Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Индукция опухолевых клонов у личинок дрозофилы канцерогенами млекопитающих

На правах рукописи

КИРСАНОВ Кирилл Игоревич

ИНДУКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛОНОВ У ЛИЧИНОК ДРОЗОФИЛЫ КАНЦЕРОГЕНАМИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 МАЙ 2011

МОСКВА 2011

4847135

Работа выполнена в лаборатории механизмов химического канцерогенеза НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И.Давыдов)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Белицкий Геннадий Альтерович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Ревазова Юлия Анатольевна

Бухман Владимир Михайлович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение НИИ онкологии им. НЛ.Петрова

Защита диссертации состоится «¿У » сиоил. 2011 года в часов ка заседании диссертационного совета Д.001.017.01 РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу. 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан » ССЬ^ЛЦ^ 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н., профессор

Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Принцип профилактической направленности является основополагающим в онкологической практике. По данным ВОЗ, при правильном проведении профилактических мероприятий можно предупреждать до 33% всех потенциальных случаев рака. Задача первичной профилактики злокачественных новообразований заключается в предупреждении действия канцерогенных агентов на уровне популяции. Среди этих агентов большую роль играют химические канцерогенные соединения, своевременное распознавание которых представляет собой важную задачу. Поскольку большинство канцерогенов обладают генотоксическими свойствами, наиболее эффективным методом их выявления является тестирование в соответствующих биологических системах. Основные принципы биологического тестирования химических соединений на мутагенность были сформулированы в начале 70-х годов прошлого века. Эти принципы основаны на идее создания батареи тестов, которые позволяют регистрировать различные типы генетических изменений, и в то же время являются достаточно экономичными.

Одним из перспективных краткосрочных тестов является SMART (Somatic Mutation and Recombination Test) на дрозофиле, разработанный Г.А.Белицким и Е.М.Ховановой в середине 70-х годов на основании данных о способности химических канцерогенов увеличивать частоту появления соматических мозаичных клонов. К настоящему времени показано, что тест на соматический мутагенез и рекомбинацию чувствителен к широкому спектру канцерогенов млекопитающих и позволяет не только выявлять все типы нарушений ДНК, но и дискриминировать их.

Исследования по биотестированию, предназначенные для экстраполяции данных на более сложные организмы, требуют знания механизмов активации и дезактивации канцерогенных соединений, особенностей повреждения и репарации ДНК в данной системе, особенностей роста трансформированных клеток. D.melanogaster является классическим хорошо изученным объектом исследований молекулярных биологов и генетиков. Наличие близких гомологов генов-супрессоров опухолевого роста и онкогенов у дрозофилы и млехопитающих позволяет моделировать процессы индукции и прогрессии опухолевого клона в экспериментах на линиях дрозофилы, имеющих различные генетические модификации. Кроме того, эксперименты на данной модельной системе несложны в выполнении и относительно дешевы.

В 2001 году Р.А.Сидоровым и соавторами впервые была разработана модификация SMART, в которой показателем мутагенного действия агента является не изменения структуры или окраски нормального органа, а образование опухоли -

процесса, гораздо более приближенного к канцерогенезу. Данный метод биотестирования сочетает в себе ряд важных свойств, которые выделяют его из многих других, предложенных ранее. Во-первых в основе данного метода лежит нарушение функции гена-супрессора wts, мутации которого с высокой частотой определяются в клетках опухолей человека. Во-вторых, процесс образования опухолевых клонов включает в себя помимо индукции первичной мутации еще и процессы, связанные с выживанием и прогрессией опухолевого клона.

Несмотря на то, что тест для скрининга бластомогенной активности химических соединений на гетерозиготах wts был создал несколько лет назад, и его перспективность была отмечена в ряде лабораторий мира, он пока относится к категории развивающихся и нуждается в дальнейшей верификации на более широком круге канцерогенов млекопитающих. Другим направлением совершенствования данного теста является повышение его разрешающей способности. Все это потребовало углубленного изучения механизмов возникновения мутаций wts/wts и роли р53 в их элиминации, а также поиска подходов к повышению разрешающей способности теста путем внесения в клетку ряда мутантных супрессоров. Решению этих вопросов и посвящена данная работа, что делает ее обоснованным и актуальным исследованием в области экспериментальной онкологии.

Основные цели и задачи исследования

Целями данного исследования были: верификация теста SMART на бластомогенную активность канцерогенных соединений с различным механизмом повреждения ДНК, усовершенствование теста с использованием современных молекулярно-биологических подходов модулирования активности генов, участвующих в регуляции пролиферации, анализ функциональной гомологии гена-супрессора опухолевого роста дрозофилы и человека. В соответствии с основными целями исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ частоты образования спонтанных и индуцированных опухолевых клонов мутантных аллелей wtsM и wtsP2.

2. Исследовать влияние канцерогенных соединений разных химических классов с различным механизмом повреждения ДНК на частоту формирования опухолевых клонов wts/wts

3. Провести исследование мутагенной и потенциальной канцерогенной активности не изученных ранее классических и новых узхобороздочных лигандов.

4. Изучить возможность повышения эффективности теста путем сочетания у одной особи мутаций по нескольким генам-супрессорам.

5. Изучить влияние ингибирования Бтр53 методом РНК-интерференции на частоту появления спонтанных и индуцированных опухолевых клонов;

6. Оценить функциональную гомологию гена-сулрессора р53 человека, интегрированного в геном дрозофилы, и Бшр53 по их влиянию на частоту возникновения спонтанных и индуцированных химическими канцерогенами опухолей

7. Разработать метод визуализации соматических опухолевых клонов у личинок с перспективой создания системы их автоматизированного подсчёта.

Научная новизна

Впервые проведена сравнительная характеристика гетерозигот \у1эР2/+ и \\1эР4/+ по частоте формирования опухолевых клонов при спонтанном и индуцированном мутагенезе; впервые изучено влияние накопления мутаций по нескольким генам-супрессорам опухолевого роста на частоту образования трансформированных клонов; впервые исследовано влияние РНК-интерференции Бтр 53 на частоту образования опухолевых клонов и проведена оценка применимости данного метода ингибирования экспрессии генов для повышения чувствительности теста; впервые создана трансгенная модель, несущая мутантный по 234 кодону аллель р53 человека, и оценено влияние экспрессии этого гена на частоту формирования опухолей у дрозофилы; впервые удалось визуализировать опухолевый клон на стадии личиночного развития плодовой мушки.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 27 декабря 2010 года на совместной научной конференции лабораторий Отдела химического канцерогенеза, лабораторий Отдела трансформирующих генов опухоли, лаборатории Механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, лаборатории Молекулярной эндокринологии, лаборатории цитогенетики НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка, 15 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы».

Список литературы содержит 196 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы посвящен истории создания экспресс-тестов для выявления канцерогенов млекопитающих на дрозофиле и сравнительной оценке их эффективности. Подробно рассмотрены сильные и слабые стороны каждой из описанных систем, показано развитие этих методических подходов в РОНЦ и других исследовательских центрах. Описаны основные типы нарушений ДНК при воздействии химических канцерогенных агентов и возможности детекции этих нарушений при помощи тестов на дрозофиле. Во второй части обзора описаны особенности активации проканцерогенов в модельных системах, указаны факторы, влияющие на чувствительность SMART. Третья часть обзора посвящена основам моделирования канцерогенеза на дрозофиле.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы следующие методы исследования: тест на соматический мутагенез и рекомбинацию на дрозофиле в нескольких модификациях, бактериальный тест Эймса на мутагенную активность, молекулярное клонирование, полимеразная цепная реакция, трансформация бактериальных клеток, выделение ДНК и РНК из тканей дрозофилы, обратная транскрипция, определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, микроинъекция плазмиды в ранние эмбрионы дрозофилы, выделение и препаративное окрашивание имагинальных дисков и слюнных желез из личинок дрозофилы, флуоресцентная микроскопия, ингибирование активности генов при помощи РНК-интерференции, статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование чувствительности тест-системы к химическим канцерогенам разных классов.

У дрозофилы ген wts необходим для контроля пролиферации клеток и нормального морфогенеза. Мутация в wts приводит к гипертрофии апикальной части эпителиальных клеток имагинальных дисков и их избыточной пролиферации [Bryant P.J. et al., 1994, Xu T et al, 2005], что при развитии особи в имаго проявляется в наличии опухолевых клонов. Однако не все мутантные по wts линии проявляют одинаковую бластомогенную активность.

В рамках данного исследования было изучено влияние мутации гена wtsM на частоту образования гомозиготных опухолевых клонов при спонтанном и

индуцированном мутагенезе у гетерозигот wtsP4/+. Данный аллель впервые использовался в тесте на соматические мутации и рекомбинацию. Показано, что при его использовании частота опухолей при индукции одним и тем же генотоксическим агентом эквимолярной концентрации возрастает практически в 2 раза по сравнению с частотой опухолей у особей, несущих Р2-аллель. Существенно, что уровень спонтанного мутагенеза при использовании обоих аллелей был примерно одинаковым.

Для дальнейшей верификации SMART на гетерозиготах по wts в настоящем исследовании были использованы соединения нескольких химических классов, различных по типу вызываемого ими повреждения участков макромолекулы ДНК: 1) полициклические ароматические углеводороды, нитрополиарены и аминоазобензолы, электрофильные метаболиты которых образуют аддукты; 2) производное нитрозомочевины, аликилирующее ДНК; 3) производные платины, образующие внутрицепочечные сшивки ДНК; 4) бифункциональные хлорэтиламины, вызывающие как образование сшивок, так и аддуктов; 5) соединение, интеркалирующее между основаниями ДНК-дуплекса, 6) соединения, связывающиеся с ДНК по узкой бороздке за счёт образования водородных и ван-дер-ваальсовых связей. В качестве контролей на ложноположительный эффект использовались следующие неканцерогенные соединения: ДЭАБ1, хризен, фенантрен, антрацен и 1234-ДБА.

Из табл.1 видно, что статистически значимое увеличение частоты появления опухолевых клонов у гетерозигот wtsP4 наблюдалось при действии канцерогенов разных химических классов, однако ни один класс не имел преимущественной способности индуцировать эти клоны. Практически одинаковый уровень повышения частоты опухолей относительно контроля показали нитрополиарены 1-НП и 1,2-НФ, интеркалятор бромистый этидий и полициклические углеводороды (ПАУ) -БП и 1,2,5,6-ДБА. Более высокие, но также одинаковые показатели дали проканцероген из группы метилированных ПАУ 20-МХ и прямой метилирующий агент араноза. Еще более активными оказались проканцерогенный табакоспецифический нитрозамин ННК и генотоксическое производное платины - оксоплатин. Наиболее мутагенными в этом эксперименте были циклоплатам, не требующий метаболической активации, и проканцероген ДМБА.

1 Список сокращений. БП-бенз(а)пирен, ДМБА- 7,12-диметилбенз(а)ашрацен, 1234-ДБ А -1,2,3,4-дибензанграцен, 1256-ДБА- 1,2,5,6-дибензантрацен, ДМСО - диметилсульфоксид, ДЭАБ - диэтиламиноазобензол, 3-МеДАБ- З-метил-4-диметиламииоазобензол, 20-МХ - 20-метилхолашрен, ННК-4-(метилнитрозамиио)-1-(-3-пиридин)-1-бутанон, ННН - N'-нитрозонорникотин, 1-НП- 1-нигропирен, 2-НФ-2-нитрофлуорен, ОААТ -ортоаминоазотолуол, ПАУ - полициклические углеводороды, Dmp53 - Drosophila melanogaster р53, wts - warts, SMART - Somatic Mutation and Recombination Test.

Из табл.1 также видно, что ни один из известных типов повреждения ДНК не имеет преимуществ по частоте индукции опухолей wtsP4. Агенты, дающие массивные аддукты ДНК (ДМБА), не отличались по этому параметру от тех, которые вызывают поперечные сшивки (цисплатин) или преимущественно метилируют основания (араноза).

Действие прямых канцерогенов сарколизина и аранозы оказалось слабее ожидавшегося. Это может быть связано с их высокой реакционной способностью, вследствие чего они инактивировались компонентами среды и доходили до клеток имагинальных дисков в низкой концентрации.

Мы не обнаружили также количественной корреляции между канцерогенной активностью отдельных соединений у грызунов и частотой индукции опухолей этими соединениями у дрозофилы. Это хорошо видно на примере про канцерогенных ПАУ -БП, 20-МХ и ДМБА. Все три соединения, являющиеся в группе ПАУ наиболее сильными канцерогенами млекопитающих, на нашей модели существенно различались по частоте индуцируемых ими опухолей. У ДМБА, вызывавшего наибольшую частоту опухолей wtsP4, эта величина была в 6 раз больше, чем у БП, и в 4 раза выше, чем у 20-МХ.

Данный результат может быть обусловлен несколькими причинами. Во-первых, трансмембранный белок гена mdr49, который функционирует как насос, удаляющий из клетки гидрофобные ксенобиотики, в том числе ПАУ, может по-разному удалять замещенные и незамещенные ПАУ [Vace, 2006]. Другой очевидной причиной могут быть особенности системы метаболической активации ксенобиотиков у насекомых.

У млекопитающих лиганды типа ПАУ, связываясь с транскрипционным фактором AhR, инициируют экспрессию блока генов метаболизма ксенобиотиков. При этом индуцируются как активирующие монооксигеназы суперсемейства CYP, и среди них подсемейства CYP1A и CYP1B, так и ферменты детоксикации типа глутатион-5-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксиредуктазы-1. Для канцерогенного действия БП и 20-МХ активация этого блока является главным условием генотоксического и канцерогенного действия, а для ДМБА она не обязательна. У млекопитающих основной изоформой, необходимой для превращения БП и MX в конечные диолэпоксиды, является CYP1A1, экспрессия которой в клетках млекопитающих при взаимодействии с этими лигандами AhR повышается в десятки раз [Fazili, 2010].

ДМБА активируется, в основном, изоформой CYP1B1, которая постоянно присутствует в клетке в качестве конститутивной изоформы [Buters, 2003]. Показано, что она одинаково работает у животных AhR+/+ и AhR-/- [Ide, 2004].

У личинок дрозофилы активность всех изоформ цитохрома Р-450 на порядок ниже, чем у грызунов, равно как и частота оборотов окисляемого субстрата на цитохроме [Фукс, 1990].

Кроме того, у насекомых отсутствует изоформа CYP1A1, которая у млекопитающих активирует большинство ПАУ [Brown, 2005]. Окисляемые ею субстраты, в частности БП и 20-МХ, метаболизируются у дрозофилы другими изоформами Р-450 благодаря их перекрывающейся субстратной специфичности, притом гораздо менее эффективно [Amichot, 1998].

Табл. 1 Частоты появления опухолевых клонов при спонтанном и индуцированном

Вещество Конц, мг/мл +/wtsM Gal4/+; р53-RNAi/wtsM

N п р,% N п Р,%

1 3 1234-ДБА 4,1 496 15 3,0 - -

в 2 1 § Хризен 6,8 472 14 3,0 - - -

Q. Я о О 5 § Ашрацен 5,34 231 8 3,5 - - -

£ S * й Фенантрен 5,34 514 19 3,7 - - -

В ДЭАБ 7,6 346 10 2,9 - - -

ЗМеДАБ 7,2 437 15 3,4 - - -

ОААТ 6,3 470 14 3,0 - - -

* Бромистый этидий 2,5 458 23 5,0* - - -

1 £ 03 1256-ДБА 4,1 483 26 5,4* - - -

1-нитропирен 0,5 655 32 4,9* 499 37 7,4

s 2-нтрофлуорен 0,42 483 27 5,6* 360 32 8,9

о а Циклофосфамид 1,55 638 40 6,3* 474 72 15,2*

U Ч Сарколизин 0,61 579 43 7,4* 556 67 12,1*

г Араноза 0,5 482 49 10,2* 504 113 22,4*

в 20-МХ 4 548 55 10,0* 562 55 9,8

U о ННК 3 456 72 15,8* 298 96 32,2*

о. и Циклоплатам 2,5 568 195 34,3* 491 262 53,4*

Оксоплатин, 1 315 47 14,9* 326 129 39,6*

1 Оксоплатин, 2 326 161 49,4 - - -

ДМБА 7,7 478 205 42,9* 518 435 84,0*

S 5-г = § с. п. ЮУоДМСО - 770 20 2,6 642 50 7,8

о t-о s SI а. Вода - 820 20 2,4 724 58 8,0

^количество особей, п- количество опухолей, р-частша формирования опухолевых клонов. * - Частота статистически значимо отлична от соответствующего контроля, Р < 0,01

Изоформа с субстратной специфичностью CYP1B1 млекопитающих экспрессируется в клетках личинки дрозофилы постоянно, и ее количество достаточно дм активации ДМБА. В результате ДМБА начинает метаболизироваться и повреждать макромолекулы непосредственно после своего поступления в клетку, а БП и 20-МХ - только спустя значительный лаг-период, в течение которого индуцируется экспрессия метаболизирующих их монооксигеназ.

В результате мутагенный эффект ДМБА выражен у дрозофилы значительно более интенсивно, чем эффекты БП и 20-МХ. При низком базальтом уровне изоформ Р-450, метаболизирующих ДМБА, их значительная активность может быть связана также и с ускоренным оборотом метаболизируемого субстрата на цитохроме. Такой механизм интенсификации метаболизма ПАУ, в сочетании с повышенным образованием дигидродиолов, мы наблюдали в ранних исследованиях в микросомах мутантной линий Drosophila simulans 364 yv, чувствительной к токсическому действию БП [Fuchs, 1992; 1995]. Следует также отметить, что и реакции метаболического превращения ПАУ у млекопитающих и насекомых значительно различаются. У первых - это образование диолэпоксидов, дающих массивные аддукты с ДНК и, в меньшей мере, образование хинонов, которые, восстанавливаясь до семихинонов, генерируют активные формы кислорода [Flowers-Geary, 1996]. У вторых - преимущественное превращение в хиноны [Фукс, 1990]. Стерически затрудненные метилированные ПАУ типа ДМБА не могут образовывать хиноны и активируются только путем образования диолэпоксидов. БП активируется обоими путями, но он же индуцирует и экспрессию НАД(Ф)Н:хинон оксиредуктазы-1, которая превращает хиноны в гидрохиноны, ингибируя их превращение в семихиноны и активные формы кислорода [Monks, 1992]. MX, как и ДМБА, имеет метильную группу, что по-видимому, ограничивает его генотоксическое действие через образование хинонов н активных форм кислорода. При низком уровне активации изоформами, заменяющими в этом процессе CYP1A1, это приводит к низкому, в сравнении с млекопитающими, генотоксическому эффекту у дрозофилы.

Этим же объясняется и низкая частота опухолей wts, индуцированных другими ПАУ, как замещенными, так и не замещенными. При этом, однако, различия между канцерогенными для млекопитающих и практически не канцерогенными ПАУ сохраняются и у дрозофилы. Частота опухолей, индуцированных слабо канцерогенными 2-НФ, 1-НП и более канцерогенным 1,2,5,6-ДБА в эксперименте была выше, чем у неканцерогенного 1,2,3,4-ДБА.

Несмотря на несоответствие в экспрессии отдельных изоформ метаболизирующих ферментов, тест на индукцию опухолей wtsP4 и wtsP2 не давал ложноположительных результатов и позволял отличать канцерогенные ПАУ от

неканцерогенных, как это было показано и в предыдущей нашей работе [Sidorov, 2001].

В то же время, на канцерогенах других классов мы получили ряд ложноотрицательных результатов, свидетельствующих о том, что не все канцерогены млекопитающих могут быть выявлены на нашей модели. В частности, это относится к азокрасителям. Эти соединения не проявили бластомогенного действия на нашей модели. Частота опухолей, возникших после обработки личинок канцерогенным для печени мышей ОААТ или печеночным канцерогеном крыс 3-МеДАБ не отличалась от неканцерогешюго ДЭАБ и контроля. Это также может быть объяснено отсутствием у дрозофилы изоформы CYP1A1, которая необходима для окисления аминогруппы и превращения проканцерогенных ОААТ и 3-МеДАБ в активные N-сульфооксипроизводные [Decios, 1986].

При действии канцерогенных нитрополиаренов 1-НП и 2-НФ мы получили лишь двукратное по сравнению с контролем повышение частоты опухолей wts. Эти соединения имеют два пути метаболической активации. Основным является их восстановление до активных нитрозопроизводных, второстепенным через превращение в диолэпоксвды, подобно незамещенным канцерогенным ПАУ. По-видимому, у дрозофилы оба процесса выражены слабее, чем у млекопитающих [Andersson, 2009].

В данной серии экспериментов особое внимание было уделено тестированию соединений, связывающихся с макромолекулой ДНК по малой бороздке. Эти соединения обладают высокой аффинностью к ДНК благодаря их способности образовывать водородные и ван-дер-ваальсовые связи по узкой борозде биополимера. Для эксперимента были отобраны классические узкобороздочкые лиганды Hoechst33342 и Hoechst33258 и новосинтезировашые производные бисбензимидазолов MB и МВ(Ас), димер MB - DB11, а также цианиновый краситель SYBR Gold, обладающий свойствами как узкобороздочного лиганда, так и интеркалятора.

При исследовании влияния узкобороздочных лигандов на частоту образования опухолевых клонов wts, мутагенную активность продемонстрировали Ное42, Ное58, MB, МВ(Ас), а также SYBR Gold (рис.1).

Исследование связывания узкобороздочных лигандов с ДНК политенных хромосом in vivo показало, что протестированные соединения при кормлении ими личинок по-разному окрашивают ДНК клеток слюнных желез (рис.4), что, по всей видимости, связано с различной проницаемостью мембраны клеток для каждого из соединений. Так, наибольшая проницаемость была зарегистрирована для

Hoechst33342; меньшая интенсивность окраски ДНК была показана для Hoechst33358, MB, МВ(Ас) и DB11.

Для того, чтобы убедиться, что наши образцы Hoechst33342 и Hoechst33258 не содержат мутагенных примесей и демонстрируют характерное для узкобороздочных бисбензимидазолов отсутствие мутагенного эффекта в тесте на реверсивные мутации на Salmonella typhimurium, а также охарактеризовать новосинтезированные соединения, мы исследовали эти соединения в тесте Эймса на штаммах ТА100 и ТА98,

Рис.1. Частота появления опухолевых клонов н>й при обработке личинок wts/+ НоесЬя332?8. Ноес118Ш342, МВ, МВ(Ас) и РВИ.

6,9*

зд 23 3,1 3,1

4,8*1

V V у у V у -£> «Р V У У V

* j'j" ///

*-частота образования опухолей значимо выше частоты появления клонов у контрольной группы, Р<0,01

Эксперименты по индукции реверсий у сальмонеллы в основной модификации теста Эймса на штаммах ТА98 и ТА 100 в диапазоне концентраций от 5 мМ до 5 мкМ показали, что Hoechst 33258 и Hoechst 33342 не мутагены. Они не вызывают мутации типа замены пар оснований или сдвига рамки считывания, как в присутствии, так и в отсутствии активирующей микросомальной смеси S9.

При определении мутагенной активности димерного производного бисбензимидазолов DB(1I) и цианинового красителя также было показано, что эти соединения не вызывают увеличения частоты реверсий ни в штамме ТА98, ни в ТА100, независимо от наличия или отсутствия активирующей смеси S9.

Мономерные производные бисбензимидазолов MB и МВ(Ас) не проявили мутагенной активности при проведении экспериментов на штамме ТА 100 в

присутствии и в отсутствии активирующей смеси Б9. Однако при тестировании этих соединений на штамме ТА98 при обработке микросомной фракцией печени крыс наблюдалось увеличение количества реверсий для обоих агентов. Количество реверсий при исследовании МВ увеличилось в 7-8,8 раз, в то время как для МВ(Ас) это значение составило 1,8-3,7 раз. Без фракции Б9 ни один из красителей не вызывает увеличения числа ревертантов на обоих штаммах.

Табл.2 Результаты тестирования мутагенного эффекта Hoechst33258, Hoechst33342, MB, МВ(Лс), DB11 и SYBR Gold на индикатоных штаммах Salmonella Typhimurium ТА100 и TA98. _ _

TA98* TA100**

-S9*** +S9 -S9 +S9

Hoechst33258 _**** — — —

Hoechst33342 — — — —

MB — + — —

MB (Ac) — + — —

DB11 — — — —

SYBR Gold — — — —

! * - чувствителен к соединениям, индуцирующим мутации со сдвигом рамки считывания **- штамм, чувствительный к веществам, индуцирующим мутации с заменой оснований *** - наличие или отсутствие активации ферментами микросомных монооксигеназ крыс

**** - мутагенная активность соединения («+» означает наличие, «—» - отсутствие мутагенной активности)

Полученные данные дают основание предположить, что узкобороздочные лигаццы вызывают преимущественно соматическую рекомбинацию. Это хорошо согласуется с результатами опубликованного исследования, направлешюго на тестирование других ингибиторов топоизомеразы I в SMART, в котором была продемонстрирована превалирующая роль соматической рекомбинации в возникновении соматических мозаичных клонов [Frei et al., 1996].

Мы показали, что SMAR-тест на гетерозиготах wts позволяет выявлять потенциальные мутагенные, рекомбиногенные и бластомогенные свойства соединений, вызывающих повреждения ДНК путем нарушения работы ферментов ее метаболизма.

Итак, верификация SMART с использованием гетерозигот по wtsP4 на 26 соединениях, как канцерогенных для млекопитающих, так и слабо канцерогенных и не канцерогенных, показала, что данная модификация теста обладает высокой специфичностью, то есть частота опухолей при действии не канцерогенных для млекопитающих соединений не превышала уровень контроля. Чувствительность метода по отношению к канцерогенам генотоксического действия была полной: все

канцерогены вызвали повышение частоты опухолей wts. При исследовании чувствительности теста к канцерогенам, нуждающимся в метаболической активации, практически все про канцерогены вызвали увеличение частоты появления опухолей. Исключите составили аминоазокрасители, что может быть связано с отсутствием у дрозофилы ферментов, способных активировать эти соединения.

Увеличение чувствительности и разрешающей способности теста.

Усовершенствование системы SMART с целью повышения эффективности выявления потенциально опасных для человека соединений подразумевает, прежде всего, увеличение его чувствительности и разрешающей способности. Это позволит, с одной стороны, уменьшить размер выборки, необходимой для получения достоверного ответа, а с другой стороны, получать достоверные различия при использовании меньших доз тестируемых соединений. В нашей работе были использованы следующие подходы: (1) одновременная инактивация в соматическом мозаичном клоне нескольких генов, влияющих на пролиферацию и запуск апоптоза; (2) подавление запуска апоптоза с помощью РЖ-интерференции Dmp53; (3) получение трансгепной линии дрозофилы с геном р53 человека, имеющем мутацию в ДНК-связывающем домене.

Влияние накопления мутаций по нескольким генам-супрессорам на частоту образования опухолевых клонов.

В рамках данной задачи были впервые получены и охарактеризованы клоны, гомозиготные по гену-супрессору опухолевого роста dco3.

Deo - ген, расположенный в третьей хромосоме, в цитогенетическом районе 100А5,6 -100В 1,2, является необходимым для нормального развития и контроля роста имагинальиых дисков личинки D.melanogaster. Продукт этого гена является гомологом казеиновой киназы I и в норме вовлечен ещё и в регуляцию циркадного ритма. Изучение трёхмерной структуры и последовательности аминокислот данной киназы у разных организмов выявило, что этот белок является высококонсервативным. Мутация dco3 в гомозиготном состоянии является летальной. При этом клетки имагинального диска продолжают делиться дольше, чем при нормальном развитии личинки. В результате развиваются неспособные вступить в метаморфоз гигантские личинки с крупными имагинальными дисками, [Zilian О. et al„ 1999].

Нами было показано, что морфологически эти клоны неотличимы от клонов wts, однако образуются с частотой в 2 раза меньшей, как при спонтанном, так и при индуцированном оксоплатином мутагенезе. По этой причине использование гена dco3

в качестве единственного маркерного гена при создании биотеста не представляло интереса, поскольку не могло привести к увеличению чувствительности системы.

Далее мы исследовали совместное действие пар мутаций р53 и с1со, р53 и с1со и на частоту соматического мозаицизма. В этой серии экспериментов были получены особи, у которых вследствие рекомбинации в соматических клетках, образовывались опухолевые клоны следующих генотипов: (\у15м ёсо3), (р532!9НСШ <1со3), (р53г59Н С1Л При исследовании совместного действия этих пар мутаций

было установлено значимое увеличение частот клонов в сравнении с вариантами без мутации р53. Частота клонов в комбинации с доминантно-негативной мутацией р53 увеличилась в 4,4 раза, а частота опухолей с1со в сочетании с данной мутацией р53-в 1,8 раз:

Генотип клона Частота формирования опухолей

Вода Оксоплатин

3,5% 22,6%

((1со) 1,4% 12,2%

(и^1"2 ¿со") 8,0% 66,7%

(р53№НЬЩ(1со') 3,7% 22,1%

4% 99,6%

Было зарегистрировано неадцитивное увеличение частоты опухолей при анализе гетерозигот по двум генам-супрессорам опухолевого роста ¿со и Так, частота опухолей у цис-дигетерозигот (оба мутантных гена расположены на одной из гомологичных хромосом) превосходила частоту клонов (1со в 6 раз (66,75% против 12,3%), частоту клонов ^ - в 2,7 раз (66,75% и 22,6%), и превышала арифметическую сумму частот клонов с1со и в 1,8 раз (66,75% против 34,9%). Подобный эффект был зарегистрирован и для спонтанного мутагенеза (1,4%+1,98% < 8,02%).

Чтобы исследовать частоту появления клонов при накоплении мутаций по трем генам-супрессорам опухолевого роста, нами были сконструированы ^кс-гетерозиготы по генам и йсо (оба типа гетерозигот имели также доминантно-негативную

мутацию в гене р53, действие которой проявлялось во всех клетках организма, в том

з а из

числе и в опухолевых клонах). У 1/ис-дигетерозигот + н'^ Лсо / р53 + + в основном образовывались клоны, гомозиготные по обеим мутациям. Частота образования клонов (улз (ко Отр53и'") составила 4,4% при спонтанном мутагенезе и 45,1% - при индукции оксоплатином. То есть, при накоплении мутаций по трем генам-супрессорам опухолевого роста мы наблюдали снижение частоты появления опухолевых клонов по сравнению с частотой появления клонов, несущих две мутации. Одним из предположений, объясняющих этот эффект может быть снижение

жизнеспособности соматической клетки при накоплении в ней мутаций по нескольким генам, играющим важную роль в пролиферативной активности и стимуляции апоптоза.

По-видимому, повышение чувствительности системы путем комбинации мутаций в отдельных генах можно ожидать в случае использования генов, ответственных за поддержание нормального клеточного гомеостаза, имеющих неперекрывающиеся функции и сигнальные пути.

Влияние ингибирования гена-супрессора Бгар53 с помощью РНК-интерференции.

Далее мы исследовали возможность увеличения частоты появления опухолевых клонов и увеличения его чувствительности при помощи РНК-интерферентного ингибировани Птр53. Метод РНК-интерференции на сегодняшний день широко используется при модулировании экспрессии генов. По сравнению с введением мутации преимуществами данного метода являются его методическая простота и свобода в выборе мишени для инактивации. Немаловажно, что при РНК-интерференции снижается экспрессия нужного белка, а не нарушается его структура, как в случае внесения мутаций. Известно, что мутация может приводить не только к инактивации таргетного гена, но и к приобретению мутантным белком новых, не характерных для нативного, функциональных активностей (эффект gain-of-function).

Мы изучили влияние ингибирования функциональной активности Отр53 методом РНК-интерференции на частоту формирования опухолевых клонов (рис.2). В результате действия оксоплатина на гетерозигот ^в'4, несущих трансгенный элемент РНК-интерференции р53 в П1 хромосоме, частота образования опухолевых клонов при спонтанном и индуцированном оксоплатином мутагенезе увеличилась.

Влияние ингибирования р53 методом РНК-интерференции на частоту образования опухолевых клонов при действии других канцерогенов было различным. При этом тип повреждения ДНК и класс канцерогенов не оказывали влияния на этот эффект. Например, ДМБА, араноза, бромистый этидий и ННК вызывали одинаковое повышение частоты появления клонов - в 2 раза. В то же время, ввиду того, что частота опухолей в контроле также увеличилась в 3 раза, относительные показатели различий между опытом и контролем снизились таким образом, что в ряде случаев стали не значимыми. Например, при действии канцерогенных нитрополиаренов (I-НП и 2-НФ) на личинок с пониженным уровнем р53 мы не наблюдали значимого увеличения частоты появления опухолевых клонов по сравнению с контрольной группой (7,4% и 8,9% против 8% в контроле), хотя у личинок с нормальной

экспрессией р53 эти же вещества в эквимодярной концентрации индуцировали значимо большее количество опухолей по сравнению с контролем (4,9%; 5.6% против 2,6%, р>0,01).

Рис.2. Частота появления опухолевых клонов при спонтанном и индуцированном мутагенезе у гетерозигот по v/t/4 и у тригетерозигот w;Gal4/+; p53-RNAi +/+ wtsPl1.

. 1

90 80 70 60 SO 40 30 20 10 0

53,4«

8 8 8.9

Зп.2-1 Shin'

<?' /

/// у '

Ж

о*

Ф АС

■J?

•С?

j? Jf г? V

** - частота появления клонов при мутагенезе у гетерозигот по ^ , в - Частота появления опухолевых клонов при спонтанном и индуцированном мутагенезе у тригетерозигот Оа!4/+; p53-RNAi +/+ \у(5Р4,

* - частота статистически значимо отлична от соответствующего контроля. Р < 0,01, наибольший доверительный интервал нигде не превышал ±0,5%.

Для объяснения полученных результатов наиболее вероятными представляются три предположения. Первое состоит в том, что в результате «off-target»- эффекта, либо в результате нарушения регулирования фланкирующих вставку генов, были нарушены какие-то структуры или сигнальные пути, влияющие на выживаемость трансформированных клеток. Второе заключается в том, что экспрессия трансгенных конструктов РНК-интерференции недостаточна для полного ингибирования Dmp53. Оба эти предположения согласуются с опасениями и предупреждениями сток-центра, от которого была получена данная линия [Dietzl et al., 2007]. Третье связано с наличием у дрозофилы р53-независимого механизма контроля стабильности генома, который может активироваться в связи с ингибированием функций р53. Запуск этого пути с последующим арестом клеточного цикла и апоптозом поврежденных клеток происходит не только у дрозофилы. В частности, остановка клеточного цихла в G1-фазе в ответ на внесение в культуру фибробластов ЗТЗ бенз(а)пирена происходила,

наряду с нормальными, также и в клетках с доминантно-негативной мутацией р53 или нокаутных по р53 [Hsing et al., 2000].

Основной р53-зависимый путь апоптоза у дрозофилы связан с изменением экспрессии проапоптотических белков Rpr2, HID, Grim, SKL и JAFRAC2 [Xu D. et al., al, 2009]. Эти белки либо разобщают связи между ингибиторами апоптоза (ШАР) и каспазами, что приводит к активации каспазного каскада, либо препятствуют связыванию DIAP с белком TRAF1, активирующим JNK, что, в свою очередь, тоже приводит к апоптозу.

В основе р53-независимого пути программируемой клеточной гибели у дрозофилы лежит способность к активации JNK-зависимого апоптоза без участия TRAF1. Лиганд семейства TNF связывается с рецептором Wengen, далее происходит последовательное эффскторное фосфорилирование и активация киназ MSN, TakI, HEP и JNK. Этот путь активации апоптоза высоко консервативен и имеет аналоги у многих организмов, в том числе и млекопитающих. In vivo этот вид апоптоза играет значительную роль при устранении аберрантных клонов и при контроле нормального морфогенеза. Возможно, что у личинок с ингибированием Dmp53, нитрополиарены вызывают компенсаторную активацию именно этого пути апоптоза, что и обуславливает отсутствие повышения частоты образования опухолевых клонов у имаго. Таким образом, ингибирование Dmp53 не привело к увеличению чувствительности тест-системы.

Исследование влияния экспрессии мутантного р53 человека на формирование опухолевых клопов у дрозофилы.

Используемые для тестирования канцерогенов млекопитающих организмы должны отвечать определенным требованиям, таким как высокая чувствительность, специфичность отклика, возможность быстрой регистрации ответа, простота содержания в лабораторных условиях и т.д. [Худолей В., 1999]. Однако главной проблемой краткосрочного биотестирования канцсрогеннов является максимальная адекватность применяемых систем молекулярно-биологическим параметрам млекопитающих, а также корреляция регистрируемых ответов системы с канцерогенезом у млекопитающих. К настоящему времени, основным подходом к решению этой проблемы при краткосрочном тестировании на дрозофиле является создание трансгенных линий, экспрессирующих гены млекопитающих.

2 DIAP - Drosophila Inhibitor of Apoptosis Protein, JNK- c-Jun N-terminalkinase, TNF - Tumor Necrosis Factor, TRAF1 - TNF receptor-associated factor 1, YAP - Yes-associated protein, Yki -Yorkie, mats-mob as tumour suppressor.

Для выяснения степени гомологии системы распознавания поврежденной ДНК у дрозофилы и человека в плане ее способности контролировать возникновение опухолей, на первом этапе была создана трансгенная линия дрозофилы, экспрессирующая мутантный р53 человека. Как известно, Бтр53 - это структурный и функциональный гомолог гена р53 человека. Основными функциями Бтр53 являются активация апоптоза и остановки клеточного цикла, в то время как человеческий гомолог данного гена обладает большим количеством функциональных активностей.

Создание трансгенной линии включало в себя несколько этапов: 1) клонирование кДНК человеческого гена р53 с мутацией в плазмидный вектор, содержащий мобильный Р-элемент для интеграции в хромосому дрозофилы; 2) инъекция указанного вектора и хелперной плазмиды, несущей транспозазу, в ранние эмбрионы дрозофилы с целью их трансформации; 3) отбор трансформантов, установление изолиний; 4) картирование полученных Р-инсерций; 5) анализ экспрессии белка

Далее мы провели оценку влияния экспрессии и гиперэкспрессии мутантного р53 человека на частоту соматического мозаицизма.

В качестве контроля были использованы гетерозиготы у\у; \у1эР4/+. Частота спонтанного мозаицизма составила для этих особей 3,1%, индуцированного оксоплатином (1 мг/мл) - 21,9%. Чтобы исключить влияние экспрессии вспомогательного белка ваМ в данной тест-системе, его влияние на частоту формирования опухолевых клонов было исследовано на гетерозиготах Оа14/+; \у1зР4/+. В этих эксперимаентах было показано, что присутствие белка-модулятора экспрессии трансгена не вносит существенный вклад в частоту формирования клонов как при спонтанном, так и при индуцированном оксоплатином мозаицизме (рис.3).

Гетерозиготы \*5Р4 + /+ р53га4С были получены в результате скрещивания ?у\у; р53У234С х ■\уйР4/ТМЗ. У этих особей экспрессия трансгена находилась на среднем уровне. Частота соматического мозаицизма у данных гетерозигот составила -4,8% при обработке 10% ДМСО и 61,3% при обработке оксоплатином 1 мг/мл.

Для исследования влияния гиперэкспрессии мутантного р53 человека на частоту формирования опухолевых клонов в результате скрещивания у\у; р53У234с X V.'; Оа14; •л151"1/ТМЗ были получены тригетерозиготы Са14/+; р53та4С/\"Л5Р4. Мы наблюдали дальнейшее увеличение частоты появления клонов как при спонтанном, так и при индуцированном оксоплатином (1мг/мл) мутагенезе (5,2% и 88% соответственно).

Полученные нами данные свидетельствуют о наличии функциональной гомологии между р53 человека и Бтр53 дрозофилы в плане их способности

контролировать уровень соматических мутаций и рекомбинаций, возникающих как спонтанно, так и при действии генотоксических агентов. Трансгенный р53 человека

Рис.3. Частота появления опухолевых клонов при спонтанном (®) и индуцированном оксоплатином (®) мутагенезе у особей с различной экспрессией трансгенного р53 человека и без него.

*-частота формирования опухолей статистически значимо отлична от частоты образования опухолевых клонов у особей wts/+, Р<0,05;+- частота значимо отлична от частоты появления клонов у дигетерозигот wts/UAS-p53(Y234C), Р<0,01.

оказал такое же влияние на частоту возникновения клонов wts/wts, как ингибирование Dmp53 методом РНК-интерференции или введете доминантно-негативной мутации Dmp53, что свидетельствует о наличии функциональной гомологии между р53 человека и дрозофилы в плане их контроля формирования опухолевых клонов.

Оптимизация системы регистрации результатов SMART на гетерозиготах wts/+.

Учитывая высокую перспективность SMART, одним из подходов к его оптимизации является усовершенствование системы регистрации результатов. Одним из перспективных путей автоматизации этого биотеста может быть визуализация опухолевых клонов в имагинальных дисках на стадии личинки с последующим их автоматическим подсчетом.

Для решения этой задачи мы использовали Gal4/Gal80 регулируемую экспрессию белка GFP (Green Fluorescent Protein). В этой системе экспрессия

флуоресцентного белка находится под контролем иАБ-промотора, активация которого происходит при наличии белка Оа14. 0а180 является ингибитором экспрессии йаЫ. Таким образом, при иаличии 0а180 экспрессия остальных двух белков подавлена.

Путем скрещивания ш; Оа14 иАЗ-бГР; Са180 X \у;+;\«Л5Р4/ТМЗ были получены особи w; Оа14 11А5-ОРР; 0а180/\\*зр4. У таких особей при соматической рекомбинации происходит потеря гетерозиготности по III хромосоме, что приводит к формированию опухолевых клонов. Поскольку генетические регионы уДз и 0а180 находятся рядом, при рекомбинации в большинстве случаев утрачивается 0а180, что приводит к восстановлению экспрессии и ваМ, и йРР. Таким образом, можно наблюдать флуоресценцию клеток мозаичного клона в зелёном диапазоне (498 нм) при освещении его синим светом (395 нм).

Нами были получены светящиеся клоны \v-ts, сформировавшиеся на крыловых имагинальных дисках дрозофилы (рис.5). Области свечения йБР не имели характерной формы и занимали различную площадь крылового диска. Самые большие из них занимали около 1/2 крылового диска. Структура таких имагинальных дисков была значительно изменена, а края не имели чёткой границы. Как было показано ранее, такие изменения морфологии имагинальных дисков характерны для опухолевых клонов и^/Мэ [Хи е! а1, 1995].

Таким образом, мы показали возможность избирательной флуоресцентной визуализации опухолевых клонов в биотесте на гетерозиготах \vts- Возможность автоматизации теста на соматические мутации и рекомбинацию ранее в литературе не обсуждалась. На базе изученной системы может быть создан полуавтоматический метод тестирования канцерогенной активности химических соединений. Решение этой задачи, поможет не только исключить влияние эффекта «других глаз» и значительно уменьшить время тестирования одного агента, но и сделает биотестирование на дрозофиле более доступным для большего числа лабораторий.

Рис.4. Связывание узкобороздочных лигандов с ДНК политенных хромосом ¡n vivo.

Hoechst 33342, 20шМ

Hoechst 33258, 20mM

Рис.5. Экспрессия ОГР в гомозиготных по клетках опухолевого клона, сформировавшегося на крыловых нмагинальных дисках дрозофилы.

выводы

1. Канцерогены млекопитающих с различным типом генотоксического действия способны вызывать опухоли у личинок дрозофилы, гетерозиготных по гену wts. Эта способность продемонстрирована на примере выборки канцерогенов, включающей алкилирующие агенты, соединения, образующие массивные аддукты ДНК или поперечные межнитевые сшивки, интеркаляторы и узкобороздочные лиганды.

2. Опухоли у дрозофилы вызывали канцерогенные полициклические ароматические углеводороды, нитрополиарены, табакоспецифические N-нитрозамины, производные нитрозомочевины, хлорэтиламины, платиносодержащие соединения, интеркалирующие фенантридины и узкобороздочные лиганды бисбензимидазольного ряда.

3. Ложноположительных результатов теста не было (100% специфичность), так как не канцерогенные аналоги этих соединений опухолей не вызывали. Ложноотрицательный ответ был получен в одном случае - для видоспецифичных гепатоканцерогенов грызунов из ряда аминоазокрасителей.

4. Аллели wts отличаются по чувствительности к канцерогенам млекопитающих. Наилучший результат был получен при использовании гетерозигот по аллелю wtsP4. Частота опухолей у гетерозигот по этому аллелю была вдвое выше, чем для

Р2

аллеля wts , использовавшегося ранее.

5. Впервые с помощью данного типа SMART был продемонстрирован мутагенный эффект нетоксичных доз узкобороздочных лигандов, которые не проявляли активности в тесте Эймса. Это свидетельствует о необходимости использовании SMART на дрозофиле при анализе эффектов соединений, обладающих опосредованным генотоксическим эффектом.

6. Показан синергизм эффектов мутаций в генах - супрессорах опухолевого роста dco и wts. Найдено неаддитивное увеличение частоты опухолей при использовании дигетерозигот dco +/+ wts. При накоплении мутаций по трем генам-супрессорам dco, wts и Dmp53 у тригетерозигот было зарегистрировано снижение частоты опухолей относительно дигетерозигот wts+/+ Dmp5 3 259H и dco wts/ ++.

7. Впервые показано, что частота как спонтанных, так и индуцированных опухолей wts у дрозофилы возрастает при ингибировании активности Dmp53 методом РНК-интерференции.

8. Продемонстрирована функциональная гомология между р53 человека и Dmp53 дрозофилы по их способности контролировать уровень соматических мутаций и рекомбинаций, возникающих как спонтанно, так и при действии генотоксических

агентов. Экспрессия мутантного р53 человека в клетках дрозофилы приводит к увеличению частоты появления опухолевых клонов wts/wts.

9. На основании Са14/0а180-регулируемой экспрессии флуоресцентного маркера разработан метод визуализации опухолевых клонов wts у личинок для создания автоматизированного SMART.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кирсанов К.И., Лесовая Е.А., Сидоров Р.А., Белицкий Г.А., Якубовская М.Г. Анализ бластомогенной активности канцерогенов млекопитающих на дрозофиле с использованием аллеля wtsP4 и ингибированием р53 методом РНК-интерференции. Журнал «Генетика», №4, том 47, с. 1-9., 2011.

2. Kirsanov К.1., Lesovaya Е.А., Yakubovskaya M.G., Belitsky G.A. SYBR Gold and SYBR Green II are not mutagenic in Ames test. Mutation Research, №699, p. 1-4, 2010.

3. Хитрово И.А., Кирсанов К.И., Лесовая E.A., Белицкий Г.А., Якубовская М.Г. Результаты сравнительного анализа мутагенной активности флуоресцентных красителей ДНК бромистого этидия и SYBR Gold. Вестник РОНЦ, т.20, №4, стр. 3843, 2009.

4. Kirsanov K.I. Investigation of human p53 function in Drosophila model, The European Association for Cancer Research Newsletters, №1, p:21, 2009.

5. Kirsanov K.I. Five mammalian carcinogens are active in a short-term tumorigenicity assay in Drosophila. Dros. Inf. Serv. 91, pp.77-79, 2008.

6. G.A.Belitsky, K.I.Kirsanov, E.M.Khovanova R.A.Sidorov, E.G.Ugnivenko. Nonadditive combined effect of multiple mutations in tumor suppressor genes on the frequency of hyperplastic mosaic clones in Drosophila imagoes. Drosophila Information Service, 2005, 88:72-74

7. R.A.Sidorov, K.I.Kirsanov, I.D.Alexandrov, M.V. Alexandrova E.M.Khovanova. The influence of the p53 mutation on the tumor frequency in wts/+ heterozygotes. Drosophila Information Service, 2003, 86:105-106.

8. Кирсанов К.И., Белицкий Г.А., Якубовская М.Г. Ингибирование р53 дрозофилы путем РНК-интерференции увеличивает частоту появления опухолевых клонов wts, индуцируемых химическими канцерогенами млекопитающих. Тезисы к19-ой Международной конференции «СПИД рак и общественное здоровье». Русский журнал СПИД рак и общественное здоровье, том14, №1, стр.22, 2010.

9. Sidorov R.A., E.M.Khovanova, Kirsanov K.I., E.G.Ugnivenko. The role of gene white in increase of mosaic clone frequency in D.melanogaster and D.simulans. Abstract book, 47th Annual Drosophila Research Conference, Houston.

Подписано в печать:

28.04.201!

Заказ № 5438 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Принцип профилактической направленности является основополагающим в онкологии. По данным ВОЗ, при правильном проведении профилактических мероприятий можно предупреждать до 33% всех потенциальных случаев рака. Задача первичной профилактики злокачественных новообразований заключается в предупреждении действия неблагоприятных факторов на уровне популяции. Факторы, принимающие участие в злокачественной трансформации клетки, разделяются в настоящее время на генотоксические и негенотоксические. Первое определение предполагает прямое или непрямое повреждение наследственного аппарата клетки, второе очерчивает круг агентов, способствующих проявлению спонтанных или индуцированных другими факторами трансформантов. Эффекты генотоксических соединений многообразны, но главными из них являются те, которые прямо или опосредованно приводят к активации онкогенов, либо инактивации факторов, контролирующих клеточное размножение. Генотоксические соединения являются основой канцерогенного действия табачного дыма, приводящего ежегодно к гибели миллионов людей, в том числе до 500 ООО в России. Большой вклад в онкологическую заболеваемость вносят также другие генотоксические (мутагенные) соединения антропогенного и природного происхождения. В связи с этим первичная профилактика злокачественного роста невозможна без оценки интегральной загрязненности окружающей среды мутагенными соединениями. Основные принципы биологического тестирования химических соединений на мутагенность были сформулированы в начале 70-х годов прошлого века. Эти принципы основаны на идее создания набора или батареи тестов, которые позволяют регистрировать различные типы генетических изменений, и в то же время являются достаточно экономичными. Исследования по биотестированию, предназначенные для экстраполяции своих данных на более сложные организмы, требуют знания механизмов активации и дезактивации канцерогенных соединений, особенностей повреждения и репарации ДНК в данной системе, особенностей роста трансформированных клеток. Кроме того, для использования этих данных в санитарно-гигиенических исследованиях необходимо определение зависимости «доза-эффект» и пороговых допустимых концентраций.

Одним из перспективных краткосрочных тестов является метод соматического мутагенеза и рекомбинации на дрозофиле. Эта группа тестов чувствительна к широкому спектру канцерогенов млекопитающих и позволяет не только выявлять все типы нарушений ДНК, но и дискриминировать их.

D.melanogaster является классическим хорошо изученным объектом исследований молекулярных биологов и генетиков. Эксперименты на данной модельной системе информативны, несложны в выполнении, относительно дешевы. Наличие близких гомологов генов-супрессоров опухолевого роста и онкогенов у дрозофилы и млекопитающих позволяет моделировать процессы индукции и прогрессии опухолевого клона в экспериментах на линиях дрозофилы, имеющих различные генетические модификации.

В нашей лаборатории в 2001 году Сидоровым P.A. впервые была создана тест-система для скрининга химических канцерогенов на дрозофиле, отличающаяся от всех предыдущих тем, что показателем мутагенного действия агента является не изменения структуры или окраски нормального органа имаго, а образование опухоли - процесса, гораздо более приближенного к канцерогенезу. В основу этого метода была положена способность образования соматических опухолевых клонов у гетерозигот по мутантному гену-супрессору опухолевого роста wtsp2 в ответ на действие химических канцерогенов. Вышеописанный метод биотестирования сочетает в себе три важных свойства, по которым можно судить о перспективности его исследования и дальнейшей разработки. Во-первых, в основе данного метода лежит увеличения числа опухолевых клонов в ответ на обработку канцерогенными соединениями. При этом канцерогенная активность агента оценивается по количеству сформировавшихся опухолевых клонов, процесс образования которых не сводится к образованию первичной мутации, а включает в себя ещё и выживание, а также прогрессию опухолевого клона. Во-вторых, в основе данного метода лежит нарушение функции гена-супрессора wts, мутации которого с высокой частотой определяются в клетках мягкотканных сарком человека и мыши.

В то же время, биотестирование на дрозофиле требует дальнейшего приближения к молекулярно-биологическим параметрам млекопитающих, на что и направлено представленное исследование. В техническом плане каждый из методов биотестирования на дрозофиле до сих пор носит некоторый элемент субъективности и зависит от степени квалификации персонала. В связи с этим представляется необходимым разработать автоматизированную систему объективной регистрации эффектов, вызываемых генотоксическими канцерогенами.

Основные цели и задачи исследования

Целями данного исследования были: верификация теста SMART на бластомогенную активность при использовании канцерогенных соединений с различным механизмом действия, усовершенствование теста с использованием современных молекулярно-биологических подходов модулирования активности генов, участвующих в регуляции пролиферации, анализ функциональной гомологии гена-супрессора опухолевого роста дрозофилы и человека. В соответствии с основными целями исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ частоты образования спонтанных w Р4 и индуцированных опухолевых клонов мутантных аллелей wts и wtsP2.

2. Исследовать влияние канцерогенных соединений разных химических классов с различным механизмом повреждения ДНК на частоту формирования опухолевых клонов wts/wts

3. Провести исследование мутагенной и потенциальной канцерогенной активности не изученных ранее классических и новых узкобороздочныхлигандов.

4. Изучить возможность повышения эффективности теста путем сочетания у одной особи мутаций по нескольким генам-супрессорам.

5. Изучить влияние ингибирования Бтр53 методом РНК-интерференции на частоту появления спонтанных и индуцированных опухолевых клонов;

6. Оценить функциональную гомологию гена-супрессора р53 человека, интегрированного в геном дрозофилы, и Ошр53 по их влиянию на частоту возникновения спонтанных и индуцированных химическими канцерогенами опухолей л\1зЛ\1;5.

7. Разработать метод визуализации соматических опухолевых клонов у личинок с перспективой создания системы их автоматизированного подсчёта.

Научная новизна

Впервые проведена сравнительная характеристика гетерозигот \\^Р2/+ и \у1зР4/+ по частоте формирования опухолевых клонов при спонтанном мутагенезе и индукции оксоплатином; впервые проведена оценка вклада одновременных мутаций в двух генах-супрессорах опухолевого роста в частоту появления соматических клонов; впервые исследовано влияние РНК-интерференции Бтр 53 на частоту образования опухолевых клонов и проведена оценка рамок применимости данного метода ингибирования экспрессии генов для теста на соматический мутагенез; впервые создана трансгенная модель, несущая мутантный по 234 кодону аллель р53 человека, и оценено влияние экспрессии этого гена на частоту формирования опухолей у дрозофилы; впервые создана трансгенная модель для исследования взаимного влияния р53 человека и гомолога гена-супрессора ЬАТ81, с мутацией которого ассоциирован ряд опухолей человека; впервые удалось визуализировать опухолевый клон на стадии личиночного развития плодовой мушки.

2. Литературный обзор

6. выводы

1. Канцерогены млекопитающих с различным типом генотоксического действия способны вызывать опухоли у личинок дрозофилы, гетерозиготных по гену wts. Эта способность продемонстрирована на примере выборки канцерогенов, включающей алкилирующие агенты, соединения, образующие массивные аддукты ДНК или поперечные межнитевые сшивки, интеркаляторы и узкобороздочные лиганды.

2. Опухоли у дрозофилы вызывали канцерогенные полициклические ароматические углеводороды, нитрополиарены, табакоспецифические N-нитрозамины, производные нитрозомочевины, хлорэтиламины, платиносодержащие соединения, интеркалирующие фенантридины и узкобороздочные лиганды бисбензимидазольного ряда.

3. Ложноноложительных результатов теста не было (100% специфичность), так как не канцерогенные аналоги этих соединений опухолей не вызывали. Ложноотрицательный ответ был получен в одном случае - для видоспецифичных гепатоканцерогенов грызунов из ряда аминоазокрасителей.

4. Аллели wts отличаются по чувствительности к канцерогенам млекопитающих. Наилучший результат был получен при использовании гетерозигот по аллелю wtsP4. Частота опухолей у гетерозигот по этому аллелю была вдвое выше, чем для аллеля wtsP2, использовавшегося ранее.

5. Впервые с помощью данного типа SMART был продемонстрирован мутагенный эффект нетоксичных доз узкобороздочных лигандов, которые не проявляли активности в тесте Эймса. Это свидетельствует о необходимости использовании SMART на дрозофиле при анализе эффектов соединений, обладающих опосредованным генотоксическим эффектом.

6. Показан синергизм эффектов мутаций в генах - супрессорах опухолевого роста dco и wts. Найдено неаддитивное увеличение частоты опухолей при использовании дигетерозигот dco +/+ wts. При накоплении мутаций по трем генам-супрессорам dco, wts и Dmp53 у тригетерозигот было зарегистрировано снижение частоты опухолей относительно дигетерозигот wts +/+ Dmp5 3259H и dcowts/ ++.

7. Впервые показано, что частота как спонтанных, так и индуцированных опухолей wts у дрозофилы возрастает при ингибировании активности Dmp53 методом РНК-интерференции.

8. Продемонстрирована функциональная гомология между р53 человека и Dmp53 дрозофилы по их способности контролировать уровень соматических мутаций и рекомбинаций, возникающих как спонтанно, так и при действии генотоксических агентов. Экспрессия мутантного р53 человека в клетках дрозофилы приводит к увеличению частоты появления опухолевых клонов wts/wts.

9. На основании Оа14ЛЗа180-регулируемой экспрессии флуоресцентного маркера разработан метод визуализации опухолевых клонов wts у личинок для создания автоматизированного SMART.