Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Особенности апоптоза и его регуляция в эндометрии женщин с трубно-перитонеальным бесплодием при различных исходах экстракорпорального оплодотворения

На правах рукописи

БОЙЦОВА АЛИСА ВИТАЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В ЭНДОМЕТРИИ ЖЕНЩИН С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ БЕСПЛОДИЕМ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ИСХОДАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1« ..'П ¿013

Иваново-2013

005052359

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Богатова Ирина Константиновна доктор биологических наук Анциферова Юлия Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»

Минздрава России) Гречканев Геннадий Олегович

доктор медицинских наук

(ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. ак. В.И. Кулакова»

Минздрава России) Смольникова Вероника Юрьевна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии».

Защита состоится "¿^"»¿¿т^^^— 2013г. в/^^^асов на заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова" Минздрава России. Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

Панова И. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В последние годы при лечении различных видов бесплодия широкое распространение получили вспомогательные репродуктивные технологии, в том числе метод экстракорпорального оплодотворения [Кулаков В.И., и соавт., 2005; Кэй Э., 2008]. Одной из наиболее частых причин обращения супружеских пар к этому методу является трубно-перитонеальный фактор бесплодия, поскольку при данной патологии проведение ЭКО является единственным эффективным способом лечения [Sweet R.L., 2012; Кулаков В.И. и соавт., 2009; Кузьмичев JI.H., 2009]. Однако результативность ЭКО составляет в среднем 35% [Корсак B.C., 2010; Отчет ESHRE, 2009]. Повышение эффективности лечения бесплодия невозможно без изучения механизмов регуляции имплантации - одного из наиболее сложных этапов развития взаимоотношений между эмбрионом и материнским организмом [Смольникова В.Ю., 2012].

Известно, что структурная и функциональная перестройки эндометрия в течение менструального цикла являются необходимым условием для успешной имплантации и прогрессирования беременности [Смольникова В.Ю., 2011; Szmidt M., et al., 2010]. В подготовке эндометрия к имплантации выявлена важная роль цитокинов, факторов роста и др. [Яворовская К.А., 2010; Harada Т., 2007; van Loendersloot L.L., et al., 2010]. Показано, что в основе структурной перестройки эндометрия лежат изменения апоптоза эндометриальных клеток. В пролиферативную фазу цикла в эндометрии отмечаются лишь единичные апоптотические клетки, тогда как в секреторную фазу апоптоз усиливается [Яманова М.В., 2009; Szmidt M., et al., 2010]. При этом важную роль в регуляции апоптоза в эндометрии имеет соотношение синтезируемых в ткани про- и антиапоптотических факторов [Harada Т., 2007]. Однако данные о взаимосвязи между синтезом в ткани эндометрия факторов, регулирующих апоптоз, и готовностью эндометрия к имплантации практически отсутствуют. Выявлено нарушение регуляции апоптоза в эндометрии пациенток при бесплодии неясного генеза и синдроме поликистозных яичников [Gonzalez D.,

et al., 2012; Vatansever H.S., 2005]. Однако у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием характер апоптоза и его регуляции в эндометрии остается неизученным. Отсутствуют работы, посвященные определению особенностей регуляции апоптоза в эндометрии этих пациенток при различных исходах ЭКО.

Заслуживает внимания вопрос о факторах, контролирующих апоптоз в эндометрии. Изучено влияние на этот процесс цитокинов [Барышников А.Ю., 2002; Thorburn А., 2007]. Есть данные, что интерферон у обладает непосредственным апоптоз-индуцирующим действием [Bazer F.W., et al., 2009]. Он продуцируется в эндометрии и участвует в пролиферации, ангиогенезе и регуляции инвазии клеток трофобласта на ранних сроках гестации [Smith J.A., et al., 2009]. Однако до сих пор не установлена роль IFNy в регуляции апоптоза и в обеспечении имплантационного потенциала эндометрия.

Цель исследования: у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием установить взаимосвязь между особенностями регуляции апоптоза в ткани эндометрия и успехом имплантации эмбриона на основан™ чего разработать новые прогностические критерии наступления беременности при проведении ЭКО.

Задачи исследования:

1. Выявить клинико-анамнестические факторы, оказывающие негативное влияние на наступление беременности после проведения ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

2. Оценить особенности экспрессии CD95 и CD95L молекул на поверхности эндометриапьных лимфоцитов и макрофагов и установить характер экспрессии мРНК факторов, регулирующих апоптоз (HSP27, XIAP, каспаза-3, PTEN) в ткани эндометрия женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

3. Выявить взаимосвязь между характером регуляции апоптоза в ткани эндометрия и наступлением беременности после проведения ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

4. В эксперименте in vitro оценить влияние IFNy на уровень экспрессии в эндометрии факторов, регулирующих апоптоз.

5. Разработать новые прогностические критерии наступления беременности при проведении ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным трубным фактором.

Научная новизна исследования:

Получены новые теоретические данные о ранжировании клинических факторов риска, определяющих исход ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

Впервые установлено, что развитие бесплодия у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия связано с угнетением Fas-зависимого пути индукции апоптоза в эндометрии за счет сниженной апоптоз-индуцирующей активности эндометриальных макрофагов.

Впервые показано нарушение генной регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, которое проявляется в одновременном усилении экспрессии мРНК антиапоптотических (XIAP, HSP27) и проапоптотических (PTEN) факторов.

Выявлена взаимосвязь между возрастом, длительностью инфертильности и особенностями регуляции апоптоза в эндометрии у женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.

Установлено, что при воздействии in vitro IFNy дозозависимо стимулирует апоптоз эндометриальных стромальных клеток у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием.

Впервые показано, что наступление беременности у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием после проведения ЭКО ассоциировано с высоким содержанием в ткани эндометрия CD95+ макрофагов и усиленной экспрессией мРНК PTEN и IFNy.

Практическая значимость исследования: в клиническую практику предложен способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе ЭКО на основании

определения в ткани эндометрия относительного содержания СБ95+ макрофагов.

Методология и методы исследования: для достижения поставленной цели в работе было проведено обследование когортным методом пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, обратившихся в центр планирования семьи и репродукции для проведения ЭКО. При обследовании женщин использовался комплекс современных клинических, иммунологических и гистологических методов исследования. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета современных компьютерных программ прикладного статистического анализа. Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушение фертильности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием связано с угнетением индукции Раз-зависимого апоптоза и нарушением генной регуляции апоптоза в ткани эндометрия, при этом максимальное угнетение апоптоза, обусловленное доминированием продукции анти-апототических факторов Х1АР и ШР27 над тканевым синтезом Р ГЕИ приводит к неуспеху ЭКО у этих пациенток.

2. стимулирует апоптоз эндометриальных клеток у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием за счет индукции экспрессии в ткани эндометрия гена РТЕ1Ч.

3. Прогностическим критерием наступления беременности после ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием является высокое содержание в ткани эндометрия СБ95+ макрофагов.

Внедрение результатов работы в практику: разработанный «Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе ЭКО» прошел предрегистрационное испытание в Центре планирования семьи и репродукции ФГБУ «Ивановский НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России (приоритетная справка № 2013107141 от 20.02.2013г).

Апробация работы: основные результаты исследований докладывались и обсуждались на: VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), XXIV Международном конгрессе «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических больных» (Москва, 2011), XIV Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 30-летию со дня основания института (Иваново, 2011), научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Неделя науки -2011» (Иваново, 2011), XIII International Symposium for Immunology of Reproduction (Varna, Bulgaria, 2012), VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012), V Российской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты» (Иваново, 2012).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 5 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора: автором самостоятельно проводились отбор пациенток в группы согласно критериям включения и исключения, клиническое обследование пациенток, ведение амбулаторных карт, анализ результатов клинико-лабораторных и функциональных исследований, статистический анализ полученных результатов, подготовка иллюстративного материала. Принимала участие в проведении иммунологических исследований.

Объём и структура диссертации: диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 245 источников, в том числе 76 отечественных и 169 иностранных. Работа иллюстрирована 51 таблицей и 5 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования:

Работа выполнена в ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава РФ (директор - д.м.н. А.И. Малышкина). Исследования проводились в центре планирования семьи и репродукции (зав. -д.м.н., профессор И.К. Богатова), в лабораториях клинической иммунологии (зав.

- д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова), патоморфологии и электронной микроскопии (зав. - д.м.н., профессор Л.П. Перетятко).

В исследование включены 137 женщин репродуктивного возраста, которые составили следующие группы:

- основную — 115 женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, планирующих проведение программы ЭКО;

- контрольную - 22 женщины фертильного возраста с реализованной репродуктивной функцией.

Пациентки основной группы после проведения программы ЭКО были разделены на две подгруппы:

- 1-ая — 46 женщин, у которых наступила беременность;

- 2-ая - 56 женщин, у которых беременность не наступила. Материалом для исследования служили биоптаты эндометрия,

полученные в период «окна имплантации» менструального цикла, предшествующего овариальной стимуляции, и периферическая венозная кровь.

В схему обследования входили клинические методы исследования (сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр, стандартные лабораторные обследования, необходимые для женщин, планирующих проведение ЭКО), морфологические и иммунологические исследования. Иммунологические методы исследования:

- выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток (МНК) из ткани эндометрия стандартным безферментативным методом с помощью скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (d=l,06 и d= 1,078 [Boyum А., 1968];

- выделение обогащенной популяции стромальных клеток из ткани эутопического и эктопического эндометрия женщин стандартным ферментативным методом [Clover L.M., et. al., 2000];

- определение экспрессии на поверхности эндометриальных лимфоцитов и макрофагов CD95 и CD95L молекул с помощью моноклональных антител (Coulter, USA) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA);

- определение количества клеток, вступивших в апоптоз, с использованием коммерческого набора с Annexin V и пропидиумом иодидом (Pi) (Invitrogen™, USA) методом проточной цитофлюориметрии;

- определение концентрации гликоделина в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland) с помощью коммерческого набора Bioserv Diagnostics (Germany);

- количественное определение экспрессии мРНК факторов, регулирующих апоптоз, в ткани эндометрия методом полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в реальном времени (RT-PCR) на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (ВЮ-RAD, USA). В работе использовались праймеры и зонды для ß2-микроглобулина, XIAP (Х-связанного ингибитора апоптоза), HSP27 (белка теплового шока 27), PTEN (фосфатазы и тензин гомолога, делегированного на хромосоме 10) производства ЗАО "Синтол» (Москва, Россия) и каспазы-3 производства ООО «Фрактал Био», (Санкт-Петербург, Россия);

- определение влияния чистого препарата IFNy на апоптоз ткани эндометрия. Проводили культивирование эндометриальных эксплантов в среде RPMI 1640, содержащей IFNy в концентрациях 10 и 50 пг/мл, в течение 24 часов при 37°С и 5% С02 с последующей оценкой экспрессии в ткани эндометрия генов, регулирующих апоптоз методом RT-PCR. Показатели эндометриальных эксплантов, инкубировавшихся в тех же условиях только в среде RPMI 1640, использовали в качестве контроля.

Морфологические методы исследования: производилось обзорное гистологическое исследование эндометрия. Биоптаты эндометрия фиксировались в 10%-ном нейтральном формалине в течение 72 часов. После стандартной парафиновой проводки готовились срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивались гематоксилином Эрлиха с докраской эозином и заключались в бальзам. В работе использовался микроскоп «Биолам» с бинокулярной насадкой АУ -12 (ЛОМО).

Статистические методы исследования: обработка полученных результатов проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. В зависимости от типа распределения достоверность различий между показателями независимых выборок оценивалась по непараметрическому критерию U Манна-Уитни или по t-критерию Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения (М±ш). Для оценки относительного риска неудачи программы ЭКО рассчитывали отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ - 95%). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных лицензионных программ "Statistica 6.О.", "Microsoft Office 2007", "GenStat", "MedCalk" и "Open Epi".

Результаты исследования и их обсуждение

Возраст обследованных женщин находился в интервале от 23 до 42 лет. Группы практически не отличались по среднему возрасту, который составил -32,9±0,3 года у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием и 32,5±1,1 года у фертильных женщин (р>0,05).

Становление и характер менструальной функции в группах особенностей не имели. В структуре акушерско-гинекологического анамнеза выявлено, что у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в отличие от фертильных пациенток наблюдалась более высокая частота эктопии шейки матки (45,2% против 22,7%, р<0,05), воспалительных заболеваний органов малого таза (100% против 45,5%, р<0,001), спаечного процесса органов малого таза (98,3% против 18,2%, р<0,001), инфекций, передаваемых половым путем (74,8% против 36,4%, р<0,01).

Полученные результаты согласуются с мнением большинства исследователей о том, что причиной окклюзии маточных труб являются перенесенные воспалительные процессы, чаще всего инициируемые генитальными инфекциями [Краснопольская К.В., 2003; Ре11ай Б., й а1., 2008]. Среднее число беременностей и своевременных родов у женщин основной группы было меньше (р<0,05 и р<0,001 соответственно), а частота внематочной беременности больше по сравнению с фертильными пациентками (52,2% против 4,6%, р<0,001).

Доля оперативных вмешательств была значительно выше в группе пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Среди них - реконструктивно-пластические операции на маточных трубах - 74,8%, операции на яичниках - 38,3% и 62,6% тубэктомий (р<0,001 во всех случаях).

У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием в отличие от фертильных женщин чаще выявлялась секреторная недостаточность эндометрия (71,6% против 9,1%, р<0,001) и хронический эндометрит (72,8% против 13,6%, р<0,001). Согласно данным литературы, хронический эндометрит среди пациенток с трубно-перитонеалъной формой бесплодия диагностируется с частотой от 15% до 76% [Гречканев Г.О., 2011, Феоктистов А.А, 2009; Шишканова, О.Л., 2008].

Эффективность программы ЭКО в нашем исследовании составила 45,1%.

В нашем исследовании наступление беременности после ЭКО чаще отмечено в возрасте до 34 лет и значительно реже у женщин в возрасте 35 лет и старше (78,3% против 53,6%; скорректированное ОШ 3,1; 95% ДИ 1,3-7,48, р<0,01).

Скудный характер менструальных выделений чаще отмечен у женщин с неудачным исходом ЭКО по сравнению с женщинами с реализованной программой (19,6% против 4,4% соответственно; скорректированное ОШ 5,4; 95% ДИ 1,1325,66; р<0,01). По-видимому, гипоменорея может быть связана с нарушениями функции гипофиза, яичников и неполноценностью эндометрия вследствие внутриматочных манипуляций или воспалительных заболеваний [Подзолкова Н.М. и соавт., 2004].

Первичное бесплодие чаще диагностировано у пациенток с неудачным исходом ЭКО (37,5% против 15,2%; скорректированное ОШ 3,3; 95% ДИ 1,26-8,81; р«0,01).

Продолжительность бесплодия более 10 лег чаще отмечалась среди женщин с неудачным исходом ЭКО (30,4% против 10,9%; скорректированное ОШ 4,9; 95% ДИ 1,33-18,2; р<0,05). По данным ряда авторов, беременность у женщин с трубно-перигонеальным бесплодием после ЭКО отмечена чаще при продолжительности бесплодия менее 5 лет [van Loendersloot L.L., et al., 2010; Краснопольская K.B., 2003].

Спаечный процесс органов малого таза Ш-IV степени чаще выявлен у женщин с неудачным ЭКО по сравнению с пациентками с успешным исходом программы (48,2% против 23,9%; скорректированное ОШ 2,9; 95% ДИ 1,26-6,98; р<Щ)1).

Среднее количество перенесенных операций на органах малого таза было больше у женщин с неудачным ЭКО (2,5±0,1) по сравнению с пациентками с наступившей беременностью (2,1±0,1; р<0,05). В группе пациенток с неудачным исходом ЭКО чаще выполнялись оперативные вмешательства на яичниках (46,4% против 26,1%; скорректированное ОШ 2,5; 95% ДИ 1,06-5,69; р<0,05). Наши данные подтверждают точку зрения, согласно которой неоднократные операции на придатках матки приводят к безвозвратной потере овариального запаса яичников, ухудшению их кровоснабжения [Кулаков В.И. и соавт., 2005; Краснопольская К.В., 2003].

К значимым факторам, прогнозирующим отрицательный результат ЭКО, относились наличие в анамнезе 3-х и более неудачных попыток (12,5% против 2,2%; р<0,01), более низкие показатели средней толщины эндометрия перед проведением трансвагинальной пункции фолликулов (9,9±0,2 мм против 10,6±0,2 мм; р<0,05).

У пациенток с удачным исходом ЭКО средний базальный уровень Е2 составил 133,5±11,7 пмоль/л в плазме крови, а концентрация AMT - 2,8±0,4 нг/мл, что больше, чем у женщин с нереализованной программой (98,3±10,5пмоль/л и

1,9±0,3нг/мл соответственно; р<0,05). Достоверных различий по средним значениям других гормонов периферической крови нами не получено.

Важную роль в обеспечении наступления беременности отводят иммунологическим параметрам, определяющим рецептивность эндометрия.

По нашим данным, в эндометрии женщин с трубно-перитонеальным бесплодием снижено по сравнению с показателями фертильных женщин общее количество стромальных клеток, вступивших в апоптоз (AnnexinV+ клетки) (16,68±0,90 против 29,04±2,71; р<0,01) и клеток, находящихся на необратимой стадии апоптоза (Annexinv+Pi+ клетки) (6,54±1,20 против 15,79±2,91; р<0,05). Известно, что интенсивность процессов апоптоза усиливается во время секреторной фазы цикла, в период «окна имплантации» [Harada Т., 2007], поэтому низкий уровень апоптоза стромальных клеток эндометрия у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием может негативно влиять на имплантационный потенциал эндометрия этих пациенток.

В эндометрии женщин с трубно-перитонеальным бесплодием снижено содержание CD95+ лимфоцитов и CD95L+ макрофагов по сравнению с аналогичными показателями фертильных женщин (р<0,001 и р<0,05; таблица 1). Выявленное нами угнетение готовности эндометриальных лимфоцитов к апоптозу и апоптоз-индуцирующей функции макрофагов может быть одной из причин снижения апоптоза клеток эндометрия у этих пациенток.

При изучении генной регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубным фактором бесплодия установлено, что уровень экспрессии мРНК антиапоптотических факторов XIAP и HSP27 у этих женщин повышен по сравнению с показателями фертильных пациенток (р<0,05 и р<0,001; таблица 1). Как известно, XIAP является одним из основных ингибиторов апоптоза, который связывается с каспазами -9, -3, -7 и инактивирует их активность [Schimmer A.D., 2006]. Усиленная продукция HSP27 также ингибирует апоптоз, предотвращая активацию каспаз [Schmitt Е., et al., 2007]. Высокая экспрессия этих факторов может оказывать негативное влияние на рецептивность эндометрия, т.к. в период «окна имплантации» в эндометрии должны

преобладать проапоптотические процессы [Akcali К.С., 2003; Hendriks D.J., 2005; Vatansever H.S., 2005].

В то же время, уровень экспрессии проапоптотического фактора PTEN у пациенток с трубным фактором бесплодия выше аналогичного показателя женщин контрольной группы (р<0,001; таблица 1). Установлено, что PTEN ингибирует киназный сигнальный каскад по PI3K/Akt пути, подавляя активность клеточной пролиферации и индуцируя апоптоз [Keniiy м., 2008]. Вероятно, выявленный нами высокий уровень синтеза PTEN у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием может отчасти компенсировать чрезмерно высокий уровень синтеза антиапоптотических факторов и играть положительную роль в подготовке эндометрия к имплантации.

Уровень экспрессии мРНК каспазы-3 в эндометрии женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в значительной степени зависел от возраста пациенток и от длительности бесплодия. Мы выявили резкое снижение уровня экспрессии мРНК каспазы-3 в эндометрии пациенток в возрасте 35 лет и старше (до 35 лет - 2,73±0,63 копий пар х102, и > 35 лет - 0,40±0,1663 копий пар хЮ2, р<0,01), а также при продолжительности инфертильности более 10 лет (4 года и более - 2,53±0,6263 копий пар хЮ2, 10 лет и более - 0,32±0,1263 копий пар х 102, р<0,05). Каспаза 3 - ключевой эффекторный белок в каскаде апоптоза. Ее активация приводит к расщеплению ядерных субстратов клетки и фрагментации ДНК, запуская необратимый процесс клеточной гибели [Joswig A. et al., 2003]. Низкий уровень синтеза каспазы-3 предполагает несбалансированное преобладание антиапоптотических процессов у данной категории пациенток, которые имели более низкую частоту наступления беременности.

Мы оценили возможность использования параметров апоптоза для прогнозирования исхода ЭКО. Выявлено, что для женщин с успешным ЭКО характерно более высокое содержание в эндометрии макрофагов, экспрессирующих CD95 молекулы, по сравнению с этим показателем у женщин с неудачным ЭКО (р<0,05; таблица 1). На основании полученных данных

разработан способ прогнозирования исхода программы ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием по относительному содержанию CD95+ макрофагов. При его значении равном 48,8% или более прогнозируют наступление беременности в результате проведения ЭКО (приоритетная справка №2013107141 от 20.02.2013г).

Наступление беременности у женщин с трубным фактором бесплодия ассоциировалось с максимально высокими значениями экспрессии в ткани эндометрия мРНК PTEN и IFNy (р<0,05 в обоих случаях; таблица 1). По данным литературы, PTEN непосредственно участвует в эмбриональном развитии. Этот фактор необходим для обеспечения процессов инвазии трофобласта в материнскую часть плаценты на ранних этапах имплантации [Lague M.N., et al., 2010; Keniry M., 2008]. Показано, что IFNy участвует в регуляции ангиогенеза в тканях ранней плаценты. Эндометриальные эпителиальные клетки в период «окна имплантации» экспрессируют рецепторы IFNy, а клетки трофобласта, инвазирующего децидуальную оболочку плаценты, продуцируют различные типы интерферонов, в том числе и IFNy [Murphy S. P., et al., 2009]. Учитывая это можно сделать вывод о том, что характер синтеза в эндометрии PTEN и IFNy непосредственно связан с успехом имплантации у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

Для определения иммунных механизмов, влияющих на апоптоз в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, мы оценили in vitro влияние IFNy на количество AnnexinV+ эндометриальных стромальных клеток и экспрессию мРНК факторов с про- и антиапоптотическим действием. Инкубация эксплантов эндометрия с высокими дозами IFNy (50 пг/мл) усиливала апоптоз эндометриальных стромальных клеток, о чем свидетельствовало увеличение уровня AnnexinV+ эндометриальных клеток (34,04±4,93% - контроль, 53,06*2,09% - IFNy в концентрации 50пг/мл; р<0,05). Кроме того, IFNy в концентрации 50пг/мл повышал уровень экспрессии в ткани эндометрия пациенток основной группы мРНК PTEN (0,48±0,09 копий пар х

Ю1 /мкл - контроль, 2,01±0,53 копий пар х Ю1 /мкл - IFNy в концентрации 50пг/мл, р<0,05).

Для уточнения роли IFNy в регуляции апоптоза клеток эндометрия группа женщин с трубно-перитонеальным бесплодием разделена на две подгруппы: с высокими (более 50 копий пар х 106/мкл) и низкими (менее 50 копий пар х 106/мкл) показателями экспрессии мРНК IFNy. При высоких значениях синтеза IFNy в эндометрии у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием отмечались достоверно более высокие значения экспрессии мРНК PTEN (5,20±1,58 копий пар х 10' /мкл), чем у женщин с низкими показателями уровня синтеза IFNy (0,94±0,32 копий пар х 101 /мкл) (р<0,05). Взаимосвязи между уровнем синтеза IFNy и экспрессией мРНК других факторов, регулирующих апоптоз, нами выявлено не было (р>0,05 во всех случаях).

Таким образом, исследования как in vitro, так и in vivo свидетельствуют о том, что IFNy является индуктором синтеза PTEN в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Учитывая важную роль PTEN в обеспечении успеха имплантации при проведении ЭКО, можно предположить, что коррекция локального уровня IFNy в эндометрии может оказать положительное влияние на эффективность программы ЭКО.

Таблица 1

Характеристика параметров апоптоза в ткани эндометрия фертильных женщин и пациенток с трубно-перитонеапьным бесплодием, участвующих в программе

ЭКО

Параметр Контрольная группа (п= 22) Основная группа (п=115) Наступление беременности после ЭКО (п=46) Отсутствие беременности после ЭКО (п=56)

СБ95+ лф*, % 12,35±0,58 21,34±1,20 р1<0,001 13,66±1,13 11,33±0,71 р2>0,05

СБ95+ мф*,% 45,11 ±2,26 47,01±1,53 р1>0,05 52,06±3,02 44,24±1,71 р2>0,05

С095Ь+лф,% 11,99±1,54 11,49±0,61 р1>0,05 11,30±1,15 11,55±0,74 р2>0,05

С095Ь+мф, % 34,06±1,27 41,43±6,97 р1<0,05 33,45±1,78 34,55±1,99 р2>0,05

мРНК Х1АР, кп х 104 /мкл 4,71±0,82 2,29±0,49 р1<0,05 5,35±1,37 5,33±1,45 р2>0,05

мРНК РТЕКГ, кп х 101 /мкл 2,49±0,27 1,05±0,23 р1<0,001 3,15±0,53 1,90±0,29 р2<0,05

мРНК каспаза-3, кп х 102 /мкл 2,53±0,52 2,28±0,78 р1>0,05 1,72±0,55 2,62±0,85 р2>0,05

мРНК Н8Р27, кп X 104 /мкл 8,15±1,11 3,09±0,78 р1<0,001 6,34±0,98 9,73±1,84 р2>0,05

мРНК 1БЫу, кпх 106/мкл 57,30±56,15 126,58±33,79 р1>0,05 236,90±65,66 53,03±15,11 р2>0,05

(Примечание: * - лф - лимфоциты, мф - макрофаги, р1 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой, р2 - достоверность различий по сравнению с подгруппой с наступившей беременностью после ЭКО).

ВЫВОДЫ

1. Для группы пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием характерны: меньшая частота беременностей и родов в анамнезе, большая частота внематочных беременностей, эктопий шейки матки, инфекций, передаваемых половым путем, воспалительных заболеваний органов малого таза, спаечного процесса органов малого таза, оперативных вмешательств на

органах малого таза. Для этих пациенток характерна недостаточность секреторной трансформации эндометрия и очаговый хронический эндометрит.

2. Отрицательными прогностическими факторами исхода программы экстракорпорального оплодотворения у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием являются: нарушения менструальной функции по типу гипоменореи (ОШ=5,4), длительность бесплодия более 10 лет (0111=4,9), первичное бесплодие (ОШ=3,3), возраст пациенток 35 лет и старше (0111=3,1), III-IV степень спаечного процесса органов малого таза (ОШ=2,9), оперативные вмешательства наличниках (ОШ=2,5).

3. В эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием снижено по сравнению с фертильными женщинами содержание CD95+ лимфоцитов, CD95L+ макрофагов и стромальных клеток, вступивших в апоптоз и находящихся на поздних/необратимых стадиях апоптоза, для этих пациенток характерна повышенная экспрессия мРНК антиапоптотических факторов XIAP и HSP27 при одновременном усилении экспрессии мРНК проапоптотического фактора PTEN. У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в возрасте 35 лет и старше, а также у женщин с бесплодием более 10 лет в эндометрии снижена экспрессия мРНК каспазы-3.

4. Наступление беременности после проведения экстракорпорального оплодотворения у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием ассоциировано с высокими значениями уровня экспрессии мРНК PTEN и IFNy в эндометрии в период «окна имплантации» в цикле, предшествующем овариальной стимуляции. У пациенток в возрасте до 35 лет наступление беременности после проведения экстракорпорального оплодотворения дополнительно связано со сниженными показателями экспрессии мРНК HSP27 в эндометрии.

5. В эксперименте in vitro IFNy в дозе 50 пг/мл усиливает экспрессию мРНК PTEN и повышает содержание стромальных клеток, вступивших в апоптоз и находящихся на ранних/обратимых стадиях апоптоза, в эндометриальных эксплантах женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. В эндометрии

пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием высокий уровень экспрессии мРНК IFNy ассоциирован с высокими значениями показателей экспрессии mPHKPTEN.

6. Высокие значения относительного содержания CD95+ макрофагов (48,8% и более) в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия женщин с трубно-перитонеальным бесплодием позволяют прогнозировать наступление беременности у этих пациенток после проведения экстракорпорального оплодотворения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Клиническими критериями эффективности лечения трубно-перитонеального бесплодия методом ЭКО являются возраст женщин моложе 35 лет, вторичное бесплодие, длительность бесплодия менее 10 лет, отсутствие гипоменореи, выраженного спаечного процесса органов малого таза, оперативных вмешательств на органах малого таза, в том числе на яичниках, не более двух неудачных попыток ЭКО в анамнезе.

У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием перед программой ЭКО в цикле, предшествующем овариальной стимуляции, рекомендуется определять в лейкоцитарном инфильтрате эндометрия, полученном в период «окна имплантации», уровень экспрессии CD95+ макрофагов. При значениях относительного содержания CD95+ макрофагов, менее 48,8% - прогнозировать отсутствие наступления беременности, а при значении равном 48,8% или более, прогнозировать успех программы ЭКО.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Публикации в журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:

1. Бойцова A.B., Семененко С.С., Богатова И.К. Апоптоз клеток эндометрия и его регуляция у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием // Вестник Уральской медицинской академической науки. Сыктывкар. — 2010.-№ 2/1 (29).— С. 101-1024.

2. Бойцова A.B., Богатова И.К., Анциферова Ю.С., Кулида Л.В. Нарушения экспрессии FAS и FASL молекул лимфоцитами и макрофагами эндометрия женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения //Медицинская иммунология. -2011. - Т. 13. -№4-5. - С. 418-419.

3. Бойцова A.B., Анциферова Ю.С., Богатова И.К. Изменение регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, участвующих в программе ЭКО // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6(14). - № 2(1). - С. 30-31

4. Бойцова A.B., Анциферова Ю.С., Богатова И.К. Роль IFNy в регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения // Вестник уральской медицинской академической науки. -2012. -№ 4(41). - С.95.

5. Бойцова A.B., Анциферова Ю.С., Богатова И.К. Особенности регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6(15).-№2.-С. 155-161.

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:

1. Бойцова A.B. Особенности апоптоза клеток эндометрия и его регуляция IFNy у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием / A.B. Бойцова // Сборник тезисов «Неделя науки -2010», Иваново-С. 16.

2. Бойцова A.B. Патоморфологические особенности эндометрия у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в зависимости от степени выраженности спаечного процесса / A.B. Бойцова // Сборник тезисов «Неделя науки - 2011», Иваново - С. 24.

3. Бойцова A.B., Кулида Л.В. Патоморфологические особенности эндометрия у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием и невынашиванием беременности в анамнезе // Бюллетень ФЦСКЭ им.В.А.Алмазова. Тезисы IV междисциплинарной конференция по акушерству, перинатологии неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный» - Санкт-Петербург. -2011,- (приложение 4). - С. 18.

4. Бойцова A.B., Кулида Л.В., Богатова И.К. Особенности экспрессии PTEN у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием // Проблемы репродукции. - Москва. - 2012. - С. 129130.

5. Бойцова A.B., Богатова И.К., Анциферова Ю.С. Иммунологические критерии прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в программе ЭКО // Проблемы репродукции. - Москва. - 2012. - С. 128-129.

6. Бойцова A.B., Богатова И.К., Анциферова Ю.С. Характер регуляции апоптоза в эндометрии и успех программы ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием // Тезисы IV ежегодной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов ФГБУ «Федеральный Центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова». - Санкт-Петербург.-2012. - С. 121-122.

7. Boitsova A.V., Sotnikova N.Y., Antsiferova Y.S., Filippova E.S. Regulation of apoptosis in the

endometrium of infertile women: relationship with IVF treatment outcome//

Am.J.Reprod.Immunol. - 2012. - Vol.67. -P. 18.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМГ — антимюллеров гормон

мРНК — матриксная рибонуклеиновая кислота

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

CD - кластер дифференцировки

Fas - синтетаза жирной кислоты

HSP - белок теплового шока

IFNy - интерферон-гамма

PTEN - фосфатаза и тензин гомолог, делегированный на хромосоме 10 XIAP - Х-связанный ингибитор апоптоза

БОЙЦОВА АЛИСА ВИТАЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В ЭНДОМЕТРИИ ЖЕНЩИН С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ БЕСПЛОДИЕМ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ИСХОДАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 25.02.2013. Формат 60x84 1/16 Печать плоская. Усл. печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ № 125. ФГБОУВПО «Ивановский государственный энергетический университет им. В.И. Ленина» 153003, Иваново, ул. Рабфаковская, 34. Отпечатано в УИУНЛ ИГЭУ.