Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Особенности дисмутации активных форм кислорода в условиях злокачественного роста

Актуальность работы. Высказанная Хеддоу (1947), Иенсен (1950), Горда (1953) и др., гипотеза о том, что, канцерогенный эффект различных агентов реализуется в организме через образование свободнорадикальных форм, в настоящее время общепризнана. Образующиеся в ходе окисления активированные метаболиты канцерогенов способны индуцировать реакции, которые приводят к сдвигам нормального обмена самих свободных радикалов (Сидорик Е.Б. и др., 1972; Ба-рабой В.А., Бездробная JT.K.,1992). Свободные радикалы могут вызывать мутации в генах, связанных с раком, изменять экспрессию стрессовых генов через активацию путей сигнальной трансдукции (Cerutti P.A., 1994). Получено много данных о канцерогенном действии активных форм кислорода, химически генерируемых или высвобождающихся из фагоцитов, а также образующихся в ходе метаболизма фенольных соединений и гормональных веществ стеринового ряда. Показано, что свободные радикалы кислорода способны вызывать обуславливающие клеточную трансформацию структурные повреждения ДНК, участвовать в регуляции экспрессии протоонкогенов c-fos и c-jun (Bergelson S. et al., 1994; Mazuno M., Pasker L.,1994; Gonzales R., Riordan N.H.,1996; и др.). Интенсивность свободнорадикального окисления в организме во многом зависит от эффективного функционирования ферментативной антиокислительной системы защиты, ключевым звеном которой является супероксиддисмутаза (СОД). Несомненно, что выяснение роли этого фермента в патогенезе злокачественных опухолей является актуальным. Так, работами многих авторов было показано, что активность СОД в организме животных, начиная с ранних стадий опухолевого роста, снижается и достигает минимальных значений к моменту их гибели (Пес-кин A.B., Збарский И.Б,1984; Симонян М.А. и др., 1985; Avila et al.,1988). Отмечалось снижение активности СОД и в самих опухолях (Oberley L.W., Buettner G.R.,1979; Bartoli et al.,1980). Вместе с тем результаты ряда исследований показали увеличение активности фермента в ткани рака молочной железы (Beanchi M.S. et al., 1992) щитовидной железы (Филенко В.А. и др., 1999). Зарегестрирована также высокая иммунореактивность СОД в клетках рака шейки матки (MasahideS. et al., 1993).

Хотя данные об изменениях активности СОД при злокачественных забо-леваних противоречивы, считается целесообразным наряду с общей активностью изучение и изоферментного спектра СОД, так как, по мнению A.M. Голубева (1984), именно изоферменты играют важную роль в изменении обмена веществ при опухолевой патологии.

Основной формой супероксидцисмутазы в плазме, лимфе и синовиальной жидкости является внеклеточная СОД, источником которой служат эндотелиальные клетки сосудов (Дубинина Е.Е.,1995; Marklund,1985; Karlson, Marklund,1987). Физиологическая роль этого изофермента недостаточно изучена, но его эффективное действие в снижении уровня 02 объясняют способностью внеклеточной СОД связываться с цитоплазматической мембраной за счет рецептора гепарансульфата (Johansson М.Н. et al.,1990). Это представляется интересным, поскольку известно, что процессы дестабилизации клеточных мембран опережают другие патологические изменения в клетке, что может выдвинуть на первый план роль рецепторных путей защитного действия антиоксидантов на клеточный метаболизм.

С другой стороны, важным показателем степени изменения метаболической активности клеток и деструктивных процессов в различных органах и тканях являются продукты катаболического распада клеточныхрецепторов -R-белки (Куль-берг А.Я. и др., 1989). И.М. Петяевым и А .Я. Кульбергом (1988) было установлено, что R-белки способны с высокой скоростью дисмутировать супероксидный анион-радикал. Было также показано, что уровень R-белков положительно коррелировал с интенсивностью генерации 02~ и уровнем перекисного окисления липидов (Агуреев А.П. и др., 1992) и служил критерием оценки степени тяжести патологических процессов (Яковлева Н.И. и др., 1986).

В связи с вышеизложенным представляется актуальным выяснить, какие факторы определяют супероксидустраняющую функцию сыворотки крови организма-опухоленосителя, и каков вклад в этот процесс СОД и других белков, обладающих супероксиддисмутирующей активностью.

Цель исследования.

Выявить особенности дисмутации супероксидного анион-радикала в организме в условиях злокачественного роста и при противоопухолевых воздействиях.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Изучить способы дисмутации супероксидных анион-радикалов в крови и немалигнизированных органах (печень, легкие) крыс в динамике химического канцерогенеза, роста опухоли и при противоопухолевом воздействии.

2. Сравнить особенности дисмутирования супероксидного анион-радикала в сыворотке крови людей при различных пролиферативных состояниях - беременность, злокачественные новообразования, хронические воспалительные заболевания; доброкачественные опухоли.

3. Изучить биохимические свойства фракций сыворотки крови, обладающих супероксидустраняющей активностью, и их влияние на рост перевивных опухолей.

4. Определить возможности клинического применения найденных особенностей дисмутации супероксидных анион-радикалов в крови онкологических больных.

Научная новизна исследования.

В диссертационной работе впервые на модели химического канцерогенеза и росте перевивной опухоли найдена перестройка процессов утилизации супероксидных анион-радикалов в организме опухоленосителя, в результате которой в сыворотке крови появляются фрагменты эпимембранных клеточных рецепторов, обладающие значительной супероксидустраняющей активностью.

Впервые в сыворотке крови больных злокачественными новообразованиями различных локализаций (II-III стадии процесса), а также беременных женщин обнаружены фракции бежов, обладающих супероксидустраняющей активностью и являющихся подуктами катаболизма клеточных рецепторов. Показано наличие у этих бежов органотропных свойств: у онкологических больных они проявляют тропность к антигенам тканей тех органов, в которых либо уже имеет место злокачественный процесс, либо он возникнет в скором времени (рецидив, метастаз).

Впервые показано, что фракция сыворотки крови онкологических больных, содержащая белки с супероксидустраняющей активностью, стимулирует рост перевивной саркомы у крыс, в отличие от истинной Си,2п-С0Д, которая его замедляет.

Практическая значимость исследования.

Результаты работы дополняют и конкретизируют существующие представления о способах дисмутации супероксидных анион-радикалов в условиях злокачественного роста. Исследования супероксидустраняющей активности сыворотки крови онкологических больных при различных видах специфического противоопухолевого лечения позволили метаболически обосновать понятие "III клиническая группа". На основании полученных данных для онкологической клиники предложены "Способ диагностики рецидивов и метастазов рака" (патент №2082984) и "Способ диагностики первичного очага злокачественной опухоли" (Реш. о выдаче патента №8114289/14 (015626) от 15.09.99), позволяющие предсказать появление рецидива или метастазов заболевания с указанием конкретного органа поражения за 3-36 месяцев до их клинического проявления, определить недиагностируемый очаг злокачественной опухоли различной гистоструктуры с указанием конкретного органа ее локализации при наличии только отдаленных метастазов.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Методы "Способ диагностики рецидивов и метастазов рака" и "Способ диагностики первичного очага злокачественной опухоли" внедрены и применяются в клинике Ростовского научно-исследовательского онкологического института. Данным методам обучены 2 специалиста на рабочем месте.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Развитие злокачественного процесса сопровождается перестройкой процессов инактивации активных форм кислорода с появлением в сыворотке крови супероксидустраняющей активности, характерной для древних форм жизни.

2. Противоопухолевые воздействия, сопровождающиеся выраженным клиническим эффектом, приводят к обратной перестройке метаболизма с восстановлением приоритета ферментативной формы утилизации супероксидного радикала.

3. Выявление в сыворотке крови белков с супероксидустраняющей активностью является перспективным для выявления первичного очага опухоли, а также клинически не манифестированных рецидивов и метастазов.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на конференции "Биоантиок-сидант" (Москва, 1998), IV Всероссийской конференции "Паллиативная помощь в онкологии" (Анталия-Москва,1999), Международной конференции "Свобод-норадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 1999), юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию Б. А. Саакова "Механизмы некоторых патологических процессов в эксперименте и клинике" (Ростов-на-Дону, 1999), Пленуме Правления Всероссийского научного медицинского общества онкологов (Ростов-на-Дону, 1999).

Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института 15 апреля 1999 года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 работ. Получен 1 патент РФ,1 решение о выдаче патента РФ и 1 приоритетная справка на предполагаемое изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 150 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 98 отечественных и 108 зарубежных источников. Наглядный материал представлен 2 таблицами и 27 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Начиная с 1 недели химического канцерогенеза, в сыворотке крови экспериментальных животных определяется супероксидустраняющая активность продуктов катаболического распада клеточных рецепторов. Указанной активностью обладает гамма-глобулиновая фракция, связывающая Ре2+. Начиная с 5 недели канцерогенеза в эритроцитах, а с 9 недели и в немалигнизи-рованных органах - печени и легких, супероксидустраняющая активность становится ведущей формой утилизации активных форм кислорода.

2. Экспериментальная терапия свидетельствует о патогенетической значимости такой формы утилизации супероксидных радикалов для развития и роста злокачественных новообразований.

3. Супероксидустраняющая активность сыворотки крови является частью "метаболической" толерантности, обусловливающей охрану "чужого" в "своем" при злокачественной пролиферации и беременности как "доброкачественном" пролиферативном процессе.

4. Элиминация из сыворотки крови белков, обладающих супер оксиду ст-раняющей активностью, и восстановление приоритетной формы утилизации активных форм кислорода является универсальным механизмом реализации клинического эффекта при различных вариантах противоопухолевых воздействий.

5. Органотропные свойства белков, обладающих супероксидустраняющей активностью, позволили разработать способы доклинического выявления первичного очага злокачественной опухоли, ее рецидивов и метастазов и планировать индивидуальную схему лечения больных раком.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени накоплен большой фактический материал, подтверждающий гипотезу о том, что процессы свободнорадикального окисления играют важную роль в злокачественной трансформации клеток и последующем росте и развитии опухолей (Сидоренко Ю.С.,идр., 1999; Cerutti P.A., 1994; Bergelson S. et al.,1994; Gonzales M.J, Riordan N.H.,1996; Маеда, Акаи-ке, 1998; и др.). В рамках этой теории было изучено участие антиоксидант-ных ферментов в патогенезе злокачественных новообразований. Были показаны изменения активности супероксиддисмутазы в связи с интенсивностью клеточного деления, степенью дифференцировки новообразований, стадией опухолевого процесса (Поляков В.М. и др.,1986;Уап Balgoy J., Roberts Е., 1978; Bartoli G.M. etal.,1982; Saito K. et al., 1986; и др.). Однако, до сих пор не выяснено, как осуществляется дисмутация супероксидных радикалов в плазме крови опухоленосителя. Это представляется важным, поскольку известны данные о том, что эффективно дисмутировать супероксид могут комплексы антител с антигенами, продукты распада клеточных рецепторов (Петяев И.М., Кульберг А.Я.,1988; Кульберг А.Я. и др., 1988), т.е. вещества, уровень которых в крови при различных заболеваниях может значительно возрастать.

Конкретизация представлений о том, какие факторы определяют суперок-сидустраняющую активность сыворотки крови организма-опухоленосителя, необходима для дополнения существующих данных о метаболизме свободных радикалов кислорода при злокачественном процессе. В связи с этим целью данной работы явилось выявление особенностей дисмутации супероксидного анионрадикала в условиях опухолевого роста и противоопухолевых воздействий.

Экспериментальная часть исследования была выполнена на белых беспородных крысах самцах и самцах крыс линии Вистар массой 150-180 г. Индукцию сарком воспроизводили путем введения под кожу спины канцерогена -3,4-бензпирена, либо суспензии клеток С-45. Материалами исследования были сыворотка и лизаты крови, гомогенаты печени и легких, полученные от экспериментальных животных.

Изучение электрофоретического спектра СОД крови крыс в динамике химического канцерогенеза показало, что, начиная с 1-й недели после инъекции 3,4-бензпирена и вплоть до выхода опухоли - 22-23-я недели, в сыворотке крови экспериментальных животных определялись зоны супероксиддис-мутирующей активности, не устраняемой ингибиторами Си,2п-С0Д - азидом, цианидом, диэтилдитиокарбаматом. Найденная активность ингибиро-валась анти-Я-реагентом, представляющим собой антисыворотку к продуктам катаболического распада клеточных рецепторов. В сыворотке крови контрольных животных подобная картина не отмечалась.

Е.В. Ткаченко и соавт. (1996) было показано, что уже в первые дни индуцированного 3, 4-бензпиреном канцерогенеза в функционировании ферментативной антиокислительной системы крови крыс, представленной в работе супероксиддисмутазой, каталазой и пероксидазой, происходили значительные изменения, которые выражались в нарушении работы естественного каскада антиокислительных энзимов. Возможно, что в результате воздействия канцерогена у животных развитие стресс-реакции, переходящей из звена адаптации в звено повреждения, завершается изменением метаболизма активных форм кислорода. А появление в сыворотке крови неспецифической супероксиду страняющей активности на 7-е сутки после введения 3,4-бензпирена можно считать критическим моментом в развитии химического канцерогенеза.

Логично предположить, что источником найденной активности могли служить эпимембранные участки рецепторов прежде всего эритроцитов как количественно преобладающих клеточных элементов крови. До сих пор считалось, что в эритроцитах присутствует лишь Си^п-СОД, при этом мембраны этих клеток не рассматравались в качестве источника дисмутазной активности. Между тем существуют данные, что эффективно дисмутировать супероксидные радикалы способны продукты катаболизма рецепторов, присутствующих на мембранах клеток различных тканей (Кульберг А.Я. и др., 1988).

Применяемые аналитические методы определения активности СиДп-СОД включают в себя этап выделения фермента из биологических образцов органическими растворителями (Beauchamp, Fridovich, 1971; Fried, 1975), что приводит к утере ценной информации о способах утилизации активных форм кислорода в клетках организма (Garner A. et al, 1984). Изменив смесь для выделения СОД на среду, содержащую детергент тритон Х-100 в трис-HCl буфере, рН 7,8, мы исследовали полученные таким образом лизаты эритроцитов, сравнивая их с традиционно приготовленными хлороформ-этанольны-ми лизатами.

В "тритоновых" гемолизатах контрольных крыс присутствовало две фракции инактивации супероксидного анион-радикала, идентифицированные с помощью ингибиторного анализа азидом, цианидом, ДДК и анти-Я-реагентом.

Для доказательства связи неизвестной фракции с клеточными рецепторами мы электрофоретически изучили лизаты (хлороформ-этанольные и "три-тоновые") и супернатант культуральной жидкости нативных и подвергнутых термическому воздействию (попеременная инкубация в течение 30 мин при +4° и при + 37°С) эритроцитов с параллельным проведением вышеописанного ингибиторного анализа. Было найдено, что при диск-электрофорезе хлороформ-этанольные экстракты имели одну зону СОД-активности, соответствующую медьцинксодержащей изоформе фермента, тогда как "трито-новые" лизаты имели две зоны дисмутирующей активности - Си,2п-С0Д и ингибируемую анти-R-реагентом. В супернатанте культуральной жидкости определялась только Си,2п-С0Д. После термического воздействия в обоих видах лизатов эритроцитов оставалось по одной фракции дисмутирующей активности, в то время как в культуральной среде их стало две. Появившаяся в культуральной жидкости вследствие термического воздействия на эритроциты, дополнительная фракция, во-первых, по электрофоретическим характеристикам совпадала с исчезнувшей фракцией "тритонового" лизата, а, во-вторых, ее активность ингибировалась анти-Я-реагентом. Следовательно, после термического шока в культуральной среде эритроцитов обнаруживались эпимембранные клеточные образования, что соответствует данным литературы о высокой лабильности рецепторного аппарата и способности клеток "сбрасывать" эпимембранные участки в ответ на патологическое воздействие (Кульберг А.Я.,1986).

Электр о фор етический анализ хлороформ-этанольных образцов показал, что в сроки канцерогенеза от 1 дня до 22 недели изменений в электрофорети-ческом спектре СОД эритроцитов не отмечалось: на денситограммах и у контрольных, и у опытных животных выявлялось по одному четкому пику, принадлежащему Си,2п-С0Д.

Начиная с 5-й и вплоть до выхода опухоли на 22-23 неделе химического канцерогенеза на денситограммах "тритоновых" гемолизатов крыс обнаружено увеличение ингибируемого анти-Я-реагентом пика супероксидустраня-ющей активности, в то время как величина пика Си,2п-С0Д снижалась. Аналогичные качественные и количественные изменения супероксидустраняю-щей активности наблюдались и в немалигнизированных тканях органов экспериментальных животных - печени и легких, начиная с 9-й недели канцере-генеза: активность Си,2п-С0Д снижалась и возрастала ингибируемая анти-II-реагентом активность.

Т.о., в динамике химического канцерогенеза в крови и немалигнизированных органах - печени и легких, экспериментальных животных происходили значительные изменения в метаболизме активных форм кислорода. Активность Си^п-СОД частично замещалась на супероксидустраня-ющую активность мембранных рецепторов, в результате чего в сыворотке крови выявлялась неспецифическая супероксидперехватывающая активность, ингибируемая антисывороткой к продуктам катаболического распада клеточных рецепторов.

Для доказательства патогенетической значимости найденных нами в динамике химического канцерогенеза перестроек метаболизма активных форм кислорода была предпринята попытка изучить изоферментный спектр СОД при экспериментальном противоопухолевом воздействии, поскольку показано восстановление активности антиоксидантных ферментов в случае эффективной противоопухолевой терапии в эксперименте (Бабенко Г.А. и др., 1986; Гуревич С.М. и др.,1993; Щербатюк Т.Г., 1997).

Среди изученных антиоксидантов особое место занимают соединения селена, с одной стороны активирующие ферментативное звено антиокислительной защиты, а с другой стороны - обладающие выраженными антибластом-ными свойствами (Рзаева H.A., и др., 1985; Бабенко Г.А. и др., 1986; Гусейнова P.A. и др.,1986; и др.). В качестве противоопухолевого агента мы применили селенорганический препарат П-3, противоопухолевые и антиоксидант-ные свойства которого были изучены ранее (Козлова М.Б. и др., 1984; Поляков В.М. и др., 1986).

На 7-е, 14-е и 21-е сутки от момента перевивки саркомы 45 из бедренной вены крыс забирали кровь, в сыворотке, хлороформ-этанольных и "тритоно-вых лизатах" которой изучали изоферментный спектр СОД методом диск-электрофореза.

Было показано, что в хлороформ-этанольных экстрактах крови интакт-ных животных определялась одна зона Си^п-СОД, а в тритоновых лизатах - одна полоса принадлежала медьцинкзависимой СОД, а другая, ингибируе-мая анти-Я-реагентом, - продуктам катаболизма клеточных рецепторов. В сыворотке крови интактных крыс супероксидустраняющая активность не обнаруживалась.

Через 7 дней после перевивки С-45 в сыворотке крови опухоленосителей регистрировалась супероксидустраняющая активность, ингибируемая анти-R-реагентом, определяемая и на 14-й день от момента перевивки. В "тритоновых" гемолизатах этой серии животных отмечалось увеличение зоны активности, ингибируемой анти-К-реагентом, что соответствовало изменениям, обнаруженным нами на 5-й неделе химического канцерогенеза. Размер опухолей у крыс в этот срок соответствовал горошине.

К 14-му дню исследования в хлороформ-этанольных и "тритоновых" лизатах данной серии животных происходила унификация супероксидустраняющей активности: выявлялся только один соизмеримый пик, принадлежащий Cu,Zn-СОД. Сопоставляя электрорфоретические спектры "тритоновых", хлороформ-этанольных лизатов и сыворотки крови крыс в этот срок с форетической картиной лизатов и культуральной жидкости подвергнутых термошоку эритроцитов можно отметить их сходство. Вероятно к этому сроку исследования проявлялось стрессорное действие опухоли на организм, сопровождаемое сбросом клеточных рецепторов.

К 21-м суткам от момента перевивки С-45 унификация электо-рофоретической картины "тритоновых" и хлороформ-этанольных лизатов крови этой серии крыс сохранялась, однако, зоны СОД-активности были слабо выражены. Эти результаты свидетельствуют о снижениии активности СиДп-СОД и согласуются с данными литературы (Комов В.П. и др., 1981; Пескин A.B., Збарский И.Б.,1984; Oberley, Buettner,1979; Avila et al.,1988). Масса опухолей у животных в этот срок исследования составляла 16,2+1,8 г., что обычно соответствует конечной стадии экспериментального опухолевого процесса. Примечательно, что супероксидустраняющая активность в сыворотке крови к этому сроку не определялась.

В сыворотке крови интактных животных, получавших П-3 по указанной схеме, также не найдено супероксидустраняющей активности. При этом на 14-е сутки опыта как в "тритоновых", так и в хлороформ-этанольных лиза-тах увеличивалась зона Си,2п-С0Д. По-видимому, П-3 способен изменять активность медьцинксодержащего изофермента, чем и объясняется возрастание пика дисмутации на денситограммах. В целом, к 21-му дню исследования электрофоретическая картина крови этой серии животных соответствовала таковой у интактных крыс.

При электрофоретическом исследовании крови крыс - носителей С-45, "леченых" П-3, были обнаружены четкие различия в характере дисмутирования супероксидного радикала в зависимости от эффективности проведенной терапии. Так, на 7-е сутки от момента перевивки опухоли (животные получили половину курсовой дозы П-3) в сыворотке крови крыс, оставшихся впоследствии резистентными к проведенной противоопухолевой терапии, выявлялись пики супероксидустраняющей активности, ингибируемые анти-Я-реаген-том, но не азидом, цианидом, ДДК. В целом, картина крови у этой серии животных соответствовала таковой у крыс-опухоленосителей, не получавших П-3. Масса опухолей на момент забоя составляла 12,5 ± 1,3 г.

В серии крыс с выраженным терапевтическим эффектом от введения П-3 супероксидустраняющей активности в сыворотке крови не обнаруживалось нив один из сроков исследования, афореграммы "тритоновых" и хлороформ-этанольных лизатов соответствовали таковым у здоровых животных.

Проведенная экспериментальная противоопухолевая терапия подтвердила патогенетическую значимость найденных в условиях химического канцерогенеза перестроек метаболизма активных форм кислорода, результатом которых служило появление в сыворотке крови белков с супероксидустраняющей активностью.

Участие свободных рад икалов, природных и синтетических антиоксидантов в регуляции клеточной пролиферации не вызывает сомнений (Бурлакова Е.Б. и др., 1975). Показано изменение активности СОД при различных состояниях организма, которые сопровождаются повышенным уровнем клеточного деления: регенерирующие ткани (Вартанян J1.C. и др., 1992 и др.), рост и созревание плаценты, беременность (Погорелова Т.Н. и соавт., 1999; Van Hien P. et al., 1974; Tamotsu Y. et al., 1979), различные хронические воспалительные процессы (Логинов А.С. и др.,1991, AdachiT. et al.,1983; Huang Y. et al.,1991 и др.), злокачественные новообразования (Ларионова В.Б.,1990; Михаевич О.Д.,1992; Фран-циянц Е.М.,1995; Laslo A. et al, 1990; и др.) и т.д.

В связи с этим представлялось интересным изучить супе-роксидустраняющую активность сыворотки крови онкологических больных с различными стадиями процесса и локализаций опухолей и сравнить полученные данные с результатами аналогичного исследования сывороток крови больных хроническими воспалительно-пролиферативными заболеваниями и доброкачественными опухолями.

Было найдено, что в сыворотке крови здоровых доноров, а также больных хроническими воспалительно-пролиферативными заболеваниями, такими как хронические пневмонии, холециститы, панкреатиты, гепатиты, гастриты, колиты, эрозии шейки матки, мастопатии и др., и доброкачественными опухолями супероксидустраняющая активность не выявлялась.

При электрофоретическом исследовании сывороток крови онкологических больных (1-Ш стадии процесса) обнаруживались 1-3 зоны дисмутации супероксидного анионрадикала, активность которых не подавлялась азидом, цианидом, ДДК, а устранялась анти-Я-реагентом. Причем анти-Я-реагент в концентрации от 1:1 до 1:150 полностью ингибировал найденную активность; при концентрации анти-Я-реагента от 1:150 до 1:250 пики супероксидустра-няющей активности постепенно принимали первоначальный вид. Не найдено какой-либо зависимости количества и общей площади пиков от локализации и гистоструктуры опухоли.

Поскольку супероксидустраняющая активность сыворотки крови больных со злокачественными новообразованиями устранялась антисывороткой к эпимембранным участкам клеточных рецепторов, мы исследовали способность эритроцитов "сбрасывать" внеклеточные участки рецепторов во внешнюю среду. Результаты опытов по термическому воздействию, проведенных на эритроцитах здоровых доноров, полностью соответствовали таковым, проведенным на эритроцитах интактных крыс. Следовательно, источником супероксидустраняющей активности в сыворотке крови онкологических больных могли служить продукты катаболического распада клеточных рецепторов эритроцитов. Показано, что в процессе злокачественного роста происходят значительные нарушения регуляторной функции мембран клеток опухоленосителя, следствием которых являются изменения физико-химических свойств клеточных рецепторов (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П.,1982). Причем измененный рецепторный аппарат имеют и клетки тканей немалигнизированных органов, и клетки самой опухоли. Исследование клеток рака яичников, выделенных из асцитической жидкости больных раком яичников асцитной формы (IV стадия процесса), после термошока показало, что они также могут служить источником супероксидустраняющей активности, не подавляемой ингибиторами СОД, а устраняемой анти-R-pea-гентом.

Для выяснения органоспецифичности найденной активности сыворотку крови онкологических больных инкубировали с тканями органов трупов лиц, умерших от острой сердечной недостаточности, либо случайных травм, после чего полученные образцы исследовали электрофоретически. Было установлено, что каталитическая активность исчезала после инкубации с тканями тех органов, в которых у больных имел место злокачественный процесс, т.е. проявлялась ее орагнотропность.

После радикального лечения больных раком легкого и шейки матки, выписанных из стационара в III клинической группе, пики супероксидустраняющей активности в сыворотке крови отсутствовали. При возникновении у больных рецидива заболевания, процесса метастазирования, а также наличия первично неизлеченной опухоли в сыворотке их крови появлялись зоны дисмутирующей активности, истощаемой антигенами соответствующих тканей. Исчезновение супероксиддисмутирующей активности отмечалось и в терминальной стадии заболевания.

Т.о., супероксиддисмутирующая активность сыворотки крови онкологических больных идентична каталитической активности, найденной в сыворотке крови животных при химическом канцерогенезе и опухолевом росте, и является патогенетическим фактором в развитии опухолевой болезни.

Давно известно, что аналоги признаков, присущих злокачественным опухолям, таких как метастазирование, инвазивный рост, высокий потенциал клеточного деления, можно встретить в различных типах клеток в процессе индивидуального развития организма. При этом до сих пор не обнаружено ни одного специфического для онкогенеза вещества или свойства, которые не встречались бы в нормальных клетках в различные сроки их роста и созревания (Шапот B.C., 1982). С этих позиций интересно было изучить супероксидустраняющую активность сыворотки крови при развитии естественного пролиферативного процесса, каким является беременность.

Электрофоретическое исследование сывороток крови женщин в различные сроки физиологической беременности показало, что су-пероксидустраняющая активность в них выявлялась, начиная с 7 дней задержки менструации. Обнаруженная активность устранялась анти-Я-реагентом, но не ингибиторами Си,2п-С0Д - азидом, цианидом, ДДК; это дало основание предполагать, что найденная супероксидустраняющая активность обусловлена продуктами катаболического распада клеточных рецепторов. Известно, что процессы эмбрио- и онкогенеза сопровождаются рядом сходных этапов развития, первый период которых начинается с воздействия на клетку инициирующего фактора и заканчивается образованием содержащих "критическую массу клеток" онкосфероидаи бластоцисты (Винницкий В.Б., 1990). Очевидно, параллельно с этим формируется общее для эмбрио- и онкогенеза состояное толерантности иммунной систтемы, направленное на программу охраны "чужого в своем" (Васильев Н.В.,1972). Возможно, что "сигнал" о такой перестройке в метаболизме организма, при котором чужеродные клетки - онкосфероид и бластоциста, избегают иммунного надзора хозяина и активно размножаются, поступает из трансформированной инициирующим фактором клетки.

Для подтверждения этого предположения было проведено электрофоретическое изучение аспиратов из полости матки, полученных при вакуумэкст-ракции. Тщательная отмывка аспиратов от крови исключала попадание в материал сывороточных белков. Применяя ингибиторный анализ анти-Я-реагентом, азидом, цианидом, ДДК, мы установили, что в аспирационном материале присутствовали бежи, обладающие супероксидустраняющей активностью, аналогичные найденным в крови беременных женщин.

При истощении сыворотки крови беременных женщин антигенами ткани матки супероксидустраняющая активность в исследуемых образцах исчезала, что свидетельствовало о наличии у данных белков органотропных свойств.

Имеются сведения о коррелятивной связи процессов имплантации и появлением сильных антигенных свойств (Винницкий В.Б.,1990), а в крови женщин с нормальной и особенно патологически протекающей беременностью обнаруживаются антиплацентарные антитела, которые могут являться причиной прерывания беременности (Трунова Л .Д., 1975). В связи с этим важным представляется факт, что у беременных женщин с угрозой выкидыша, который вскоре имел место, супероксидустраняющая активность в сыворотке крови не ингибировалась антигенами матки.

При сроке физиологической беременности 14-16 недель в крови женщин продолжала выявляться супероксидустраняющая активность, однако она не ингибировалась антигенами ткани матки. Данный срок исследования примечателен тем, что к этому времени происходит полное созревание плаценты, т.е. заканчивается ее рост и инвазия в стенку матки.

В 33-34 недели беременности супероксидустраняющая активность в сыворотке крови электрофоретически не выявлялась.

Сравнительный анализ результатов изучения супероксидустраняющей активности сыворотки крови онкологических больных и женщин в процессе беременности позволяет высказать предположение об общности биологических законов развития эмбриона и злокачественной опухоли.

Далее представлялось интересным определить, какая из фракций сыворотки крови проявляет супероксидустраняющую активность. Сыворотка крови больных злокачественными новообразованиями различной локализации Т2 ^ хМ0 была разделена на фракции с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в увеличивающемся градиенте ЫаС1. Идентификацию фракций проводили электрофоретически на ацетатной пленке. После хроматографического разделения каждую фракцию исследовали методом диск-электрофореза на наличие супероксиду страняющей активности с использованием вышеописанного ингибиторного анализа.

Было установлено, что бета-глобулиновая фракция сыворотки крови содержала внеклеточную Си,гп-СОД. В гамма-глобулиновой фракции находились белки, супер оксиддисмутирующая активность которых устранялась только анти-Я-реагентом. Ранее А.Я. Кульбергом и соавт. (1988) было показано, что с фракцией связаны продукты катаболического распада клеточных рецепторов - Я-белки, каталитическая активность которых выявлялась в системе ксантин-ксантиноксидаза и ингибировалась анти-И.-реагентом. Аналогичное исследование, проведенное в сыворотке крови больных, получивших радикальное противоопухолевое лечение и находящихся в стадии полного клинического излечения в течение 10-15 лет, выявило лишь наличие в бета-глобулиновой фракции внеклеточной Си^п-СОД. Ни в самой сыворотке крови, ни в ее гамма-глобулиновой фракции патологической супероксиддисмутирующей активности не обнаруживалось.

Поскольку супероксиддисмутирующая активность гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови онкологических больных не подавлялась ДДК, мы предположили, что в этом случае способствовать дисмутации супероксидных радикалов могут другие металлы переменной валентности, например, железо. Окраска гелевых столбиков соответствующими реагентами выявила в зоне дисмутации ионы двхувалентного железа.

И.М. Петяев и А.Я. Кульберг (1988) установили, что в формировании СОД-активности лиганд-рецепторных и иммунных комплексов могут принимать участие ионы Си2+, так как их ферментативная активность ингибировалась ДОК. Следовательно, в сыворотке крови онкологических больных присутствует особая, содержащая железо изоформа рецепторных белков (Я-белков), обладающая антителоподобными свойствами. Этот факт представляет значительный интерес, поскольку способность утилизировать супероксидные радикалы с помощью железозависимых СОД присуща только прокариотам. Изучение белков, обладающих супероксидустраняющей активностью, позволило нам сравнить их с железопорфириновыми пигментами, филогенетически древними соединениями, которые предшествовали появлению ферментативного способа утилизации активных форм кислорода (Коржуев П.А.,1949). Мы полагаем, что в процессе развития злокачественных новообразований организм опухоленосителя перестраивается на наиболее древний путь кислородного метаболизма. При этом дисмутирующие супероксидные радикалы белки работают вне физиологического каскада антиокислителей, что приводит к накоплению Н202-эндогенного токсина, способного обусловить весь симптомокомплекс, присущий опухолевой болезни.

К настоящему времени хорошо известен факт блокады сывороткой крови опухоленосителя различных реакций опухолеспецифического иммунитета. Блокирующие факторы могут быть представлены фрагментами иммуноглобулинов и антителами к ним, опухолевыми и нормальными антигенами и антителами к ним, циркулирующими в крови онкологического больного в виде иммунных комплексов (Донеко Ф.В. и др., 1992; Цыплаков Д.Э. 1995; Kumazawa Н., Hess М.,1991; Schultz J.C., 1994; и др.). Анализ ряда работ по изучению иммунологического статуса животных-опухоленосите-лей и больных злокачественными новообразованиями позволяет предположить, что их иммунная система достаточно сохранена, но функционально направлена на защиту неопластических клеток, а не организма-хозяина (Гордиенко С.П., 1987). Предполагая, что белки гамма-глобулиновой фракции больных раком, обладающие СОД-подобной активностью, причастны к перестройке метаболизма организма, направленной на охрану "чужого" в "своем", мы решили проиммунизировать крыс-опухоленосителей этой фракцией, тем самым еще раз доказав патофизиологическую значимость найденных изменений в утилизации супероксидных радикалов в крови онкологических больных.

Беспородных белых крыс самцов, носителей саркомы С-45, иммунизировали гамма-глобулиновой фракцией, выделенной из сыворотки крови онкологических больных и содержащей белки с супероксидустраняющей активностью. В качестве контроля была проведена иммунизация аналогичной фракцией сыворотки крови излеченных больных. Суспензию, содержащую исследуемые фракции и полный адъювант Фрейнда, вводили в подушечки задних лап и в бока внутрикожно через 7 дней после перевивки опухолей.

При оценке эффективности проведенной терапии было установлено, что у 30% животных, иммунизированных гамма-глобулиновой фракцией сыворотки крови онкологических больных, наблюдалась полная регрессия экспериментальных опухолей. У остальных 70% крыс этой серии в 1,5 раза увеличилась продолжительность жизни по сравнению с контрольными животными, при этом процент торможения роста сарком составил 33,7%.

Ранее сообщалось о способности глобулиновой фракции асцитической жидкости и сыворотки крови животных с карциномой Эрлиха, введенной парентерально, ускорять рост экспериментальных опухолей (Доненко Ф.В. и др., 1992), что может быть, как мы показали, связано с наличием в этой фракции патологических белков с супероксидустраняющей активностью. Результаты данного фрагмента работы показывают принципиальную возможность создания противоопухолевой вакцины, однако, это требует дальнейших исследований.

Давно существует идея об использовании СОД в качестве терапевтического средства при лечении заболеваний, связанных с нарушением метаболизма активных форм кислорода, в том числе и злокачественных новообразований (Крыжановский Г.Н. и др., 1990; Максименко A.B. и др., 1995, 1999; Гусаков И.В.идр.,1995;ЭйсмонтЮ.А.идр, 1999; Reub К. et al., 1983; Saito Т. et al., 1994; и др.). Предполагалось, что экзогенно введенная эритроцитарная СОД, проникая в клетку должна корректировать супероксидзависимые процессы, оказывая тем самым терапевтическое действие. Однако, в действительности препараты Си,2п-С0Д не оправдали в полной мере возлагавшихся надежд из-за высокой иммуногенности фермента, невозможности его проникать через клеточные мембраны и, как следствие этого, короткого срока жизни в кровотоке (Petkau А.,1976; Meisel R., 1992).

Из вышеописанных результатов очевидно, что патофизиологическую значимость для развития опухолевой болезни имеют в том числе и нарушения утилизации активных форм кислорода, происходящие вне клеток организма. Поэтому мы предприняли попытку воздействия на опухолевый процесс с помощью внеклеточной СОД, а также СОД-активного препарата вирусного происхождения (ГПВГ-2).

Крысам - носителям саркомы С-45 внутрибрюшинно вводили по 0,2 мкг ГПВГ-2 в течение 5 дней двумя циклами с интервалом между ними в 7 дней. В аналогичном режиме вводился раствор бета-глобулиновой фракции сыворотки крови онкологических больных, получивших радикальное лечение и находящихся без признаков заболевания в течение не менее 10 лет. Как показали предыдущие исследования, эта фракция сыворотки крови содержала внеклеточный изофермент Си^п-СОД. В обеих группах "леченых" указанными препаратами животных отмечалась 30% регрессия опухолей, а у остальных 70% крыс в - 1,6 раза удлинение продолжительности жизни. Кроме того, у в группе леченых ГПВГ-2 животных наблюдалось на 36,5% торможение роста перевивных сарком.

Оценивая эффективность проведенной терапии, можно сделать вывод, что бета-глобулиновая фракция и препарат ГПВГ-2 обладают выраженным противоопухолевым действием. Полученные результаты открывают перспективы для поиска новых подходов к лечению злокачественных новообразований и созданию лекарственных средств на основе внеклеточных СОД.

С помощью определения супероксидустраняющей активности сыворотки крови как патогенетического фактора развития опухолевой болезни нам удалось создать способы диагностики первичного очага злокачественного процесса, а также его рецидивов и метастазов с указанием конкретного органа-мишени в сроки, предшествующие их клиническому проявлению.

Разработанным нами "Способом диагностики первичного очага злокачественной опухоли", основанном на проведении иммуносорбции в условиях электрофореза, было проведено исследование супероксидустраняющей активности сывороток крови 25 больных, 18 из которых обратились с рядом жалоб на открытый прием в РНИОИ и 7 больных, находившихся в клинике института. У всех больных имели место гистологически подтвержденные отдаленные метастазы без выясненного первичного очага злокачественной опухоли. У 21 из

25 больных (84%) результаты данного лабораторного исследования, указавшего локализацию первичного очага злокачественного процесса, были подтверждены в дальнейшем методами спецдиагностики (пункционная биопсия с последующим гистологическим исследованием, УЗИ и др.) при направленном клиническом обследовании.

Способом диагностики рецидивов и метастазов рака" было проведено исследование сывороток крови 42 больных раком различной локализации (легкое, гениталии, молочная железа, кожа, органы желудочно-кишечного тракта) и различной гистоструктуры. У 34 больных (81%) результаты исследования супероксидустраняющей активности сывороток крови, указывающие на наличие рецидивов или метастазов в различных органах больных в дальнейшем были подтверждены методами спецдиагностики. Необходимо отметить, что указанным способом рецидивы и метастазы выявлялись задолго до их клинического проявления (от 3 мес до 1,5 лет).

Проведенные исследования доказали необходимость учета факта регистрации супероксидустраняющей активности сыворотки крови для ранней диагностики клинически бессимптомно развивающихся злокачественных опухолей, рецидивов и метастазов рака независимо от их гистоструктуры и локализации с целью своевременной коррекции плана лечения онкологических больных.

Применяя "Способ диагностики рецидивов и метастазов рака", мы в ходе динамического наблюдения после специфического лечения обследовали 8 больных раком молочной железы, выписанных из стационара в III клинической группе. Сыворотку крови больных исследовали через 3, 6, 9 месяцев после завершения лечения. У 6 из обследованных больных результаты анализов указывали на возможность развития рецидивов заболевания и метастазов в кости, печень, легкие, мозг, что позже было верифицировано методами спецдиагностики. Следует отметить, что лабораторный прогноз опережал клиническое проявление заболевания на 3-40 месяцев. У 2 больных с помощью данного метода удалось зафиксировать "метаболически обоснованную" III клиническую группу: у них на этапах контрольного обследования суперок-сидустраняющая активность в сыворотке крови не выявлялась, и больные на протяжении 2 лет живут без признаков активации процесса. Данное исследование показало принципиальную возможность доклинического выявления признаков рецидивирования и метастазирования рака молочной железы, а использование его в клинике поможет клиницистам своевременно осуществлять адекватное лечение.

С помощью органотропных свойств белков, обладающих супероксидуст-раняющей активностью, мы пытались выявить возможные метаболические связи неопластических заболеваний кожи с состоянием органов желудочно-кишечного тракта у больных раком кожи. Как показывают клинические наблюдения, злокачественные новообразования кожи чрезвычайно редко мета-стазируют во внутренние органы. Однако, наличие этого заболевания увеличивает вероятность выявления у тех же больных синхронных и метахронных злокачественных опухолей внутренних органов (Гуслицер Л.Н., Цукерман И.М., 1973). А висцеральные злокачественные новообразования внутренних органов, в свою очередь, часто сочетаются с изменениями кожи в виде опухолей, метастазов, паранеопластических заболеваний (Дедкова Е.М., Рабен А.С.,1977; Денисов Л. Е. и др. ,1995). Вместе с тем, биохимических тестов, указывающих на наличие метаболических связей заболеваний кожи и состоянием внутренних органов, до сих пор не предложено.

Нами было обследовано 24 пациента, у 12 из которых был впервые установлен диагноз рака кожи 1-П стадии с единичным очагом поражения, а остальные больные в период от 2 до 20 лет неоднократно подвергались различным видам лечения по поводу первично-множественного или многократно повторяющегося на новых участках лица и туловища рака кожи. У всех больных в сыворотке крови были выявлены пики неспецифической супероксиду-страняющей активности, проявляющие тропность к антигенам ткани кожи. Исследование сродства указанной активности к антигенам тканей органов желудочно-кишечного тракта показало, что в группе больных с единичноочаговыми поражениями рака кожи ингибирование супероксидустраняющей активности антигенами ткани желудка наблюдалось в 66,7% случаев, а антигенами ткани кишечника - в 62,5% случаев. В группе больных с первично-множественным или мультицентрическим ростом опухоли тропность белков с супероксиддисмутирующей активностью к тканям желудка составила 37,5%, а кишечника - 75%.

Как в группе пациентов с единично-очаговым, так и в группе больных с первично-множественным (или мультицентрическим) поражением кожи отмечались случаи, когда патологическая супероксидперехватывающая активность ингибировалась и тканью желудка, и тканью толстого кишечника. При этом такое сочетание в группе больных с единичным очагом поражения кожи встречалосьь в 50% случаев, а у больных с первично-множественным раком кожи лишь у 15%.

Полученные результаты представляют значителььный интерес, поскольку имеются сведения о том, что у больных первично-множественным раком поражение толстого кишечника сочетается с раком кожи в 51, 6% случаев, причем у 40% больных первично-множественный рак дебютирует в виде рака кожи (Денисов Л .Е. и др., 1995). А РеПег на основании проведенного исследования полагал, что мобилизация защитных сил организма после излечения от рака кожи предохраняет от возникновения опухолей других локализаций, в частности рака желудка (цит. по Гуслицер Л.Н., Цукерман И.М., 1973).

Таким образом, полученные нами результаты соотвествуют данным литературы о высокой степени вероятности сочетания рака кожи со злокачественными опухолями желудочно-кишечного тракта (Денисов Л .Е. и др., 1995), а белки, обладающие супероксидустраняющей активностью, могут служить маркерами для дальнейшего изучения метаболичесикх связей раковых заболеваний кожи с физиологическим состояние внутренних органов. Считаем целесообразным при выявлении у больных рака кожи в план обследования включать исследование органов желудочно-кишечного тракта, причем диспансеризация таких больных должна быть пожизненной.

В свете вышеописанных результатов логично было ожидать, что в организме больных злокачественными новообразованиями в случае эффективного противоопухолевого лечения (независимо от вида применяемой специфической терапии) должны будут произойти перестройки метаболизма, направленные на элиминацию из сыворотки крови белков с супероксиддисмутиру-ющей активностью, что служило бы метаболическим обоснованием понятия "III клиническая группа".

Для выяснения механизмов реализации противоопухолевого эффекта и роли супероксидустраняющей активности в патогенезе опухолевых заболеваний мы провели электрофоретическое исследование сыворотки крови больных раком шейки матки на этапах различных видов противоопухолевого лечения, законченного с выраженным клиническим эффектом.

В качестве основного метода лечения была использована сочетанная лучевая терапия с традиционным чередованием доз внутриполостного и дистанционного облучения (I группа). Учитывая распространенность процесса, больным назначалась предлучевая подготовка: в лимфососуды нижних конечностей вводили либо смеси ударных доз цитостатиков (2 группа), либо препарат ГПВГ-2, обладающий супероксиддисмутазной активностью (3 группа). На этапах предлучевой подготовки и в группе больных с чисто лучевым лечением оценивалась супероксидустраняющая активность сыворотки крови параллельно с данными о клинической регрессии первичной опухоли и морфологическими ее критериями.

В 1 группе исследования проводили до начала лечения, после дозы наружного облучения 10 Гр,20 Гр, 40 Гр и по окончании лечения. Во 2 и 3 группах больных исследования проводили до начала лечения, после 1 и 2 введения цитостатиков (ЭПХТ) или ГПВГ-2 с интервалом 7-10 дней и по окончании лечения.

В сыворотке крови больных раком шейки матки всех трех групп до начала лечения присутствовали четко выраженные зоны инактивации супероксидного анионрадикала. Игибиторный анализ показал, что каталитическая активность устранялась только анти-Я-реагентом, что указывало на присутствие в сыворотке крови больных продуктов катаболического распада клеточных р ецептор ов.

Далее было найдено, что в 1 группе больных характер фореграмм образцов сывороток крови не отличался от фона: на всех этапах исследования вплоть до окончания лечения (суммарная доза 70-80 Гр) пики супероксидус-траняющей активности продолжали определяться.

При проведении ЭПХТ (2 группа) отмечалась несколько иная картина. Так, через неделю после ударных доз смесей химиопрепаратов в сыворотке крови больных определась зона каталитической активности, ингибируемая азидом, цианидом и ДДК, но не анти-Я-реагентом, что указывало на принадлежность ее к медь-цинксодержащему ферменту. Однако, найденные изменения оказались нестойкими, и уже через месяц после лимфоинфузий химиопрепаратов и лучевой терапии (40 Гр) в крови обследованных пациенток наметились тенденции к восстановлению исходных форм утилизации супероксидных радикалов.

В 3 группе больных раком шейки матки, которым в качестве первого этапа лечения эндолимфатически вводили СОД-активный препарат ГПВГ-2, через две недели от начала лечения супероксидустраняющая активность, обусловленная продуктами катаболизма рецепторов, в сыворотке крови не обнаруживалась. Фореграммы имели вид таковых у здоровых женщин. Такая элек-трофоретическая картина сохранялась и через месяц после этапа лечения ГПВГ-2+40 Гр, и после окончания лечения в целом (ГПВГ-2 + сочетанное лучевое лечение).