность Р450 1А2 и 2В1 печени у НУ крыс после воздействия ишемия/реперфузия не угнетается, как у ВУ, а, наоборот, значительно увеличивается, становится очевидным нецелесообразность профилактического применения ФБ для "реанимации" активности даных изоформ в постишемическом периоде у животных с низкой естественной резистентностью к гипоксии. Более того, дополнительная стимуляция активности данных изоформ ФБ, обуславливая еще более высокую, чем у подвергнутых воздействию ишемия/реперфузия неиндуцированных крыс, скорость метаболизма специфичных для Р450 1А2 и 2В1 ксенобиотиков-проканцерогенов, повышает вероятность образования канцерогенных аддук-тов (Лукиенко Р.И. и др.. 1995; ВооЫэ А.Я. е1 а!., 1994; йуЫпд Е. е1 а1., 1992) у крыс с низкой естественной резистентностью к гипоксии. В тоже время, прогрессирующее падение скорости р-гидроксилирования анилина в постишемическом периоде у ФБ-индуцированных крыс, говорит об индифферентности анилингидроксилазы к ФБ (рис. 2)

16

жоль/мр шн

0,4'

0,3

0,2

ОД

О,-,----,-----,---

Контрлъ ФБ 1 3 7 сутки

Рис.2. Изменение р-гидроксилазной активности печени в шстииемическом периоде у Ж-шдуцироганных крыс

Изучение изменения активности изоферментной системы Р450 индуцированных ФБ крыс при остром гипоксическом воздействии показало разнонаправленный характер срочной адаптивной реакции животных, а зависимости от фенотипа резистентности к гипоксии: животные с низкой естественной резистентностью к гипоксии адаптируются посредством снижения активности Р450 1А1 и 2В1, БУ - посредством повышения активности Р450 2В1 (рис. 3,4). В соответствии с этим изменяется и скорость метаболизма специфичных для данных изоформ лекарственных веществ.

Подводя итог, можно отметить следующее: индивидуальная устойчивость крыс Вистар к гипоксии определяет индивидуальный характер активности изоформ Р450 печени - 1А1, 1А2 и 2В1 - как в условиях нормоксии, так и при различных режимах острого гипоксического воздействия, индукции микросомальной системы печени ФБ, комбинации данных возмущающих факторов. Причем, в зависимости от вида воздействия, исходные межиндивидуальные различия активности данных изоформ могут усиливаться, инвертироваться или нивелироваться; а при непосредственном воздействии ишемии/реперфузии на печень - скорость метаболизма ксенобиотиков, специфичных для Р450 1А2 и 2В1 может снижаться или возрастать в зависимости от естественной резистентности крыс к гипоксии.

17

пкмоль/мг Ь/мин

А

в

Рис.3 Влияние острой гипобарической гипоксии (ОГ) на активность Р450 1А1 ФБ-индуцированных НУ (А) и ВУ (В) крыс

Рис. 4 Влияние острой гипобарической гипоксии (ОГ) на активность Р4502В1 ФБ-индуцированных НУ (А) и ВУ (В) крыс

Принимая во внимание установленные ранее значительные межиндивидуальные различия в породе крыс Вистар структурно-функциональных параметров жизнеобеспечения на клеточном, органном и системном уровнях, кореллирующие с индивидуальной резистентностью к гипоксии (Лукьянова Л.М., Дудченко A.M., 1988, 1995; Власова И.Г. и др., 1990; Уголев А.Т. и др., 1991; Шарапов В.И., 1993; Крапивин C.B. и др., 1994; Пермяков H.A. и др., 1994; Агаджанян H.A. и др., 1995; Ярыгин В.Н. и др., 1994; Малышев А.Ю , 1996), наиболее вероятными причинами межиндивидуальных различий реактивности одноименных изоформ Р450, на наш взгляд, могут являться:

1. Различие регуляторных факторов, обеспечивающих индивидуальную адаптабельность к стресс-индуцирующим воздействиям, в том числе и к острой гипоксии, частным проявлением которой является изменение активности отдельных изоформ Р450;

2. Различие зональной локализации в печеночной дольке одноименных изоформ Р450, обеспечивающее их неодинаковую оксигенацию и чувствительность к гипоксическому повреждению, гипероксии, ФБ-индукции;

3. Ген-ассоциированные различия экспрессии данных изоформ, в частности Р450 2В1.

ВЫВОДЫ

1. В породе крыс Вистар в условиях нормоксии существуют межиндивидуальные различия концентрации Р450 и каталитической активности Р450 1А1, 1А2 и 2В1, сопряженные с индивидуальной резистетностью к гипоксии.

2. В условиях острой гипобарической гипоксии исходные различия изоферментной активности Р450 между животными усиливаются и, в зависимости от резистентности особей к гипоксии, проявляются увеличением скорости метаболизма ксенобиотиков, специфичных для Р450 1А1 или 1А2.

3. Индукция фенобарбиталом МОГ системы печени крыс Вистар выявляет более чем 2-х кратные различия метаболической активности Р450 2В1. Р450 1А1, сопряженные с индивидуальной резистентностью к гипоксии.

4. В зависимости от естественной резистентности крыс к гипоксии, воздействие ишемия/реперфузия на печень вызывает разнонаправленную реакцию некоторых изоформ Р450: у высокоустойчивых животных скорость метаболизма субстратов, специфичных для Р450 1А1, 1А2 и 2В1, снижается; у низкоустойчивых активность Р450 1А2 и 2В1 значительно возрастает.

5. Фармакопрофилактика ФБ угнетения изоферментной активности Р450 в постишемическом периоде целесообразна с учетом индивидуальной фенотипической резистентности к гипоксии: у высокоустойчивых животных предварительная индукция ФБ предотвращает угнетение скорости метаболизма специфичных для Р450 1А1, 1А2 и 2В1 ксенобиотиков; у низкоустойчивых - профилактическое применение ФБ нецелесообразно.

19

6. В зависимости от фенотипа резистетности крыс к гипоксии, предварительная индукция ФБ обеспечивает принципиально различную скорость метаболизма специфичных для Р450 1А1, 2В1 ксенобиотиков в условиях острой гипобарической гипоксии.

7. Экспериментально обоснован поиск индивидуальных особенностей лекарственного метаболизма у индивидов с различным фенотипом резистентности к гипоксии в человеческих популяциях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ :

1. Баянов A.A. Профиль изоферментной активности цитохрома Р450 у крыс с различной устойчивостью к гипоксии II Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств : Тез. докл. 1 Съезда Российского научн. общ. фармакол. - М„ 1995. - С.39.

2. Баянов A.A. Влияние острой гипоксии на изоферментные активности цитохрома Р450 у крыс с различной устойчивостью к гипоксии II Тез. докл. научн. сессии сотрудн. НМИ. - Новосибирск, 1995. - С.14.

3. Баянов A.A., Грек O.P. Влияние предварительной индукции фенобарбиталом на изоферментную активность цитохрома Р450 крыс с различной резистентностью к гипоксии II Патогенез, профилактика и коррекция ги-поксических и ишемических состояний . - Новосибирск, 1996. - С.6-7.

4. Баянов A.A. Динамика изменения изоферментной активности цитохрома Р450 у крыс с различной устойчивостью к гипоксии после обратимой ишемии печени II Актуальные проблемы современной медицины : Тез. докл. научн. конф. молод, ученых. - Новосибирск, 1996. - С. 10.

В5 - щтохром В5

В/ - высокоустойчивые к гипоксии животные

НУ - низкоустойчиав к гипоксии животные

мт - монооксигеназная система

мрод - метоксирезоруфин-О-дважилазная активность

ПРОД - пентокоирезору^иь^-О-деалкилазная активность

® - фенобарбитал

эгод - этоксирезору!|ш--<>деалкклазная активность

Р450 - цитохром Р450