Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Особенности аллельного полиморфизма генов ферментов метионинового и фолатного циклов при атеросклеротическом поражении артерий

На правах рукописи УДК: 575.113:616.13-004.6

КЛЕНКОВА НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ОСОБЕННОСТИ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТИОНИНОВОГО И ФОЛАТНОГО ЦИКЛОВ ПРИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ АРТЕРИЙ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ 4855745

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 А ф£В 2011

Санкт-Петербург 2011

4855745

Работа выполнена в ФГУ «РОССИЙСКИЙ НИИ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ» ФМБА России (директор - член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Е.А. Селиванов)

Научные руководители:

доктор биологических наук Сергей Игоревич Капустин кандидат медицинских наук Виктор Дмитриевич Каргин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Людмила Николаевна Бубнова доктор биологических наук, профессор Наталья Николаевна Зыбина

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « Срб^РвЛЙ 2011 года в ч

на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском НИИ

гематологии и трансфузиологии ФМБА России по адресу.

191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук Т.В.Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Сердечно-сосудистая патология, обусловленная атеросклеротическим поражением артерий, с середины XX века является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности населения в развитых странах. Классические факторы риска развития атеросклероза (курение, артериальная гипертензия, дислипопротеинемии, сахарный диабет и пр.) не могут полностью объяснить генез заболеваемости и смертности от кардиоваскулярной патологии. В связи с этим, пристальное внимание уделяется углублению понимания процесса развития атеросклеротического поражения сосудов и поиску триггерных факторов его возникновения. Особое место в литературе отводится выявлению причин генетической предрасположенности к развитию данного патологического процесса.

К доказанным факторам риска развития атеросклеротических и протромботических изменений относят гипергомоцистеинемию (ГГЦ) -повышенное содержание в плазме крови аминокислоты гомоцистеина (ГЦ). Атерогенное действие, оказываемое избытком гомоцистеина, является комплексным и может быть объяснено, прежде всего, патологическими изменениями в сосудистой стенке (Петрищев Н.Н., 2007; Dhillon В. et al., 2003; Roybal С. et al., 2004; Wang H. et al., 2002; Zhang С. et al., 2001). Возникающая при этом дисфункция эндотелия характеризуется угнетением его антикоагулянтных и активацией прокоагулянтных свойств (Durand P. et al., 2001; Harpel P. et al., 1996; Joseph J. et al., 2003; Markis M., 2000).

Повышение уровня гомоцистеина в плазме крови может быть вызвано приобретенными и генетическими факторами. Большинство из них прямо или опосредованно вызывают нарушения в метаболическом цикле данной аминокислоты. Приобретенная ГГЦ возникает, прежде всего, вследствие воздействия факторов, провоцирующих развитие витамино-дефицитных состояний (De Bree A. et al., 2001; Nygard О. et al., 1998). "Генами-кандидатами", обуславливающими наследственную предрасположенность к развитию ГГЦ, являются гены ферментов, непосредственно вовлеченных в регуляцию метаболизма метионина и фолатов.

Имеющиеся в литературе данные о влиянии аллельных вариантов генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма метионина и фолатов на уровень ГЦ в плазме крови и риск возникновения атеросклеротического поражения артерий весьма противоречивы (Laraqui A. et al., 2006; Lewis S. et al., 2005; Lievers K. et al., 2001; Klerk M. et al., 2003; Kluijtmans L. et al., 2003). В частности, ни одна из ассоциативных связей не была однозначно подтверждена всеми исследователями.

Принимая во внимание разнообразие патогенетических механизмов, лежащих в основе возникновения ГГЦ и атеросклероза, важным при установлении генетических детерминант, предрасполагающих к развитию данных патологических состояний, является сочетанный анализ генетических вариантов (так называемый анализ "ген-генных взаимодействий"). Работы,

направленные на анализ ген-генных взаимодействий крайне немногочисленны. В популяции Северо-Западного региона России подобные исследования не выполнялись.

Все вышесказанное определило значимость изучения влияния аллельного полиморфизма генов метаболизма метионина и фолатов на риск возникновения ГГЦ и атероскяеротического поражения артерий и явилось основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Установить роль аллельного полиморфизма генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов в развитии гипергомоцистеинемки и атеросклеротического поражения артерий различной локализации.

Задачи исследования.

1. Выявить ассоциативные связи между носительством аллельных вариантов генов метилентетрагидрофолат редуктазы (МТОТИ С677Т и А1298С), метионин синтазы (МБ А2756С), редуктазы метионин синтазы (МТЯЯ А660), метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (МТИББ С1958А) и уровнем ГЦ в плазме крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и атеросклерозом артерий нижних конечностей (ААНК).

2. Определить генотипические сочетания аллельных вариантов генов МТНРЛ, МБ, МТШ1, МТНГО ("ген-генные взаимодействия"), ассоциированные с риском развития ГГЦ у больных с атеросклеротическим поражением артерий

3. Провести сравнительный анализ частот встречаемости генотипов по генам МТИИ*, МБ, МТИЯ, МТНГО у больных ИБС, ААНК и в контрольной группе. На основании анализа "ген-генных взаимодействий" выявить генотипические сочетания, ассоциированные с риском развития ИБС и ААНК.

4. Провести сравнительный анализ распределения генотипов по генам между пациентами с ИБС, ААНК и больными ААНК с наличием в анамнезе клинически и инструментально подтвержденных осложнений, связанных с атеросклеротическим поражением коронарных артерий.

5. Изучить ассоциативные связи между генотипом индивида и некоторыми общепризнанными индукторами атерогенеза у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полиморфизм генов метионинового и фолатного циклов является важной генетической составляющей, оказывающей влияние на уровень ГЦ в плазме крови. Аллельные варианты МТНР"{1 677ТТ, МТНИ1 1298АА, МБ 275бАА и в особенности их сочетания, являются существенными генетическими предпосылками развития ГГЦ.

2. Аллельный полиморфизм генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов оказывает существенное влияние на риск развития

ИБС и ААНК. Генетические варианты МТНРЯ 677Т , МТИБЯ 1298АА и МБ 2756АА реализуют свой неблагоприятный эффект через развитие ГГЦ. Генотипическое сочетание МТЯ11 66СО/МТНР13 19580А ассоциировано с риском развития указанных заболеваний независимо от уровня ГЦ в плазме.

3. Общий характер закономерностей, выявленных при изучении ассоциативных связей между аллельным полиморфизмом генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов, уровнем ГЦ в плазме, а также риском возникновения ИБС и/или ААНК свидетельствует об универсальности механизмов генетической предрасположенности к развитию ГГЦ и атеросклеротическому поражению артерий.

Научная новизна.

Впервые определены частоты встречаемости аллельных вариантов генов МТНРЯ А1298С, М8 А2756С, МТШ1 АббО, МТНРО 01958А и их сочетаний у больных ИБС и ААНК с учетом содержания ГЦ в плазме, и в здоровой популяции Северо-Западного региона России.

Впервые показано, что генотипы МЮТИ 1298АА, МБ 2756АА, а также, сочетания МТОИ*. 677ТТ/МТНИ1 1298АА, МТНР'И 677ТТ/МБ 2756АА, \1THFR 1298АА/М8 2756АА являются существенными генетическими предикторами развития ГГЦ у больных ААНК и ИБС, проживающих в СевероЗападном регионе России.

Установлено, что увеличение риска развития ИБС и ААНК у лиц с неблагоприятными генотипами МТИРЯ 677СТ и 677ТТ, М8 2756АА, а также их сочетаниями, наблюдается только при наличии ГГЦ.

Впервые показано, что генотипическое сочетание МТКЯ ббОО/МТНРБ 19580А ассоциировано с риском развития атеросклеротического поражения артерий вне зависимости от уровня ГЦ в плазме.

Практическая значимость.

Полученные данные способствуют более эффективному выделению лиц группы риска развития ГГЦ, что позволит повысить эффективность профилактических мероприятий по снижению частоты сердечно-сосудистых заболеваний в популяции.

Использование результатов генотипирования полиморфизма генов МЮТК, МБ, МТИИ, МТНРБ у больных с венозной и артериальной патологией может способствовать повышению качества прогнозирования и профилактики повторных тромботических осложнений.

Данные о частотах встречаемости генотипов по генам МЮТК, МБ, МТ1Щ, .\4THFD в здоровой популяции могут быть использованы в качестве референтных при изучении предрасположенности к различным заболеваниям.

Апробация материалов диссертации.

Положения диссертационной работы были представлены на Международных Конгрессах по тромбозу и гемостазу: 2007 год - Женева, Швейцария, 2009 год - Бостон, США; Всероссийских научно-практических конференциях "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.), Всероссийской конференции с международным участием "Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 2009 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 2010), Международной конференции "Математическая биология и биоинформатика" (Москва, 2010).

Внедрение результатов исследования в практику.

Полученные результаты используются при обследовании больных с сердечно-сосудистой патологией, находящихся на лечении в КО "Хирургия" ФГУ "РосНИИГТ" ФМБА России, а также направляемых на обследование из других медицинских учреждений города.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 232 источника, из них 24 - отечественных и 208 -зарубежных.

Личный вклад автора.

Автором лично выполнено молекулярно-генетическое типирование у больных и в контрольной группе. Проведен сбор анамнестических данных, статистическая обработка полученных результатов, анализ выявленных закономерностей и их обобщение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Обследовано 225 больных с различными проявлениями артериальной патологии - 126 пациентов с диагнозом "атеросклероз артерий нижних конечностей" (ААНК) в возрасте от 27 до 72 лет, находившихся на стационарном или амбулаторном лечении в клиническом отделении "Хирургия" ФГУ "РосНИИГТ" ФМБА России и в клинике им. Петра Великого, а также 99 больных с диагнозом "ишемическая болезнь сердца" (ИБС) в возрасте от 36 до 73 лет, проходивших лечение в клинике им. Петра Великого. Диагноз ААНК устанавливался на основании данных анамнеза и подтверждался методом ангиографии и/или ультразвуковым дуплексным сканированием. Диагноз ИБС был верифицирован на основании данных анамнеза, электрокардиографии, велоэргометрии, эхокардиографии и ангиографии. Критериями исключения из исследования служили: возраст более 75 лет, хроническая почечная недостаточность, онкологические заболевания, сахарный диабет, а также прием лекарственных препаратов, влияющих на уровень гомоцистеина. Среди больных, находившихся на стационарном или амбулаторном лечении в клиническом отделении "Хирургия" с диагнозом атеросклероз артерий нижних конечностей, 51 чел (40,5%) ранее имел осложнения, связанные с атеросклеротическим поражением коронарных артерий. У всех больных, включенных в исследование, учитывалось наличие таких факторов риска развития атеросклеротического поражения артерий, как курение и артериальная гипертензия (АГ). Под термином "артериальная гипертензия" подразумевался синдром повышения артериального давления при гипертонической болезни. Диагноз "гипертоническая болезнь" устанавливался на основании Европейских рекомендаций по контролю АГ (2003). Подавляющее большинство обследованных составили лица мужского пола -102 чел (81,0 %) среди больных ААНК и 80 чел (80,8 %) среди пациентов с ИБС.

Группа контроля состояла из 121 человека - кадровых доноров крови и сотрудников РосНИИГТ, не имевших в анамнезе клинических проявлений артериальной патологии и проживающих с Северо-Западном регионе России.

Материалом для исследования являлась венозная кровь, полученная путем пункции локтевой вены и стабилизированная 2,5% раствором ЭДТА в соотношении 10:1. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции согласно Miller S. et al. (1998).

В работе исследован аллельный полиморфизм четырех генов ключевых ферментов метаболизма метионина - метионин синтазы (MS), редуктазы метионинсинтазы (MTRR) и фолатов - метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (MTHFD).

Характеристика и использованные методы идентификации изученных ДНК-полиморфизмов, с указанием оригинального источника,

представлены в таблице 1. Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих указанные полиморфные варианты, осуществляли на основе технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Идентификацию аллельных вариантов осуществляли с помощью анализа длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта (метод ПЦР-ПДРФ). После проведения 35 циклов ПЦР, образовавшийся амплификат инкубировали с 10 ед. специфической эндонуклеазы рестрикции в условиях, рекомендуемых поставщиком (ООО "Сибэнзим", Россия). Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 7% (для МТНРЯ А1298С - в 10%) полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл (Маниатис Т. и соавт., 1984).

Таблица 1

Исследованные однонуклеотндные замены и методы их идентификации.

Ген (сокращение) Локализация Полиморфиз м Метод Источник

Метилентетрагидро-фолат редуктаза (MTHFR) 1р36.3 С677Т (Ala222Val) ПЦР-ПДРФ Frosst Р. et al., 1995

Метилентетрагидро-фолат редуктаза (MTHFR) 1р36.3 А1298С (Е433А) ПЦР-ПДРФ Van der Put N. et al., 1998

Метионин синтаза (MS) lq34 A2756G (D919G) ПЦР-ПДРФ Leclerc D. et al., 1996

Редуктаза метионин-синтазы (MTRR) 5р15.2-р15.3 A66G (I22M) ПЦР-ПДРФ Le Marchand L. et al., 2002

Метилентетрагидро-фолат дегидрогеназа (MTHFD) 14q24 G1958A (R653Q) ПЦР-ПДРФ Brody L. et al., 2002

Статистическая обработка результатов была выполнена на персональном компьютере с использованием целого ряда современных статистических программ: GraphPad Prism (версия 4) и StatXact (версия 8.0.0) - расчет выборочных статистических показателей описательной статистики и анализ категоризованных данных; Hardy-Weinberg Diagnostics (версия 2.0) - проверка согласия распределений генотипов по изучаемым генам с равновесием Харди-Вайнберга; AtteStat (версия 12.2) - проверка на нормальность распределения; Past (версия 1.82Ь) - установление ассоциативных связей между генотипами по изучаемым генам и содержанием гомоцистеина в плазме крови с

использованием критериев Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни с поправкой Бонферрони на множественность сравнений. Оценка различий в частоте встречаемости генотипов и их сочетаний выполнялась с помощью ""точного критерия Фишера. Показатель "отношение шансов" OR (odds ratio) определялся при двустороннем доверительном интервале CI (confidence interval), равном 95%. Статистическая значимость различий устанавливалась при значениях р<0,05.

Измерение концентрации гомоцистеина в плазме проводилось в лаборатории свертывания крови РосНИИГТ (руководитель д.м.н., проф. J1. П. Папаян) методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с флуоресцентной детекцией (Fiskerstrand Y. et al., 1993). Значения ГЦ выше 13,5 мкмоль/л расценивали как гипергомоцистеинемюо согласно данным Шмелевой В.М. (Шмелева В.М. и др., 2008).

Результаты исследования и их обсуждение.

На первом этапе исследования был выполнен ассоциативный анализ между носительством аллельных вариантов генов MTHFR С677Т и А1298С, MS A2756G, MTRR A66G, MTHFD G1958A и содержанием в плазме ГЦ у больных ИБС и ААНК. Полученные данные продемонстрировали идентичность результатов для пациентов с ИБС и ААНК, что является закономерным и отражает единообразие процессов, связанных с метаболизмом гомоцистеина, вне зависимости от выявленного атеросклеротического поражения артериального бассейна. В связи с этим, представлялось обоснованным объединение больных в единую группу.

Продемонстрировано, что существенные различия по уровню ГЦ наблюдались между носителями генотипов 677СС, 677СТ и 677ТТ по полиморфизму MTHFR С677Т. Следует подчеркнуть, что статистически высоко значимыми являлись различия по уровню ГЦ не только между группами лиц с гомозиготным носительством "Т" и "С" аллельных вариантов (677ТТ против 677СС р=0,0007), но также и в группе гетерозигот 677СТ по сравнению с "нормальным" 677СС вариантом (р=0,01) (рис. 1 А).

Фермент MTHFR осуществляет конверсию 5,10-

метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат - основную циркуляторную форму фолатов в организме и донора метальной группы в реакции восстановления гомоцистеина в метионин. Выполненные in vitro оценки свидетельствуют о снижении активности у гетерозигот 677СТ на 3035% и гомозигот по мутантному "Т" аллелю на 60-70% по сравнению с уровнем активности нормального (677СС) фермента (Frosst P. et al., 1995; Guenther В. et al., 1999). Однако, активность "дефектного" фермента может быть скорректирована путем увеличения концентрации 5-метил-тетрагидрофолата (Guenther В. et al., 1999). Несмотря на однозначность выводов о влиянии полиморфизма С677Т на ферментативную активность MTHFR, сведения об ассоциации между С677Т аллельным вариантом и уровнем ГЦ носят крайне противоречивый характер (Lewis S. et al., 2005).

Выраженное влияние С677Т полиморфизма на уровень ГЦ, выявленное в ходе нашего исследования, находится в согласии с данными, полученными in vitro (Frosst P. et al., 1995; Guenther В. et al., 1999), и свидетельствует о недостаточности, в среднем, концентрации фолатов и других витаминов группы "В" в плазме у обследованных нами больных для фенотштической коррекции данной зависимости (Guenther В. et al., 1999; Lewis S. et al., 2005).

25

G 20 &

in

is

- § M

re £ a b X OI

ai о 2C

10

4

* i

- -- --

677CC 677CT 677TT Генотип

25 20 15 10

i i Г

t

- - -

1298AA 1298AC 1298CC Генотип

А Б

Рис 1. Ассоциация между генотипами по аллельным вариантам МТИБЯ С677Т (А) и А1298С (Б) и содержанием ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

В отличие от полиморфизма С677Т гена MTHFR, данные о влиянии нуклеотидной замены А1298С на ферментативную активность MTHFR (Lievers К. et al., 2001; Weisberg I. et al., 2001; Yamada K. et al., 2001), и тем более, на уровень ГЦ противоречивы (Hanson N. et al., 2001; Lievers К. et al., 2001). Наши данные свидетельствуют о наличие влияния полиморфного варианта MTHFR А1298С на уровень ГЦ (рисЛБ). Наиболее высокая концентрация данного метаболита наблюдалась среди носителей генотипа 1298АА, и имелось статистически значимое различие по уровню ГЦ между группами с гомозиготными генотипами (1298АА против 1298СС; р=0,003).

Фермент метионин синтаза является ключевым в конверсии гомоцистеина в метионин. В литературе имеются прямо противоположные сведения об ассоциации между нуклеотидной заменой 2756A->G и уровнем ГЦ (Tsai М. et al., 2000; Laraqui A. et al., 2006; Klerk M. et al., 2003; Kluijtmans L. et al., 2003). Наши результаты свидетельствуют о наличии влияния рассматриваемого полиморфного варианта на уровень ГЦ. Содержание ГЦ

и

оказалось выше в группе носителей генотипа МБ 2756АА по сравнению с таковым у лиц с генотипами МБ 2756АС и МБ 275600 полиморфизму МБ А2756й (2756АА против 275600 р=0,04) (рис.2).

и

1Л СП

сс

ГО

о. н X

О)

=г

X

о а:

25

20

15

10

*

<

—— —

2756РА2756Ав2756вв

Генотип

Рис 2. Ассоциация между генотипами по аллельному варианту МБ А2756С и содержанием ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

^ 25

20

и

1П 21

=г 2

ГО X =■110 х ш

§ 5 ас

*

1

66АА 66АС бевс Генотип

А

25

20

15

10

* * 1

- - -

195866 1958СА 1958АА Генотип

Рис.3. Ассоциация между генотипами по аллельным вариантам МИ Аббв (А) и МТНРО 01958А (Б) и содержанием ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

Фермент редуктаза метионин синтазы необходим для поддержания фермента метионин синтазы в активном состоянии, а фермент метилентетрагидрофолат дегидрогеназа является ключевым в метаболизме фолатов. Анализ полиморфных вариантов генов данных ферментов - МТКЯ А66С и МТНБО С1958А продемонстрировал отсутствие ассоциации между нуклеотидными заменами МТБЖ 66А->в и МТНРБ 1958 в ->А и содержанием ГЦ в плазме крови (р=0,33 и р=0,43 соответственно) (рис 3).

Попарный анализ сочетанного влияния рассматриваемых аллельных вариантов генов МЮТК, МБ, МТЯИ, МТНРБ на содержание ГЦ продемонстрировал, что имеются статистически значимые различия по уровню ГЦ между группами больных с носительством генотипов МТНИ1 677ТТ/МТНР11 1298АА против МТНИ1 677СС/МТНР11 1298СС (р=0,007); МТНРЯ 677ТТ/М8 2756АА против МТНРЯ 677СС/МБ 2756АО (р=0,002); МЮТ!* 1298АА/М8 2756АА против МТИБЯ 1298СС/М8 2756АО (р=0,04) (пример сочетанного анализа представлен на рис.4).

25

20

и

а н

х ш я

X

о ас

5

41---

0

-1-1-

<<13<<U<<0

шшщшшш^ии)

Ш1ПЩЛ1ЛЮ1ЛШ1Л

Г-Г^Г-чГ^Г^Г-чГ-Г^Г-.

NrM(>JMN(^|N(^JN

677 СС 677 СТ 677 ТТ

Генотип по двум генам

Рис.4. Ассоциация между сочетанные генотипами по аллельным вариантам МТНРИ С677Т и МБ А2756С и содержанием ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

Анализ сочетаний по трем генотипам продемонстрировал, что самый высокий средний уровень ГЦ (95% С1) - 17,9(14,2-22,5) мкмоль/л наблюдался в группе больных с генотипом МТИБЯ 677ТТ/МТНРК 1298АА/М5 2756АА. Данный показатель оказался достоверно выше, чем у пациентов, не имеющих в геноме вышеназванных генотипов - 9,9 (8,6-11,4) мкмоль/л; р=0,0001. Установлено, что среди носителей сочетанного генотипа МТНБЯ 677ТТ/МТНР11 1298АА/М8 2756АА лица с ГГЦ (значения ГЦ выше 13,5 мкмоль/л) составили 57,1% против 21,6% у больных, не имеющих данных генотипов (р=0,02; (Ж=4,85 С1:1,39-16,95) (рис.5).

100% 80% 60%

40% 20% 0%

0 ГГЦ □ без ГГЦ

Рис. 5. Частота встречаемости больных с повышенным и нормальным уровнем ГЦ у носителей генотипа МТНРК. 677ТТ/МТНРК 1298АА/М8 2756АА ("генотип риска") и пациентов, не имеющих в геноме вышеназванных генотипов.

Таким образом, сочетание МТИРИ 677ТТЛМТНРЯ 1298АА/М5 является важным предиктором генетически обусловленной ГГЦ. Однако, даже в случае сочетания в геноме трех генотипов, предрасполагающих к развитию ГГЦ, в 42,9% случаев уровень ГЦ находился в пределах нормы, что может быть детерминировано либо благоприятным влиянием внешних факторов, либо другими наследственными факторами, нивелирующими действие вышеуказанных. Полученный результат свидетельствует о необходимости определения концентрации данного метаболита для установления факта наличия ГГЦ у пациента с неблагоприятным генетическим профилем, а также

"генотип другие риска" генотипы

целесообразности дальнейшего поиска аллельных вариантов генов, влияющих на содержание данного метаболита.

С целью изучения ассоциативных связей между полиморфными вариантами генов МТНРЯ С677Т и А1298С, МБ А2756С, МТБЖ Аббв, МТНРБ С1958А и риском возникновения заболеваний, обусловленных атеросклеротическим поражением артерий, выполнен сравнительный анализ распределения частот генотипов по указанным генам в группе контроля и у больных ИБС и ААНК с учетом уровня ГЦ в плазме (с ГГЦ и уровнем ГЦ в пределах нормы). Среди пациентов, страдающих ИБС, ГГЦ наблюдалась у 39,4% больных, что незначительно превысило соответствующий показатель у пациентов с ААНК - 31,8% случаев (р=0,26; СЖ=1,40; С1:0,81-2,42).

ГГЦ без ГГЦ БОЛЬНЫЕ ИБС КГ

ГГЦ без ГГЦ БОЛЬНЫЕ ААНК КГ

этт на псс етт ист псс

А Б

Рис.6. Распределение генотипов по полиморфизму С677Т гена МТНРЯ у пациентов с ИБС (А) и ААНК (Б) с учетом уровня ГЦ в плазме и в контрольной группе (КГ).

Установлено, что у больных ИБС при наличии ГГЦ частота встречаемости аллеля MTHFR 677Т (генотипы 677СТ и 677ТТ) составила 71,8% и существенно превысила таковую в группе пациентов без ГГЦ - 45,0% (р=0,01; OR=3,l; С1:1,3-7,4) и в контроле - 47,9% (р=0,01; OR=2,8; С1:1,3-6Д)(рис. 6А). Аналогичный результат был получен и для пациентов с ААНК (рис. 6Б). В частности, среди больных с ГГЦ доля носителей аллеля MTHFR 677Т составила 67,5% против 46,5% у пациентов с нормальным уровнем ГЦ (р=0,03; OR=2,39; CI: 1,09-5,27) и 47,9% в контрольной группе (р=0,04;

011=2,26; С1: 1,06-4,79). Особенно заметным в группе больных ААНК с ГГЦ оказалось увеличение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа МТИБЯ 677СТ (55,0% против 36,1% у больных с нормальным уровнем ГЦ; р=0,05; 011=2,17; С1: 1,01-4,65).

Анализ другого полиморфного варианта гена МТНРК - А1298С - в группе больных ИБС продемонстрировал некоторое увеличение доли лиц с генотипом МТНБК 1298АА (53,9%) по сравнению с пациентами без ГГЦ (41,2%; р=0,30; 011=1,63; С1:0,72-3,68) и лицами контрольной группы (43,8%; р=0,36; 011=1,50; С1:0,72-3,09). Аналогичные результаты получены для больных ААНК: 55,0% с ГГЦ против 44,2% у пациентов без ГГЦ (р=0,34; 011=1,54; 0:0,73-3,28) и против 43,8% в контроле (р=0,27; 011=1,57; С1:0,76-3,22). При анализе полиморфного варианта А2756в гена МБ, также ассоциированного с изменением уровня ГЦ, наблюдалась повышенная частота встречаемости генотипа М8 2756АА среди больных ААНК с ГГЦ (75%) по сравнению с пациентами с нормальным содержанием ГЦ (58,1%, р=0,06; 011=2,20; С1: 0,94-4,98) и группой контроля 60,3% (р=0,12; 011=1,97; С1: 0,884,41).

БОЛЬНЫЕ ИБС КГ БОЛЬНЫЕ ААНК КГ

авв ЕЗАв ПАА ЯЪЬ С1АА

А Б

Рис. 7. Распределение генотипов по аллельным вариантам Аббв гена МТКИ у больных ИБС (А) и ААНК (Б) с учетом уровня ГЦ в плазме и в контрольной группе.

У больных с ГГЦ выявлена также повышенная частота встречаемости генотипа МТИЯ ббвв по полиморфизму Аббв (рис.7). Так, среди больных ИБС, в группе с ГГЦ носители генотипа 66вО наблюдались в 41,0% случаев, что существенно превысило соответствующий показатель у пациентов без ГГЦ (25%; р=0,12; СЖ=2,09; 01: 0,88-4,90). При сравнении с контрольной группой различия статистически значимы (41,0% против 23,1%; р=0,04; 011=2,31; 95% С1:1.08 - 4.97). У больных ААНК соответствующие показатели составили 40,0% у лиц с ГГЦ против 27,9% у пациентов без таковой (р=0,22; СЖ=1,72; 95% С1: 0,78 -3,79) и 23,1% в контроле (р=0,04; 011=2,21; С1:1.03 - 4,73).

Учитывая мультифакториальность природы атеросклероза, в рамках данного исследования важным для нас являлся поиск наиболее неблагоприятных генетических сочетаний, предрасполагающих к развитию атеросклеротического поражения сосудов. Анализ "ген-генных взаимодействий", выполненный у больных ИБС и ААНК, а также в контрольной группе, выявил следующие закономерности. Частоты встречаемости генотипов с сочетанным носительством аллельных вариантов МШИ* 677Т, МТНИ1 1298АА, МБ 2756АА (сочетания МТИБЯ 677ТТ/МТНБК 1298АА; МТНРЫ 677СТ/МТНРЯ 1298АА; МТИ^ 677СТ/М8 2756АА; МТНП1 1298АА/М5 275600) достоверно повышены по сравнению с контролем у пациентов ИБС и ААНК при наличии у них ГГЦ. Более того, статистически значимые различия по частотам встречаемости данных генотипических сочетаний были выявлены не только между группой больных с ГГЦ и контролем, но также и между больными с ГГЦ и нормальным содержанием данного метаболита.

Изложенные факты позволяют предположить, что ГГЦ, обусловленная носительством вышеназванных аллельных вариантов, явилась фактором, провоцирующим развитие атеросклеротического поражения артерий в данной группе пациентов.

У больных ИБС и ААНК с ГГЦ отмечалась также повышенная частота встречаемости сочетаний аллельных вариантов генов, ассоциированных с развитием ГГЦ, с генотипом МТИЯ 66вС (сочетания МЮТИ 677ТТ/МТ11К 660в; МТНРЛ 1298АА/6600; МБ 2756АА/МТШ1 6600). Причем, и для больных ИБС и для пациентов с ААНК различия по частоте встречаемости данных генотипических сочетаний между пациентами с ГГЦ и группой контроля являлись статистически значимыми.

В то же время, статистически значимое повышение частоты встречаемости сочетания МТБЖ ббОО/МТНБВ 19580А отмечено у больных ИБС и ААНК по сравнению с контролем вне зависимости от уровня ГЦ (рис. 8).

Для больных ИБС носительство сочетания МТЯЯ ббОО/МТИББ 19580А выявлено в 25,6% и 18,4% случаев у лиц с и без ГГЦ против 9,9% в контроле (р=0,02; 011=3,1; С1: 1,23-7,97 и р=0,03; 011=2,04; С1:1,09-8,81 соответственно). В группе пациентов с ААНК данные показатели составили 22,5% и 19,8% среди больных с и без ГГЦ против 9,9% в контроле (р=0,02; 011=2,64; С1:1,02-6,83 и р=0,03; 011=2,24; С1:1,01-4,97 соответственно).

Аллельный вариант MTRR 66G может обуславливать менее эффективное (по сравнению с MTRR 66А вариантом), восстановление активности фермента MS - одного из ключевых в фолатном и метиониновом циклах (Olteanu Н. et al, 2002). Фермент MTHFD осуществляет конверсию различных форм фолатов (Brody L. et al, 2002), а полиморфизм MTHFD G1958A находится в области гена, регулирующей синтез пуринов (Barlow С. et al., 1990; Hum D. et al., 1988), и, следовательно, ДНК. Можно предположить, что синергичное влияние полиморфных вариантов MTRR 66GG и MTHFD G1958A оказывает негативный эффект на процессы, связанные с делением клеток (возможно, с регенерацией сосудистого эндотелия) и именно этим объясняется повышенный риск развития артериальной патологии у лиц с данным генотипическим сочетанием.

30% 25%

20%

15% 10% 5% 0%

Рис. 8. Частота встречаемости сочетанного генотипа MTRR ббСО/МТНРБ 19580А у больных ИБС (А) и ААНК (Б) при наличии и в отсутствии ГГЦ и в контрольной группе.

Рядом авторов высказывается предположение, что хотя атеросклероз и является системным заболеванием, факторы риска (в том числе и генетические), обуславливающие его развитие в артериях различных органов и магистральных сосудах конечностей, не являются идентичными (АЬоуапэ V. е1 а1., 2006). В связи с этим выполнен сравнительный анализ между пациентами с ИБС, ААНК и больными ААНК с наличием в анамнезе клинически и

ГГЦ без ГГЦ БОЛЬНЫЕ ИБС

ГГЦ без ГГЦ БОЛЬНЫЕ ААНК

инструментально подтвержденных осложнении, связанных с атеросклеротическим поражением коронарных артерий.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии достоверных различий по частоте встречаемости генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD между анализируемыми группами больных. Данный факт может быть обусловлен, во-первых, тем, что процесс реметилирования по фолат-опосредованному пути реализуется во всех клетках тела человека, за исключением эритроцитов. Следовательно, аллельный полиморфизм генов, кодирующих ферменты этого пути, будет оказывать одинаковое влияние на развитие патологического процесса вне зависимости от его локализации. Во-вторых, диагноз, обусловленный атеросклеротическим поражением в одном сосудистом бассейне и отсутствие диагноза, связанного с атеросклеротическим поражением сосудов иной локализации, вовсе не означает отсутствия сочетания симптомной и асимптомных форм атеросклеротического поражения артерий (Hiatt W. et al., 1995; Selvin E.et al., 2004).

Одной из составляющих данного исследования являлось изучение ассоциативных связей между генотипом индивида и некоторыми общепризнанными индукторами атерогенеза (табакокурение и артериальная гипертензия) у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

100,

100

80

60

40

20

Р

H

1

I

i

ГГЦ без ГГЦ ГГЦ без ГГЦ КУРЯЩИЕ НЕКУРЯЩИЕ

атт ист асс

А

ГГЦ без ГГЦ ГГЦ без ГГЦ КУРЯЩИЕ НЕКУРЯЩИЕ

ВАА ЕЗАС С^С

Б

Рис. 9. Распределение генотипов по аллельным вариантам МТИБЯ С677Т (А) и МБ А2756С (Б) у пациентов с атеросклеротическим поражением артерий с учетом ГГЦ и курения.

Повышенная частота встречаемости носителей аллеля MTHFR 677Т у лиц с ГГЦ отмечалась как среди курильщиков (73,5% "с" против 51,1% "без" ГГЦ; р=0,01; OR=2,65; С1:1,25-5,63), так и у некурящих пациентов с артериальной патологией (63,6% "с" против 33,3% "без" ГГЦ; р=0,03; OR=3,5; С1:1,20-10,18). Однако среди курильщиков данный показатель оказался выше (рис. 9А). Полученный результат может быть объяснен негативным влиянием никотина на уровень фолатов (De Bree A. et al., 2001), что, в свою очередь, понижает стабильность "дефектного" MTHFR фермента. В то же время, опосредуемое через развитие ГГЦ, выявленное влияние MS 2756АА генотипа на риск развития артериальной патологии отмечалось только в группе курильщиков (77,6% "с" против 52,1% "без" ГГЦ; р=0,004; OR=3,17; CI: 1,45-6,95). У некурящих пациентов статистически значимые отличия по частоте встречаемости лиц с 2756АА генотипом между больными с ГГЦ и без таковой отсутствовали (50,0% "с" против 62,2% "без" ГГЦ; р=0,43; OR=0,61; С1:0,22-1,70) (рис.9Б). Выявленная особенность может быть обусловлена крайне негативным влиянием компонентов табачного дыма на витамин В,2 - кофактор фермента метионин синтазы.

Вышеизложенные данные свидетельствуют, что у носителей неблагоприятных генотипических вариантов MTHFR 677Т, MS 2756АА курение повышает риск развития артериальной патологии.

Среди больных с атеросклеротическим поражением артерий диагноз "артериальная гипертензия" был поставлен в 62,2% случаев. У лиц с ГГЦ данный показатель составил 65,8%, а без таковой - 60,3%, что свидетельствует об отсутствии явной корреляции между повышенным уровнем ГЦ и АГ среди пациентов в нашей выборке (р=0,50). Анализ распределения частот генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD у больных с артериальной патологией с учетом наличия/отсутствия ГГЦ и АГ показал, что полиморфизм данных генов не ассоциирован с риском развития АГ. Однако, как и в случае курения, АГ усиливает фенотипическое проявление неблагоприятного влияния аллеля MTHFR 677Т, опосредуемое через ГГЦ. Так, выявлены статистически высоко значимые различия по частоте встречаемости носителей аллеля 677Т среди пациентов с ГГЦ и АГ по сравнению с больными с нормальным содержанием ГЦ и АГ (р=0,0004; OR=3,74; С1:1,78-7,77).

Общепризнанно, что снижение показателей инвалидизации и смертности от сердечно-сосудистой патологии может быть достигнуто в результате приема препаратов фолиевой кислоты. Однако, наряду с позитивным эффектом, прием таких препаратов таит немалую угрозу, так как может способствовать росту неопластических клеток и развитию субклинических форм ряда онкологических заболеваний (Smith D. et al., 2008). На фоне избыточного приема синтетической фолиевой кислоты может возникнуть также функциональный дефицит природных фолатов (Nijhout Н. et al., 2004). Приведенные в данной работе исследования могут способствовать выявлению групп риска, генетически предрасположенных к развитию ГГЦ и артериальной

патологии, что позволит правильно выбрать комплекс профилактических мероприятий для каждого отдельного пациента.

Выводы.

1. Аллельный полиморфизм генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов является существенным предиктором уровня ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий. Наиболее значимыми генетическими факторами риска развития ГГЦ является носительство аллельных вариантов MTHFR 677ТТ, MTHFR 1298АА, MS 2756АА.

2. Генотипическое сочетание MTHFR 677TT/MTHFR 1298AA/MS 2756АА является наиболее неблагоприятным предиктором развития генетически-обусловленной ГГЦ.

3. Носительство генетических вариантов MTHFR 677Т, MTHFR 1298АА, MS 2756АА, а также их сочетаний, при наличии ГГЦ приводит к повышенному риску развития ИБС и ААНК. Генотипическое сочетание MTRR 66GG/MTHFD 1958GA является самостоятельным фактором риска развития ИБС и ААНК.

4. Между больными ИБС и ААНК отсутствуют статистически значимые различия в распределении генотипов по генам MTHFR, MS, MTRR, MTHFD, а также характере их ассоциативных связей с уровнем ГЦ в плазме крови.

5. Курение и артериальная гипертензия являются значимыми факторами, увеличивающими риск развития ГГЦ и атеросклеротического поражения артерий у носителей неблагоприятных аллельных вариантов генов MTHFR и MS.

Практические рекомендации.

При обследовании больных с сердечно-сосудистой патологией, обусловленной атеросклеротическим поражением артерий, рекомендуется проведение молекулярно-генетического тилирования полиморфных вариантов генов MTHFR С677Т и А1298С, MS A2756G, MTRR A66G, MTHFD G1958A. Полученные результаты будут способствовать выделению пациентов группы высокого риска, что позволит своевременно определить адекватную патогенетическую терапию.

Список трудов, опубликованных по теме диссертации.

1. Кленкова H.A. Особенности аллельного полиморфизма генов, вовлеченных в метаболизм гомоцистеина, у больных с артериальными тромбозами / Кленкова H.A., Капустин С.И., Смирнова O.A., Салтыкова Н.Б., Шмелева В.М., Дрижун Ю.С., Филановская Л.И., Блинов М.Н. // Вестник гематологии. - 2007. - Том 3 № 2. -С.75.

2. Klenkova N.A. The role of DNA polymorphisms in genes coding the homocysteine and folate metabolizing enzymes in ischaemic heart disease / N.A. Klenkova, S.I. Kapustin, O.A. Smirnova, V.M. Shmeleva, L.P. Papayan, M.N. Blinov // J. Thrombosis &Haemostasis. - 2007. - Vol. 5, Supplement 2. -Abstract P-T-474.

3. Кленкова H.A. Изучение влияния аллельного полиморфизма генов, вовлеченных в метаболизм гомоцистеина и фолатов, на уровень гомоцистеина в плазме крови и риск возникновения облитерирующего атеросклероза сосудов нижних конечностей / Кленкова Н.А., Капустин С.И., Шмелева В.М., Салтыкова Н.Б., Блинов М.Н. // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: Материалы 4-ой Всероссийской конференции с международным участием. - Москва, 2009. - С. 207-208.

4. Кленкова Н.А. Аллельный полиморфизм генов метионинового и фолатного циклов и уровень гомоцистеина в плазме крови у больных с ишемической болезнью сердца / Кленкова Н.А., Капустин С.И., Смирнова О.А., Шмелева В.М., Блинов М.Н. // Вестник гематологии. - 2009. - Том 5 №2. - С. 69.

5. Klenkova N.A. Genetic polymorphism of the homocysteine and folate metabolizing enzymes: association with plasma homocysteine and peripheral arterial disease risk / N.A. Klenkova, S.I. Kapustin, A.A. Gyrgy, V.M. Shmeleva, L.P. Papayan, N.B. Saltykova, M.N. Blinov. // J. of Thrombosis and Haemostasis. - 2009. - Vol.7, Supplement 2. - Abstract PP-TH-346.

6. Smirnova O.A. Molecular genetics analysis in coronary artery disease / O.A. Smirnova, V.M. Shmeleva, S.I. Kapustin, N.A. Klenkova, M.N. Blinov, L.P. Papayan. // J. of Thrombosis and Haemostasis. - 2009. - Vol.7, Supplement 2. -Abstract PP-WE-361.

7. Кленкова H.A. Особенности аллельного полиморфизма генов метаболизма гомоцистеина и фолатов у больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей / Кленкова Н.А., Капустин С.И., Салтыкова Н.Б., Шмелева В.М., Блинов М.Н. // Вестник хирургии имени И.И. Грекова. - 2009. - Том 168, №6. -С. 41-44.

8. Кленкова Н.А. Генетические предикторы гипергомоцистеинемии у больных с атеросклерозом артерий нижних конечностей / Кленкова Н.А., Капустин С.И., Салтыкова Н.Б., Шмелева В.М., Блинов М.Н, Папаян Л.П. // Клиническая геронтология. - 2009. - № 12. - С. 54-58.

9. Шмелева В. М. Кумулятивный эффект гипергомоцистеинемии и генетических детерминант развития эндотелиальной дисфункции и активации тромбоцитарного звена гемостаза на развитие атеротромбоза / Шмелева В. М., Капустин С.И., Кленкова Н.А., Блинов М.Н. Папаян Л.П. // В сб. Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению». - Москва, 2009. - С.135-136.

10. Кленкова Н.А. Генетические факторы риска развития гипергомоцистеинемии у больных ишемической болезнью сердца: роль ген-генных взаимодействий / Кленкова Н.А., Смирнова О.А., Шмелева

B.М., Блинов М.Н., Капустин С.И. // Вестник гематологии. - 2010. - Том VI №3 -С.31.

11. Шмелева В.М. Гипергомоцистеинемия в структуре тромбофилических состояний в северо- западном регионе России / Шмелева В.М., Папаян Л.П., Капустин С.И., Кленкова H.A., Блинов М.Н. // Вестник гематологии. -2010. - Том VI №3 - С. 65-67.

12. Шмелева В.М. Особенности распределения аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты системы гемостаза, у больных атеросклерозом нижних конечностей при наличии гипергомоцистеинемии / Шмелева В.М., Капустин С.И., Кленкова H.A., Блинов М.Н., Папаян Л.П. // Научно-практический журнал «Клинико-лабораторный консилиум». - 2010. - № 23 (33-34) -С.107-112.

13. Кленкова H.A. Особенности аллельного полиморфизма генов метаболизма гомоцистеина и фолатов у больных с ишемической болезнью сердца / Кленкова H.A., Капустин С.И., Шмелева В.М., Смирнова О.А, Блинов М.Н. // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. -Материалы всероссийской научно-практической конференции. - Киров. -2010. - С.331-332.

14. Кленкова H.A. Применение статистических методов анализа для изучения влияния аллельного полиморфизма генов ключевых ферментов метаболизма гомоцистеина на риск возникновения гипергомоцистеинемии и атеросклеротического поражения сосудов / Кленкова H.A., Капустин

C.И., Шмелева В.М., Хромов-Борисов H.H., Блинов М.Н. // Математическая биология и биоинформатика. - Доклады III международной конференции. - Москва. - 2010. - С.230-231.

Список сокращений

ААНК - атеросклероз артерий нижних конечностей

АГ - артериальная гипертензия

ГГЦ - гипергомоцистеинемия

ГЦ - гомоцистеин

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-ПДРФ - анализ длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта CI - доверительный интервал MS - метионин синтаза

MTHFD - метилентетрагидрофолат дегидрогеназа MTHFR - метилентетрагидрофолат редуктаза MTRR - редуктаза метионинсинтазы OR - отношение шансов

Подписано в печать 21.01.2011. Формат 60X84/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 32. Типография СПбМАПО. 191015, СПб., Кирочная ул., д.41.

Сердечно-сосудистая патология, обусловленная атеросклеротическим поражением артерий, с середины XX века является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности населения в развитых странах. Вызывает тревогу факт, что Россия в последние десятилетия печально отличается от других индустриально развитых стран негативной динамикой смертности от болезней системы кровообращения. Это привело к тому, что в настоящее время в Российской Федерации, несмотря на широкое применение противотромботических препаратов и средств профилактики гипертонической болезни, смертность от заболеваний, обуславливаемых атеросклеротическим поражением сосудов (ишемической болезни сердца и мозга, атеросклероза артерий нижних конечностей) в 2-3 раза выше, чем в экономически развитых странах [25].

Данные одного из крупнейших эпидемиологических проектов Всемирной организации здравоохранения - MONICA, охватившего 35 центров в 21 стране мира, в том числе и в России, показали, что классические факторы риска развития атеросклероза (курение, артериальная гипертензия, дислипопротеинемии, сахарный диабет и пр.) не могут полностью объяснить динамику заболеваемости и смертности от кардиоваскулярной патологии. В связи с этим, пристальное внимание уделяется углублению понимания процесса развития атеросклеротического поражения сосудов, поиску триггерных факторов его возникновения и выявлению генетических детерминант данного патологического процесса. При изучении генеза атеросклероза особое место отводится гипергомоцистеинемии (ГГЦ) — повышенному содержанию в плазме крови аминокислоты гомоцистеина (ГЦ), образующейся в процессе метаболизма метионина.

Результаты многочисленных экспериментальных работ свидетельствуют о том, что атерогенное действие, оказываемое избытком гомоцистеина, является комплексным и может быть объяснено, прежде всего, патологическими изменениями в сосудистой стенке. Возникающая при этом дисфункция эндотелия характеризуется угнетением его антикоагулянтных и активацией прокоагулянтных свойств [81,114]. Длительное воздействие повышенных концентраций ГЦ может провоцировать развитие гиперкоагуляционного синдрома и, соответственно, тромботических осложнений [124]. В то же время, данные эпидемиологических исследований об ассоциации между ГГЦ и риском возникновения сердечно-сосудистой патологии, на сегодняшний день, остаются неоднозначными. Наряду с ретроспективными и проспективными исследованиями, демонстрирующими, что повышенный уровень ГЦ является независимым фактором риска развития атеросклероза и его клинических осложнений [42,45], авторами других работ корреляция между уровнем ГЦ и кардиоваскулярной патологией не наблюдалась [52, 84, 88, 206].

Повышение уровня гомоцистеина в плазме крови может быть вызвано нарушениями в нормальном метаболическом цикле данной аминокислоты. В настоящее время накоплены убедительные доказательства вклада генетической компоненты в повышение уровня ГЦ [91,224]. В связи с этим, поиск аллельных вариантов генов, которые могут быть ассоциированы с ГГЦ, представляет большой интерес. "Генами-кандидатами", обуславливающими наследственную предрасположенность к развитию ГГЦ, прежде всего, являются гены ферментов, непосредственно вовлеченных в регуляцию метаболизма метионина и фолатов. Полиморфизм в этих генах может приводить к нарушениям в функционировании соответствующих ферментов и, следовательно, влиять на концентрацию ГЦ в плазме крови.

Имеющиеся в литературе данные о влиянии аллельных вариантов генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма метионина и фолатов на уровень ГЦ в плазме крови и риск возникновения заболеваний, обусловленных атеросклеротическим поражением артерий, весьма противоречивы. В частности, ни одна из ассоциативных связей не была однозначно подтверждена всеми исследователями.

Принимая во внимание разнообразие патогенетических механизмов, лежащих в основе возникновения ГГЦ и атеросклероза, важным при установлении генетических детерминант, предрасполагающих к развитию данных патологических состояний, является сочетанный анализ генетических вариантов (так называемый анализ "ген-генных взаимодействий"). Можно ожидать, что при сочетании нескольких неблагоприятных генетических детерминант их отрицательный эффект может суммироваться и приводить к проявлению признаков заболевания, не отмечаемых при рассмотрении единичных полиморфных вариантов. Работы, направленные на анализ ген-генных взаимодействий крайне немногочисленны. Особо следует отметить, что в популяции Северо-Западного региона России подобные исследования не выполнялись.

Все вышесказанное определило значимость изучения влияния аллельного полиморфизма генов метаболизма метионина и фолатов на риск возникновения ГГЦ и заболеваний, обусловленных атеросклеротическим поражением артерий, и явилось основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Установить роль аллельного полиморфизма генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов в развитии гипергомоцистеинемии и атеросклеротического поражения артерий различной локализации.

Задачи исследования.

1. Выявить ассоциативные связи между носительством аллельных вариантов генов метилентетрагидрофолат редуктазы (МТН№ С677Т и А1298С), метионин синтазы (МБ А2756С), редуктазы метионин синтазы (МТЯЯ А66С), метилентетрагидрофолат дегидрогеназы (МТНРБ 01958А) и уровнем ГЦ в плазме крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и атеросклерозом артерий нижних конечностей (ААНК).

2. Определить генотипические сочетания аллельных вариантов генов МТНРЫ, МБ, МТЯЯ, МТТОТ) ("ген-генные взаимодействия"), ассоциированные с риском развития ГГЦ у больных с атеросклеротическим поражением артерий

3. Провести сравнительный анализ частот встречаемости генотипов по генам МЮТ!*., МБ, МТЯЯ, МТНРБ у больных ИБС, ААНК и в контрольной группе. На основании анализа "ген-генных взаимодействий" выявить генотипические сочетания, ассоциированные с риском развития ИБС и ААНК.

4. Провести сравнительный анализ распределения генотипов по генам между пациентами с ИБС, ААНК и больными ААНК с наличием в анамнезе клинически и инструментально подтвержденных осложнений, связанных с атеросклеротическим поражением коронарных артерий.

5. Изучить ассоциативные связи между генотипом индивида и некоторыми общепризнанными индукторами атерогенеза у больных с атеросклеротическим поражением артерий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полиморфизм генов метионинового и фолатного циклов является важной генетической составляющей, оказывающей влияние на уровень ГЦ в плазме крови. Аллельные варианты МТНРЯ 677ТТ, МТИБЯ 1298АА, МБ 2756АА и в особенности их сочетания, являются существенными генетическими предпосылками развития ГГЦ.

2. Аллельный полиморфизм генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов оказывает существенное влияние на риск развития ИБС и ААНК. Генетические варианты МТИРЯ 677Т , МТНРЫ 1298АА и МБ 2756АА реализуют свой неблагоприятный эффект через развитие ГГЦ. Генотипическое сочетание МТШ1 ббСС/МТНРБ

1958СА ассоциировано с риском развития указанных заболеваний независимо от уровня ГЦ в плазме.

3. Общий характер закономерностей, выявленных при изучении ассоциативных связей между аллельным полиморфизмом генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов, уровнем ГЦ в плазме, а также риском возникновения ИБС и/или ААНК свидетельствует об универсальности механизмов генетической предрасположенности к развитию ГГЦ и атеротромботическому поражению артерий.

Научная новизна.

Впервые определены частоты встречаемости аллельных вариантов генов МТНРЯ А1298С, М8 А27560, МТЬШ АббО, МТНРБ 01958А и их сочетаний у больных ИБС и ААНК с учетом содержания ГЦ в плазме, и в здоровой популяции Северо-Западного региона России.

Впервые показано, что генотипы МТНРЯ 1298АА, МБ 2756АА, а также, сочетания МТЬШК 677ТТ/МТНРК 1298АА, МТЫИ* 677ТТ/МБ 2756АА, МЮТЯ 1298АА/М8 2756АА являются существенными генетическими предикторами развития ГГЦ у больных ААНК и ИБС, проживающих в Северо-Западном регионе России.

Установлено, что увеличение риска развития ИБС и ААНК у лиц с неблагоприятными генотипами МТНРЫ 677СТ и 677ТТ, МБ 2756АА, а также их сочетаниями, наблюдается только при наличии ГГЦ.

Впервые показано, что генотипическое сочетание МТШ1 ббСО/МТНРО 1958вА ассоциировано с риском развития атеросклеротического поражения артерий вне зависимости от уровня ГЦ в плазме.

Практическая значимость.

Полученные данные способствуют более эффективному выделению лиц группы риска развития ГГЦ, что позволит повысить эффективность профилактических мероприятий по снижению частоты артериальных тромбоэмболических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний в целом в популяции.

Использование результатов генотипирования полиморфизма генов МТНРЫ, МБ, МТЯИ, МТНРБ у больных с венозной и артериальной патологией может способствовать повышению качества прогнозирования и профилактики повторных тромботических осложнений.

Данные о частотах встречаемости генотипов по генам МТНРЫ, МБ, МПШ, МТНРБ в здоровой популяции могут быть использованы в качестве референтных при изучении предрасположенности к различным заболеваниям.

Апробация материалов диссертации.

Положения диссертационной работы были представлены на Международных Конгрессах по тромбозу и гемостазу: 2007 год — Женева, Швейцария, 2009 год - Бостон, США; Всероссийских научно-практических конференциях "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.), Всероссийской конференции с международным участием "Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2009 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины" (Киров, 2010), Международной конференции "Математическая биология и биоинформатика" (Москва, 2010).

Внедрение результатов исследования в практику.

Полученные результаты используются при обследовании больных с сердечно-сосудистой патологией, находящихся на лечении в КО "Хирургия" ФГУ "РосНИИГТ" ФМБА России, а также направляемых на обследование из других медицинских учреждений города.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 15 рисунками. Библиография включает 232 источника, из них 24 - отечественных и 208 -зарубежных.

выводы

1. Аллельный полиморфизм генов ключевых ферментов метаболизма метионина и фолатов является существенным предиктором уровня ГЦ в плазме крови у больных с атеросклеротическим поражением артерий. Наиболее значимыми генетическими факторами риска развития ГГЦ является носительство аллельных вариантов МТНРР. 677ТТ, МТНИ1 1298АА, МБ 2756АА.

2. Генотипическое сочетание МТИ^ 677ТТ/МТНР11 1298АА/М8 2756АА является наиболее неблагоприятным предиктором развития генетически-обусловленной ГГЦ.

3. Носительство генетических вариантов МТНИ1 677Т, МТНРЯ 1298АА, МБ 2756АА, а также их сочетаний, при наличии ГГЦ приводит к повышенному риску развития ИБС и ААНК. Генотипическое сочетание МТШ1 ббОО/МТНРБ 19580А является самостоятельным фактором риска развития ИБС и ААНК.

4. Между больными ИБС и ААНК отсутствуют статистически значимые различия в распределении генотипов по генам МТНР11, МБ, МТ1Ш, МТНРБ, а также характере их ассоциативных связей с уровнем ГЦ в плазме крови.

5. Курение и артериальная гипертензия являются значимыми факторами, увеличивающими риск развития ГГЦ и атеросклеротического поражения артерий у носителей неблагоприятных аллельных вариантов генов МТНРК и МБ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При обследовании больных с сердечно-сосудистой патологией, обусловленной атеросклеротическим поражением артерий, рекомендуется проведение молекулярно-генетического типирования полиморфных вариантов генов МТОТК С677Т и А1298С, МБ А2756С, МТЫЯ АббО, МТНРЭ С1958А. Полученные результаты будут способствовать выделению пациентов группы высокого риска развития повторных эпизодов тромбоэмболических осложнений, что позволит своевременно определить адекватную патогенетическую терапию.