Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Влияние модифицированных витаминов с антиоксидантным действием на эффективность и токсичность противоопухолевой терапии в эксперименте

На правах рукописи ИВАНОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВИТАМИНОВ С АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ТОКСИЧНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.14 - онкология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 ? г с м

Томск - 2009

003476958

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ онкологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Чердынцева Надежда Викторовна

кандидат биологических наук

Иванов Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Удут Владимир Васильевич

доктор медицинских наук, профессор

Кологривова Елена Николаевна

часов на заседании

Ведущая организация:

ФГУ НИИ онкологии им. H.H. Петрова, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «£ » 2009г. в _

диссертационного совета Д 001.32.01 при НИИ онкологии СО РАМН

(634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии СО РАМН Автореферат разослан «_

/ » бгиУи^сЛ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Фролова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В последние годы достигнуты определенные успехи в лечении больных со злокачественными новообразованиями, связанные с внедрением в клиническую практику новых противоопухолевых препаратов и схем их введения, созданием принципиально новых подходов на основе таргетных (специфически нацеленных на определенную мишень на клеточной мембране или в цитоплазме опухолевой клетки) препаратов (Imyanitov E.N., Hanson K.P., 2004; Sawyers С., 2004). Однако в подавляющем большинстве в качестве противоопухолевой терапии используется комплексное лечение, включающее химио-, радиотерапию и оперативное вмешательство. Химио- и лучевая терапия используются как в неоадъювантном режиме для перевода опухолевого процесса в операбельное состояние или возможности осуществления органосохранной операции, так и в адъювантном режиме с целью предотвращения рецидивирования и метастазирования (Семиглазов В.Ф. и др., 2003; Kautmann М. et al., 2006). Главным препятствием в достижении желаемого эффекта являются врожденная или приобретенная резистентность опухолей к лекарственным препаратам и лучевому воздействию, а также высокая токсичность этих воздействий, нередко ограничивающая проведение интенсивной противоопухолевой терапии (Богуш Т.А. и др., 2000; Жданова О.С. и др., 2005; Карпинская Н.П., Чубик М.В., 2006; King P., Perry М., 2001; Walker М., Ni О., 2007). Возникновение побочных эффектов при проведении химиотерапии и радиотерпии онкологических больных обусловлено самим принципом их повреждающего действия в основном на активно пролиферирующие клетки путем нарушения процессов деления или запуска апоптоза (Гольдберг В.Е. и др.,1999; Дарьялова C.JI., 2000; Гольдберг Е.Д. и др., 2001; Птушкин В.В., 2002; Поддубная И.В. и др., 2003; Удут Е.В. и др., 2008; Park S-J. et al., 2008; Chabner B.A., Roberts T.G., 2005). Поэтому эти виды противоопухолевого воздействия являются токсичными для систем, функционирование которых связано с высокой пролиферативной активностью клеток - костного мозга, иммунной системы, слизистых оболочек, детоксицирующих органов, таких как печень, почки, а также головного мозга и сердца (Богуш Т.А., Богуш Е.А. 1995; Кондратьев В.Б., Карасева H.A., 2000; Поддубная И.В. и др., 2000; Heinrich Е., GetoffN., 2000; Mackall С. et al, 1995; Sharma S. et al., 1999; Schwartz R„ 2000). Побочное действие лекарственных препаратов и лучевой терапии, таким образом, связано с их низкой избирательностью, необходимостью поддерживать достаточно высокую терапевтическую дозу, длительностью лечения.

В структуре осложнений большинства цитостатических агентов основное место занимает супрессивное влияние на костномозговое кроветворение (Гольдберг В.Е. и др., 1999; Гольдберг Е.Д, Дыгай A.M., 2001; Гершанович M.JI. идр., 2001), гепатотоксичность, приводящая к снижению противоопухолевого эффекта и увеличению токсичности препаратов, метаболизирующихся в печени (Когуш Т.А., Богуш Е.А. 1995, Mackali С. et al, 1995). Одним из специфических осложнений противоопухолевой терапии является нейротоксичность, которая характерна для производных платины (цисплатин), таксанов (паклитаксел), метотрексата (Кондратьев В.Б., Карасева H.A., 2000; Поддубная И.В. и др., 2000, Walker М., Ni О., 2007), а также широко используемых в настоящее время целого ряда радиосенсибилизаторов (Барсуков Ю.А. и др., 2005; Heinrich Е., GetoffN., 2000). При этом установлено, что

снижение дозы препарата или дозы облучения вызывает также и снижение терапевтического эффекта, однако на токсичность практически не влияет (Богуш Т.А. и др., 2000). При использовании комбинации 2-х и более препаратов с целью повышения эффективности лечения токсичность полихимиотерапии возрастает (Переводчикова Н.И., Горбунова В.А., 2001; Дельгадо Ф.Г., 2002; Баранова О.Ю. и др., 2003; Богданов А.Н. и др., 2004). Достижение максимальной терапевтической эффективности цитостатических методов лечения злокачественных опухолей может быть связано с использованием новых средств, блокирующих или замедляющих развитие токсических повреждений, но не снижающих противоопухолевых свойств цитостатиков (Богуш Т.А. и др., 2000; Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Немцова Е.Р. и др., 2003; Птушкин В.В., 2004). Все это делает актуальным разработку средств и способов снижения токсического действия специфического противоопухолевого лечения и защиты жизненно важных органов и тканей, способствующих высокой эффективности цитостатической терапии.

Основным механизмом повреждающего действия на нормальные клетки и ткани при химиотерапии и лучевом воздействии является избыточное накопление активных форм кислорода в результате активации микросомального окисления и радиолиза воды соответственно (Меньшикова Е.Б. и др., 2006). Следствием этого является повреждение функционирования системы антиоксидантной защиты (включая ее ферментативное и неферментативное звенья), нарушение иммунологических механизмов, участие которых также чрезвычайно важно в процессах детоксикации и регуляции гемопоэза (Якубовская Р.И., 2002; Aboud М. et al., 1993; Hung К. et al., 1998; Sharma S. et al., 1999).

В процессе решения данной задачи было разработано и обосновано применение большого числа различных модифицирующих воздействий, направленных на снижение токсичности и/или усиление терапевтического эффекта малотоксичных доз цитостатических и лучевых воздействий (Deng G., 2005; Kontogiorgis А.С., 2005). Среди средств, предупреждающих повреждение нормальных тканей, достаточно широко представлены природные соединения (церулоплазмин, лактоферрин), колониестимулирующие факторы (ленограстим, филграстим, молграмостим, пегфилграстим, эритропоэтин) (Bauvet F. et al., 2008), тиоловые соединения (амифостин) (Богуш Т.А. и др., 2ОО0; Немцова Е.Р. и др., 2003; Stolarska М. et al., 2006; Batista C.K.L. et al., 2007). Однако узкая направленность действия корректоров токсичности, наличие побочных эффектов или высокая стоимость ограничивают их применение (Птушкин В.В., 2004; Машковский М.Д., 2007; Othieno-Abinya N.A. et al., 2007). В качестве сопровождения химиотерапии достаточно широко используются природные антиоксиданты с неферментативным действием, в частности, а-токоферол и аскорбиновая кислота (Меньшикова Е.Б. и др., 2006; Немцова Е.Р. и др., 2003; Птушкин В.В., 2002; Бишоп Д.М., 1991; Fang Y-Z., et al, 2002). Показано, что защитные эффекты антиоксидантов в определенной мере селективны для нормальных клеток и могут уменьшать токсичность противоопухолевого лечения без снижения эффективности. Более того, есть данные, что антиоксиданты могут способствовать повышению эффективности химио- и лучевых воздействий (Nair С. С. К., 2001; Prasad К., 2004).

Однако, есть литературные данные о том, что антиоксиданты могут защищать и раковые клетки, снижая тем самым эффективность противоопухолевой терапии

(D'Andréa G.M., 2005). Аскорбиновая кислота имеет ряд недостатков: во-первых, это достаточно нестабильное соединение, которое разрушается под действием тепла, света, ионов тяжелых металлов и при нейтральном значении рН (Птушкин В.В., 2002), и, во-вторых, она способна становиться мощным прооксидантом в присутствии ионов железа или меди, что особенно нежелательно и даже опасно в клинической ситуации (Clement M.V. et al., 2001; Lesperance M.L. et al., 2002; Song J.H. et al., 2003; D'Andréa G.M., 2005; Chen Q. et al. 2008). Липофильные свойства витамина E (а-токоферола), которые обеспечивают его тропность к липидному слою клеточных мембран, существенно ограничивают радиус его действия в живой клетке, не позволяя проявлять активность в водной фазе (Brigelius-Flohe R. et al., 2002).

В последние годы создан ряд новых форм витаминов-антиоксидантов путем модификации их структуры, приводящей к изменению свойств по сравнению с указанными природными витаминами (Петрова Г.В., Донченко Г.В., 2005; Austria R. et al., 1997; Kunitsa N.I. et al., 1993; Yamamoto I. et al., 1990). Японскими учеными разработаны и изучаются оригинальные модифицированные антиоксиданты -гликозид витамина С (2-О-а -О-глюкопиранозил-Ь-аскорбиновая кислота) (Fujinami Y. et al., 2001; Kumano Y. et al., 1998) и гликозид витамина E (2-(а-0-глюкопиранозил) метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол) (Murase H. et al., 1997). Благодаря наличию глюкозы в своей структуре гликозид витамина Е (tocopherol monoglucosid - TMG) приобретает способность растворяться в воде (>1x103 мг/мл) и проявлять антирадикальную активность не только в липидной фазе биологических мембран, но и в цитоплазме клеток, в отличие от его прототипа а-токоферола (Murase H. et al., 1998).

Экспериментальные исследования показали, что гликозид витамина С (ascorbic acid glucoside - AAG) in vitro проявляет меньшую цитотоксичность в высоких концентрациях, чем аскорбиновая кислота (Fujinami Y. et al., 2001; Muto N., Nakamura T., 1990). Кроме того, AAG более стабилен и обеспечивает накопление аскорбиновой кислоты в организме в более высоких концентрациях и, таким образом, может оказывать более выраженный защитный эффект. Одним из основных отличий в механизме антиоксидантного действия AAG по сравнению с аскорбиновой кислотой является то, что он обладает выраженным инактивирующим эффектом по отношению к высокореактивному ОН-радикалу. Это обусловлено тем, что образующиеся при взаимодействии AAG с ОН-радикапом аддукты обладают более низкой способностью к генерации АФК, в отличие от немодифицированного витамина (El-Nahas S.M. et al., 1993; Mathew D. et al., 2007; Rajagopalan R. et al., 2002).

Японскими и индийскими исследователями получены данные о том, что TMG оказывает радиопротекторное действие, эффективно защищает ДНК нормальных клеток от повреждающего действия гамма-излучения, а также защищает нормальные ткани при рентгеновском облучении мышей опухоленосителей, не снижая его противоопухолевой эффективности (Satiamitra M. et al., 2001, 2003; Shimanskaya R. et al., 2001; Nair et al, 2004; Salvi V.P. et al., 2001).

Показано, что AAG защищает ткань печени от повреждающего действия гамма-излучения в эксперименте (Mathew D. et al, 2007), а в клинических условиях при применении до облучения у больных со злокачественными новообразованиями существенно снижает проявление таких побочных эффектов радиотерапии как тошнота и диарея (Koizumi M. et al., 2005).

Все вышесказанное делает целесообразным исследование эффективности названных соединений в защите жизнедеятельности и обеспечении полноценного функционирования критических органов и тканей, повреждаемых при цитостатической терапии, и механизмов действия с целью патогенетического обоснования их использования в качестве сопровождающей терапии на фоне комплексного противоопухолевого лечения. Чрезвычайно важной является проблема улучшения качества жизни онкологических больных, получающих цитостатическое лечение, за счет снижения побочных токсических реакций (Чойнзонов E.J1. и др., 2008). При этом важное значение может иметь аспект повышения эффективности противоопухолевой терапии под влиянием антиоксидантных агентов, которые по механизму действия являются модификаторами биологических реакций и способны регулировать взаимоотношение опухоли и организма, особенно в условиях специфической антибластомной терапии (Якубовская Р.И., 2000; Rozenberg, 1999; Schrimacher P. et al„ 2001; Zitvogel L., Kroemer G„ 2008).

Цель исследования: изучить влияние гликозида витамина С и гликозида витамина Е на эффективность и токсические эффекты химиотерапии и лучевого воздействия и выявить механизмы их действия.

Задачи исследования:

1. Изучить способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать противоопухолевую и антиметастатическую эффективность циклофосфана у мышей с перевиваемой опухолью карциномой легких Льюис (LLC).

2. Исследовать влияние модифицированных витаминов на показатели системы иммунитета в условиях иммунодепрессии, вызванной введением противоопухолевого цитостатика циклофосфана в высокой дозе.

3. Оценить способность гликозидов витамина С и витамина Е снижать нейротоксичность, индуцированную химиопрепаратами.

4. Изучить влияние гликозидов витамина С и витамина Е на показатели гемопоэза у мышей после рентгеновского облучения в сублетальной дозе.

5. Исследовать защитный эффект гликозида витамина С на пролиферативную активность клеток селезенки мышей при действии гамма-излучения.

6. Оценить участие системы глутатиона в защитном действии гликозида аскорбиновой кислоты в условиях окислительного стресса, индуцированного действием радиации и химиотерапии.

Научная новизна

В экспериментальных исследованиях установлено, что модифицированные витамины гликозид витамина С и гликозид витамина Е, в сравнении с аскорбиновой кислотой и альфа-токоферолом, оказывают более выраженное действие на повышение эффективности и снижение токсичности противоопухолевой терапии.

Впервые показана способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей. Установлено, что введение AAG или TMG потенцирует антиметастатическое действие циклофосфана в низких терапевтических дозах.

Установлено, что гликозиды витамина С и витамина Е способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на тимус и селезенку у мышей, а также способствуют более быстрому восстановлению уровня лейкоцитов

периферической крови и клеток костного мозга в условиях циклофосфан-ивдуцированной иммунодепрессии.

Получены новые данные о способности гликозидов витамина С и витамина Е снижать одно из специфических осложнений химиотерапии - нейротоксичность. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2286777 от 10 октября 2006 г "Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте".

Впервые показано, что введение гликозидов витамина С и витамина Е мышам, облученным в сублетальной дозе, умеренно защищает клетки костного мозга и крови в острый период радиационного воздействия и стимулирует процессы восстановления кроветворения, что можно рассматривать как один из основных механизмов радиопротекторного и антитоксического действия изучаемых агентов.

Получены оригинальные данные о том, что гликозид витамина С препятствует ингибированию спонтанной пролиферации лимфоцитов в условиях окислительного стресса in vivo и in vitro.

Установлено, что защитное действие гликозида витамина С в условиях окислительного стресса, индуцированного радио- и химиотерапией, обусловлено нормализацией редокс состояния глутатиона.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные результаты расширяют представление о механизмах антитоксического действия модифицированных витаминов - гликозидов витамина С и витамина Е при химиотерапии и лучевом воздействии.

Они могут явиться основой для разработки новых методов коррекции побочных эффектов лекарственной и лучевой терапии, что позволит повысить качество жизни и эффективность лечения онкологических больных.

Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации гликозида витамина С в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями для снижения побочных эффектов химио- и радиотерапии.

Положения, выносимые на защиту:

Гликозиды витамина С и витамина Е способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном и снижать выраженность токсических проявлений химио- и радиотерапии.

В основе радиопротекторного и антитоксического действия

модифицированных витаминов лежит их способность стимулировать восстановление кроветворения и функциональной активности клеток иммунной системы.

Антитоксическое действие гликозида витамина С при противоопухолевой терапии обусловлено его способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов и нормализовать редокс состояние глутатиона.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии СО РАМН в 2003, 2005, 2006, 2009 гг, конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V и VI конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2004, 2005), 10, 12, 13-ой международной конференции по повышению эффективности противоопухолевого лечения "Annual meeting on the

sensitization of cancer treatment"(KHOTO, Япония, 2004, 2006, 2007), 13 международном конгрессе по приполярной медицине "Проблемы фундаментальной и прикладной медицины" (Новосибирск, 2006), VII международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2006), 1 и 2-ой конференции японского общества по радиопротекции "Radioprotection (Human Defense) Society" (Киото, Япония, 2007, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 2 - в центральных журналах, рекомендуемыми "Перечнем..." ВАК Минобрнауки. Получен патент на изобретение №2286777 от 10 ноября 2006 г "Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте".

Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 268 источников, из них российских 81, иностранных 185. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводились в рамках проекта международного агентства по атомной энергетике (МАГАТЭ).

Экспериментальные животные Эксперименты выполнены на 1134 мышах I категории разводки лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН (сертификат имеется) обоего пола в возрасте 8-14 недель, массой 18-24 г. Используемые линии мышей C57B1/6J (H-2b), (CBAxC57Bl/6J)Fl (H-2h/l). Животных содержали на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Лаб. Животные, 2004).

Для получения исследуемого материала мышей забивали методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Каждый эксперимент был проведен, по крайней мере, дважды.

Препараты, используемые в работе Гликозид аскорбиновой кислоты (2-О-а -О-глюкопиранозил-Ь-аскорбиновая кислота) или AAG (Hayashibara Company, Япония) был синтезирован из аскорбиновой кислоты и мальтозы или олигосахарвдов путем трансгликозилирования ферментов (Yamamoto I. et al., 1990; Yamamoto I. et al., 1990; Aga H. et al., 1991; Mandai T. et al., 1992) и любезно предоставлен профессором В.Т. Кагией (Health Research Foundation), Киото, г. Япония. Экспериментальные данные in vitro показали, что AAG проявляет меньшую цитотоксичность, чем аскорбиновая кислота в высоких концентрациях (более 0,5 мМ) (Fujinami Y., Tai A., Yamamoto J., 2001).

Водорастворимый витамин Е (TMG). гликозид витамина Е (CCI Company, Япония) был синтезирован из 2-гидроксиметил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол и мальтозы в растворе с содержанием DMSO путем трансгликозилирования с а-гликозидазой из Saccaromyces species. Гликозилированный продукт был идентифицирован как 2- (а-0-глюкопиранозил)метил-2,5,718-тетраметилхроман-6-ол.

отличие от витамина Е TMG обладает высокой растворимостью в воде (>1х103 7мл), проявляет более высокую антирадикальную активность по сравнению с а-1коферолом и его водорастворимым аналогом - тролоксом (Murase Н. et al., 1997).

В качестве препаратов сравнения использовали аскорбиновую кислоту и ггамин Е (Sigma).

Циклофосфан - М'-бис-(Р-Хлорэтил)-Ы'-0-триметиленовый эфир диамида осфорной кислоты «ЛенсФарм», Москва). Сам циклофосфан не обладает гготоксическим действием. В результате биотрансформации в печени из него 5разуются активные метаболиты (фосфамид и акролеин), которые оказывают зотивоопухолевое действие, атакуя нуклеофильные центры белковых молекул, 5разуя поперечные сшивки между молекулами ДНК и блокируя митоз в опухолевых íereax (Kehrer J., Biswal S., 2000). Препарат обладает иммунодепрессивным гйствием (Cupps Т. et al., 1982; Bailas Z„ 1986).

Саназол (AK-21231 [СЫ-2'-(метоксиэтил)-2-(3'-нитро-Г-триазолил)ацетамид] -ыл любезно предоставлен проф. Кагией, Киото, Япония. Саназол - гипоксический здиосенсибилизатор из класса соединений нитротриазолов, полученный в Киотском ииверситете (Япония), преимущество которого по сравнению с его аналогом исонидазолом заключается в практическом отсутствии токсичности терапевтических эз (Sakano К. et al., 1986). В то же время положительные результаты по эрадикации элидных опухолей при интенсивном режиме введения высоких доз саназола нередко риводят к проявлению нейротоксичности (Kagiya V.T., 2006).

Дизайн экспериментов

Способность модифицированных антиоксидантов модулировать Ефективность цитостатической терапии экспериментальных злокачественных новообразований изучали на мышах с гематогенно-метастазирующей в легкие карциномой легких Льюис (LLC), полученной из банка опухолевых штаммов РОНЦ РАМН (г. Москва). Данная опухолевая модель является адекватной для изучения противоопухолевой и антиметастатической активности препаратов (Методические рекомендации по доклиническому изучению средств,..., Москва, 2005).

При терапии экспериментальных опухолей циклофосфан инъецировали внутрибрюшинно двукратно в дозе 120 или 60 мг/кг на 3-й и 7-е сутки после трансплантации опухоли. Группе животных без введения цитостатиков по аналогичной схеме инъецировали эквиобъемные количества физиологического раствора. Гликозид аскорбиновой кислоты, в дозе 50 мг/кг или гликозид витамина Е в дозе 100 мг/кг вводили на протяжении роста опухоли со 2-го дня после перевивки.

Иммунодепрессию v мышей С57В1/6 моделировали путем однократной внутрибрюшинной инъекции циклофосфана в максимально переносимой дозе 250 мг/кг. Введение гликозидов витамина С в дозе 50 мг/кг или витамина Е в дозе 100 мг/кг начинали со дня инъекции циклофосфана и продолжали в течении 4-7 дней. Для определения уровня показателей у животных без иммунодепрессии использовали группу здоровых мышей, которым вводили физиологический раствор по схеме, аналогичной введению антиоксидантов.

В качестве экспериментальной модели нейротоксичности использовали однократное внутрижелудочное введение саназола в токсической дозе 2,1 г/кг. Для оценки нейротоксического действия саназола служил тест "открытого поля" (Буреш Я. И и др., 1991). Эффективность применяемых воздействий оценивали по

поведенческим реакциям (вертикальная, горизонтальная и локомоторная активность) до воздействия, на 1-е и 2-е сутки после введения препаратов. AAG вводили в дозе 50 мг/кг, перорально, TMG в дозе 100 мг/кг, внутрибрюшинно, контрольной группе вводили физиологический раствор за 30 минут до введения саназола.

Для изучения влияния модифицированных витаминов на побочные эффекты рентгеновского излучения у мышей использовали тотальное облучение в сублетальной дозе (доза облучения составила 5,6 Гр, при мощности дозы 0,5 Гр в минуту) на рентгеновском аппарате РУМ-17 (фильтр 0,5 мм. меди + 1,0 мм. алюминия, напряжение на трубке 200 кВ, анодный ток 5 мА).

Для изучения влияния модифицированных витаминов на систему кроветворения и пролиферацию лимфоцитов AAG или витамин С вводили перорально в дозе 100 мг/кг за 60 минут до облучения, TMG вводили внутрибрюшинно в дозе 600 мг/кг непосредственно сразу после облучения. Контрольной группе вводили эквиобьемные количества физиологического раствора по аналогичным схемам. Эффективность воздействия модифицированных антиоксидантов оценивали по динамике восстановления клеток крови и костного мозга и иммунологическим показателям на 3, 7, 14 и 21-е сутки после облучения, в соответствии со стандартными гематологическими методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992)

Окислительный стресс в изолированных спленоцитах in vitro индуцировали гидроперекисью водорода.

Методы исследования

Для перевивки карциномы легких Льюис использовали стерильно выделенные опухолевые клетки по 1 млн. в 0,2 мл среды 199, которые вводили внутримышечно в бедро правой задней лапы.

Оценку эффективности терапевтических воздействий на животных-опухоленосителях проводили по торможению роста первичной опухоли и ингибированию метастазирования. Рассчитывали следующие показатели:

- торможение роста опухоли (ТРО, %):

ТРО = Mo-Mj/M, х 100%, где Мк и М0 - масса опухоли в контрольной (без лечения) и опытной группах;

- индекс ингибиции метастазирования (ИИМ, %) - интегральный показатель, рассчитываемый по формуле: ИИМ = (А. В, - АоВ„) 100/ (А, В„ где А, А,,) - А, и А,,-доля мышей с метастазами в контрольной и опытной группах, В, и В0- среднее количество метастазов в легких (в тех же группах);

- торможение роста метастазов (ТРМ, %): ТРМ = (Sk - Sc)/ Sk, где St и S0 -суммарная площадь метастазов в контрольной и опытной группах.

Определение уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови и в головном мозге мышей проводили методом, предложенным Brubacher G. and Vuilleumier J.P. (1974). Интенсивность флюоресценции измеряли на спектрофлюориметре Hithachi - 750 (Япония).

Гидроперекиси липидов в селезенке мышей определяли FOX-2 методом (Hermes-Lima М., Willmore W.G., Storey К.В., 1995), основанным на способности гидропероксидов липидов окислять ионы Fe2+ при низком значении РН, в результате чего образуется комплекс Ре3+-ксиленолоранж[о-крезолсульфонфталеин-3,3 -бис(метилиминоди-ацетата натриевая соль], имеющий максимум поглощения при 580

нм. Оптическую плотность регистрировали на СФ-2000 (Россия). В качестве стандарта использовали гидроперекись кумола («Merk», Германия).

Содержание уровня общего, восстановленного и окисленного глутатиона определяли высокоспецифичным и чувствительным циклическим методом, предложенным М. Е. Anderson (1985). Кинетику реакции регистрировали на СФ-2000 (Россия). Уропень восстановленного и окисленного глутатиона выражали в мкмоль/мг белка и рассчитывали отношение GSH/GSSG.

Определение количества белка проводили по методу М.М. Bradford (1994) с использованием красителя Coomassie G-250.

Определение спонтанной пролиферации спленоцитов мышей проводили по включению меченного радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [!М]-тимидина (Изогол) в ДИК. Включение [!Н]-тимидина (радиоактивность) в ДИК исследуемых клеток измеряли с использованием планшетного микро-р-счетчика («Wallac», Голландия) а выражали в импульс/мин.

Статистическая обработка результатов Все полученные данные подвергали математической обработке, используя методы вариационной статистик». Вычислялось: среднее значение^ среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего значения. Значимость различий показателен между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Вилкоксопа - Манна - Уитии. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (Рсброва О.Ю., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние гликозидов витзмшш С (AAG) и витамина Е (TMG) на эффективность циклофосфаиа у мышей с карциномой легких Льюис

Природа и механизм воздействия средств, включаемых в комбинированную терапию опухолей, могут быть различны и связаны с их радиомодифицирующим, иммунотроннмм, адаптогенпым, аитиоксидантным, антитоксическим действием (Rodenberg S.A., 1999; Якубовская Р.И., 2000, 2002; Schrimacher Р. et al., 2001; Zitvogel L., Kroemer G., 2008). Одним из современных подходов к повышению эффективности лечения злокачественных новообразований является использование биотерапевтических воздействий з сочетании с классическими методами (химио-, лучевая терапия, операционное вмешательство). Преимущество такого комплексного подхода заключается в одновременном повреждающем действии на опухолевые клетки и активизации защитных механизмов организма, оказывающих, в свою очередь, противоопухолевый эффект (1 ольдберг, Е. Д., Зуева Е.П., 2000; Чердынцева Н.В., 2002; Zitvogel L., 2008). В число МБР входят природные и синтетические иммуномодуляторы и здашогсш,], антиоксиданты, цитокины и их индукторы, а также физические факторы (Schaid D. et al., 1999; Аничков Н.М., 2003; Кадагидзе З.Г., 2003; Константинова М.М., 2003; Gerhard С., 2003).

Для изучения модулирующего влияния изучаемых антиоксидантов на рост и метастазирование экспериментальных опухолей использовали перевиваемую карциному легких Льюис (LLC).

Применение ЦФ в максимальной терапевтической дозе 120 мг/ кг приводило к умеренному торможению роста опухоли на 34,8 % и практически полному подавлению метастазирования (ТРМ составило 99,8 %; ИИМ - 99,9 %), однако

сопровождалось выраженной токсичностью, о чем судили по снижению клеточности селезенки (таблица 1). Снижение дозы ЦФ хотя и приводило к снижению токсичности (таблица 1), однако не оказывало выраженного терапевтического эффекта (ТРО составило 8,7 %, НИМ - 74,3 %,, ТРМ-71,6 %, (р<0,05)).

Таблица 1 - Влияние гликозидов витамина С (ААв) и витамина Е (ТМО) на противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в дозе 60 мг/кг у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюис (Х±т)___

Метастазы ТРМ, % НИМ, % Клстоимость ТРО, %

Количество шт Площадь мм2 селезенки, 106/мл

Контроль (1ХС), п=5 16,7±1,9 28,8±4,7 - - 325,0±13,3 -

1ХС + ЦФ, 120 мг/кг, п=5 1,5±0,5* 0,045±0,0 1» 99,8 99,9 231,0±9,3* 34,8

ЬЬС + ЦФ, 60 мг/кг, п=5 6,5±1Д* 8,2±3,4* 71,6 74,3 294,0±10,1 8,7

ЦФ(60>ЯШЗ, 100 мг/кг, п=5 2±0,8»* 0,6±0,3** 91,5 83 341,0±31,9** 15,2

ЦФ(60)+Вит.Е, 100 мг/кг, п=5 4,8±1,9 4,7±0,6 42,7 26,2 319Д±29,7 0

ЦФ(60)+ААС, 50 мг/кг, п=5 6,5±1,5 2,9±1,7" 89,9 61 421,0±38,9** 0

ЦФ(60)+Вит.С, 50 мг/кг, п=5 4,2*1,3 5,9±0,8 28,0 35,4 325±24,3 92

Примечания 1 в таблице приведены результаты одного из 3-х серий экспериментов; 2 *- различия статистически значимы с контролем (р<0,05); 3 ** - различия статистически значимы с группой ЦФ, 60 мг/кг (р<0,05).

Использование ЦФ в низкой дозе совместно с ААв или ТМв приводило к выраженному торможению метастазирования, которое по величине было сравнимо с эффектом препарата в максимальной терапевтической дозе, но при этом не отмечалось токсического действия на селезенку (таблица 1). Влияния на первичный рост опухоли практически не отмечено. С одной стороны, это подтверждает целесообразность удаления первичного опухолевого узла для достижения максимальной эффективности сочетанного использования цитостатической терапии и модификаторов, с другой - свидетельствует о безопасности их применения при наличии опухолевого процесса в организме с точки зрения возможной стимуляции опухолевого роста. Введение аскорбиновой кислоты и а-токоферола совместно с циклофосфаном не оказывало выраженного влияния на антиметастатическую эффективность цитостатической терапии.

Известно, что основной причиной смертности от злокачественных новообразований является диссеминация процесса, поэтому с самого начала развития направления по использованию модификаторов биологических реакций в онкологии главной целью было ингибирование метастазирования опухоли. В основе торможения метастатического процесса важную роль играет иммунная система. В последние годы убедительно показано, что иммунная система в синергичном режиме вовлекается в эрадикацию опухолевых клеткок при цитостатической терапии (ЗсЬпшасЬег Р., 2001;

I.., 2008). Это происходит в снязи с модификацией опухолевых клеток циюстатическими препаратами, способствующей активации специфического иммунного ответа. Однако иммупоеуирессирующее действие цитостатической терапии может повреждать иммунную систему. Поэтому следующим этапом исследований была оценка способности модифицированных витаминов снижать токсическое действие цитосгатиков на иммунную систему на модели цнклофосфановсл иммунодепрессни.

Влияние модифицированных антиоксидантов на уровень ядро« одержат и?; ¡меток органов иммунитета яри иммунодепрессни, вызванной введением высокой дозы цшелофосфгна Циклофосфан - алкилирующш: мент с высокой эффективностью и широким спектром противоопухолевого действия. Однако при проведении терапии больных злокачественными опухолями циклсфосфзном, как н большинством противоопухолевых агентов, часто лимитирующими факторами являются миело - и иммунотоксичность цитостатичсских агентов, что вынуждает прекратить лечение или снизить дозы противоопухолевых агентов (Птушкин В.В., 2002; Уооп Б. Л а1., 2003).

На общепринятой экспериментальной модели было показано, что ведение ЦФ в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) угнетает кроветворение и иммунную сист ему мышей (таблица 2).

Таблица 2 - Влияние гликозидов витамина С (ААО) и витамина Е (ТМй) на клеточиость селезенки, тимуса, количество лейкоцитов в периферической крови и миелокарноцитоа у мышей (С57В1/6), получавших циклофосфан в дозе 250 мг/кг №т)_______

Группы животных Клеточность Клеточкость Количество Количество

селезенки, млн/орган тимуса, млн/оган лейкоцитов в пер. крови, млн/мл миелокариоцитов, млн/бедро

Интаетные животные 152,8±7,4 153,3±8,4 9,9±1,1 9,4±0,8

ЦФ, 250 мг/кг 55,6±3,6 19,2±1,4 2,2±0,3 3,8±0,4

5« ЦФ, 250 мг/кг + ААО, 50 мг/кг 61,6±4,8 17,2±1,7 3,8±0,1* б,4±0,1*

ЦФ, 250 мг/кг + ТМО, 100 мг/кг 57,б±3,1 15,4±1,6 3,2±0,2* 4,9±0,9

ЦФ, 250 мг/кг 118,8±6,9 68,0±2,02 б,5±0,б 15,1±1,б

Ж Н & ЦФ, 250 мг/кг + ААО, 50 мг/кг 151,2±9,9* 82,8±10,7* 9,96±1,4* 16,6±0,7*

и ЦФ, 250 мг/кг + ТМО, 100 мг/кг 134,5±5,5» 81,6±9,5 9,7±1,5* 15,7±1,3*

Примечание * - различия статистически значимы с группой ЦФ, 250 мг/кг (р<0,05).

Нарушение костномозгового кроветворения является критическим механизмом, ограничивающим использование цитостатических препаратов, с другой стороны, костный мозг - это морфофункциональная основа иммунной системы, напрямую определяющая ее полноценность. Оба модифицированных витамина оказывали протекторное действие, особенно выраженное в ранние сроки воздействия, на костный мозг мышей, получавших токсичную дозу цитостатика (таблица 2).

Одним из информативных критериев, позволяющих оценить степень повреждающего действия цитостатической химиотерапии на организм, является показатель общего количества лейкоцитов в периферической крови. Изучаемые антиоксиданты показали не только умеренную защиту этого показателя в «острый» период миелодепрессии, но и более раннее его восстановление до уровня нормы (таблица 2). Введение гликозидов аскорбиновой кислоты и витамина Е совместно с циклофосфаном в дозе 250 мг/кг сопровождалось повышением клеточности селезенки практически до уровня контроля. Клеточность тимуса увеличивалась до 54 и 52 % от исходного уровня, соответственно. Очевидно, что данные эффекты ААО и ТМв могут вносить значительный вклад в улучшение переносимости цитостатической терапии (Туков А.Р. и др., 2002).

Влияние модифицированных антиоксидантов на показатели гемопоэза у мышей при действии гамма облучения

Ионизирующая радиация, используемая при лечении онкологических больных, оказывает повреждающее действие на нормальные ткани и вызывает комплексный ответ на клеточном и молекулярном уровнях. Одной из наиболее радиочувствительных является кроветворная система, поражение которой может оказаться критическим в плане невозможности продолжения лечения и, в случае фракционирования, для набора необходимой терапевтической суммарной дозы облучения.

Мы изучили влияние модифицированных антиоксидантов ЛАв и ТМв на клетки крови при облучении мышей С57В1/6 рентгеновскими лучами. Для этого была использована общепринятая экспериментальная модель, в которой мышей подвергали общему однократному рентгеновскому облучению в сублетальной дозе 5,6 Гр. ААв вводили за 60 минут до облучения в дозе 100 мг/кг, ТМО сразу после облучения в дозе 600 мг/кг. В течение 24 дней после облучения наблюдали за изменением клеточного состава периферической крови и костного мозга.

Мы отметили, что в ранний период после воздействия степень лейкопении была менее выражена в группах облученных мышей, получавших ААв и ТМв, чем в контрольной группе (рисунок 1,2).

Известно, что лимфоциты составляют наибольшую долю клеток крови у мышей и являются менее устойчивыми к действию радиации по сравнению с другими клетками крови (Данилов И.П., Микша Я.С., 1999; Михайловская Э.В., 1999). Введение гликозида витамина Е приводило к значительной защите уровня лимфоцитов в периферической крови (рисунок 1). Абсолютное и процентное содержание лимфоцитов у мышей с ТМв на всем протяжении исследования было значимо выше, чем в группе облученных животных, получавших физиологический раствор, а, начиная с 8-х суток, не отличалось от показателей у необлученных животных. При введении ААв наблюдалась практически такая же закономерность (рисунок 2).

В острый период опустошения костного мозга (первую неделю после облучения) происходило существенное снижение клеточности костного мозга у животных всех исследуемых групп (рисунки 3, 4).

В группах животных, которым вводили ААО до облучения и ТМО сразу после облучения, количество миелокариоцитов было умеренно выше, чем в контроле. К 14-

му дню после облучения наблюдалась регенерация костного мозга и увеличение числа миелокариоцитов.

25 п

сутки после облучения

сутки после облучения

Рисунок 1 - Влияние гликозида витамина Е (ТМО) на содержание лейкоцитов (слева) и лимфоцитов (справа) в периферической крови мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр (Х±ш)

- 1 коблу «гаме ¡толп* ЯоблучеянеДьГр овит.м, я> в мо, (¡а иг ярь бГр

су^и после облучен«* 1! 24

иослё омутнйл

13 24

Рисунок 2 - Влияние гликозида витамина С (ЛАО) на содержание лейкоцитов (слева) и лимфоцитов (справа) в периферической крови мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр (Х±ш)

При этом следует отметить, что содержание лимфоидных элементов в группе облученных животных, которым вводили ААв и ТМО, значительно раньше достигало контрольного уровня, чем в группе только облученных животных (рисунки 3, 4).

Процесс регенерации был более выражен в группе с ААД чем у получавших витамин С мышей, о чем судили по общему содержанию миелокариоцитов и лимфоидных элементов костного мозга (рисунки 3, 4).

По всей видимости, способность модифицированных витаминов уменьшать выраженность пострадиационной депрессии кроветворения обусловлена их защитным действием на лимфоидный росток кроветворения, и стимулирующим - на процессы кроветворения в восстановительный период.

-о- обличение. 5,6 Гр -fr- 5.6I>+TMG

О 3 8 14 20 а

сугхи после облучения

Рисунок 3 - Влияние гликозида витамина Е (IMG) на содержание миелокариоцитов и лимфондных клеток в костном мозге мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе 5 6 Гр (Х±т)

щ необл ученные животные О облучение, 5,6 Гр а Вит.С+5,6Гр р AAG,(100 мг/иг)+5.6Гр

Рисунок 4 - Влияние гликозида витамина С (АЛО) на содержание миелокариоцитов (слева) и лимфоидных клеток (справа) в костном мозге мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр (Х±т)

Способность модифицированных тиаминов снижать нейротоксичность

гипоксического радиосенсибилизатора саназола Широкое использование лучевой терапии для воздействия на опухолевый процесс привело к созданию подхода по увеличению ее эффективности на основе использования радиосенсибилизатсров, позволяющих расширить

радиотерапевтический потенциал, т. е. селективно усилить повреждение опухоли и снизить радиопоражаемость нормальных тканей (Бойко A.B. и др,, 2004). В их число входят электроноакцепторные соединения нигроимвдазолыюго ряда - мисонвдазол, метронидазол, обладающие высокой нейротоксичностью (Sugie С. et al., 2005).

Головной мозг, в сравнении с другими органами, наиболее подвержен опасности воздействия свободных радикалов, и недостаточность антиоксидантной системы может быть причиной развития нейротоксичности (Heinrich Е., üetoff N., 2000; Joshi G. et al., 2007). Синтезированный в 90-х годах саназол (Kimura R et al.,

1986) выгодно отличался от мисонвдазола низкой нейротоксичностью его терапевтических доз. Недавно получены положительные результаты по эрадикации солидных опухолей при интенсивном режиме введения высоких доз саназола, что нередко приводит к появлению нейротоксичности (Kagiya V.T., 2006). Поскольку в развитии нейротоксического эффекта принимают участие АФК, достаточно очевидным является предположение о потенциальной роли антиоксидантов в качестве церебропротективных агентов, поэтому мы изучили возможность использования модифицированных витаминов для снижения нейротоксичности. Для этого в работе была создана модель нейротоксичности, индуцированной высокими (превышающими терапевтические) дозами саназола. Наличие нейротоксического действия и степень его выраженности, оценивали по поведенческим реакциям животных в классическом тесте "открытое поле" (Буреш Я. И и др., 1991).

Через 2 часа после введения саназола в дозе 2,1 г/кг наблюдалось статистически значимое снижение всех параметров поведения (вертикальной, горизонтальной двигательной активности и эмоциональной реакции) в "открытом поле" в сравнении с контрольной группой (р<0,05), которой вводили только физиологический раствор (рисунок 5).

-0,WNa№uiB3M

ТМСНсанаиа

О ХМ

)ДО» дни после введения

2 до»

Одень

1 день дни после введения

2 ди»

Одень

1 день дни после введения

2 день

Рисунок 5 - Влияние гликозидов аскорбиновой кислоты (ЛАС) и а-токоферола (ТМв) на поведенческие реакции мышей (СВАхС57В1/6)Р1 с индуцированной нейротоксичностью (Х±ш)

Полученные данные указывают на то, что саназол в высокой дозе является нейротоксичным, поскольку нарушение параметров поведения и ориентации животных является индикатором, свидетельствующим о развитии нейротоксического эффекта (Тешшзеп С.Е. й а1., 2001).

Введение гликозидов витамина С и витамина Е в концентрации 50 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно, за 30 минут до введения высокой дозы саназола, приводило к статистически значимому повышению показателей эмоциональной и двигательной активности у мышей (р<0,05), по сравнению с группой животных, получавших только саназол, что указывает на их защитный эффект, то есть способность снижать нейротоксичность (рисунок 5).

На 2-й день после введения саназола происходило дальнейшее снижение эмоциональной, горизонтальной и двигательной актиьности в группе мышей, которой вводили только саназол (рисунок 5). Введение ААО или ТМО способствовало восстановлению этих показателей (рисунок 5). Введение аскорбиновой кислоты не оказывало значимого влияния на данные показатели, по сравнению с группой животных, получавших гликозид аскорбиновой кислоты (р<0,05), а на 2-е сутки эксперимента даже привело к гибели животных, что может быть связано с прооксидантным действием аскорбиновой кислоты.

Для прояснения причин различий модулирующей и антитоксическом эффективности ААО и витамина С мы оценили динамику уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови у здоровых животных после введения гликозида витамина С в сравнении с введением экзогенной аскорбиновой кислоты. Было показано, что при введении ААС в дозе 50 мг/кг наблюдается более быстрое и существенное увеличение уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови, чем при введении просто аскорбиновой кислоты в той же дозе (р<0,05). 'Го есть мы показали способность ААО предотвращать снижение уровня аскорбиновой кислоты п крови в условиях нейротоксического воздействия.

Это указывает на то, что введение гликозида витамина С может длительное время поддерживать высокие концентрации аскорбиновой кислоты в кропи, тем самым обеспечивая более выраженное защитное действие в организме.

Таким образом, в первой части работы представлены результаты, характеризующие эффекты новых модифицированных витаминов глимпндов витамина С и витамина Е, которые ранее не изучались. Хотя действие ААО и ТМО сравнимо по эффективности, следует отметить преимущество ААО. Оно обусловлено возможностью использования ААО при кратно более низких концентрациях, при пероральном пути введения, что выгодно отличает С1 о от ТМО. Кроме того, ААО является широко распространенным препаратом, достаточно проста технология его получения, что обеспечивает его низкую стоимость. Стоимость ТМО существенно выше. Все это свидетельствует, что при сопоставимых биологических эффектах с ТМв гликозид витамина С является более перспективным в плане его внедрения в практическую медицину, как одного из препаратов поддерживающей терапии онкологических больных. Поэтому дальнейшее углубленное изучение механизма радиопротекторного и антитоксического действия было предпринято для гликознда витамина С.

Влияние гликозида витамина С на пропиферативнуш активность спленоцитов у мышей при воздействии гамма-излучения в сублетальпой дозе Способность клеток к пролиферации является одним из ключевых условий восстановления гемопоэза при действии повреждающих факторов, поэтому было изучено влияние гликозида витамина С и аскорбиновой кислоты на пролиферативную

активность спленоцитов после облучения мышей в сублетальной дозе. Максимальное снижение пролиферативной активности клеток наблюдалось на 3-й сутки (рисунок 6) и было ассоциировано с минимальным уровнем ядросодержащих клеток в селезенке. Введение животным за один час до облучения аскорбиновой кислоты или ее гликозида препятствовало снижению пролиферативной активности клеток на протяжении всего эксперимента, при этом эффект гликозида был более значительным (рисунок 6).

■ необлученные животные □ облучение 5,6 Гр О ААО + облучение 5,6 гр ЕЭ Вит.С + облучение 5,6 Гр

Рисунок 6 - Влияние гликозида витамина С (ААО) и аскорбиновой кислоты на спонтанную пролиферацию спленоцитов у мышей С57В1/6. после облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр, измеренную по включению Н3-тимидина в ДНК (Х±ш)

сутки поеме облучения

Полученные результаты свидетельствуют о том, что радиозащитный эффект ААО на костный мозг и органы иммунной системы в существенной степени обусловлен его влиянием на пролиферативную активность клеток. Это влияние может носить как опосредованный характер, через воздействие на цитокиновую регуляцию процесса пролиферации, так и непосредственный, путем снижения уровня токсических интермедиатов кислорода и предотвращения их повреждающего действия на клетки.

Действительно, мы показали, что введение ААв за 1 час до тотального облучения мышей приводило к снижению уровня первичных продуктов ПОЛ -гидроперекисей липидов в селезенке через 12 и 24 часа после воздействия, более существенному по сравнению с аскорбиновой кислотой (рисунок 7).

□ облучение В Вит. С+облучение

Рисунок 7 - Влияние гликозида витамина С (ААО) и аскорбиновой кислоты на содержание гидроперекисей липидов в селезенке мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр (Х±т)

Мы подтвердили эти результаты и на модели индукции окислительного стресса гидроперекисью водорода в изолированных спленоцитах in vitro.

Гидроперекись водорода в высокой концентрации значимо ингибировала спонтанную пролиферацию спленоцитов. AAG в концентрации 5 мМ, в отличие от аскорбиновой кислоты в той же концентрации, полностью препятствовал ингибирующему действию Н202 на пролиферативные процессы в спленоцитах.

Исследование роли системы глутатиона в антитоксическом действии гликозида аскорбиновой кислоты

Основным механизмом повреждающего действия при химиотерапии и лучевом воздействии является избыточная генерация активных форм кислорода и радикалов в результате активации микросомального окисления и радиолиза воды. Посрадиационная ответная реакция клеток обусловлена состоянием антиоксидантной системы, что подтверждается многочисленными литературными данными (Biaglow J.E., et al., 2003; Guo G., et al., 2003; Ustinova A.A., Riabinin V.E., 2003; D'Andréa G.M., 2005). Ключевая роль в защите клеток от окислительного стресса отводится системе глутатиона. Недавние исследования показали, что аскорбиновая кислота играет важную роль в поддержании нормального уровня глутатиона в условиях окислительного стресса (Montecinos V. et al., 2007). Поэтому целесообразно было изучить влияние AAG на систему глутатиона в условиях окислительного стресса, индуцированного различными воздействиями, в частности, радиосенсибилизатором саназолом, при его использовании в нейротоксической дозе, и гамма-излучением в сублетапьной дозе.

Введение саназола в нейротоксической дозе приводило к существенному снижению уровня восстановленного глутатиона в головном мозге экспериментальных животных (таблица 3). Содержание окисленного глутатиона при этом существенно повышалось и отношение GSH/GSSG снижалось, что свидетельствует об активации процессов окислительного стресса в ткани мозга.

Таблица 3 - Уровень восстановленного (ОвН), окисленного (СБйО) глутатиона и отношение ОБН/ОББИ в мозге мышей, получавших гликозид аскорбиновой кислоты в сочетании с нейротоксической дозой саназола (Х±ш)__

Группы животных GSH (мкмоль/ г ткани) GSSG (нмоль/г ткани) GSH/GSSG

Интактные 1,34± 0,08 8,48± 0,53 163

Саназол, 2,1 г/кг 0,95± 0,08* 10,64±0,64* 89*

Саназол, 2,1 г/кг + Вит С, 50 мг/кг 1,06± 0,08* 10,08±0,35 104*

Саназол, 2,1 г/кг + AAG, 50 мг/кг 1,30±0,05** 8,76± 0,3** 148**

Примечания 1 * - различия статистически значимы с ищ-актной группой (р<0,05); 2 ** - различия статистически значимы с саназолом (р<0,05).

Предварительное введение животным ААО приводило к повышению уровня СЭН и снижению уровня окисленного глутатиона, по сравнению с группой животных, получавших только саназол. В результате этого происходило восстановление отношения ОБН/ОББС, что свидетельствует о защите клеток от окислительного стресса. Очевидно, что способность ААО поддерживать высокий уровень ввН вносит вклад в его нейропротекгорное действие. В то же время предварительное введение

аскорбиновой кислоты не вызывало существенного повышения уровня ОБН и не оказывало выраженного нейропротекторного эффекта.

Аналогичный эффект изучаемых антиоксидантов на уровень глутатиона в спленоцитах мы наблюдали и на модели облучения животных в сублетальной дозе. Предварительное введение гликозида витамина С способствовало сохранению более высокого уровня восстановленного глутатиона в спленоцитах мышей в ранние сроки после облучения и более быстрому восстановлению его уровня до контрольных значений в отдаленные сроки (рисунок 8). ААв более эффективно, чем витамин С, предотвращал повышение окисленной формы глутатиона и способствовал сохранению уровня его восстановленной формы и отношения ОБН/СЖО в условиях окислительного стресса, индуцированного облучением.

■ необлучениые животные И облучение. 5,6 Гр □ МО, (100 аг/|гг«6л>чеиш, 5.6 Гр - ЯВиг.С,(100ыг/кг)+о6луче№е,5,6Гр

24 часа 1

сутки госле обдученда

24 часа 3 суш после «¡лучения

24 часа 3 7

сутки после облучения

Рисунок 8 - Влияние гликозцда витамина С (ДАО) и аскорбиновой кислоты на уровень восстановленного (08Н), окисленного (О,480) глутатиона и отношение (08Н/0880) в спленоцитах мышей С57В1/6 в разные сроки после облучения в сублетальной дозе 5,6 Гр (Х±ш)

Это объясняется тем, что в условиях in vivo, благодаря стабильности AAG, более длительное время создается высокая концентрация аскорбиновой кислоты в плазме крови. Под действием активных форм кислорода, образующихся в процессе радиолиза воды при действии радиации, происходит окисление аскорбиновой кислоты, в результате образуется дегидроаскорбиновая кислота, которая с помощью транспортеров глюкозы ГЛУТ-] транспортируется в клетки и индуцирует активацию пентозофосфатного цикла (Puskas F. et al., 2000). Окисленный глутатион, образующийся в реакциях нейтрализации активных радикалов, генерируемых ионизирующим излучением, восстанавливается в глутатинредуктазной реакции за счет NADPH, который синтезируется в активированном пентозофосфатном цикле. Это позволяет клеткам поддерживать более высокий редокс-потенциал системы

глутатиона и защищает их от радикалов, образующихся при действии ионизирующей радиации.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показан целый ряд модулирующих эффектов новых соединений - гликозида витамина С (AAG) и гликозида витамина Е (TMG). Выявлена способность AAG и TMG повышать антиметастатическую эффективность циклофосфана путем снижения его токсического действия на показатели системы иммунитета и стимуляции функциональной активности лимфоцитов, при этом показано преимущество модифицированных витаминов по сравнению с природными. Показан широкий спектр антитоксической активности модифицированных витаминов на моделях циклофосфан-индуцированной гемо- и иммунотоксичности, нейротоксичности, рентгеновского облучения в сублетальной дозе, окислительного стресса in vitro. Одним из важных механизмов протекторного действия изучаемых агентов в условиях индукции окислительного стресса под влиянием цитостатической терапии является их способность проявлять умеренное защитное действие на клетки костного мозга и иммунной системы в ранний период после повреждающего действия и существенно стимулировать процессы восстановления кроветворения и функциональной (пролиферативной) активности лимфоцитов. Гликозид аскорбиновой кислоты более выражено, чем аскорбиновая кислота, ингибирует ПОЛ и способен сохранять высокий редокс-потенциал системы глутатиона. Полученные данные являются патогенетическим обоснованием для использования гликозида витамина С в комплексном лечении онкологических больных с целью снижения миело-, иммуно- и нейротоксических проявлений, индуцируемых химио- и лучевой терапией.

Выводы

1. Гликозиды витамина С и витамина Е усиливают антиметастатическое действие низких доз циклофосфана (60 мг/кг) у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюис (торможение роста метастазов составило 89,9% и 91,5% соответственно, индекс ингибиции метастазирования в группе с TMG составил 83%), что сопоставимо с уровнем эффективности максимальной дозы цитостатика (120 мг/кг) (ТРМ - 99,8%, ИИМ - 99,9%).

2. Введение модифицированных витаминов одновременно с токсической дозой циклофосфана (250 мг/кг) существенно предотвращает степень снижения клеточности селезенки и содержания лейкоцитов в периферической крови и миелокариоцитов в костном мозге и способствует ускоренному их восстановлению у мышей С57В1/6.

3. Гликозвды витамина С и витамина Е способны нормализовать поведенческие реакции (горизонтальную, вертикальную двигательную активности и эмоциональную реакцию) животных в условиях индуцированной нейротоксичности, что свидетельствует о их нейропротекторном действии.

4. Введение гликозвдов витамина С и витамина Е мышам, подвергнутым воздействию гамма-излучения в сублетальной дозе, способствует защите уровня лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови и ядросодержащих клеток костного мозга на ранних этапах после облучения и ускоренному восстановлению кроветворения.

Гликозид витамина С препятствует ингибированию спонтанной пролиферации спленоцитов при гамма облучении in vivo и в условиях окислительного стресса, индуцированного in vitro гидроперекисью водорода.

Гликозид витамина С снижает уровень окислительного стресса, индуцированного радиацией и цитостатическими агентами, в нормальных клетках и тканях путем влияния на систему глутатиона, нормализуя соотношение восстановленной и окисленной форм глугатиона.

Модифицированные витамины (гликозиды витамина С и витамина Е) в сравнении с аскорбиновой кислотой и альфа-токоферолом оказывают более выраженное действие на повышение эффективности и снижение токсичности противоопухолевой терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Шишкина A.A. Исследование способности антиоксидантных агентов (аскорбиновой кислоты и водорастворимого витамина Е) понижать нейротоксичность высоких доз препарата саназола (АК-2123) у мышей (CBAxC57Bl/6)Fl [Текст] / A.A. Шишкина, Е.А. Малиновская // Науки о человеке: сборник статей по материалам пятого конгресса молодых ученых и специалистов, Томск. - 2004. - С. 332-334.

Шишкина A.A. Исследование способности водорастворимых антиоксидантов снижать нейротоксичность высоких доз саназола в эксперименте [Текст] / A.A. Шишкина, Н.В. Чердынцева, Е.А. Малиновская, Т.В. Кагия // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии", Томск. -2004. -С. 312-313.

Шишкина A.A. Влияние водорастворимого аналога витамина Е (TMG) на систему кроветворения у сублеталыю облученных мышей [Текст] / A.A. Шишкина, И.Ю. Буторин // Науки о человеке: сборник статей по материалам шестого конгресса молодых ученых и специалистов, Томск. - 2005. -С. 90-91. Иванова A.A. Определение глутатиона в гомогенате мозга мышей после введения высокой дозы саназола [Текст] / A.A. Иванова И IV Всероссийская конференция молодых ученых "Проблемы фундаментальной и прикладной медицины", Новосибирск. - 2006. - С. 24-25.

Иванова A.A. Способность водорастворимого витамина Е (TMG) и гликозида витамина С (AA-2G) модулировать терапевтическую эффективность циклофосфана [Текст] / A.A. Иванова // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: "сборник материалов региональной конференции молодых ученых, Томск. - 2006. - С.29-30.

6. Иванова A.A. Влияние модифицированного антиоксиданта гликозида витамина С (AA-2G) на уровень глутатиона в гомогенате мозга мышей [Текст] / A.A. Иванова, Н.В. Чердынцева, В.В. Иванов // VII Международная конференция "Биоантиоксидант", Москва. -2006. -С.142-144.

7. Изобретение Шишкина A.A. Патент Российской Федерации на изобретение №2286777 от 10 ноября 2006 г. "Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте" / A.A. Шишкина, Н.В. Чердынцева, Е.А. Малиновская, Т. В. Кагия.

8. Иванова А.А. Способность водорастворимого витамина E(TMG) и гликозида витамина С (AAG) снижать побочные эффекты при химиот- радиотерапии [Текст] / А.А. Иванова, В.А. Шепилова // II региональная конференция молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии", Томск, Сибирский онкологический журнал. - 2007. - прил. № 2. - Р. 52 - 53.

9. Иванова А.А. Механизм действия гликозида витамина С (AAG) в защите системы кроветворения у мышей после облучения в сублетальной дозе [Текст] / А.А. Иванова, В.А. Шепилова // IV региональная конференция молодых ученых-онкологов им. Академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии", Томск, Сибирский онкологический журнал. - 2009. - прил. № 1. - С. 80 - 81.

10. Иванова А.А. Способность гликозида витамина С (AAG) защищать систему кроветворения у мышей после облучения в сублетальной дозе [Текст] / А.А. Иванова, В.В. Иванов, В.А. Шепилова // Материалы Российской науно-практической конференции с международным участием "Проблемы современной онкологии", Барнаул. - 2009. - С. 143 - 144.

11. Иванова А.А. Способность модифицированных витаминов Е и С модулировать терапевтическое действие циклофосфана [Текст] / А.А. Иванова, В.В. Иванов, Н.В. Чердынцева, В.А. Шепилова, Т.В. Кагия // Сибирский онкологический журнал - 2009. - № 2(32). - С.55-59.

12. Шишкина А.А. Inhibitory effect of water soluble bioantioxidants on the neurotoxicity induced by sanazole sensitizer in mice [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A. Shishkina, T. Kagiya II 10й1 Annual Meeting on the Sensitization of Cancer Treatment, Japan. -2004.-P. 19.

13. Шишкина А.А. Effect of tocopherol-monoglucoside (TMG) on hematopoietic recovery in irradiated mice [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A. Shishkina, I.Yu. Butorin, H. Murase, P.A. Gervas // 47th Annual Meeting Japan Radiation Research Society, Nagasaki. - 2004. 11/25-27. - P.77.

14. Шишкина A.A. Effect of tocopherol-monoglucoside (TMG), a water-soluble glycosylated derivative of vitamin E, on hematopoietic recovery in irradiated mice [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A.,Shishkina, I.Yu. Butorin, H. Murase, P.A. Gervas, V.T. Kagiya // J. Rad. Res. - 2005. - Vol. 46, № 1. - P. 37-41.

15. Иванова A.A. Effect of ascorbic acid and its glycoside on the glutathione level in brain of micc administered with high dose of sanazole (AK-2123) [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A. Ivanova, V.V. Ivanov, T.V. Kagiya // 12 Annual Meeting on the sensitization of cancer treatment, Japan. - 2006. - P.l 8.

16. Иванова A.A. Tocopherol mono-glucoside, and ascorbic acid glycoside modulate the efficacy of cyclophosphamide (CPA) [Текст] / A.A, Ivanova, N.V. Cherdyntseva, T.V. Kagiya // 12 Annual Meeting on the sensitization of cancer treatment, Japan. - 2006. -P. 19.

17. Иванова A.A. Biological mechanisms underlying the tocopherol mono-glucoside (TMG) ability to modify the efficacy of chemotherapy and decrease radio-and chemotoxicity [Текст] / A.A. Ivanova, N.V. Cherdyntseva, V.V. Ivanov, I.Yu. Butorin, H. Murase, T.V. Kagiya // 13 Annual Meeting on the sensitization of cancer treatment, Japan.-2007.-P. 16.

18. Иванова A.A. Glucoside of ascorbic acid modifies efficacy and toxicity of chemotherapy and gamma irradiation [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A. Ivanova, V.V. Ivanov, E. Malinovskaya, V. Shepilova, T.V. Kagiya // 13 Annual Meeting on the sensitization of cancer treatment, Japan. - 2007. - P. 117.

19. Иванова A.A. Tocopherol mono-glucoside and Ascorbic acid glucoside inhibit radiation and chemotherapy induced side effects [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A. Ivanova, V.V. Ivanov, T.V. Kagiya // 1st Conference of Radioprotection (Human-Defense) Society, Kyoto, Japan. - 2007. - P.28.

0. Иванова A.A. Glucoside of ascorbic acid modifies efficacy and toxicity of chemotherapy and gamma irradiation [Текст] / N.V. Cherdyntseva, A.A. Ivanova, V.V. Ivanov, E. Malinovskaya, V. Shepilova, T.V. Kagiya // 1st Conference of Radioprotection (Human-Defense) Society, Kyoto, Japan. -2007. - P.29. 21. Иванова A.A. Mechanisms underlying the glucoside of ascorbic acid capacity to protect hemopoiesis in gamma-irradiated mice [Текст] / N.V. Cherdyntseva, V.V. Ivanov, V. Shepilova, A.A. Ivanova, E. Cherdyntsev, T.V. Kagiya H 2nd Conference of Radioprotection (Human-Defense) Society, Kyoto, Japan. - 2008. - P.42-43.

Автор выражает глубокую признательность проф. Т.В. Кагии (Киото, Япония), к.б.н. С.Ю. Семенову, В.А. Шепиловой за помощь при проведении исследований и обсуждении результатов.

Список сокращений

АК-2123 - саназол

АО - антиоксидант

АФК - активные формы кислорода

ПОЛ - перекисное окисление липидоз

ЦФ - циклофосфан

AAG - гликозид аскорбиновой кислоты (ascorbic acid glucoside)

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

LLC - карцинома легких Льюис

TMG - гликозид витамина (tocopherol monoglucoside)

Подписано к печати 31.08.2009. Тираж 100 экз. Кол-во стр.25. Заказ № 36-09 Бумага офсетная. Формат А-5. Печать RISO. Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбх» Лицензия Серия ПД № 12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 046 тел. (3822) 56-44-54

Актуальность темы

В последние годы достигнуты определенные успехи в лечении больных со злокачественными новообразованиями, связанные с внедрением в клиническую практику новых противоопухолевых препаратов и схем их введения, созданием принципиально новых подходов на основе таргетных (специфически нацеленных на определенную мишень на клеточной мембране или в цитоплазме опухолевой клетки) препаратов [177, 238]. Однако в подавляющем большинстве в качестве противоопухолевой терапии используется комплексное лечение, включающее химио-, радиотерапию и оперативное вмешательство. Химио- и лучевая терапия используются как в неоадъювантном режиме для перевода опухолевого процесса в операбельное состояние или возможности осуществления органосохранной операции, так и в адъювантном режиме с целью предотвращения рецидивирования и метастазирования [69]. Главным препятствием в достижении желаемого эффекта являются врожденная или приобретенная резистентность опухолей к лекарственным препаратам и лучевому воздействию, а также высокая токсичность этих воздействий, нередко ограничивающая проведение интенсивной противоопухолевой терапии [10, 33, 52, 187, 266]. Возникновение побочных эффектов при проведении химиотерапии и радиотерапии онкологических больных обусловлено самим принципом их повреждающего действия в основном на активно пролиферирующие клетки путем нарушения процессов деления или запуска апоптоза [17, 21, 28, 60, 65, 75, 102, 121]. Поэтому эти виды противоопухолевого воздействия являются токсичными для систем, функционирование которых связано с высокой пролиферативной активностью клеток - костного мозга, иммунной системы, слизистых оболочек, детоксицирующих органов, таких как печень, почки, а также головного мозга и сердца [11, 38, 61, 98, 167, 180, 240, 252]. Побочное действие лекарственных препаратов и лучевой терапии, таким образом, связано с их низкой избирательностью, необходимостью поддерживать достаточно высокую терапевтическую дозу, длительностью лечения.

В структуре осложнений большинства цитостатических агентов основное место занимает супрессивное влияние на костномозговое кроветворение [15, 17, 21], гепатотоксичность, приводящая к снижению противоопухолевого эффекта и увеличению токсичности препаратов, метаболизирующихся в печени [11, 98]. Одним из специфических осложнений противоопухолевой терапии является нейротоксичность, которая характерна для производных платины (цисплатин), таксанов (паклитаксел), метотрексата [38, 61, 266], а также широко используемых в настоящее время целого ряда радиосенсибилизаторов [6, 167]. При этом установлено, что снижение дозы препарата или дозы облучения вызывает также и снижение терапевтического эффекта, однако на токсичность практически не влияет [10]. При использовании комбинации 2-х и более препаратов с целью повышения эффективности лечения токсичность полихимиотерапии возрастает [29, 31, 58]. Достижение максимальной терапевтической эффективности цитостатических методов лечения злокачественных опухолей может быть связано с использованием новых средств, блокирующих или замедляющих развитие токсических повреждений, но не снижающих противоопухолевых свойств цитостатиков [3, 10, 21, 65]. Все это делает актуальным разработку средств и способов снижения токсического действия специфического противоопухолевого лечения и защиты жизненно важных органов и тканей, способствующих высокой эффективности цитостатической терапии.

Основным механизмом повреждающего действия на нормальные клетки и ткани при химиотерапии и лучевом воздействии является избыточное накопление активных форм кислорода в результате активации микросомального окисления и радиолиза воды соответственно [57]. Следствием этого является повреждение функционирования системы антиоксидантной защиты (включая ее ферментативное и неферментативное J звенья), нарушение иммунологических механизмов, участие которых также чрезвычайно важно в процессах детоксикации и регуляции гемопоэза [83, 92, 252, 255].

В процессе решения данной задачи было разработано и обосновано применение большого числа различных модифицирующих воздействий, направленных на снижение токсичности и/или усиление терапевтического , эффекта малотоксичных доз цитостатических и лучевых воздействий [136,

190]. Среди средств, предупреждающих повреждение нормальных тканей, достаточно широко представлены природные соединения (церулоплазмин, лактоферрин) [166, 196], колониестимулирующие факторы (ленограстим, филграстим, молграмостим, пегфилграстим, эритропоэтин) [110, 222], тиоловые соединения (амифостин) [3, 10, 87, 100, 131]. Однако узкая направленность действия корректоров токсичности, наличие побочных эффектов или высокая стоимость ограничивают их применение [48, 65, 215]. В качестве сопровождения химиотерапии достаточно широко используются , природные антиоксиданты с неферментативным действием, в частности, атокоферол и аскорбиновая кислота [3, 57, 65, 146]. Показано, что защитные эффекты антиоксидантов в определенной мере селективны для нормальных клеток и могут уменьшать токсичность противоопухолевого лечения без снижения эффективности. Более того, есть данные, что антиоксиданты могут способствовать повышению эффективности химио- и лучевых воздействий [210, 224].

Однако, есть литературные данные о том, что антиоксиданты могут защищать и раковые клетки, снижая тем самым эффективность « противоопухолевой терапии [132]. Аскорбиновая кислота имеет ряд недостатков: во-первых, это достаточно нестабильное соединение, которое разрушается под действием тепла, света, ионов тяжелых металлов и при нейтральном значении рН [65], и, во-вторых, способное становиться мощным прооксидантом в присутствии ионов железа или меди, что особенно нежелательно и даже опасно в клинической ситуации [132, 203,

221, 232, 261]. Липофильные свойства витамина Е (а-токоферола), которые обеспечивают его тропность к липидному слою клеточных мембран, существенно ограничивают радиус его действия в живой клетке, не позволяя проявлять активность в водной фазе [258].

В последние годы создан ряд новых форм витаминов-антиоксидантов путем модификации их структуры, приводящей к изменению свойств по сравнению с указанными природными витаминами [59, 152, 192, 217, 245]. Японскими учеными разработаны и изучаются оригинальные модифицированные антиоксиданты - гликозид витамина С (2-О-а -D-глюкопиранозил-Ь-аскорбиновая кислота) [144, 154] и гликозид витамина Е (2-(а-0-глюкопиранозил) метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол) [251]. Благодаря наличию глюкозы в своей структуре гликозид витамина Е (tocopherol monoglucoside - TMG) приобретает способность растворяться в воде (>1x10 мг/мл) и проявлять антирадикальную активность не только в липидной фазе биологических мембран, но и в цитоплазме клеток, в отличие от его прототипа а-токоферола [103, 234].

Экспериментальные исследования показали, что гликозид витамина С (ascorbic acid glucoside - AAG) in vitro проявляет меньшую цитотоксичность в высоких концентрациях, чем аскорбиновая кислота [154, 208]. Кроме того, AAG более стабилен и обеспечивает накопление аскорбиновой кислоты в организме в более высоких концентрациях и, таким образом, может оказывать более выраженный защитный эффект. Одним из основных отличий в механизме антиоксидантного действия AAG по сравнению с аскорбиновой кислотой является то, что он обладает выраженным инактивирующим эффектом по отношению к высокореактивному ОН-радикалу. Это обусловлено тем, что образующиеся при взаимодействии AAG с ОН- радикалом аддукты обладают более низкой способностью к генерации АФК, в отличие от немодифицированного витамина [142, 182, 200].

Японскими и индийскими исследователями получены данные о том, что TMG оказывает радиопротекторное действие, эффективно защищает хромосомный аппарат и ДНК нормальных клеток от повреждающего действия у-излучения, а также защищает нормальные ткани при действии у-излучения у мышей опухоленосителей, не снижая его противоопухолевой эффективности [143, 211, 242, 249].

Показано, что AAG защищает ткань печени от повреждающего действия гамма-излучения в эксперименте [200], а в клинических условиях при применении до облучения у больных со злокачественными новообразованиями существенно снижает проявление таких побочных эффектов радиотерапии как тошнота и диарея [129].

Все вышесказанное делает целесообразным исследование эффективности названных соединений в защите жизнедеятельности и обеспечении полноценного функционирования критических органов и тканей, повреждаемых при цитостатической терапии, и механизмов действия с целью патогенетического обоснования их использования в качестве сопровождающей терапии на фоне комплексного противоопухолевого лечения. Чрезвычайно важной является проблема улучшения качества жизни онкологических больных, получающих цитостатическое лечение, за счет снижения побочных токсических реакций [34]. При этом важное значение может иметь аспект повышения эффективности противоопухолевой терапии под влиянием антиоксидантных агентов, которые по механизму действия являются модификаторами биологических реакций и способны регулировать взаимоотношение опухоли и организма, особенно в условиях специфической антибластомной терапии [84, 172, 236, 270].

Цель исследования: изучить влияние гликозида витамина С и гликозида витамина Е на эффективность и токсические эффекты химиотерапии и лучевого воздействия и выявить механизмы их действия.

Задачи исследования: 1. Изучить способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать противоопухолевую и антиметастатическую эффективность циклофосфана у мышей с перевиваемой опухолью карциномой легких Льюис (LLC).

2. Исследовать влияние модифицированных витаминов на показатели системы иммунитета в условиях иммунодепрессии, вызванной введением противоопухолевого цитостатика циклофосфана в высокой дозе.

3. Оценить способность гликозидов витамина С и витамина Е снижать нейротоксичность, индуцированную химиопрепаратами.

4. Изучить влияние гликозидов витамина С и витамина Е на показатели гемопоэза у мышей после рентгеновского облучения в сублетальной дозе.

5. Исследовать защитный эффект гликозида витамина С на пролиферативную активность клеток селезенки мышей при действии гамма-излучения.

6. Оценить участие системы глутатиона в защитном действии гликозида аскорбиновой кислоты в условиях окислительного стресса, индуцированного действием радиации и химиотерапии.

Научная новизна

В экспериментальных исследованиях установлено, что модифицированные витамины: гликозид витамина С и гликозид витамина Е, в сравнении с аскорбиновой кислотой и альфа-токоферолом, оказывают более выраженное действие на повышение эффективности и снижение токсичности противоопухолевой терапии.

Впервые показана способность гликозидов витамина С и витамина Е повышать эффективность цитостатической терапии экспериментальных опухолей. Установлено, что введение AAG или TMG потенцирует антиметастатическое действие циклофосфана в низких терапевтических дозах.

Установлено, что гликозиды витамина С и витамина Е способны снижать токсическое действие высоких доз циклофосфана на тимус и селезенку у мышей, а также способствуют более быстрому восстановлению лейкоцитов периферической крови и клеток костного мозга в условиях циклофосфан-индуцированной иммунодепрессии.

Получены новые данные о способности гликозидов витамина С и витамина Е снижать одно из специфических осложнений химиотерапии -нейротоксичность. Приоритет полученных данных подтвержден патентом РФ №2286777 от 10 октября 2006 г "Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте".

Впервые показано, что введение гликозидов витамина С и витамина Е мышам, облученным в сублетальной дозе, умеренно защищает клетки костного мозга и крови в острый период радиационного воздействия и стимулирует процессы восстановления кроветворения, что можно рассматривать как один из основных механизмов радиопротекторного и антитоксического действия изучаемых агентов.

Получены оригинальные данные о том, что гликозид витамина С препятствует ингибированию спонтанной пролиферации лимфоцитов в условиях окислительного стресса in vivo и in vitro.

Установлено, что защитное действие гликозида витамина С в условиях окислительного стресса, индуцированного радио- и химиотерапией, обусловлено нормализацией редокс состояния глутатиона.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные результаты расширяют представление о механизмах антитоксического действия модифицированных витаминов - гликозидов витамина С и витамина Е при химиотерапии и лучевом воздействии.

Они могут явиться основой для разработки новых методов коррекции побочных эффектов лекарственной и лучевой терапии, что позволит повысить качество жизни и эффективность лечения онкологических больных.

Полученные результаты позволяют рекомендовать проведение клинической апробации гликозида витамина С в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями для снижения побочных эффектов химио- и радиотерапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Гликозиды витамина С и витамина Е способны повышать эффективность терапии злокачественных опухолей циклофосфаном и снижать выраженность токсических проявлений химио- и радиотерапии.

2. В основе радиопротекторного и антитоксического действия модифицированных витаминов лежит их способность стимулировать восстановление кроветворения и функциональной активности клеток иммунной системы.

3. Антитоксическое действие гликозида витамина С при противоопухолевой терапии обусловлено его способностью ингибировать перекисное окисление липидов и нормализовать редокс состояние глутатиона.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных отчетных конференциях молодых ученых НИИ онкологии СО РАМН в 2003, 2005, 2006, 2009 гг., конференции, посвященной 70-летию биолого-почвенного факультета ТГУ (Томск, 2003), V и VI конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2004, 2005), 10, 12, 13-ой международной конференции по повышению эффективности противоопухолевого лечения "Annual meeting on the sensitization of cancer treatment" (Киото, Япония, 2004, 2006, 2007), 13 международном конгрессе по приполярной медицине "Проблемы фундаментальной и прикладной медицины" (Новосибирск, 2006), VII международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2006), 1 и 2-ой конференции японского общества по радиопротекции "Radioprotection (Human-Defense) Society" (Киото, Япония, 2007, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 работа, в том числе 2 - в центральных журналах, рекомендованными "Перечнем." ВАК Минобрнауки. Получен патент на изобретение №2286777 от 10 ноября 2006 г "Способ снижения нейротоксичности радиосенсибилизатора саназола в эксперименте". t

ВЫВОДЫ

1. Гликозиды витамина С и витамина Е усиливают антиметастатическое действие низких доз циклофосфана (60 мг/кг) у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюис (торможение роста метастазов составило 89,9% и 91,5% соответственно, индекс ингибиции метастазирования в группе с TMG составил 83%), что сопоставимо с уровнем эффективности максимальной дозы цитостатика (120 мг/кг) (ТРМ - 99,8%, ИИМ - 99,9%).

2. Введение модифицированных витаминов одновременно с токсической дозой циклофосфана (250 мг/кг) существенно предотвращает степень снижения клеточности селезенки и содержания лейкоцитов в периферической крови и миелокариоцитов в костном мозге и способствует ускоренному их восстановлению у мышей С57В1/6.

3. Гликозиды витамина С и витамина Е способны нормализовать поведенческие реакции (горизонтальную, вертикальную двигательную активности и эмоциональную реакцию) животных в условиях индуцированной нейротоксичности, что свидетельствует о их нейропротекторном действии.

4. Введение гликозидов витамина С и витамина Е мышам, облученным в сублетальной дозе, способствует защите уровня лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови и ядросодержащих клеток костного мозга на ранних этапах после гамма-облучения и ускоренному восстановлению кроветворения.

5. Гликозид витамина С препятствует ингибированию спонтанной пролиферации спленоцитов при гамма облучении in vivo и в условиях окислительного стресса, индуцированного in vitro гидроперекисью водорода.

6. Гликозид витамина С снижает уровень окислительного стресса, индуцированного радиацией и цитостатическими агентами, в нормальных клетках и тканях путем влияния на систему глутатиона, нормализуя соотношение восстановленной и окисленной форм глутатиона.

7. Модифицированные витамины (гликозиды витамина С и витамина Е) в сравнении с аскорбиновой кислотой и альфа-токоферолом оказывают более выраженное действие на повышение эффективности и снижение токсичности противоопухолевой терапии. I

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на безусловные достижения современной противоопухолевой терапии, проблема повышения эффективности лечения онкологических больных, по-прежнему остается актуальной. В настоящее время в практику лечения злокачественных новообразований внедряются новые подходы, основанные на использовании таргетных (специфически нацеленных на определенную мишень на клеточной мембране или в цитоплазме опухолевой клетки) препаратов [177], разрабатываются методы I специфического влияния на молекулярно-генетические повреждения в злокачественных клетках (siRNA, антисмысловые олигонуклеотидные последовательности) [2, 139, 193] с целью ингибиции или реверсии злокачественного фенотипа. Однако подавляющую часть противоопухолевой терапии все еще составляет комплексное лечение, включающее химио-, радиотерапию и оперативное вмешательство. Главным препятствием в достижении желаемого эффекта являются врожденная или приобретенная (индуцированная) резистентность опухолей к лекарственным препаратам и лучевому воздействию, а также высокая токсичность этих воздействий, I нередко ограничивающая проведение интенсивной противоопухолевой терапии. Побочные эффекты являются неотъемлемым атрибутом лекарственной и радиотерапии в силу принципа их действия, основанного на способности оказывать повреждающее (цитостатическое или цитотоксическое) действие на пролиферирующие клетки. Поэтому токсическому влиянию подвергаются такие системы, функционирование которых связано с высокой пролиферативной активностью их клеточных элементов: костный мозг, система иммунитета, система слизистых оболочек, органы, осуществляющие детоксикацию (печень, почки), сердце и нервная 1 система [11, 38, 60, 61, 98, 167, 180, 240, 252].

Основным механизмом повреждающего действия при химиотерапии и •лучевом воздействии является избыточное накопление активных форм кислорода в результате активации микросомального окисления и радиолиза воды соответственно. Следствием этого является повреждение функционирования системы антиоксидантной защиты (включая ее ферментативное и неферментативное звенья), нарушение иммунологических механизмов, участие которых также чрезвычайно важно в процессах детоксикации и регуляции гемопоэза [83, 92, 252, 255].

В процессе решения данной задачи было разработано и обосновано применение большого числа различных модифицирующих воздействий, направленных на усиление терапевтического эффекта цитостатических и лучевых воздействий, либо на снижение их токсичности [32, 40]. Среди широкого спектра модифицирующих воздействий достаточно широко используются антиоксиданты с неферментативным действием, которые в основном представлены а-токоферолом и аскорбиновой кислотой [104, 112, 122].

Аскорбиновая кислота имеет ряд существенных недостатков: это достаточно нестабильное соединение, оно разрушается под действием тепла, света, в присутствии ионов железа становится мощным прооксидантом. Липофильность токоферола (его локализация только в мембране клетки) ограничивает радиус его действия в живой клетке [258].

В связи с этим в последние годы интенсивно развивается технологии создания модифицированных антиоксидантов, изучаются их свойства для оценки возможности использования в качестве эффективной защиты организма при противоопухолевой (лекарственной и лучевой) терапии злокачественных новообразований.

Японскими учеными разработаны и изучаются оригинальные модифицированные антиоксиданты гликозид витамина С - AAG (2-О-а -D-глюкопиранозил -L-аскорбиновая кислота) [144, 154] и витамина Е - TMG (2-(a-D-глюкопиранозил) метил-2,5,7,8-тетраметилхроман-6-ол) [251].

Экспериментальные данные показали, что AAG проявляет меньшую токсичность в высоких концентрациях, чем аскорбиновая кислота. Кроме того, AAG обеспечивает накопление аскорбиновой кислоты в организме в более высоких концентрациях и, таким образом может оказывать более выраженный защитный эффект.

Благодаря наличию глюкозы в свой структуре, TMG приобретает способность растворяться в воде и проявлять антирадикальную активность не только в биологических мембранах (липидной фазе), но и в цитоплазме клеток, в отличие от его прототипа а-токоферола.

Японскими и индийскими исследователями получены данные о способности TMG защищать от гибели мышей, облученных в летальной дозе, снижать повреждающее действие радиации на ДНК, предотвращать хромосомные перестройки в костном мозге облученных мышей, защищать микросомальные мембраны печени [129, 211, 229, 242, 249]. Показано, что AAG защищает ткань печени от повреждающего действия гамма-излучения в эксперименте [200], а в клинических условиях при применении до облучения существенно снижал проявление таких побочных эффектов как тошнота и диарея [129].

Все вышесказанное делает целесообразным исследование эффективности названных соединений в защите жизнедеятельности критических органов и тканей, повреждаемых при цитостатической терапии, и механизмов их действия с целью патогенетического обоснования их использования для снижения побочных эффектов у онкологических больных, получающих комплексное противоопухолевое лечение. При этом важное значение может иметь аспект повышения эффективности противоопухолевой терапии под влиянием антиоксидантных агентов, которые по механизму действия рассматриваются как модификаторы биологических реакций, способные регулировать взаимоотношение опухоли и организма, особенно в условиях терапии [83, 172, 236, 270].

В этой связи целью работы явилось исследование модулирующего влияния модифицированных витаминов (AAG и TMG) на противоопухолевую эффективность и токсические эффекты химиотерапии и лучевого воздействия и выявление опосредующих их действие механизмов.

В последние два десятилетия в мире интенсивно развивается направление использования воздействий различной природы, которые могли бы модулировать эффективность специфической противоопухолевой терапии путем регуляции эндогенных механизмов, способных проявлять противоопухолевое действие, при этом наиболее обоснованным подходом является не биотерапия, как таковая, а сочетание специфических методов лечения новообразований с модификаторами. В рамках этого направления мы оценили способность гликозидов витамина С (AAG) и витамина Е (TMG) модулировать эффективность цитостатического агента циклофосфана в экспериментальной ситуации роста злокачественной опухоли у мышей.

В наших экспериментах на мышах с гематогенно-метастазирующей в легкие карциномой Льюис (LLC) было показано, что применение ЦФ в максимальной терапевтической дозе 120 мг/ кг приводило к умеренному торможению роста опухоли и практически полному подавлению метастазирования, однако сопровождалось выраженной токсичностью, о чем судили по снижению клеточности селезенки. Снижение дозы ЦФ при более умеренной токсичности однако не оказывало выраженного терапевтического эффекта. Использование ЦФ в низкой дозе совместно с AAG или TMG приводило к выраженному торможению метастазирования, которое по величине было сравнимо с эффектом препарата в максимальной терапевтической дозе, но при этом не отмечалось токсического действия на селезенку. Важно отметить, что введение AAG и TMG совместно с циклофосфаном в дозе 60 мг/кг не оказывало влияния на рост первичной опухоли, что может свидетельствовать о безопасности их применения при наличии опухолевого процесса в организме с точки зрения возможной стимуляции опухолевого роста. Введение аскорбиновой кислоты и а-токоферола совместно с циклофосфаном не оказывало выраженного влияния на антиметастатическую эффективность цитостатической терапии. Известно, что основной причиной смертности от злокачественных новообразований является диссеминация процесса, поэтому с самого начала развития направления по использованию модификаторов биологических реакций в онкологии главный акцент делался не на удалении первичной опухоли, а на ингибиции метастатического процесса [64]. Это и обусловило продуктивность подхода по совместному использованию биоактивных агентов с воздействиями, удаляющими первичный опухолевый очаг.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о способности TMG и AAG усиливать терапевтическое действие малой дозы цитостатика в отношении метастазов до эффекта максимальной терапевтической дозы. Одним из механизмов, ответственных за повышение антиметастатического эффекта модификаторов является регуляция активности иммунной системы, которая играет важную роль в контроле метастазирования [83, 84]. Модифицированные антиоксиданты в силу способности снижать уровень биологически агрессивных продуктов свободнорадикального окисления оказывают защитный эффект в отношении клеток иммунной системы и способствуют их полноценному функционированию.

Известно, что циклофосфан при введении в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) угнетает кроветворение и иммунную систему мышей. Одним из наиболее информативных критериев, позволяющих оценить степень повреждающего воздействия цитостатической химиотерапии на организм, является показатель общего количества лейкоцитов периферической крови. С использованием классической модели циклофосфановой иммунодепрессии выявлено, что изучаемые антиоксиданты показали не только умеренную защиту этого показателя в «острый» период депрессии, но и более раннее его восстановление до уровня нормы. Нарушение костномозгового кроветворения является критическим механизмом, ограничивающим использование цитостатических препаратов, с одной стороны, с другой стороны, костный мозг - это морфофункциональная основа иммунной системы, напрямую определяющая ее полноценность. Оба модифицированных витамина оказывали протекторное действие на костный мозг мышей, получавших токсичную дозу цитостатика.

В наших экспериментах на 4-е сутки после введения циклофосфана в указанной дозе отмечена выраженная иммунодепрессия: клеточность селезенки составила 36,4 % от уровня интактных животных, принятого за 100 %, тимуса - 12,5 %. Введение AAG и TMG не влияло на данные показатели. На 7-е сутки после введения циклофосфана наблюдалось частичное восстановление количества спленоцитов и клеток тимуса. Введение AAG сопровождалось повышением клеточности селезенки практически до 100 % и составила 98,9 %, а введение TMG оказывало менее выраженный эффект на данный показатель, клеточность селезенки составила 88 % от исходного уровня (принятого за 100 %). Введение AAG и TMG повышало клеточность тимуса до 54 и 52 % от исходного уровня, соответственно.

Таким образом, курсовое введение AAG и TMG после инъекции циклофосфана в дозе 250 мг/кг способствуют увеличению клеточности тимуса и селезенки, значительно сниженных при действии цитостатика, а также содержанию лейкоцитов в периферической крови и миелокариоцитов.

Ионизирующая радиация, используемая при лечении онкологических больных, оказывает повреждающее действие на нормальные ткани и вызывает комплексный ответ на клеточном и молекулярном уровнях. Одной из наиболее радиочувствительных является кроветворная система, поражение которой может оказаться критическим в плане невозможности продолжения лечения и, в случае фракционирования, для набора необходимой терапевтической суммарной дозы облучения.

Поэтому мы изучили влияние модифицированных антиоксидантов (AAG и TMG) на клетки крови при облучении мышей С57В1/6 рентгеновскими лучами. Для этого была использована общепринятая экспериментальная модель, в которой мышей подвергали общему однократному рентгеновскому облучению в сублетальной дозе 5,6 Гр. AAG вводили за 60 минут до облучения в дозе 100 мг/кг, TMG непосредственно сразу после облучения в дозе 600 мг/кг. В течение 24 дней после облучения наблюдали за изменением клеточного состава периферической крови и костного мозга.

Мы отметили, что в ранний период после воздействия степень лейкопении была менее выражена в группах облученных мышей, получавших AAG и TMG, чем в контрольной группе. Известно, что лимфоциты составляют наибольшую долю клеток крови у мышей и являются I менее устойчивыми к действию радиации по сравнению с другими клетками крови [27, 54]. Предварительное введение гликозида витамина Е приводило к значительной защите уровня лимфоцитов в периферической крови. Абсолютное и процентное содержание лимфоцитов у мышей с TMG на всем протяжении исследования было значимо выше, чем в группе облученных животных, получавших физиологический раствор, а, начиная, с 8-х суток не отличалось от показателей у необлученных животных. При введении AAG соблюдалась практически такая же закономерность.

В острый период опустошения костного мозга (первую неделю после I облучения) происходило существенное снижение клеточности костного мозга у животных всех исследуемых групп, но в группах животных, которым вводили AAG до облучения и TMG сразу после облучения, количество миелокариоцитовбыло умеренно выше, чем в контроле.

К 14-му дню после облучения наблюдалась регенерация костного мозга и увеличение числа миелокариоцитов. При этом следует отметить, что содержание лимфоидных элементов практически достигало уровня необлученных животных в группе с AAG и TMG значительно раньше, чем в группе только облученных животных. Уже 7-му дню- после облучения у I мышей, которым вводили AAG, началось восстановление клеточности костного мозга и наблюдалось статистически значимое увеличение числа миелокариоцитов по сравнению с группой животных, которые подвергались только облучению. Процесс регенерации был более выражен в группе с AAG, чем у получавших витамин С мышей, о чем судили и по общему содержанию миелокариоцитов костного мозга и по уровню лимфоидных элементов. Важным и показательным является тот факт, что к 20-м суткам, когда происходит физиологическое восстановление клеточности костного мозга у мышей, получавших облучение без дополнительных воздействий, в группах животных с введением AAG или TMG уровень изучаемых показателей существенно выше, что можно рассматривать как компенсаторное повышение. Наши данные, характеризующие динамику пострадиационных изменений количества миелокариоцитов в костном мозге и лейкоцитов в периферической крови у животных, которым до облучения вводили AAG или сразу после облучения TMG, свидетельствуют о том, что их радиозащитное действие реализуется в существенной мере через систему гемопоэза. По всей видимости, способность модифицированных витаминов уменьшать выраженность пострадиационной депрессии кроветворения, обусловлена их защитным действием на лимфоцитарный росток кроветворения, и стимулирующим - на процессы кроветворения в восстановительный период. На это указывают данные о более раннем и интенсивном увеличении, по сравнению с контролем, числа лейкоцитов и миелокариоцитов после облучения у животных, которым вводили AAG или TMG. I

Нейротоксичность является специфическим осложнением ряда противоопухолевых химиопрепаратов (цисплатин, оксалиплатин, таксан, метотрексат), снижающим качество жизни пациентов, и в ряде случаев ограничивающим эффективную дозу цитостатиков, что негативно сказывается на результатах лечения [38, 121, 205]. Широкое использование лучевой терапии для воздействия на опухолевый процесс привело к созданию подхода по увеличению ее эффективности на основе использования радиосенсибилизаторов, позволяющих расширить радиотерапевтический потенциал, т. е. селективно усилить повреждение опухоли и снизить радиопоражаемость нормальных тканей [46]. В их число входят электроноакцепторные соединения нитроимидазольного ряда -мисонидазол, метронидазол, обладающие высокой нейротоксичностью [235].

Головной мозг, в сравнении с другими органами, наиболее подвержен опасности воздействия свободных радикалов, и недостаточность антиоксидантной системы может быть причиной развития нейротоксичности [157, 241]. Синтезированный в 90-х годах саназол [123] выгодно отличался от мисонидазола низкой нейротоксичностью его терапевтических доз. Однако в последние годы в клинике были показаны положительные результаты по эрадикации солидных опухолей при интенсивном режиме введения высоких доз саназола, что нередко приводило к проявлению нейротоксичности [184]. Биологическая активация саназола путем восстановления электронно-акцепторной нитрогруппы до радикала нитроаниона с участием ферментов ксантиноксидазы и цитохрома Р-450-редуктазы [167] в нормооксических условиях завершается окислением с образованием 02-, который затем подвергается спонтанной или ферментативной дисмутации с продукцией активных форм кислорода, взаимодействующих с различными клеточными компонентами, вызывая тем самым повреждение клеток и тканей организма. Кроме того, нитрозопроизводные саназола могут быть источником оксида азота, цитотоксические и регуляторные свойства которого хорошо известны [36, 106, 225]. Поскольку в развитии нейротоксического эффекта принимают участие АФК [167], достаточно очевидным является предположение о потенциальной роли антиоксидантов в качестве церебропротективных агентов, поэтому мы изучили возможность использования модифицированных витаминов для снижения нейротоксического влияния саназола. Для этого в работе была создана модель саназол-индуцированной нейротоксичности, оценку наличия нейротоксического действия и степени его выраженности, проводили с использованием классического для такого рода исследований теста "открытое поле" [12]. Измерение двигательного паттерна и способности ориентации в пространстве являются чувствительными индикаторами для мониторинга изменений в поведении, которые обусловлены нейротоксичностью, в различных экспериментальных моделях [111].

Через 2 часа после введения саназола в дозе 2,1 г/кг наблюдалось снижение параметров поведения у всех исследуемых групп животных в "открытом поле" в сравнении с контрольной группой, которой вводили только физиологический раствор. Однако введение гликозидов витамина С и витамина Е в концентрации 50 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно, за 30 минут до введения саназола, оказывало достоверную защиту эмоциональной и двигательной активности.

На 2-й день происходило дальнейшее снижение эмоциональной, горизонтальной и общей двигательной активности у мышей, которым вводили только саназол. Введение AAG или TMG, напротив, способствовало восстановлению этих показателей. Введение аскорбиновой кислоты не оказывало влияния на данные показатели, а на 2-е сутки эксперимента даже привело к гибели животных, что может быть связано с ее прооксидантным действием. Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение модифицированных антиоксидантов, во-первых, снижает проявление нейротоксического эффекта в острый период, а во-вторых, ускоряет восстановление поведенческих реакций. Поскольку механизм нейротоксического действия большинства цитостатиков связан с образованием высокореактивных свободных радикалов, то можно полагать, что введение гликозидов аскорбиновой кислоты и витамина Е, являющихся водорастворимыми антиоксидантами, должно способствовать инактивации свободных радикалов и, таким образом, оказывать протекторное влияние при использовании химиопрепаратов, вызывающих побочные нейротоксические эффекты [120, 207].

Таким образом, в первой части работы представлены результаты, характеризующие эффекты новых модифицированных витаминов гликозидов витамина С и витамина Е, которые ранее не изучались. Мы показали, что изучаемые модифицированные витамины способны усиливать терапевтическое действие малой дозы цитостатика в отношении метастазов до эффекта максимальной терапевтической дозы. Для AAG также была показана способность проявлять собственное антиметастатическое действие на модели перевиваемой карциномы легких Льюис без введения цитостатика. Введение AAG или TMG на фоне иммунодепрессии, вызванной введением высокой дозы циклофосфана, способствует нормализации состояния тимуса и селезенки, ускоренно восстанавливает количество ядросодержащих клеток костного мозга, лейкоцитов в периферической крови. Введение гликозидов витамина С и витамина Е за 30 минут до введения высокой дозы гипоксического радиосенсибилизатора саназола снижает проявление -нейротоксического эффекта. Также впервые получены данные о способности модифицированных витаминов уменьшать выраженность пострадиационной депрессии кроветворения, что обусловлено их защитным действием на лимфоидный росток кроветворения, и стимулирующим — на процессы кроветворения в восстановительный период.

Мы исследовали биологическую активность AAG в сравнении с его природным прототипом витамином С и показали более выраженный защитный эффект AAG на таких экспериментальных моделях как гамма-облучение мышей в сублетальной дозе, циклофосфан-индуцированная иммунодепрессия, саназол-индуцированная нейротоксичность. Возможные причины таких различий будут освещены ниже. Что касается сравнительного изучения действия TMG и природного витамина Е, здесь возникли определенные трудности. Витамин Е является жирорастворимым и активен только в липидной фазе. В этой связи технически было невозможно сопоставить его эффективность с TMG в условиях in vivo. TMG растворим в водной фазе. Показано, что оптимальными условиями для проявления его максимальной антиоксидантной активности является рН в пределах от 6 до 9 [248], что объясняет показанную нами его неэффективность при пероральном пути введения (по сути, внутрижелудочном, поскольку в эксперименте применяется специальный внутрижелудочный зонд), связанную, по-видимому, с окислением и ослаблением антиоксидантных свойств в кислой среде желудка. При интраперитонеальном пути введения TMG проявляет антиокислительные свойства лишь при достаточно высоких концентрациях (начиная от 100 мг/кг).

Принимая во внимание тот факт, что гликозид аскорбиновой кислоты не уступает по эффективности TMG, проявляет действие при пероральном введении в невысоких дозах, а также является более доступным и его применение экономически обосновано по сравнению с TMG, мы сочли целесообразным провести изучение механизма радиопротекторного и антитоксического действия гликозида аскорбиновой кислоты.

В свете прояснения причин различий модулирующей и антитоксической эффективности AAG и витамина С мы, прежде всего, оценили динамику уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови у здоровых животных после введения гликозида витамина С в сравнении с введением экзогенной аскорбиновой кислоты. Было показано (рисунок 14), что при введении AAG в дозе 50 мг/кг, per os наблюдается более быстрое увеличение уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови, чем при введении просто аскорбиновой кислоты в той же дозе. Известно, что пероральное введение аскорбиновой кислоты не позволяет создать высокие концентрации витамина в плазме крови, максимальная концентрация ее при этом отмечается через 4 часа [265]. Уровень аскорбиновой кислоты в плазме крови через 4 часа после введения AAG был практически в 2 раза выше, чем после введения просто аскорбиновой кислоты (р<0,05). Это указывает на то, что AAG может более длительное время поддерживать высокие концентрации аскорбиновой кислоты в крови и тем самым оказывать более выраженное антиоксидантное действие в организме. Этот механизм может быть, ответственен за эффекты AAG, полученные в условиях воздействий, нарушающих баланс между окислительным процессом и антиоксидантной системой. Поэтому на следующем этапе была проведена оценка влияния гликозида аскорбиновой кислоты на уровень аскорбиновой кислоты в плазме крови у мышей' на фоне нейротоксичности, вызванной введением высокой дозы саназола. Введение саназола приводило к существенному снижению уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови по сравнению с группой интактных животных, что рассматривается, как показатель окислительного стресса [189]. Предварительное введение гликозида аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг/кг, но не витамина С, предотвращало снижение уровня аскорбиновой кислоты в плазме крови. Полученные различия, по-видимому, обусловлены большей стабильностью и лучшей биоусвояемостью гликозида аскорбиновой кислоты [154].

Поскольку способность клеток к пролиферации является основным условием восстановления организма через систему гемопоэза, нами было изучено влияние AAG и аскорбиновой кислоты на пролиферативную активность спленоцитов после облучения мышей в сублетальной дозе. Максимальное снижение пролиферативной активности клеток наблюдалось на 3-й сутки и было ассоциировано с минимальным уровнем ядросодержащих клеток в селезенке. Введение животным за один час до облучения аскорбиновой кислоты или ее гликозида препятствовало снижению пролиферативной активности клеток на протяжении всего эксперимента, при этом эффект гликозида был более значительным. Полученные результаты свидетельствуют о том, что радиозащитный эффект AAG на костный мозг и органы иммунной системы обусловлен его влиянием на их пролиферативную активность. Это влияние может носить как опосредованный характер, через воздействие на цитокиновую регуляцию пролиферации, так и непосредственный, путем снижения уровня токсических интермедиатов кислорода и предотвращения их повреждающего действия на клетки. Действительно, мы показали, что введение AAG за 1 час до тотального облучения мышей приводило к более существенному по сравнению с аскорбиновой кислотой, снижению уровня первичных продуктов ПОЛ - гидроперекисей липидов в лимфоцитах через 12 и 24 часа после воздействия. По-видимому, AAG вызывает пролонгированное увеличение концентрации аскорбиновой кислоты в организме, которая инактивирует свободные радикалы, образующиеся под действием гаммаизлучения, и таким образом препятствует накоплению гидроперекисей липидов, оказывая тем самым защитный эффект на ранних стадиях после облучения. Наряду с этим AAG в отличие от аскорбиновой кислоты является скавэнджером гидроксильного ОН. радикала [227], генерируемого в процессе радиолиза воды и являющегося основным инициатором свободнорадикального окисления липидов. Это также может обуславливать более выраженный защитный эффект гликозида аскорбиновой кислоты при действии радиации.

Мы подтвердили эти результаты и на модели изолированных спленоцитов in vitro, при индукции окислительного стресса гидроперекисью водорода. Гидроперекись водорода в концентрациях 500 мкМ, 1 мМ, 5 мМ достоверно ингибировала спонтанную пролиферацию спленоцитов. AAG в концентрации 5 мМ полностью препятствовал ингибирующему действию Н202 на пролиферативные процессы в спленоцитах, в то время как аскорбиновая кислота в такой концентрации не обладала выраженным эффектом на пролиферацию в условиях окислительного стресса. Более того, оказалось, что в нормальных условиях (без индукции окислительного стресса) аскорбиновая кислота в высоких концентрациях (500 мкМ, 1 мМ и 5 мМ) приводила к значительному ингибированию спонтанной пролиферации спленоцитов, что связано с ее прооксидантными свойствами, тогда как AAG не проявлял такого эффекта. Известно, что гликозид, в отличие от аскорбиновой кислоты не участвует в 2-х электронном переносе из-за наличия во втором положении у атома углерода глюкозы вместо гидроксильной группы [144] и поэтому обладает менее выраженным прооксидантным эффектом.

Основным механизмом повреждающего действия при химиотерапии и лучевом воздействии является избыточное накопление активных форм кислорода и радикалов в результате активации микросомального окисления и радиолиза воды [57]. Ключевая роль в защите клеток от окислительного стресса отводится системе глутатиона [41, 47]. Поэтому целесообразно было изучить влияние AAG на систему глутатиона в условиях окислительного стресса, индуцированного различными воздействиями, в частности, радиосенсибилизатором саназолом, при его использовании в нейротоксической дозе, и гамма-излучением в сублетальной дозе.

Введение саназола приводило к существенному снижению уровня восстановленного глутатиона в головном мозге экспериментальных животных. Содержание окисленного глутатиона при этом существенно повышалось и отношение GSH/GSSG снижалось со 163 до 89. Данное отношение является маркером окислительного стресса и полученные результаты свидетельствуют об активации окислительного стресса в ткани мозга при введении саназола [256, 269]. Предварительное введение животным AAG вызывало повышение уровня GSH и увеличение отношения до 148. Предварительное введение аскорбиновой кислоты не вызывало существенного повышения уровня GSH и не оказывало, как нами было показано ранее, выраженного нейропротекторного действия.

Аналогичный эффект AAG на уровень глутатиона мы получили и на модели облучения животных в сублетальной дозе. Было показано, что предварительное введение гликозида витамина С способствовало сохранению более высокого уровня общего глутатиона в спленоцитах мышей в ранние сроки после облучения и более быстрому восстановлению его уровня до контрольных значений в отдаленные сроки. AAG более эффективно предотвращал повышения окисленной формы глутатиона и способствовал сохранению уровня его восстановленной формы и отношения GSH/GSSG в условиях окислительного стресса, индуцированного облучением.

Это объясняется тем, что в условиях in vivo, благодаря стабильности AAG, более длительное время создается высокая концентрация аскорбиновой кислоты в плазме крови. Однако аскорбат сам не может восстанавливать глутатион из его окисленной формы. Под действием активных форм кислорода, образующихся в процессе радиолиза воды при действии радиации, происходит окисление аскорбиновой кислоты. Окисленная форма витамина -дегидроаскорбиновая кислота с помощью транспортеров глюкозы ГЛУТ-1 транспортируется в клетки и индуцирует активацию пентозофосфатного цикла [246]. Окисленный глутатион, образующийся в реакциях нейтрализации активных радикалов, генерируемых ионизирующим излучением, восстанавливается в глутатинредуктазной реакции за счет NADPH, который синтезируется в активированном пентозофосфатном цикле. Это позволяет клеткам поддерживать более высокий редокс-потенциал системы глутатиона и защищает их от радикалов, образующихся при действии ионизирующей радиации.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показан целый ряд модулирующих эффектов новых соединений — гликозида витамина С (AAG) и гликозида витамина Е (TMG), полученных в результате структурной модификации молекул природных витаминов С и Е путем присоединения глюкозы. Выявлена способность AAG и TMG повышать антиметастатическую эффективность циклофосфана путем снижения его токсического действия на показатели системы иммунитета и стимуляции функциональной активности лимфоцитов, при этом показано преимущество модифицированных витаминов по сравнению с природными. Показан широкий спектр антитоксической активности модифицированных витаминов на моделях циклофосфан-индуцированной гемо- и иммунотоксичности, нейротоксичности, рентгеновского облучения в сублетальной дозе, окислительного стресса in vitro. Получены результаты, свидетельствующие, что одним из важных механизмов протекторного действия изучаемых агентов в условиях индукции окислительного стресса является их способность проявлять умеренное защитное действие на клетки костного мозга и иммунной системы в ранний период после повреждающего действия и существенно стимулировать процессы восстановления кроветворения и функциональной (пролиферативной) активности лимфоцитов. В экспериментах in vivo и in vitro показано, что гликозид аскорбиновой кислоты проявляет более выраженное, чем аскорбиновая кислота, прямое антиокислительное действие и способность сохранять высокий редокс-потенциал системы глутатиона. Полученные данные являются патогенетическим обоснованием для использования гликозида витамина С в комплексном лечении онкологических больных с целью снижения миело-, иммуно- и нейротоксических проявлений, индуцируемых химио- и лучевой терапией. I