Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Основные аспекты регуляции лептином и грелином клеток иммунной системы

9 15-3/87

На правах рукописи

Орлова Екатерина Григорьевна

ОСНОВНЫЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск - 2015

Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Ширшев Сергей Викторович

Официальные оппоненты:

Колесникова Наталья Владиславовна - доктор биологических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики факультета повышения квалификации и переподготовки специалистов, профессор

Кудряшова Анна Владимировна - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, лаборатория клинической иммунологии, старший научный сотрудник

Чистякова Гузель Нуховна - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации, научное отделение иммунологии и микробиологии, руководитель

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии наук, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится Ск^А_ 2015 года в^^часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и на сайте www.chelsma.ru.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследовании и степень ее разработанности

Пептидные гормоны - лептин и грелин, являются функциональными антагонистами, регулирующими энергетический гомеостаэ, иммунную и репродуктивную системы (Tena-Sempere М. Interaction between energy homeostasis and reproduction: central effects of leptin and ghrelin on the reproductive axis. Horm. Metab. Res. 2013. V. 45, P. 919-927). Действуя на уровне гипоталамуса, лептин и грелин оппозитно контролируют чувство голода и аппетит, регулируя потребление пищи, метаболизм жировой ткани, энергетический обмен, процессы роста и развития (Tena-Sempere М. Interaction between energy homeostasis and reproduction: central effects of leptin and ghrelin on the reproductive axis. Horm. Metab. Res. 2013. V. 45, P. 919-927). Оба гормона обладают выраженной иммунорегулягорной активностью (Fantuzzi G., Faggioni R. Leptin in the regulation of immunity, inflammation, and hematopoiesis J. Leukoc. Biol. 2000. V. 68, P. 437-446; Dixit V., Schaffer E„ Pyle R. et al. Ghrelin inhibits leptin- and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells. J. Clin. Invest. 2004. V. 1, P. 57-66). Рецепторы к лептину и грелину обнаружены на большинстве клеток иммунной системы (Dixit V., Taub D. Ghrelin and immunity: a young player in an old field. Exp. Gerontol. 2005. V. 40, P. 900910; Dixit V., Yang H., Cooper-Jenkins A. et al. Reduction of T cell-derived ghrelin enhances proinflammatory cytokine expression: implications for age-associated increases in inflammation. Blood. 2009. V. 113, P. 5202-5205; Matarese G„ Carrieri P., La Cava A. et al. Leptin increase in multiple sclerosis associates with reduced number of CD4+CD25+ regulatory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102, P. 5150-5155; Waseem Т., Duxbury M., lto H. et al. Exogenous ghrelin modulates release of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in LPS-stimulated macrophages through distinct signaling pathways. Surgery. 2008. V. 143, P. 334-342). Основные исследования иммуномодулирующих эффектов лептина и грелина проводились на моделях ожирения и воспаления, когда концентрации гормонов значительно превышают физиологические (Faggioni R., Fantuzzi G., Konowal J. et al. IL-1 beta mediates leptin induction during inflammation. Am. J. Physiol. 1998. V. 274, P. 204-208; Dixit V., Mielenz M., Taub D., Parvizi N. Leptin induces growth hormone secretion from peripheral blood mononuclear cells via a protein kinase C- and nitric oxide-dependent mechanism. Endocrinol. 2003. V. 144, P. 5595-5603; Dixit V., Yang H„ Cooper-Jenkins A. et al. Reduction of T cell-derived ghrelin enhances proinflammatory cytokine expression: implications for age-associated increases in inflammation. Blood. 2009. V. 113, P. 52025205). Лептин является провоспапительным гормоном и способствует преобладанию клегочно-опосредованного иммунного отвега (Faggioni R., Fantuzzi G., Fuller J. et al. IL-I beta mediates leptin induction during inflammation. Am. J. Physiol. 1998. V. 274, P. 204-208). Грелин проявляег противовоспалительную активность, оказывая антагонистическое действие по отношению к лептину, блокируя лептин-индуцированные провоспапительные реакции (Dixit V., Schaffer Е., Pyle R. et al. Ghrelin inhibits leptin- and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells. J. Clin. Invest. 2004. V. 1, P. 57-66). Оба гормона способны рецимрокно регулировать экспрессию рецепторов друг друга на клетках-мишенях (Dixit V., Schaffer Е„ Pyle R. et al. Ghrelin inhibits leptin- and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells. J. Clin. Invest. 2004. V. 1, P. 57-66; Komori Г., Doi A., Furuta H. el al. Regulation of ghrelin signaling by a leptin-induced gene, negative regulatory element-binding protein, in the

hypothalamic neurons. J. Biol. Chem. 2010. V. 285, P. 37884-37894). Сочетанное действие лептина и грелина как в клетке, так и на уровне организма приводит к формированию кооперативных эффектов, определяющих энергетический и иммунный гомеостаэ (Komori Т., Doi A., Furuta Н. et al. Regulation of ghrelin signaling by a leptin-induced gene, negative regulatory element-binding protein, in the hypothalamic neurons. J. Biol. Chem. 2010. V. 285, P. 37884-37894; Tena-Sempere M. Interaction between energy homeostasis and reproduction: central effects of leptin and ghrelin on the reproductive axis. Horm. Metab. Res. 2013. V. 45, P. 919-927; Watterson K„ Bestow D„ Gallagher J. et al. Anorexigenic and orexigenic hormone modulation of mammalian target of rapamycin complex 1 activity and the regulation of hypothalamic agouti-related protein mRNA expression. Neurosignals. 2013. V. 21, P. 28-41).

При беременности энергетический обмен, метаболизм жировой ткани и иммунореактивность организма матери претерпевают существенные изменения, а уровень лептина и грелина в периферической крови значительно нарастает, поскольку оба гормона регулируют имплантацию, активно вырабатываются плацентой, контролируют рост и развитие плода (Tena-Sempere М. Interaction between energy homeostasis and reproduction: central effects of leptin and ghrelin on the reproductive axis. Horm. Metab. Res. 2013. V. 45, P. 919-927). Однако механизмы реализации иммунорегуляторных эффектов лептина и грелина в физиологических концентрациях, характерных для беременности, практически не исследованы. Изучение роли лептина и грелина в контроле функциональной активности клеток, обеспечивающих неспецифическую резистентность и адаптивный иммунитет, может существенно расширить представления о гормональной регуляции иммунных реакций в целом, формировании толерантности при беременности, канцерогенезе, причинах репродуктивных дисфункций при нарушениях жирового обмена.

Цель исследования: изучить иммуномодулирующие эффекты лептина и грелина, и их физиологических сочетаний в концентрациях, характерных для беременности, в регуляции основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи исследования

1. Изучить влияние лептина и грелина и их комбинаций на фагоцитарную, окислительную и секреторную активность моноцитов периферической крови.

2. Исследовать эффекты лептина и грелина, и их сочетаний, в регуляции фенотипа NK- и NKT-клеток периферической крови.

3. Оценить роль лептина, грелина, а также их комбинаций в контроле экспрессии активационных маркеров, апоптоза и продукции цитокинов Т-лимфоцитами периферической крови.

4. Изучить влияние лептина, грелина, а также их совместные эффекты на формирование регуляторных субпопуляций CD4 Т-лимфоцитов (Treg, Th 17) периферической крови, а также роль протеинкиназы А и фосфатидилинозитол-3-киназы в реализации эффектов гормонов.

5. Исследовать роль гормонов в регуляции фенотипического созревания, апоптоза и продукции цитокинов тимоцитами.

6. Оценить влияние лептина, грелина и их сочетаний на тимический этап формирования регуляторных клеток (Treg, Th 17, инвариантных NKT-клеток).

Методология и методы исследования

Работа выполнялась на базе лаборатории иммунорегуляции ФГБУН ИЭГМ УрО РАН (заведующий лабораторией - заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Ширшев С.В.) с 2004 по 2014 гг. Работа проводилась в рамках плана НИР «Механизмы гормональной регуляции иммунной системы» № Государственной регистрации - 0120.0 809371.

Все представленные в работе исследования выполнены согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Для решения поставленных задач в качестве объекта исследования использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток, а также разные популяции лимфоцитов, выделенные из периферической крови практически здоровых небеременных женщин-добровольцев репродуктивного возраста (от 19 до 37 лет). В соответствии с поставленной целью, лептин и грелин использовали в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови по триместрам беременности. Для оценки иммуномодулирующих эффектов исследуемых гормонов на функции основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета, выделенные клетки культивировали с гормонами в условиях in vitro. Далее в соответствии с поставленными задачами выполнялся комплекс экспериментальных иммунологических исследований. Контролем служили пробы, куда вместо гормонов вносили физиологический раствор, используемый для растворения гормонов. Для изучения влияния гормонов на тимический этап дифференцировки лимфоцитов использовали тимоциты детей до года, которые выделяли из фрагментов тимуса, полученных в ходе сердечнососудистых операций в соответствии с существующей хирургической практикой.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие ивтора

Высокий уровень достоверности результатов диссертационной работы, а также обоснованность выводов определяется достаточным числом наблюдений, продуманным методическим и методологическим дизайном исследования, использованием современных иммунологических и лабораторных методов, позволяющих решить поставленные задачи, а также адекватных методов статистического анализа при помощи прикладных компьютерных программ «Statistica for Windows 6.0», «Microsoft Excel 2007».

Материалы диссертации представлены и обсуждены на VIII Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкг-Петербург, 2005 г.); Ill конференции иммунологов Урала (г. Уфа, 2006 г.), VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», (г. Пермь - г. Н.Новгород - г. Пермь, 2008 г.); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (г. Пермь, 2010 г.); IX Российской конференции иммунологов Урала, посвященной 90-летию профессора Л.Я. Эберта (г. Челябинск, 2011 г.); I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», (г. Пермь, 2011 г.), V Российской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты» (г. Иваново, 2012 г.); X конференции иммунологов Урала (г. Тюмень, 2012 г.); Объединенном иммунологическом форуме (г. Нижний Новгород, 2013 г.).

Личный вклад соискателя составляет более 80% и состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Планирование научной работы выполнено автором совместно с научным консультантом, заведующим

лабораторией иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН, заслуженным деятелем науки РФ, д.м.н., профессором Ширшевым C.B. Формулировка цели и задан диссертационного исследования, определение общей концепции, разработка дизайна и методологии исследования, анализ и систематизация данных литературы, выполнение комплекса иммунологических исследований проведены лично автором. Часть исследований по изучению функциональной активности моноцитов периферической крови проводилась автором совместно с сотрудниками лаборатории иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН: д.б.н., с.н.с. Замориной С.А.; к.б.н., н.с. Некрасовой И.В., за что автор выражает им искреннюю благодарность. Статистическая обработка и интерпретация полученных данных, написание и оформление рукописи диссертации выполнены лично соискателем. Подготовка публикаций по теме диссертации осуществлялась автором совместно с научным консультантом. Результаты диссертационной работы представлялись в виде докладов на научных конференциях лично соискателем. Автор выражает искреннюю благодарность доценту кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России, к.м.н. Логиновой Н.П. за помощь в организации работы по исследованию тимоцитов.

Положения, выносимые на защиту

1. Самостоятельные эффекты лептина и грелина на функциональную активность моноцитов имеют разнонаправленный характер и зависят от концентрации гормона, активационного статуса клетки, типа фагоцитируемого объекта. Действие гормонов в комбинациях нивелирует индивидуальные угнетающие эффекты гормонов на фагоцитарную активность в отношении бактериальных объектов, спонтанную и стимулированную продукцию активных форм кислорода. Физиологическое сочетание лептина и грелина, соответствующее III триместру беременности, угнетает продукцию окиси азота моноцитами, а во 11-111 триместрах беременности - усиливает индуцированную активность фермента индоламин-2.3-диоксигеназы моноцитов.

2. Эффекты лептина и грелина на NK-клетки, главным образом, однонаправлены и сохраняются при совместном действии гормонов. Основные эффекты проявляются в концентрациях и комбинациях, характерных для II-III триместров беременности, и приводят к увеличению числа NK-клеток с регуляторным фенотипом. Гормоны преимущественно не влияют на экспрессию молекул CD16/CD56 на NKT-клетках.

3. Лептин и грелин разнонаправлено регулируют функциональную активность Т-лимфоцитов периферической крови. Совместное действие лептина и грелина либо нивелирует самостоятельные эффекты гормонов, либо способствует преобладанию действия одного из них. Лептин снижает уровень активированных Th-клеток и апоптоз лимфоцитов. Грелин повышает количество активированных Th-клеток и апоптоз лимфоцитов. Комбинации гормонов не влияют на апоптоз лимфоцитов, но препятствуют апоптозу С04+Т-лимфоцитов периферической крови. Грелин и комбинация лептина с грелином стимулируют синтез интерлейкина-4 Т-лимфоцитами.

4. Лептин и грелин разнонаправлено регулируют формирование адаптивных регуляторных субпопуляций CD4Т-лимфоцитов периферической крови. Лептин усиливает формирование Th!7, но препятствует образованию Treg. Грелин способствует преобладанию Treg, но угнетает поляризацию в Thl7. Реализация регуляторных эффектов лептина и грелина на Th 17/Treg девиацию задействует

протеинкиназу А и фосфатидилинозитол-3-киназу. Комбинации гормонов либо не влияют, либо усиливают образование Treg.

5. Лептин и грелин не влияют на фенотипическое созревание тимоцитов, но стимулируют продукцию интерлейкина-4 тимоцитами. Исследуемые гормоны угнетают кортикостероид-индуцированный апоптоз тимоцитов, препятствуют образованию Treg в тимусе и оказывают разнонаправленные эффекты на формирование Thl7 и инвариантных NKT-клеток. Лептин усиливает, грелин угнетает, а комбинации гормонов не влияют на генерацию Thl7 и инвариантных NKT-клеток в тимусе.

Научная новизна

Впервые показано, что лептин и грелин, а также их физиологические комбинации, отражающие уровень гормонов в периферической крови при беременности, являются значимыми регуляторами функций основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета. На основании детального изучения влияния гормонов на функциональную активность моноцитов впервые показано, что самостоятельные эффекты лептина и грелина разнонаправлены и зависят от концентрации гормона, активационного статуса клетки, типа фагоцитируемого объекта. Гормональные комбинации нивелируют индивидуальное угнетающее действие гормонов на фагоцитарную и окислительную активность моноцитов. Комбинация лептина и грелина, соответствующая I-II триместру беременности, угнетает продукцию окиси азота моноцитами, а 11-111 триместру беременности -усиливает индуцированную активность индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитов. Основные эффекты гормонов на NK-клетки однонаправлены, сохраняются в комбинациях и приводят к увеличению числа NK-клеток с регуляторным фенотипом. Раскрыты новые механизмы гормональной регуляции Т-клеточного звена иммунитета. Лептин и грелин, смещая направленность иммунных реакций по Th2-iMny путем усиления выработки интерлейкина-4, а также регулируя Treg/Thl7 девиацию и апоптоз С04,Т-лимфоцитов, являются значимыми факторами формирования иммунной толерантности. Впервые проанализирована роль фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы А в Thl7/Treg девиации под влиянием гормонов на уровне С04+Т-лимфоцитов периферической крови. Впервые показано, что гормоны не влияют на фенотипическое созревание тимоцитов, но контролируют формирование регуляторных клеток в тимусе и угнетают стимулированный апоптоз тимоцитов. Исследуемые гормоны стимулируют продукцию ингерлейкина-4 и экспрессию рецептора к интерлейкину-7 натимоцитах.

Теоретическая и практическая значимость работы

В теоретическом плане работа расширяет существующие представления о гормональном контроле функций основных клегок врожденного и адаптивного иммунитета. Показано, что совместное действие гормонов в физиологических концентрациях, характерных для беременности, либо нивелирует самостоятельные эффекты лептина и грелина, либо способствует преобладанию действия одного из них. Полученные данные о самостоятельных и совместных иммунорегуляторных эффектах лептина и грелина объясняют роль гормонов в перестройке иммунных реакций в аспекте беременности, а также актуальны для анализа причин репродуктивных дисфункций при нарушениях жирового и энергетичекого обмена. Определены механизмы участия лептина и грелина в регуляции функций клеток врожденного и адаптивного иммунитета, ассоциированных с формированием иммунной толерантности. Проанализировано участие гормонов в формировании

регуляторных клеток в тимусе и на периферии, имеющих ключевое значение при беременности, аутоиммунных патологиях, онкологических заболеваниях. Выявленные закономерности гормональной регуляции тимического развития лимфоцитов предполагают новый взгляд на процессы, сопровождающие физиологическую инволюцию тимуса. Изученные молекулярные механизмы реализации эффектов лептина и грелина, и их комбинаций открывают новые возможности для фармакологического манипулирования направленности дифференцировки клеток, а также прогнозирования действия других гормонов с учетом их рецепции и внутриклеточной сигнализации. В практическом плане полученные данные по механизмам действия лептина и грелина следует учитывать при клиническом использовании гормонов. Работа открывает новые перспективы для исследований в области нейроэндокринной регуляции иммунитета, а также применения лептина и грелина в качестве иммуномодуляторов.

Внедрение результатов исследования в практику. Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермского государственного национального исследовательского университета» в программе спецкурсов «Общая эндокринология» и «Иммунология репродукции», а также на кафедре нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России в программе курса «Нормальной физиологии».

Конкурсная поддержка. Работа поддержана грантом Фонда содействия отечественной науке «Выдающиеся ученые. Кандидаты и доктора наук» (2008-2009 гг.); именной стипендией Пермского края I категории (2008 г.); грантом РФФИ 1104-01109 «Роль лептина и грелина в контроле функциональной активности ИЛ 17-продуцирующих и Т-регуляторных лимфоцитов»; грантом РФФИ 11-04-96015-р-урал-а «Изучение гормональной регуляции тимического этапа дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов»; грантом РФФИ 13-04-00571 «Роль лептина и грелина в контроле созревания и функций дендритных клеток и их участия в индукции регуляторных Т-лимфоцитов в период физиологически протекающей беременности». Часть исследований выполнена в рамках программ президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Изучение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия гормонов репродукции» (2009-2011 гг.) и «Клеточные и молекулярные механизмы гормонального контроля функциональной активности иммунной системы в период гестации» (2012-2015 гг.).

Публикации. Соискатель имеет более 90 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 44 научные работы общим объемом 7 печатных листов, в том числе 28 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень Российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, 12 работ в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов, 4 статьи в вузовских сборниках.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 261 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных сокращений и библиографического указателя, включающего 338 источников, в том числе 44 отечественных, 294 зарубежных. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 60 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Дизайн исследования. Все исследования выполнялись согласно Хельсинской Декларации BMA 2000 г. и протоколу Конвенции Совега Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. В качестве объектов исследования использовались мононуклеарные клетки (МПК), которые выделяли из гепаринизированной периферической крови практически здоровых небеременных женщин-добровольцев репродуктивного возраста (от 19 до 37 лет). Критериями отбора доноров являлись: отсутствие хронических, аутоиммунных, аллергических заболеваний, отсутствие приема гормональных, иммуномодулирующих и анаболических препаратов, отсутствие диеты (по данным словесного опроса), индекс массы тела (ИМТ) менее 25 (нормостеники), наличие информированного согласия донора на использование биологического материала в научных целях. ИМТ рассчитывали по формуле "ИМТ = масса тела, кг рост2, м". Забор крови осуществлялся в утренние часы в фолликулярную фазу менструального цикла (2-8 день), поскольку известно, что прогестерон, эффекты которого превалируют в лютеиновую фазу цикла, модулирует экспрессию рецепторов лептина (Koshiba H., Kitawaki J., Ishihara H. Progesterone inhibition of functional leptin receptor mRNA expression in human endometrium. Mol. Hum. Reprod. 2001. V. 7, P. 567-572) и грелина (Tawadros N., Salamonsen L., Dimitriadis E., Chen C. Facilitation of decidualization by locally produced ghrelin in the human endometrium. Mol. Human Reprod. 2007. V. 13, P. 483-489). МПК выделяли из периферической крови центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) («Sigma», США; «Спофа», Чехия, соответственно). Далее использовали либо суспензию МГ1К, либо обогащенную популяцию моноцитов, полученную из МПК путем адгезии на чашках Петри (Эккерт Р. Иммунологические методы. Под ред. I". Фримеля. М.: Медицина, 1987. С. 226-254), либо целевые субпопуляции лимфоцитов (СТМ'Т-клетки; CD4XD25 'Т-клетки), выделенные методом иммуномагнитной сепарации. Для исследования тимического этапа дифференцировки клеток использовали тимоциты, которые получали из фрагментов тимуса детей до года, удаляемых в ходе сердечно-сосудистых операций, в соответствии с существующей хирургической практикой. Жизнеспособность фракционированных клеток оценивалась в тесте с эозином и составляла 95-98%. Чистота выделения контролировалась методом проточной цитометрии с помощью соответст вующих моноклональных антител и составляла 78-85%.

Гормоны. Леитин («Sigma», США) в культуры вносили в концентрациях 10 и 35 иг/мл, отражающих его содержание в периферической крови в I и во II-III триместрах беременности соответственно (Hardie L., Trayhurn P. Circulating leptin in women: longitudinal study in menstrual cycle and during pregnancy. Clin. Endocrinol. 1997. V. 47, P. 101-106). Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1,25 и 0,83 нг/mji, сопоставимых с уровнем гормона в периферической крови в I-II и III триместрах беременности (Fuglsang J., Skjaerbaek, Espelund IJ„ Frystyk J. Ghrelin and its relationship to growth hormones during normal pregnancy. Clin. Endocrinol. 2005. V. 62, P. 554-559). При исследовании совместных эффектов гормоны в культуры вносили одномоментно в сочетаниях, соответствующих их содержанию в периферической крови в 1-11 (лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл) и во 11-111 (леитин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл) триместрах беременности. В контрольные пробы вместо гормона добавляли физиологический раствор, используемый для

растворения гормонов. Ряд показателей оценивали только в пробах с теми концентрациями гормонов, которые оказывали наиболее значимые эффекты.

Фагоцитарную активность моноцитов тестировали методом, регистрирующим снижение биолюминесценции бактерий Е. coli lux+ при поглощении их фагоцитами. Метод разработан в лаборатории иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН (ШиршевС.В.. Куклина Е.М., Заморина С.А. и др. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Патент РФ № 2292553. 2007 г.). Суспензию бактерий (180 мкл, 5х106кл/мл) вносили в лунки 96-луночного планшета для люминоскана, инкубировали 3-5 мин при 37°С и снимали фоновое свечение, затем вносили суспензию моноцитов (соотношение клетка/бактерия равно 1/10) и измеряли степень гашения биолюминесценции при поглощение Е. coli lux фагоцитами в течение 30 мин (рисунок 1). Рассчитывали индекс фагоцитарной активности клеток (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции по сравнению с исходным уровнем по формуле: ИФА=((Х1-Х2)/Х|)* 100, где xi -интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), хг -интенсивность биолюминесценции опытной пробы (бактерии + фагоциты). Биолюминесценцию оценивали на люминоскане «Accent» (Финляндия) в относительных световых единицах (RLU).

Рисунок 1 - Динамика интенсивности биолюминесценции, оцениваемая по поглощению бактерий Е. coli lux (а), и ИФА (б) моноцитов. Примечание: по оси абсцисс время инкубации моноцитов с Е. coli liix , мин

Окислительную активность моноцитов определяли по продукции активных форм кислорода (АФК) в реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) (Dahigrcn С., Stendahl О. Myeloperoxidase modulates the phagocytic activity of polymorphonuclear neutrophil leukocytcs. Studies with cells from a myeloperoxidase deficient patient. J. Clin. Invest. 1984. V. 73, P. 366-373). В лунки 96-луночного плоскодонного планшета для люминоскана вносили 180 мкл бесцветного раствора Хенкса («Биолот», Россия) с люминолом (5хН)"4 М), инкубировали 3-5 мин ири 37°С и фиксировали фоновое свечение. Затем вносили 20 мкл клеточной суспензии (5x106 кл/мл) и оценивали спонтанную ЛЗХЛ. Потом добавляли 20 мкл суспензии бактерии E.coli К12 и измеряли в динамике интенсивность стимулированной ЛЗХЛ на люминоскане «Accent» (Финляндия). Результаты выражали в RLU.

Продукции NO моноцитами оценивали спектрофотометрически по уровню ЫОг в супернатантах клеточных культур в микроварианте метода с использованием

реактива Грисса (TUmer С., Bilgin Н„ Obay В. et al. Effect of ghrelin administration on phagocytic activity in acute cold-restraint stress exposed rats. Regul. Pept. 2007. V. 2-3, P. 113-117).

Активность иидоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) моноцитов определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина. Для стимуляции использовали липополисахарид (ЛПС) (100 нг/мл) («Sigma», США) (Braun D., Longman R., Albert M. A two-step induction of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) activity during dendritic-cell maturation. Blood. 2005. V. 106, P. 2375-2381).

Фенотип лимфоцитов и тимоцитов оценивали методом проточной цитометрии. Суспензию MI1K (1хЮ6 кл/мл) инкубировали в полной питательной среде (ППС) с гормонами 24 ч при 37°С в условиях 5% СОг. Определяли следующие субпопуляции лимфоцитов: активированные Т-лимфоциты-хелперы (Th) (CD3+CD4+CD25dim), активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) (CD3+CD8+CD25+); Th-клегки, экспрессируюшие CD95 (CD3+CD4+CD95+) и ЦТЛ, экспрессирующие CD95 (CD3+CD8+CD95+); натуральные киллеры (NK-клетки) (CD3"CD16+CD56+) и Т-клетки с функциями натуральных киллеров (NKT-клеток) (CD3+CD16+CD56+). Количество Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) оценивали по экспрессии транскрипционного фактора FOXP3 в гейте С1>ГТ-лимфоцитов, либо СП4'Си25Ьг1вЬЧ'-лимфоцитон. На Treg изучали экспрессию иммуносупрессорных молекул: CTLA-4 (ассоциированный с цитотоксическими лимфоцитами антиген 4), GITR (индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухоли), GARP (рецептор для латентного трансформирующего фактора роста-pi (TGF-pi). Число интерлейкин (IL)-17-нродуцирующих Th (Thl7) оценивали как процент клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор RORyt и IL-I7A в гейте С04+Т-клеток. На Thl7 оценивали экспрессию р-хемокинового рецептора 6 типа (CCR6). Для исследования регуляции гормонами функциональной активности NK-клеток определяли присутствие на них CCR7, L-селектина и степень экспрессии CD56. В этой серии экспериментов NK-клетки идентифицировали по наличию специфического маркера NKp46+, экспрессирующегося только на NK-клетках (Tomasello Е„ Yessaad N., Gregoire Е. et al. Mapping of NKp46+ Cells in Healthy Human Lymphoid and Non-Lymphoid Tissues. Front. Immunol. 2012. V. 3, P. 344-358). Фенотипическое созревание тимоцитов оценивали по изменению коэкспрессии молекул CD4/CD8. Па С04+тимоцитах определяли экспрессию рецептора к IL-7 (CD 127). Количество инвариантных (i)NKT-KieTOK в тимусе оценивали как процент Уа24.1а18-позитивных клеток в гейте СОЗ+тимоцитов.

Апоптоз лимфоцитов и тимоцитов фиксировали путем окрашивания апнексином-V (AnV) и йодистым пропидием (PI) коммерческим набором Annexin V - FITC Kit (IMMUNOTECH, Франция). Для индукции апоптоза лимфоцитов использовали анти-СОЗ моноклинальные антитела (5 мкг/мл, «Медбиоспектр», Россия), которые вносили в культуры вместе с гормонами (Bijl М., Horst G„ Limburg P., Kallenberg С. Anti-CD3-induced and anti-Fas-induced apoptosis in systemic lupus erythematosus (SLE). Clin. Exp. Immunol. 2001. V. 123, P. 127-132). Для индукции апоптоза тимоцитов в культуры перед гормонами добавляли дсксаметазоп (10"6 М, «KRKA», Словения) (Lupine S., l.akatos В., Courageot М. et al. Sphingosine contributes to glucocorticoid-nduced apoptosis of thymocytes independently of the mitochondrial pathway. J. Immunol. 2004. V. 173, P. 3783-3790). Контролем служили пробы, в которые вносили только индуктор апоптоза.

Внутриклеточный синтез цитокинов лимфоцитами исследовали методом проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител к поверхностным (CD4, CD8) и внутриклеточным молекулам (IFN-y, IL-4, IL-I7A). Для активации внутриклеточного синтеза цитокинов в культуры клеток добавляли форболмиристатацетат и иономицин, а также блокаторы внутриклеточного транспорта - брефелдин А и моненсин (Cell Stimulation Cockteil, «eBioscience»), в соответствии с методикой производителя.

Продукцию цитокинов в супернатантах клеточных культур (моноцитов, лимфоцитов, тимоцитов) определяли методом иммуноферментного анализа коммерческими наборами согласно инструкции производителя («ВекторБест», Россия; «Цитокин», Россия; «eBioscience», США).

Индукцию формирования адаптивных (a)Treg оценивали в культурах CD4+T-лимфоцитов и тимоцитов, которые инкубировали в ППС с добавлением с TGF-ßl (5 нг/мл, «GIBCO»), Для инициации формирования (а)ТН17 в культуры С04+Т-лимфоцитов и тимоцитов вносили IL-lß (10 нг/мл, «eBioscience») и 1L-6 (10 нг/мл. «eBioscience»), Формирование ÍNKT индуцировали внесением IL-2 (100 U/мл, "eBioscience") в культуры тимоцитов. Далее клетки инкубировали с гормонами 72 ч при 37°С в условиях 5% СОг. Во все пробы вносили магнитные частицы с анти-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabcads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen»), а также нейтрализующие анти-IFNy и анти-1Ь-4 моноклональные антитела (10 мкг/мл, «eBioscience»). Затем снимали супернатанты, удаляли магнитные частицы и оценивали фенотип методом проточной цитометрии. Жизнеспособность клеток после 72 ч инкубации с гормонами составляла 92-95%.

Поскольку девиация ThI7/Treg определяется, главным образом, конкурентной активацией транскрипционных факторов RORyt или FOXP3, где ведущая роль принадлежит протеинкиназа А (РКА)-зависимым механизмам и фосфатидилинозитол-3-киназа (Р13К)-зависимому сигнальному пути, исследовали эффекты гормонов на фоне внесения Н-89 (ингибитор РКА, 1 мкг/мл, R&D, Великобритания) (Tesmer J.J., Dessauer C.W., Sunahara R.K. et al. Molecular basis for P-site inhibition of adenylyl cyclase. Biochemistry. 2000. V. 39, P. 14464-14471) и вортманнина (W) (ингибитор PI3K, 100 пМ, R&D, Великобритания) (Davies S.P., Reddy I I., Caivano M., Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. J. Biochem. 2000. V. 351, P. 95-105). Ингибиторы добавляли за 1 ч до гормонов в концентрациях, которые наиболее эффективно по данным литературы блокируют специфические сигнальные пути и сигнальные молекулы. Контролем служили пробы только с ингибиторами.

Статистический анализ. Данные обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Результаты во всех таблицах и рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±т). Нормальность распределения данных контролировалась критерием Фишера (F). Достоверность различий между группами оценивали по /-критерию Стьюдента для непарных и парных данных. Различия считались значимыми при р<0,05. Для преодоления проблемы множественных сравнений применяли поправку Бонферрони. В ряде случаев использовали корреляцию Пирсона (г) и Спирмена (R). Сортировку и обработку данных проводили на компьютере IBM PC с использованием программного обеспечения Microsoft Office при помощи прикладных компьютерных программ «Statistics for Windows 6.0», «Microsoft Excel 2007».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярные и клеточные механизмы иммуиомодулирующей активности лептина и грелииа в регуляции функций клеток врожденного иммунитета

Роль лептина и грелина в регуляции фагоцитарной, окислительной функций моноцитов и активности IDO. Установлено, что лептин в концентрации, характерной для I триместра беременности, снижает фагоцитарную активность и стимулированную J13XJT моноцитов в отношении Е. coli в динамике исследования (таблица I), а в концентрации второй половины беременности (11-111 триместр), лептин оказывает более глубокое угнетающее действие, снижая фагоцитарную активность, спонтанную и стимулированную J13XJ1 моноцитов в отношении бактериальных объектов.

Таблица 1 - Модуляция лептином моноцитов в отношении Е. coli (п=8)

фагоцитарной активности и J13XJ1

Экспериментальное воздействие

Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл

Контроль1 Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл

Исходный уровень 53,72±5,54 35,26-1-4,30* 33.88+2,56* Спонтанная ЛЗХЛ, RLU

ИФА моноцитов, % 10 мин 20 мин

58,08±5,46 ~ 70,71*4.06

38,87±4,58* 35,04±4,83*

69,00±5,38 54,65±4,29*

30 мин

84.45±2,09 83.08-ti.67 79,15±1,58*

Стимулированная ЛЗХЛ, RLIJ

0,008±0,001 0,028±0,003 0,039±0,005 0,027±0,003 0,008±0,001 0,018±0,002А : 0,029±0,004 0,024±0,002л 0,006±0,001л 1 0,017±0,004/ч ' 0,026±0,004А 0,014±0,004л

Примечание: п - здесь и во всех рисунках и таблицах количество проведенных исследований; * - различия статистически значимы (р<0,05) по парному /-критерию Стьюдента по отношению к контролю; А - по парному /-критерию Стьюдента по отношению к контролю1 _________________________ ___

Грелин в концентрациях, характерных для беременности, снижает поглотительную активность моноцитов в отношении Е. coli, но не влияет на стимулированную этими бактериями ЛЗХЛ и спонтанную ЛЗХЛ моноцитов (таблица 2).

Действуя совместно, лептин и грелин в физиологических комбинациях, характерных для беременности, не влияют на фагоцитарную активность (рисунок 2а), стимулированную (рисунок 26) и спонтанную ЛЗХЛ моноцитов (рисунок 3). Таким образом, совместное действие гормонов в комбинациях, как первой, так и второй половины беременности отменяег самостоятельные угнетающие эффекты лептина и грелина на фагоцитарную активность в отношении бакгериальных объектов и продукцию АФК моноцитами, что, по-видимому, в контексте беременности способствует сохранению иммунореактивности организма матери.

Таблица 2 - Модуляция грелином фагоцитарной активности и ЛЗХЛ моноцитов в отношении Е. coli (п=8)_______ _______________

Экспериментальное воздействие ИФА моноцитов, %

Исходный уровень 10 мин 20 мин 30 мин

Контроль 53,72±5,54 58,08±5,46 70,71 ±4,06 84,45±2,09

Грелин, 1,25 нг/мл 48,19±4,13 40,72±5,53* 44.64*4.78* 78,41± 1,45*

Грелин, 0,83 нг/мл 34,93±4,69* 40,39±5,89* 49,06±4,46* 83,24±1,39

Спонтанный ЛЗХЛ, RLU Стимулированный ЛЗХЛ, RLU

Контроль1 0,008±0,001 0,028±0,003 0,039±0,005 0,027±0,003

Грелин, 1,25 нг/мл 0,008±0,001 0,020±0,004 0,037±0,004 0.023±0,004

Грелин, 0,83 нг/мл 0.007.0.002 0,023±0,003 0,050±0,006 0.036.0.007

Примечание: * - различия статистически значимы [р<0,05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

ифа, %

Рисунок 2 - Совместные эффекты лептина и грелина в регуляции фагоцитарной активности (а) и стимулированной ЛЗХЛ моноцитов (б) в отношении Е. coli (п=8). Примечание: но оси абсцисс - время, мин; контроль сплошная линия с маркером -ромбом; пунктирная линия с маркером-квалратом комбинация лептина и грелина первой половины беременности (лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл); пунктирная линия с маркером-треугольником комбинация лептина и грелина второй половины беременности (лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл); * - различия статистически значимы (/К0,05) по парному f-критерию Стьюдента по отношению к контролю

При изучении влияния лептина в концентрациях, характерных для беременности, на синтез NO моноцитами модулирующих эффектов не выявлено (контроль 6.89±0,57 мкМ; лептин, 10 нг/мл 7,27±0,44 мкМ, р>0,05; лептин, 35 нг/мл 6,32±0,34 мкМ, р>0,05). Г релин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает, а в концентрации III триместра не влияет на секрецию N0 моноцитами (контроль 6,89±0,57 мкМ; грелин, 1,25 нг/мл 5,50±0,37 мкМ, р<0,05; грелин, 0,83 нг/мл 6,56±0,82 мкМ, р>0,05). При совместном внесении гормоны в сочетании I-II триместров беременности снижают продукцию N0 моноцитами (рисунок 36), но в комбинации II-III триместров беременности не

влияют на этот показатель. Таким образом, можно полагать, что при совместном действии гормонов в комбинации первой половины беременности доминируют угнетающие эффекты грел и на в регуляции выработки N0 моноцитами.

RLU

мкМ

0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000

8,0

4,0

2,0

0,0

контроль

Л1+Г1

Л2+Г2

+

т

контроль

Л1+Г1

Л2+Г2

Рисунок 3 - Совместные эффекты лептина и грелина в модуляции спонтанной ЛЗХЛ (а) и продукции NO (б) моноцитами in vitro (п=8). Примечание: по оси абсцисс -экспериментальное воздействие: Л1+Г1 - комбинация лептина и грелина первой половины беременности (лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл); Л2+Г2 - комбинация лептина и грелина второй половины беременности (лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл); * - различия статистически значимы (р<0,05) по парному /-критерию Стьюдента по отношению к контролю

При изучении модуляции гормонами активности IDO моноцитов установлено, что лептин в концентрации, характерной для 11-111 триместров беременности, усиливает, а грелин в исследуемых концентрациях не влияет на ЛПС-индуцированную активность IDO моноцитов (таблица 3). При совместном внесении лептина и грелина в концентрациях, характерных для второй половины беременности, выявлено увеличение ЛПС-индуцированной активности IDO моноцитов.

Таблица 3 - Влияние лептина и грелина на активность IDO моноцитов периферической крови при стимуляции Л ПС« viíro (п=7) _______________

Экспериментальное воздействие Концентрация кинуренина, мкМ

Контроль 2,23±0,55

Лептин, 10 нг/мл 3,05±0,79

Лептин, 35 нг/мл 6,83+2.24*

Грелин, 1,25 нг/мл 4,81 ±1,64

Грелин, 0,83 нг/мл 4,19±1,64

Лептин 10 нг/мл + Грелин 1,25 нг/мл 4,62±1,38

Лептин 35 нг/мл + Грелин 0,83 нг/мл 6,05±1,41*

Примечание: * - различия статистически значимы (/?<0,05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

Таким образом, лептин в концентрации, сопоставимой с его уровнем во второй половине беременности, является значимым регулятором активности ШО моноцитов, и. по-видимому, его эффекты доминируют при совместном внесении гормонов в комбинации, характерной для второй половины беременности.

Поскольку активирующий эффект лептина проявляется только совместно с ЛПС, можно предположить, что гормон усиливает, в основном, NF-кВ-эависимый (ядерный фактор кВ) путь активации IDO (Puccetti P., Grohmann U. IDO and regulatory Т cells: a role for reverse signalling and non-canonical NF-kappaB activation. Nat. Rev. Immunol. 2007. V. 7, P. 817-823), который конкурирует с сигналом грелина.

В целом, лептин и грелин в концентрациях, характерных для беременности, разнонаправлено регулирует функциональную активность моноцитов. Совместное действие гормонов нивелирует их самостоятельные угнетающие эффекты на фагоцитарную активность и продукцию АФК моноцитами в отношении бактериальных объектов, что в контексте беременности значимо для сохранения противомикробной резистентности организма матери. Угнетение выработки N0 моноцитами под действием гормональной комбинации первой половины беременности можно рассматривать как фетопротективный фактор, поскольку усиление продукции N0 стимулирует синтез провоспалительных цитокинов и Thl-иммунный ответ (McCord N.. Ayuk P., McMahon M. et al. System y+ arginine transport and NO production in peripheral blood mononuclear cells in pregnancy and preeclampsia. Hypertension. 2006. V. 47, P. 109-115). Тогда как активация гормонами IDO моноцитов в комбинации второй половины беременности способствует формированию иммунной толерантности (Miwa N., Hayakawa S., Miyazaki S. et al. IDO expression on decidual and peripheral blood dendritic cells and monocytes/macrophages after treatment with CTLA-4 or interferon-gamma increase in normal pregnancy but decrease in spontaneous abortion. Mol. Hum. Reprod. 2005. V. 11, P. 865-870). Таким образом, лептин и грелин в исследуемых концентрациях и комбинациях, действуя на моноциты, регулируют их функциональную активность и неспецифические иммунные реакции, что в контексте беременности способствует сохранению иммунорезистентности организма матери и формированию иммунной толерантности.

Роль лептина и грелина в регуляции фенотипа NK- и NKT-клеток периферической крови. Известно, что NIC-клетки конститутивно экспрессируют CD56, а присутствие CD 16 варьирует в зависимости от зрелости и функциональной активности и определяет их цитотоксичность. Лептин в концентрации I триместра повышает количество С056ЧЧК-клеток, экспрессирующих CD16\ что коррелирует с увеличением продукции IFN-a мононуклеарными фагоцитами под влиянием лептина (R=0,76; р<0,05). Тогда как в концентрации 11-111 триместра беременности лептин, напротив, снижает количество CD 16+CD56 'NIC-клеток (рисунок 4). Рассуждая о механизмах реализации разнонаправленных эффектов лептина, можно полагать, что гормон действует как непосредственно, связываясь с рецепторами лептина (Ob-R) на NK-клетках, так и опосредовано, активируя продукцию IFN-a мононуклеарными фагоцитами, выполняющего функцию костимулятора (Tian Z., Sun R., Wei H., Gao В. Impaired natural killer (NIC) cell activity in leptin receptor deficient mice: leptin as a critical regulator in NIC cell development and activation. Biochcm. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 298, P. 297-302). Тогда как во II-III триместрах беременности действие лептина направлено в большей степени на усиление экспрессии CD56, что подтверждается повышением количества СП>56Ьг,в1,гМК-клеток (рисунок 4). Подобная конверсия CD56'CD16+NK в CD56bngh'CDI6"NK-KJieTKH периферической крови отмечена и другими авторами при культивировании in vitro выделенных из периферической крови CD56+CD16+NK либо с TGF-pi, либо с клетками децидуальной стромы (Keskin D., Allan D., Rybalov

В. et al. TGFbeta promotes conversion of CD 16' peripheral blood NK cells into CD16 NK cells with similarities to decidual NK cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104, P. 3378-3383). Этими же авторами показано, что и другие продукты стромальных децидуальных клеток способны индуцировать подобную конверсию, причем механизмы зависят от совокупности действующих факторов. Можно полагать, что лептин, также синтезируемый плацентой при беременности, задействует подобные механизмы.

Грелин в исследуемых концентрациях не влияет на количество CD16+CD56+NK-icneTOK, но повышает число CD56bnBhtNK-iaieTOK (рисунок 4). При совместном внесении лептина и грелииа в комбинации 1-11 триместров беременности модулирующих эффектов не выявлено, тогда как в сочетании, характерном для II-III триместра, гормоны повышают содержание CD16+CD56+NK и увеличивают количество CD56brlghrNK-wieTOK (рисунок 4). Таким образом, можно полагать, что исследуемые гормоны и их физиологические комбинации, характерные для беременности, способны регулировать уровень экспрессии CD16 и CD56 на NK-клетках, модулируя их цитотоксический и регуляторный потенциал. Важно отметить, что приобретение фенотипа CD16"/('°w)CD56brlBb,NK-KjieTKaMH периферической крови ассоциировано со снижением их цитолитической активности и усилением способности к секреции цитокинов (Cooper М„ Fehinger Т., Turner S. et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset. Blood. 2001. V. 97, P. 46-51), в связи с их последующей миграцией в матку для формирования маточного пула CD16"/(iow,CD56br'ehrNK-KJieTOK, непосредственно участвующих в имплантации, ангиогенезе и поддержании беременности (Saito S., Nakashima A., Myojo-Higuma S., Shiozaki A. The balance between cytotoxic NK cells and regulatory NK cells in human pregnancy. J. Reprod. Immunol. 2008. V. 7, P. 14-22).

Рисунок 4 - Влияние гормонов на экспрессию CD 16 на CD3'CD56+NK-icneTKax (а) И степень экспрессии CD56 на NKp46'NK-KJieTKax (б) in vitro (П = 12). Примечание-

светлые столбики - процент CD3CD16 CD56 NK-клеток; темные столбики - процент CD56b""'"NKp46 NK; по оси абсцисс - экспериментальное воздействие: К - контроль; Л1 лептин. 10 hi/мл; J12 - лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 - лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл; Л2+Г2 - лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл; П грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; * различия статистически значимы (/КО,05) по парному (-критерию Стьюдента по отношению к контролю, А по парному /-критерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением того же гормона (комбинации гормонов) в концентрации первой половины беременности

На следующем этапе оценивали влияние гормонов на экспрессию мембранных молекул, влияющих на хоминг NK-клеток. По данным литературы, высокий уровень экспрессии молекул CCR7 на С1)56Ьпв',гЫК-клетках ассоциирован с их миграцией к лимфатическим узлам (Mailliard R., Alber S„ Shen H. et al. IE-18-induced CD83+CCR7+ NK helper cells. J. Exp. Med. 2005. V. 202, P. 941-953), a L-еелектин

определяет их миграцию в плаценту (Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat. Rev. Immunol. 2002. V. 2, P. 656-663). Установлено, что лептин и грелин в концентрациях П-Ш триместра беременности, действуя как самостоятельно, так и совместно, угнетают экспрессию CCR7 на NK-клетках, но усиливают экспрессию L-селектина на CD56bnBbtNK-icneTKax. Лишь грелин, действуя самостоятельно, не оказывает эффектов на экспрессию L-селектина на CD56bnghtNK-клетках (таблица 4). По данным литературы, снижение экспрессии CCR7 на CD56br'BbtNK-icieTKax ассоциировано с усилением их цитолитической активности (Hong Н., Ahmad F., Eberhard J. Loss of CCR7 expression on CD56bright NK cells is associated with a CD56dimCD16+ NK cell-like phenotype and correlates with HIV viral load. PLoS One. 2012. V. 7, P. e44820). Таким образом, можно полагать, что исследуемые гормоны, угнетая экспрессию CCR7, способствуют сохранению цитолитического потенциала NK-клеток, а усиление экспрессии L-селектина на CD56br'BhINK-ioieTKax во второй половине беременности объясняет роль гормонов в конверсии фенотипа NK-клеток периферической крови для их миграции в децидуальную оболочку.

Таблица 4 - Влияние гормонов на экспрессию CCR7 на NKp46+>JK-tuieTKax и L-селсктина на CD56bn>!hrNKp46HNK-MCTKax in vitro (п=7) ______

Экспериментальное воздействие CCR7', % С056ьпеьТ-селекти11+,%

Контроль 0,81 ±0,10 1,26±0,13

Лептин, 10 нг/мл 0,73±0,19 2,88±0,89

Лептин, 35 нг/мл 0,53±0,06* 2,10±0,32*

Грелин, 1,25 нг/мл 0,81 ±0,20 2,74±0,89

Грелин, 0,83 нг/мл 0,49±0,08* 2,18±1,01

Лептин,35 нг/мл+Грелин 0,83 нг/мл 0,41±0,06* 2,40±0,25*

Примечание:* - различия статистически значимы {р~ 0.05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

Несмотря на малочисленность NKT-клеток в периферической крови, они играют важную роль в иммунорегуляции, поскольку при активации способны быстро секретировать большие количества как IFN-y, так и IL-4, определяя Thl/Th2 девиацию, направленность развития иммунного ответа и формирование периферической толерантности (Bendelac A., Savage Р.В., Teyton L. The biology of NKT cells. Ann. Rev. Immunol. 2007. V. 25, P. 297-336). Поэтому важно было оценить роль гормонов в регуляции фенотипа NKT-клеток по экспрессии CD16 и CD56 на С034лимфоцитах. Установлено, что лептин в концентрации I триместра беременности не влияет, а в концентрации, сопоставимой с его уровнем во II-III триместре, увеличивает процент CD3 'лимфоцитов, экспрессирующих CD 16 и CD56 (рисунок 5). Грелин, а также исследуемые комбинации гормонов не оказывают значимых эффектов на содержание CDI6+CD56+NKT-iciieTOK. Увеличение числа CD 16 CD56'NKT-клеток под действием лептина в поздние сроки гестации можно рассматривать как индукцию гормоном созревания NKT-клеток, поскольку формирование такого фенотипа является терминальной стадией акгивации NKT-клеток и ассоциировано с приобретением наибольшей цитотоксичности (Ou D., Metzger D.L., Wang X. et al. Beta-cell antigen-specific CD56+ NKT cells from type I diabetic patients: autoaggressive effector T cells damage human CD56+ beta cells by HLA-restricted and non-HLA-restricted pathways. Hum. Immunol. 2002. V. 63, P. 256270), что подтверждает провоспалительную направленность эффектов лептина.

Выявленная положительная корреляция между увеличением С1)16ТС1356'>ЖТ-клеток под действием лептина и повышением концентрации ГЫ-цигокинов 1Ы1'-<х (Я=0,857; р<0,05) и Н-ТМ-а (К=0,96; р<0,05), продуцируемых МПК, свидетельствует о возможной реализации эффектов лептина на МКТ-клетки путем индукции синтеза вышеупомянутых цитокинов.

С03+СШб+С056ТЖТ. %

Л1

Л2

Г1

Г2

Л1+Г1

Л2+Г2

Рисунок 5 - Влияние лептина, грелина и их комбинаций на количество CD3+CD16+CD56+NKT-KnerOK периферической крови in vitro (П=12). Примечание по оси ординат - процент CD3 CD16 CD56 NKT-клеток; по оси абсцисс - экспериментальное воздействие: К -контроль; Л| - лептин, 10 нг/мл; Л2 - лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 - лептин, 10 нг/мл ' грелин, 1,25 нг/мл; Л2+Г2 - лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл; Г1 - грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; * - различия статистически значимы (/»<0,05) по парному /-критерию Стьюдента по отношению к контролю

В целом, гормоны в исследуемых концентрациях принимают активное участие в контроле экспрессии мембранных молекул 1МК- и МКТ-клетками, что ассоциировано с регуляцией их функциональной активности. Действуя как самостоятельно, так и совместно, гормоны однонаправлено регулируют функции МК-клеток. Основные модулирующие эффекты гормоны оказывают во второй половине беременности. Гак в 1 триместре беременности лишь лептин повышает количество СП 16+СП56'МК-клеток, что, учитывая их функциональную гетерогенность, важно как для защиты матери и плода от микробной атаки, так и для увеличения пула СО 16+С056'МК-клеток периферической крови в связи с последующей их миграцией в децидуальную оболочку. Во второй половине беременности гормоны, действуя как самостоятельно, так и совместно, в исследуемых комбинациях повышают количество С056Ьп8|"МК-клеток, экспрессию на них Ь-селектина, но снижают присутствие хемокинового рецептора ССК7 наЫК-клегках. Гормоны, действуя совместно, не влияют на количество С03+С016+С056+МКТ-клеток периферической крови. Можно заключить, что при беременности совместное действие гормонов способствует формированию регуляторного фенотипа ЫК-клегок для их миграции в эндометрий, что определяет их фетотрофическое влияние. Таким образом, исследуемые гормоны эффективно регулируют функции основных клеток врожденного иммунитета. Несмотря на самостоятельные разнонаправленные эффекты лептина и грелина на изученные функции моноцитов. !МК- и ЫЮ'-клеток, можно полагать, что при физиологически протекающей беременности совместное действие гормонов формирует условия для поддержания резистентности организма матери и успешной имплантации в первой половине беременности, при этом лептин демонстрирует присущую ему провоспалительную активность, а во второй половине беременности комбинации гормонов способствуют формированию иммунной толерантности.

Роль леи тина и грслина в регуляции функций основных клеток адаптивною иммунитета

Исследование гормональной регуляции функций клеток адаптивного иммунитета включало оценку основных процессов, сопровождающих активацию зрелых Т-лимфоцитов периферических крови - экспрессию активационных маркеров, апоптоз, продукцию ключевых цитокинов, формирование субпопуляций регуляторных Т-клеток.

Регуляция лептином и грелином экспрессии акгивациопмых маркеров, амопгоза и продукции цитокинов Т-лимфоцитами периферической крови. Поскольку основным аутокринным активатором дифференцировки Т-лимфоцитов является IL-2, оценивали экспрессию его рецептора (CD25) на Th-клетках и ЦТЛ. Установлено, что грелин в концентрации 1-11 триместра беременности увеличивает, а в концентрации III триместра не влияет на процент активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CI)25dlm. Лептин, напротив, снижает количество CD4'CI)25dimT-клеток. Совместное действие гормонов в комбинации I-II триместра беременности нивелирует самостоятельные эффекты как лептина, так и грелина, тогда как в комбинации II-III триместра беременности, гормоны увеличивают процент СП4'С1)25ЛтТ-клеток (рисунок 6). Гормоны не оказывают значимых эффектов на экспрессию CD25 на ЦТЛ. Лишь лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности, усиливает экспрессию CD25 ЦТЛ по сравнению с его эффектами в первой половине беременности (рисунок 6). Известно, что активация Т-клеток инициирует формирование эффекторных и регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов. Важно отмстить, что, несмотря на самостоятельные разнонаправленные эффекты лептина и грелина на активацию зрелых Т-клеток, действуя вместе, гормоны активируют Т-клеточное звено лишь в комбинации второй половины беременности. реализуя свои эффекты только на Th, трансформирующиеся, главным образом, в регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов, не затрагивая ЦТЛ, наиболее опасные с позиции развития антифетальных реакций.

CD.VCD4 С1)25'»п\ %

СШ' CD8+CD25', %

гЬ

1

г

1

1

к л1 л2 г1 г2 л1+г1 л2+г2 к л1 л2 г1 г2 л1+г1 л2+п

Рисунок 6 - Модуляция лептином и грелином экспрессии CD25 на Th (CD3+CD4') (а) и ЦТЛ (CD3+CD8+) (б)/и vitro (п=22). Примечание: по оси ординат светлые столбики - процент CD4 CD25d,n4VnHM(J)onmoB в гейте CD3 CD4 Т-клеток; темные столбики - процент CD8 CD25 Т-лимфоцитов в гейте CD3 CD8 Т-клеток; по оси абсцисс - экспериментальное воздействие: К -контроль; Л1 лептин, 10 нг/мл; J12 - лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 лептин, 10 нг/мл + фелин, 1,25 нг/мл; Л2+Г2 лептин, 35 нг/мл + [релин, 0,83 нг/мл; Г1 грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; * - различия статистически значимы (р<0,05) по парному /-критерию Стьюдента по отношению к контролю, л - по парному /-критерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением того же гормона (комбинации гормонов) в концентрации, характерной для первой половины беременности

Альтернативным исходом Т-клеточной активации является инициация алоптоэа. Грелин в концентрации 1-II триместра беременности усиливает апогггоэ лимфоцитов, а в концентрации III триместра беременности повышает экспрессию маркера активации и готовности клетки к вступлению в апоптоз - CD95 как на Th (CD3+CD4+CD95+), так и на ЦТЛ (CD3+CD8+CD95+) (таблица 5). Лептин, напротив, проявляет антиапоптотическое действие, снижая количество АпУ7РГлимфоцитов, и не влияет на присутствие CD95 на Т-лимфоцитах. Результатом совместного действия лептина и грелина в исследуемых комбинациях является отмена самостоятельных модулирующих эффектов гормонов на апоптоз лимфоцитов периферической крови при усилении экспрессии CD95 на Th.

Таблица 5 - Модуляция грелином и лептином апоптоза лимфоцитов и экспрессии CD95 на Th (CD3XD4") и ЦТЛ (CD3XD8+) in vitro

Экспериментальное воздействие

Контроль __

Лептин, 10 нг/мл

__Лептин^ 35 нг/мл_

Грелин, 1,25 нг/мл Грелин, 0,83 нг/мл_ Лептин, 10 нг/мл+ Грелин 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин 0,83 нг/мл

AnV+Pl+ % (п=7) 62,88? 5,62 49,92± 11.28*

48,94± 11,79*

71,06±3,97* 68,71 ±4,46

59,39± 12,54

59,44±15,95

CD3+CD4+CD95+ %(п=13)

15,58±4,73 14.34x5,29

17,09±3,65

22,23±5,42 22,59±2,82*

26,05±3,88*

30,06±5,01н

CD3+CD8+CD95+,

___% (п=13)

11,71±1,34 14,58±3.49 14,08±2,91

20,90±6,91 21.03*4,7*

15,24±0,99

17,08±2,03

Примечание: * - различия статистически значимы (р <0,05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

Анализируя полученные результаты в контексге беременности, следует отметить, что увеличение количества активированных Th под действием грелина в первой половине беременности сопровождается активацией гормоном апоптоза лимфоцитов, что, возможно, ограничивает уровень активации Th. Тогда как снижение количества активированных Th под действием лептина, напротив, сопровождается угнетением апоптоза лимфоцитов, что, по-видимому, способствует сохранению общего пула активированных Th. Можно полагать, что исследуемые гормоны контролируют формирование эффекторных популяций зрелых Т-лимфоцитов периферической крови, регулируя количесгво активированных клеток путем апоптоза.

Поскольку одним из наиболее важных механизмов, определяющих направленность развития иммунного ответа, является баланс в формировании Thl/Th2 (Wegmann Т., Lin П., Guilbert L„ Mosmann Т. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon? Immunol. Today. 1993. V. 14, P. 353-356), исследовали влияние лептина и грелина на продукцию основных Т-клеточных цитокинов IFN-y и IL-4 Т-лимфоцитами периферической крови. Установлено, что грелин не влиял на процессы трансляции IFN-y, но стимулировал внутриклеточный синтез IL-4 CD4f и С08'Т-лимфоцитами (таблица 6). Лептин в исследуемых концентрациях эффектов не оказывал. При совместном внесении гормоны стимулировали синтез IL-4 как CD4', так и CD8T-клегками. Полученные результаты дают основание полагать, что совместное действие гормонов способствует преимущественному формированию Th2.

Таблица 6 - Влияние лептина и грелина на внутриклеточный синтез IFN-y и

IL-4 CD4+ и CD8T-лимфоцитами периферической крови in vitro (n=6)

Экспериментальное CD4+lFN-y+, CD4+IL-4+, CD8+IFN-y+, CD8+lL-4+,

воздействие % % % %

Контроль 1,52+0,61 1,34±0,31 1,53+0,47 1,84±0,62

Лептин, Юнг/мл 2,31 ±0,91 1,93±0,51 1,82+0,74 2,44±0,99

Лептин, 35 нг/мл 1,39±0,57 2,79±0,96 1,38+0,36 2,72+0,91

Грелин, 1,25 нг/мл 2,81±1,16 3,45±1,09* 1,76±0,93 3,60±0,88*

Грелин, 0,83 нг/мл 2,99±1,54 4,55±1,71* 2,43±0,86 4,92±0,73*

Лептин, 10 нг/мл + Грелин 1,25 нг/мл 2,65±1,83 4,25+1,01* 2,74±0,88 3,54±1,25*

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 1,69±0,54 2,87+0,69* 2,82+1,11 2,74±0,68

Примечание:* - р<0,05 по парному /-критерию Стъюдентв по отношению к контролю

Таким образом, в концентрациях, характерных для беременности, грелип и лептин проявляют разнонаправленные регуляторные эффекты на исследуемые показатели функциональной активности зрелых Т-лимфоцитов. Совместное действие грелина и лептина на уровне Т-лимфоцитов в зависимости от триместра беременности либо нивелирует самостоятельное влияние каждого гормона, либо способствует проявлению эффектов одного из них, главным образом, грелина. В целом, можно заключить, что в контексте беременности совместное действие гормонов на уровне зрелых Т-лимфоцитов периферической крови будет увеличивать количество активированных Th, переключая иммунный ответ по ТЬ2-типу, что раскрывает механизм участия гормонов в формировании иммунной толерантности.

Роль лептина и грелина в формировании регуляторных субпопуляций С04+Т-лимфоцигов (Treg, ТИ17) периферической крови, а также значение РКА и PI3K в реализации эффектов гормонов. Согласно современным представлениям, баланс регуляторных субпопуляций Г-клеток (Th 17/Treg) периферической крови играет важнейшую роль в контроле адаптивного иммунитета и иммунореактивности в целом. В зависимости от воздействующих стимулов наивные С04+Т-клетки периферической крови могут трансформироваться в адаптивные субпопуляции как aTreg, так и aThl7 (Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2004. V. 299, P. 1057-1061). Повышение количества Treg периферической крови является одним из ведущих механизмов обеспечения иммунной толерантности, которое происходит как за счет индукции aTreg путем инициации экспрессии транскрипционного фактора FOXP3 в СП4"СП25Т-лимфоцитах периферической крови, так и за счет пролиферации конститутивных или натуральных (n)Treg (CD4'CD25b"Bt"FOXP3l) (Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2004. V. 299, P. 1057-1061).

Для оценки гормонального контроля формирования aTreg МПК инкубировали с гормонами 24 ч, а далее определяли количество CD4+CD25br'8h'FOXP3+-лимфоцитов. Инкубация с гормонами в течение 24-72 ч дает возможность оценить только экспрессию транскрипционного фактора FOXP3 СП4'С025Т-лимфоцитами периферической крови, т.е. формирование aTreg, поскольку для оценки

пролиферации nTreg необходима более длительная инкубация (4-7 суток) (Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2004. V. 299, P. 1057-1061). Установлено, что лептин и грелин проявляют реципрокные регуляторные эффекты на формирование aTreg периферической крови. Так, лептин в концентрации 1-11 триместров беременности снижает количество С04'С025Ьпе,1ТОХРЗтТ-лимфоцитов (таблица 7). Тогда как грелин в концентрации III триместра беременности, а также комбинации грелина с лептином, напротив, стимулируют экспрессию FOXP3 в Сй4*СП25"Т-лимфоцитах.

Таблица 7 - Влияние лептина и грелина на формирование aTreg (С04тС025Ьг'вЫРОХРЗ+Т-лимфоцитов) периферической крови in vitro (п=8)

Экспериментальное воздействие CD4+CD25brish,FOXP3+, % j

___Контроль _________82,7±3,3 __ j

Лептин, 10 нг/мл 66,4±5,4*

Лептин, 35 нг/мл __81,6±4,5

Грелин, 1,25 нг/мл 85,9±4,5

_____Грелин, 0,83 нг/мл_____________89,3±5,2*______

Лептин, 10 нг/мл+Грелин, 1,25 нг/мл 89,3±3,6*

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 89,8±3,6*

Примечание: * - различия статистически значимы (/?<0,05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

Механизмы модулирующих эффектов гормонов на формирование aTreg исследовали в модели, создающей условия для преимущественной дифференцировки наивных CD4 'Т-лимфоцитов в aTreg. Для этого выделенные CD4 Т-лимфоциты периферической крови инкубировали с гормонами 72 ч в присутствии TGF-ßl, а далее оценивали количество aTreg (CD4FOXP3), экспрессию на них иммуносупрессорной молекулы CTLA-4, а также продукцию противовоспалительного цитокина IL-10.

Установлено, что грелин (I-II триместр) усиливает дифференцировку TGF-ßl-примированных С04+Т-лимфоцитов в aTreg (рисунок 7а) и экспрессию на них CTLA-4 (CD4+CTLA-4+FOXP3+) (рисунок 76). Лептин, напротив, угнетает формирование aTreg (рисунок 7а), а в концентрации II-III триместров беременности снижает процент aTreg, экспрессирующих CTLA-4 (рисунок 76). Совместное действие лептина и грелина в комбинации, характерной для 1-11 триместров беременности (рисунок 7а) усиливает дифференцировку С04+Т-лимфоцитов в aTreg, но не влияет на экспрессию CTLA-4 (рисунок 76).

CD4'FOXP3\%

rb

' : nh

rh

l

CD4*CT(.A-4'FOXP3\ %

.

Ш

1 1

tp

fü

1

s

s

Ш

л1+г1 л2+г2

Рисунок 7 — Влияние лептина и грелина на индукцию aTreg (CD4+FOXP3+) (а) и экспрессию на них CTLA-4 (б) из TGF-ßl-примированных CD4+T-лимфоцитов периферической крови in vitro. Примечание: по оси ординат - серые столбики (а) - процент CD4+FOXP3*T-oeTOK (п 8); полосатые (б) - процент CD4tCTLA-4+FOXP3tT-icii(rr0K (n=l 1); по оси абсцисс - экспериментальное воздействие: К - контроль; Л1 - лептин, 10 нг/мл; Л2 - лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл; Л2+Г2 - лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл; Г1 грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; * - различия статистически значимы (/КО,05) по парному (-критерию Стьюдента по отношению к контролю

Лептин и грелин в исследуемых концентрациях не влияют на продукцию IL-10 в культурах CD4T-лимфоцитов, примированных TGF-ßl (таблица 8). Можно полагать, что формируемые под действием грелина 1 reg не относятся к популяции Tri (Treg, продуцирующие IL-10).

Таблица 8 - Влияние лептина и грелина на продукцию IL-10 в культуре

TGF-ßl-примированных CD4'Т-лимфоцитов пери< прической крови in vitro (n=6)

Экспериментальное воздействие IL-10, пг/мл

Контроль 952,3±117,6

Лептин, 10 нг/мл 880,9±138,6

Лептин, 35 нг/мл 965,1±I29,4

Грелин, 1,25 нг/мл 1012,2±121,7

Грелин, 0,83 нг/мл 990,2± 124,4

Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 1200,9±208,1

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 1095,4±165,3

Таким образом, лептин, действуя как на суспензию МНК периферической крови, так и на ТОР-р1-примированные С04Т-лимфоциты, угнегает, а грелин, напротив, усиливает формирование а'П^, экспрессирующих С'П.Л-4. Совместное действие гормонов также приводит к преимущественному формированию причем по данным корреляционного анализа этот эффект обусловлен именно влиянием грелина (г=0,75; р<0,05).

Для дополнительной характеристики механизмов, регулирующих формирование аТге§, важно было оценить действие гормонов на апоптоз СГ)4'25"Т-лимфоцитов. Установлено, что лептин, а также исследуемая комбинация лептина с грелином препятствуют апоптозу СЭ4+25"Т-лимфоцитов (таблица 9). Грелин не влияет на апоптоз Т-лимфоцитов с фенотипом С04+25" (таблица 9). Учитывая, что лептин угнетает формирование aTreg, можно полагать, что его антиапоптотический эффект в отношении С1)4'25"Т-лимфоцитов способствует сохранению общего пула С1)4Т-лимфоцитов, включающего и потенциальных предшественников а'1ге§.

Таблица 9 - Влияние лептина и грелина на апоптоз С04+С025"Т-лимфоцитов in vitro (n=12)____________________________

Экспериментальное воздействие АпХ/^Т-лимфоциты, %

Контроль 12,19±3,25

Лептин, 35 нг/мл 8,54±2,47*

Грелин, 1,25 нг/мл 11,88±2,44

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 8,78±1,51*

Примечание: * - различия достоверны (/><0,05) по парному /-критерию Стьюдента по отношению к контролю

Таким образом, несмотря на то, что каждый из гормонов в исследуемых концентрациях оказывает диаметрально противоположные эффекты на индукцию aTreg периферической крови, действуя совместно, лептин и грелин усиливают формирование aTreg, что особенно важно в 1-Й триместрах беременности, которые характеризуются высоким риском спонтанных абортов.

Для характеристики влияния лептина и грелина на уже присутствующие в периферической крови Treg (С04+С025ь"в1"Р0ХРЗ+Т-лимф0циты) из суспензии МПК выделяли С04+С025+Т-лимфоциты методом иммуномагнитной сепарации, культивировали их с гормонами и далее оценивали их функциональную активность. Известно, что пул Treg периферической крови гетерогенен и включает разные субпопуляции, в том числе и nTreg, которые формируются в тимусе и играют важную роль в поддержании аутотолерантности. Характеристика nTreg периферической крови затруднена ввиду их малочисленности и отсутствия специфических маркеров, поэтому их идентифицируют как CD4+CD25br'BhlFOXP3+T-лимфоциты, отличные по функциональной активности от других регуляторных субпопуляций Т-клеток (Strauss L., Whiteside Т., Knights A. et al. Selective Survival of Naturally Occurring Human CD4+CD25+Foxp3+ Regulatory T Cells Cultured with Rapamycin. J. Immunology. 2007. V. 178, P. 320-329). Поскольку выделенная субпопуляция Т-клеток на 85% и более представлена CD4+CD25br'eh,FOXP3+T-лимфоцитами и эффекты гормонов оценивались в гейте CD4+CD25bngh,FOXP3+T-лимфоцитов, можно с определенной долей вероятности полагать, что исследовались, главным образом, nTreg периферической крови. Реализация супрессорной функции nTreg осуществляется, главным образом, путем взаимодействия мембранных иммуносупрессорных молекул Treg (CTLA-4, GITR, GARP и др.) со своими лигандами на эффекторных клетках, поэтому изучение экспрессии этих молекул является важной характеристикой функциональной активности nTreg.

Установлено, что лептин и грелин, а также их комбинация не оказывают значимых эффектов на количество С04'СП25ь"в,1,РОХРЗЧ-лимфопитов, несущих CTLA-4 (рисунок 8). Лептин в концентрации 11-111 триместров беременности усиливает экспрессию GITR, а грелин в концентрации I-1I триместров беременности, повышает экспрессию GARP на С04>С025Ьг18ЫРОХРЗ+Т-лимфоцитах (рисунок 8). Сочетанное действие лептина и грелина нивелирует самостоятельное влияние каждого из гормонов на экспрессию GITR и GARP. Различия в эффектах гормонов на экспрессию CTLA-4 на индуцируемых aTreg и на CD4hCD25br'Bh,FOXP3+T-лимфоцитах, по-видимому, обусловлены тем, что экспрессия CTLA-4 необходима для индукции FOXP3 в наивных CD4'Т-клетках при формировании aTreg (Zheng Y., Manzotti С., Burke F. et al. Acquisition of suppressive function by activated human CD4+CD25' Tcells is associated with the expression of CTLA-4 not FoxP3. J. Immunol. 2008. V. 181, P. 1683-1691).

CTLA-4 \ % a

3) -

К Л1 J12 Г1 Г2 Л1+Г1 Л2+Г2 К Л2 Г1 Л2+Г2 К Л2 Г| Л2+Г2

Рисунок 8 - Влияние гормонов на экспрессию иммуносупрессорных молекул CTLA-4 (a), GITR (б), GARP (в) на С04ЧГ025Ьп8,1'РОХРЗ+Т-лимфоцитах в модели in vitro (п=6). Примечание: по оси ординат: (а) процент CTLA-4', (б) - процент GITR', (в) -процент GARP* в гейте С 1)4*СП25,1пеЫ1''ОХ1:'3*Т-лимфоцитон, по оси абсцисс - экспериментальное воздействие: К - контроль; Л1 - лептин, 10 нг/мл; Л2 - лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 - лептнн, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл; Л2+Г2 - лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл; Г1 - грелин, 1,25 нг/мл; Г2 -грелин, 0,83 нг/мл; * - различия статистически значимы (/><0,05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что лептин оказывает оппозитные эффекты, угнетая формирование aTreg, но усиливая экспрессию GI I R на С1)4'С025ь"вЬ'1'0ХРЗ"7-лим(||0цитах, повышая их супрессорный потенциал. Грелин, напротив, действует однонаправлено, усиливая формирование aTreg, экепрессирующих CTLA-4, и присутствие GARP на CD4+CD25b"8h,FOXP3+T-лимфоцитах.

При изучении влияния лентина и грелина на секрецию иммуносупрессорных цитокинов TGF-fH и IL-10 в культурах CD4+CD25+T-mieTOK модулирующих эффектов не выявлено (таблица 10). Возможно, это объясняется характерной особенностью п'1'reg проявлять низкую функциональная активность в условиях in vitro (Proeaccini С., De Rosa V., Galgani M. et al. An oscillatory switch in mTOR kinase activity sets regulatory T cell responsiveness. Immunity. 2010. V. 6, P. 929-941).

Таблица 10 - Влияние лептина и грелина на продукцию TGF-|i 1 и II.-10 С1)4*С025Т-лимфоцитами in vitro

Экспериментальное воздействие TGF-pi, нг/мл (n= 10) IL-I0, нг/мл (п=6)

Контроль 26,30± 13,95 8,38±2,66

Лептин, 35 нг/мл 29,36± 16,38 9,62±6,14

Грелин, 1,25 нг/мл 22,34±9,01 7,89±2,96

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 20,55± 17,95 8,18±2,62

При оценке влияния гормонов на апоптоз СТ)4ЧЛ)25ь"8НТОХРЗ+Т-лимфоцитов показано, что лептин снижает процент клеток, вступивших в ранний обратимый аноптоз (таблица II). Грелин в концентрации, характерной для беременности, не влияет на апоптоз С1)4 С025ЬпцИ'10Х1>3 Т-лимфоцитов. Результатом совместного действия лептина и грелина в комбинации, характерной для беременности, является снижение числа СТ)4"С025Ьпв1"ГОХРЗ+Т-лимфоцитов, находящихся в позднем апоптозе.

GITR\ % б GARP*. % В

"I • ..... п ь г

ll.nl

Таблица 11 - Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+CD25bngh,FOXP3+ Т-лимфоцитовв модели in vitro (n=l 0)

Экспериментальное воздействие AnV+PI", %

Контроль 5,76±2,79

Лептин, 35 нг/мл 2,76±1,66*

Грелин, 1,25 нг/мл 2,91±1,41

Лептин, 35нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 4.89Н ,95

AnV+Pr, % 26,07±8,55 27,46± 11.46 25,06± 12,96 13,50±3,11*

Примечание: * - различия статистически значимы (/х0,05) по парному /-критерию Стъюдента к контролю

Таким образом, в физиологических концентрациях, характерных для беременности, лептин и грелин являются важными регуляторами формирования и функциональной активности Treg периферической крови. Лептин, действуя самостоятельно, проявляет провоспалительную активность и угнетает формирование aTreg, но способствует сохранению иммуносупрессорного потенциала общего пула Treg периферической крови, препятствует их апоптозу. Грелин. напротив, усиливает формирование aTreg и экспрессию иммуносупрессорных молекул на Treg периферической крови в целом. Действуя совместно, гормоны усиливают образование aTreg, не влияя на изученные показатели функциональной активности Treg, но оказывают антиапоптотическое действие, способствуя сохранению общего пула Treg периферической крови. В контексте беременности выявленные механизмы раскрывают роль грелина и лептина в формировании иммунной толерантности посредством регуляции количества и функций Treg периферической крови.

Регуляция лептином и грелином дифференцировки С04+Т-лимфоцитов периферической крови в Thl7. Установлено, что в модели, формирующей условия для дифференцировки СП44Т-лимфоцигов в аТЫ7 (с добавлением IL-lß/IL-6), лептин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, не влияет, а в концентрации, сопоставимой с 111 триместром беременности, усиливает дифференцировку СП4' Г-лимфоцитов в aThl7 (CD4+RORyt+IL-17A+) (рисунок 9а) и повышает экспрессию на них хемокинового рецептора CCR6 (CD4+CCR6+IL-17A+) (рисунок 96), а также продукцию IL-I7A в супернатантах культур (таблица 12). CCR6 присутствует на большинстве ТЫ 7 и необходим для их трансэндотелиальной миграции (Annunziata F., Cosmi L.. Liotta F. et al. The phenolype of human Thl7 cells and their precursors, the cytokines that mediate their differentiation and the role of Thl7 cells in inflammation. Int Immunol. 2008. V. 20, P. 1361-1368), что вместе с продукцией IL-17A отражает провоспалительный потенциал этих клеток. Грелин, напротив, в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает формирование Th 17 (CD4+RORyt+IL-17Af) (рисунок 9а) и продукцию IL-I7A (таблица 12) и вне зависимости от концентрации снижает количество CD4+CCR6+IL-l7A+T-лифoцитoв (рисунок 96). Совместное действие лептина и грелина не влияет на формирование aThl7 из С04*Т-лимфоцитов периферической крови, но второй половине беременности повышает продукцию II.-I7A в культурах С04Т-лимфоцитов (таблица 12). Данные корреляционного анализа показывают, что грелин препятствует увеличению количества Th 17 при совместном внесении гормонов, поскольку была выявлена положительная корреляция между снижением уровня ТЫ 7 под действием только [релина и грелина в сочетании с лептином в концентрациях, характерных для 11-111 триместров беременности (г=0,95; р<0,05).

CD4*RORyTIL-l7A\ %

CD4+CCR6'[L-17A+, %

rh

□

A

Ai

Л2 Л1+Г1 Л2<Т2 Г!

Л1 Л2 Л1+Г1 Л2*Г2 Г1

Рисунок 9 - Влияние лептина и грелина на дифференцировку CD44T-лимфоцитов периферической крови, примированных IL1-0/IL-6, и формирование Thl7 (а), И экспрессию на НИХ CCR6 (б) В модели in vitro (п=9). Примечание: по оси ординат (а) - процент CD4'RORyt 1Ы7АТ-лимфоцитов в гейте С04'Т-лимфоцитов, (б) - процент CD4 CCR6 1LI7A Т-лимфоцитов в гейте CD4И--17АТ-лимфоцитов; * - различия статистически значимы (/?<0,05) по парному /-критерию Стьюдента по сравнению с контролем

Таблица 12 - Влияние лептина и грелина на продукцию IL-17A в культуре С04'Т-лимфоцитов, примированных IL- ip/IL-6 in vitro (n=6) Экспериментальное воздействие Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл

___Грелин, 0,83 нг/мл __

Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин. 0,83 нг/мл

IL-17A, пг/мл 226,05±28,78 234,07±59,62 252.20*31.96* 204,65 tl 9,76* 211.66-fc51.93

232,92±25,39 273,63±16,53*

лептин, jj нг/мл -г I релин. u,ej нг/мл z /j.oji io,j

Примечание: * - различия статистически значимы (/К0.05) по парному /-критерию Стьюдента

к контролю

В целом, лептин и грелин разнонаправлено контролируют индукцию адаптивных регуляторных субпопуляций С04+Т-лимфоцитов периферической крови. Лептин усиливает формирование aThl7, но препятствует образованию aTreg, т.е. в контексте беременности выступает абортогенным фактором, поскольку повышение Thl7 в периферической крови на фоне снижения Treg ассоциировано со спонтанными абортами (LiuY., Wu L., Tong X. et al. Study on the relationship between Thl7 cells and unexplained recurrent spontaneous abortion. Am. J. Reprod. Immunol. 2011. V. 65, P. 503-511). Выявленные закономерности, по-видимому, являются одной из причин высокой частоты прерывания беременности у женщин с ожирением, когда концентрация лептина в периферической крови резко возрастает. Грелин, напротив, способствует формированию aTreg, но угнетает поляризацию в Th 17. Возможно, что нарастание уровня грелина в сыворотке крови в 1-II триместрах беременности, в том числе, является фактором, который способствует увеличению пула Treg периферической крови в период, сопряженный с высоким риском спонтанных абортов, Совместное действие гормонов, которое можно экстраполировать для характеристики гормональных эффектов в первой половине беременности, способствует конверсии наивных С04'Т-лимфоцитов преимущественно в aTreg, т.е. оказывает фетопротективное влияние, формируя состояние иммунной толерантность.

Молекулярные механизмы гормонального контроля лифференцнровки С04+Т-лимфоцитов в адаптивные регуляторныс субнопуляций Т-клеток. Для

изучения молекулярных механизмов регуляции лептином и грелином дифференцировки наивных CD4 'Т-лимфоцитов в адаптивные субпопуляции Т-регуляторных клеток использовали ингибитор РКА (Н-89) и ингибитор Р13К (W), поскольку именно РКА и PI3K являются ключевыми ферментами для индукции транскрипции FOXP3 или RORyt в CD4Т-лимфоцитах (Procaccini С.. De Rosa V.. Galgani М. et al. Leptin-induced mTOR activation defines a specific molecular and transcriptional signature controlling CD4+ effector T cell responses. J. Immunol. 2012. V. 189. P. 2941-2953).

Установлено, что Н-89 угнетает дифференцировку С D4'Т-лимфоцитов как в aThl7 (CD4+RORyt+), так и в aTreg (CD4+FOXP3+) (рисунок 10), что подтверждает ключевую роль РКА.

К Л ЛГ Г Н-89 Л ЛГ Г W Л ЛГ Г К Л ЛГ Г Н-89, Л ЛГ Г W Л ЛГ Г

+ н-89 + w + Н-89 + W

Рисунок 10 - Влияние лептина и грелина на дифференцировку CD4+T-лимфоцитов в aTh 17(a) (п=6) и aTreg (б) (п=8) на фоне внесения ингибитора РКА (Н-89) и ингибитора Р13К (W) в системе in vitro.

Примечание: по оси ординат (а) процент Thl 7 (ОМ'ЯСЖуГТ-лимфоцитов) в гейте CD4*T-лимфоцитов, примированных ILl-ß/IL.-6; (б) - процент Treg (С D4*FOXP3 *Т-л им фо цитов ) в гейте С04*Т-лимфоцитов, примированных TGF-ßl, по оси абсцисс - экспериментальное воздействие: К -контроль, Л - лептин, 35 нг/мл; ЛГ - лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл; Г - грелин, 1,25 нг/мл; Н-89 - пробы с внесением Н-89, 1 мкг/мл; W пробы с внесением вортманнина, 100 нМ; * - /><0,05 по парному /-критерию Стьюдента по сравнению с контролем, # - по парному /-критерию Стьюдента по сравнению с пробой, куда вносили только Н-89; л - по парному /-критерию Стьюдента по сравнению с пробой, куда вносили только W

Рассуждая о молекулярных механизмах, можно полагать, что ингибирование РКА препятствует активации CREB (белок, связывающий сАМР-чувствительный элемент), необходимого для экспрессии FOXP3 и формирования aTreg (Grant С., Fugo U., Takenouchi N. et al. Foxp3 represses retroviral transcription by targeting both NF-kappaB and CRHB pathways. PLoS. Pathog. 2006. V. 2, е.ЗЗ). Тогда как снижение образования aTh 17 при внесении 11-89 можно объяснить ингибированием другой его мишени - MSKI (мигоген- и стрссс-акгивируемая протеинкиназа 1), активирующей NF-кВ и экспрессию RORyt (Arthur J. MSK activation and physiological roles. Front. Biosci. 2008. V. 13. P. 5866-5879).

Ингибитор PI3K (W) не влияет на формирование aTh 17, но усиливает образование aTreg (рисунок 10). Активирующее действие W на индукцию aTreg, очевидно, обусловлено тем, что W отменяет способность Р13К через Akt

(протеинкиназа В) стимулировать mTOR (мишень для рапамицина млекопитающих), что угнетает экспрессию FOXP3 (Sauer S., Bruno L., Hertweck A. et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via P13K, Akt, and mTOR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105, P. 7797-7802).

При изучении действия гормонов на фоне внесения ингибиторов установлено, что стимуляция лепгином дифференцировки CD4Т-лимфоцитов преимущественно в аТЫ7 реализуется при участии Р13К (рисунок 10а), поскольку внесение W отменяет лептин-индуцированное усиление формирования aThl7. Тогда как депрессивный эффект лептина на индукцию aTreg не связан с активностью ни PI3K, ни РКА.

Рассматривая возможные молекулярные механизмы регуляции гормонами дифференцировки С L)4'Т-лимфоцитов в aTreg/Thl7, следует отметить, что взаимодействие лептина с Ob-R на лимфоцитах запускает несколько сигнальных путей, основной из которых аналогичен таковому для IL-6 и включает STAT3 (передатчик сигнала и активатор транскрипции 3) - ключевой индуктор для RORyt (NishiharaM., Ogura П., Ueda N. et al. IL-6-gpl30-STAT3 in T cells directs the development of IL-17+ Th with a minimum effect on that of Treg in the steady state. Int. Immunol. 2007. V. 19, P. 695-702; Procaccini C., De Rosa V., Galgani M„ Carbone F. et al. Leptin-induced mTOR activation defines a specific molecular and transcriptional signature controlling CD4+ effector T cell responses. J. Immunol. 2012. V. 189, P. 29412953). Помимо этого, лептин, связываясь с Ob-R, стимулирует ERKI/2 (экстраклегочно-регулируемая протеинкиназа), с последовательным фосфорилированием Akt, и, как следствие, высвобождением NF-кВ, который инициирует транскрипцию генов провоспапительных цитокинов и RORyt (Louis G., Greenwald-Yarnell M., Phillips R. et al. Molecular mapping of the neural pathways linking leptin to the neuroendocrine reproductive axis. Endocrinol. 2011. V. 152, P. 2302-2310). Следовательно, преобладание дифференцировки С04+'Г-лимфоцитов в Th 17 под действием лептина можно объяснить преимущественной активацией гормоном RORyt.

Принципиальная роль Р13К для лептин-зависимой экспрессии RORyt объясняется тем, что взаимодействие лептина с Ob-R индуцирует Р13К-зависимую активацию PDE (фосфодиэстеразы) (Kohno D., Nakata М., Maekawa F. et al. Leptin suppresses ghrelin-induced activation of neuropeptide Y neurons in the arcuate nucleus via phosphatidylinositol 3-kinase- and phosphodiesterase 3-mediated pathway. Endocrinol. 2007. V. 148, P. 2251-2263), что поддерживает низкий уровень сАМР в клетке, поскольку повышение его уровня угнетает транскрипцию генов провоспалительных факторов и RORyt (Ширшев С.В. цАМФ-зависимые механизмы эндокринного контроля иммунной системы при беременности. Успехи соврем, биологии. 2010. Т. 130, С. 26-30). Преимущественная активация лептином RORyt в С04+Т-лимфоцитах также является причиной угнетения гормоном дифференцировки CD4+T-лимфоцигов в aTreg, так как по данным литературы и mTOR, и STAT3 эффективно подавляют экспрессию FOXP3 в С1)4нТ-клегках независимо от активности РКА и PI3K (Procaccini С., De Rosa V., Galgani М. et al. Leptin-induced mTOR activation defines a specific molecular and transcriptional signature controlling CD4+ effector T cell responses. Journal of Immunology. 2012. V. 189, P. 2941-2953; Laurence A., Amarnath S., Mariotti J. et al. STAT3 transcription factor promotes instability of nTreg cells and limits generation of ¡Treg cells during acute murine graft-versus-host disease. Immunity. 2012. V. 37, P. 209-222). Гипотетическая схема, суммирующая молекулярные механизмы реализации регуляторных эффектов гормонов на дифференцировку

С04+Т-лимфоцитов периферической крови и формирование а'ГЫ7 и aTreg, представлена на рисунке 11.

лептина и грелина в регуляции дифференцировки С044Т-лимфоцитов периферической крови и формирования аТЫ7 и aTreg.

Примечание: сплошные стрелки - стимулирующий эффект, пунктирные - ингибируюший эффект; Oq/ii.-, ßy - субъединицы G-белка; Ас - аденилатциклаза; Akt протеинкиназа В; АМРК - АМР-активируемая протеинкиназа; АР-1 - активирующий белок 1; СаМКК2 - кальмодулин-зависимая протеинкиназа; сАМР - аденозин-3'5'-циклофосфат; CRHB - белок, связывающий сАМР-чувствительный элемент; DAG - диацилглицерол; ERK '/4 - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами; JAK2 Янус-киназы; MSK1 митоген- и стресс-активируемая протеинкиназа I, mTOR мишень для рапамицина млекопитающих; NF-кВ ядерный фактор kB; NFAT - ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов; РКС - протеинкиназа С; PLC фосфолипаза С; PDH -фосфодиэстераза; STAT3 - передатчик сигнала и активатор транскрипции

При изучении молекулярных механизмов действия грелина установлено, что блокада РКА нивелирует регуляторные эффекты гормона на формирование аТЫ7 и aTreg (рисунок 10). При внесении W (ингибитора PI3K) эффекты гормона меняются на противоположные: грелин стимулирует синтез aThl7 и угнетает формирование aTreg. Следовательно, действие грелина на девиацию С1)4+Т-лимфоцитов опосредовано через РКА и PI3K, однако ведущая роль в акгивации [релином экспрессии FOXP3 и подавлении RORyt принадлежит PI3K. Исследования последних лет показали, что при связывании грелина со специфическим рецептором GHS-R происходит его димеризация с привлечением других типов G-сопряженных рецепторов с разными типами а-субъединиц G-белка (Schellekens П., Dinan Т.. Сгуап J. Taking two to tango: a role for ghrelin receptor heterodimerization in stress and reward. Front. Neurosci. 2013. V. 7, A. 148). В зависимости от специфичности а-субъединицы G-белка инициируются такие сигнальные каскады, как фосфолипаза С ((Независимый путь с активацией протеинкиназы С (РКС) и повышением уровня

внутриклеточного Са2+; аденилатциклаза (Ас) - РКА-зависимый путь. Помимо этого, при лигировании GHS-R происходит диссоциация G-белка на а- и Ру-субъединицы, каждая из которых имеет собственные субстратные мишени (Korbonits М., Goldstone A., Gueorguiev М., Grossman A. Ghrelin - a hormone with multiple functions. Front. Neuroendoerinol. 2004. V. 25, P. 27-68). Ру-субъединицы G-белка активируют PI3K (Ballou L.M., Chattopadhyay M„ Li Y. et al. Galphaq binds to pi I0alpha/p85alpha phosphoinositide 3-kinase and displaces Ras. J. Biochem. 2006. V. 394, P. 557-562) и Ac с последующей стимуляцией РКА (Schellekens Н., Dinan T.G., Cryan J.F. Taking two to tango: a role for ghrelin receptor heterodimerization in stress and reward. Front. Neurosci. 2013. V. 7, A. 148). Стимуляция РКА также осуществляется комплексом Са27кальмодулин, через кальмодулин-зависимую протеинкиназу (СаМКК2) и АМР-активируемую протеинкиназу (АМРК) (Chen P., Kryukova Y., Shyng S. Leptin Regulates KATP Channel Trafficking in Pancreatic P-Cells by a Signaling Mechanism Involving AMP-activated Protein Kinase (AMPK) and cAMP-dependent Protein Kinase (PKA). J. Biol. Chem. 2013. V. 288, P. 34098-34109), а также PI3K (Ballou L„ Chattopadhyay M„ Li Y. et al Galphaq binds to pi 10alpha/p85alpha phosphoinositide 3-kinase and displaces Ras. J. Biochem. 2006. V. 394, P. 557-562). Таким образом, РКА играет значимую роль в реализации эффектов грелина. Ключевая роль РКА в усилении грелином формирования aTreg обусловлена, по-видимому, РКА-зависимой активацией CREB - основного фактора, активирующего транскрипцию FOXP3. Индукция FOXP3 подавляет экспрессию RORyt, поскольку FOXP3 непосредственно связывается с промотором RORyt, блокируя его активацию (lchiyama К., Yoshida П., Wakabayashi Y. et al. Foxp3 inhibits RORgammat-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORgammat. J. Biol. Chem. 2008. V. 283, P. 1700317008), что и является возможной причиной угнетения грелином дифференцировки CD4 Т-лимфоцитов в Thl7. Помимо этого, АМРК, активируемая через GHS-R - PLC - Са2+-путь, угнетает mTOR (Memmott R., Dennis P. Akt-dependent and -independent mechanisms of mTOR regulation in cancer. Cell Signal. 2009. V. 21, P. 656-664), что также способствует превалированию экспрессии FOXP3.

Рассматривая принципиальную роль PI3K в реализации эффектов грелина, следует отметить, что по данным литературы активация GHS-R вызывает как угнетение PI3K через Gaq-субъединицу (Ballou L„ Chattopadhyay М„ Li Y. et al. Galphaq binds to pi I0alpha/p85alpha phosphoinositide 3-kinase and displaces Ras. J. Biochem. 2006. V. 394, P. 557-562), так и стимуляцию PI3K через Ру-субъединицы G-белка (Schellekens П., Dinan Т., Cryan J. Taking two to tango: a role for ghrelin receptor heterodimerization in stress and reward. Front Neurosci. 2013. V. 7, A. 148). Поэтому определение роли PI3K в поляризирующих эффектах грелина требует дальнейших уточнений. Учитывая, что блокада PI3K меняет направленность действия грелина, можно предположить, что PI3K регулирует экспрессию ключевых транскрипционных факторов, таких как Smad3 (фактор транскрипции TGF-P), NFAT (ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов), NF-кВ и АР-1 (активирующий протеин-1), кооперация которых также приводит к преобладанию экспрессии либо FOXP3, либо RORyt (Tone Y„ Furuuchi К., Kojima Y. el al. Smad3 and NFAT cooperate to induce Foxp3 expression through its enhancer. Nat. Immunol. 2008. V. 9, P. 194-202). Другим возможным механизмом, объясняющим ключевую роль Р13К в грелин-опосредованной регуляции дифференцировки CD4Т-лимфоцитов, является участие PI3K в контроле локальной продукции и деградации внутриклеточного сАМР,

который реципрокно, инициируя/угнетая разные сигнальные пути, активирует либо FOXP3, либо RORyl.

Анализ совместных эффектов гормонов показывает, что ингибирование РКА и PI3K не влияет на совместное действие лептина и грелина на индукцию aThl7 (рисунок 10), но Н-89 отменяет стимулирующий эффект комбинации лептина и грелина на индукцию aTreg (рисунок 10). Можно полагать, что характерное для 1-II триместров беременности повышение числа aTreg периферической крови обусловлено эффектами грелина, реализуемыми через РКА. При одномоментном связывании лептина и грелина с клеткой за счет грелин-опосредованного повышения внутриклеточного сАМР реализуются, главным образом, РКА-зависимый эффект грелина, что приводит к усилению экспрессии FOXP3 и преимущественному формированию aTreg. По-видимому, РКА является ключевым фактором кооперации сигнальных путей лептина и грелина, что характерно и для других типов клеток (Kohno D., Gao Н., Muroya S. et al. Ghrelin directly interacts with neuropeptide-Y-containing neurons in the rat arcuate nucleus: Ca2+ signaling via protein kinase A and N-type channel-dependent mechanisms and cross-talk with leptin and orexin. Diabetes. 2003. V. 52, P. 948-956). Гипотетический механизм реализации совместных эффектов лептина и грелина суммирован на рисунке 12. Можно предполагать, что экспрессия FOXP3 в ответ на активацию С04+Т-клетки является доминирующей, тогда как для экспрессии RORyl необходимы дополнительные стимулы, например, связывание с провоспалительными цитокинами.

Таким образом, определены молекулярные механизмы регуляции лептином и грелином дифференцировки С04+Т-лимфоцитов периферической крови в адаптивные субпопуляции Thl7/Treg с участием РКА и PI3K. Лептин в концентрации II-III триместров беременности усиливает дифференцировку CD4+T-лимфоцитов периферической крови в aTh!7 при участии PI3K. Реализация регуляторных эффектов грелина на формирование aTreg и aTh 17 задействует РКА и PI3K. Совместное действие лептина и грелина приводит к РКА-зависимому усилению образования aTreg.

Рисунок 12 - Гипотетическая схема реализации совместных эффектов лептина и грелина в регуляции формирования аТЫ7 и аГге§ из наивных С04'Т-лимфоцитов периферической крови.

Суммируя полученные данные, можно полагать, что лептин и грелин в физиологических концентрациях, отражающих уровень гормонов при беременности, являются значимыми регуляторами функций Г-клеточного звена иммунитета. Гормоны проявляют реципрокные модулирующие эффекты на функциональную активность зрелых Т-лимфоцитов и формирование регуляторных субпопуляций ТЫ 7 и Treg. Совместное действие гормонов в зависимости от триместра беременности и исследуемой функции либо нивелирует их самостоятельные эффекты, либо способствует преобладанию эффектов грелина. Полученные результаты дают основание предполагать, что при физиологически протекающей беременности, совместное действие лептина и грелина на зрелые Т-клегки периферической крови результируется в преимущественной активации С1)4'Г-димфоцитов с их последующей трансформацией в регуляторные субпопуляции, главным образом, в смещая направленность иммунного ответа по ТЬ2-типу путем усиления выработки 11,-4, что, в целом, дополняет механизмы, защищающие плод от цитолитической атаки материнских клеток и способствует формированию иммунной толерантности.

Роль лептина и грелина в регуляции тимического этапа формирования лимфоцитов

Исследование гормональной регуляции эффекторов адаптивного иммунитета включало оценку их тимического этапа развития.

Регуляция лептином и грелином феиотипического созревания, алоптоза тимоцитов и продукции цитокииов. Установлено, что лептин, грелин и их комбинации в концентрациях, характерных для беременности, не влияют на фенотипическое созревание тимоцитов, оцениваемое по изменению коэкспрессии С04/СЦ8 и переходу незрелых СЭ4+С08+тимоцитов в более зрелые С1МЧСП)8 /СП)4 С08+клетки (таблица 13). Рассматривая полученные результаты в аспекте беременности, можно полагать, что лептин и грелин не влияют на формирование основных Т-клеточных субпопуляций (ТИ, ЦТЛ) в тимусе, определяющих, в конечном счете, стратегию адаптивного иммунитета.

Таблица 13 - Фенотипические изменения в культуре тимоцитов под влиянием лептина и грелина (п- 10) Экспериментальное воздействие

Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл

С04+СЭ8+ тимоциты,% 86.64±2.28 86.66+3.13 85.8614,41 85,69+3,99 84,64+5,54

86,49±4,58 85,95±4,20

С04+СЭ8" ^гимоциты, % 8.64*2.62 9.871-2.73 ~ 10,32+3,15 10.87*3.21 12,48±4,67

10,17±3,90

10,20±3,43

С04С08+ тимоциты, % 3,43+1,65 2.5711.16 2.84+1,35 2,61+2,00 1,90+0,58

С04С08" тимоциты, %

1,28+0,72 " 0,88+0,46 0,96+0,51 0,82+0,62 0,97+0,51

2,53+1,30 0.79+0,43

3,02+1,65 0,81+0,51

В условиях направленной индукции апоптоза тимоцитов дексаметазоном, лептин, грелин, а также их комбинации в исследуемых концентрациях, проявляют выраженную антиапоптотическую активность, препятствуя кортикостероид-индуцированному апоптозу тимоцитов (таблица 14).

Таблица 14 - Влияние лептина и грелина на дексаметазон-индуцированный

апоптоз тимоцитов в модели т \>11го (п= 10)

Экспериментальное воздействие

Проба без внесения дексаметазона Контроль (дексаметазон, 10"6М) Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл

АпУ 'тимоциты, %

24,67+8,26* 82,41+7,01 60,81+22,14* 64,47+15,33* 65,36+18,51 66,93+16,69* 61,33+19,91* 67,83+17,92*

Примечание: * - различия статистически значимы (/><0,05) по парному критерию Стъюлентв к контролю

Учитывая, что беременность сопровождается физиологической инволюцией тимуса, причиной чему является индуцированный половыми стероидами апоптоз тимоцитов, полученные результаты дают основание предполагать, что при беременности лептин и грел и н в физиологических концентрациях способствуют сохранению массы и клеточиости тимуса.

Для выяснения механизмов тимопоэтического действия гормонов оценивали экспрессию рецепторов к IL-7 (IL-7R) и продукцию IFN-y и IL-4 тимоцитами. По данным литературы, IL-7 является основным тимопоэтическим фактором, поддерживающим рост и развитие тимоцитов, а вырабатываемые тимоцитами цитокины выполняют, главным образом, трофическую функции в тимусе (Ярилин A.A. Цитокины в тимусе. Биологическая активность и функции цитокинов в тимусе. Цитокины и воспаление. 2003. №2, С. 12-18). Установлено, что лептин в концентрации II-III триместров беременности, и комбинация лептина с грелином I-II триместров беременности, усиливали экспрессию IL-7R на С134+тимоцитах (рисунок 13). Другими авторами было показано, что лептин повышает выработку IL-7 эпителиальными клетками тимуса (Gruver A.L., Ventevogel M.S., Sempowski G.D. I.eptin receptor is expressed in thymus medulla and leptin protects against thymic remodeling during endotoxemia-induced thymus involution. J. Endocrinol. 2009. V. 203, P. 75-85). Суммируя эти данные, можно полагать, что возможным механизмом тимопоэтического действия лептина является не только усиление выработки IL-7 эпителиальными клетками тимуса, но и повышение экспрессии IL-7R на СТМ'тимоцитах.

CD4TL-7R \ %

I

■

К Л1 Л2 Г1 Г2 Л1+Г1 Л2+Г2

Рисунок 13 - Влияние гормонов на экспрессию IL-7R на ОМ'тимоцитах в модели in vitro. Примечание: по оси ординат - процент CD4ML-7R 'тимоцитов (п=10); по оси абсцисс экспериментальное воздействие: К контроль; Л1 лептин, 10 нг/мл, Л2 - лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 - лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл; Л2+Г2 лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл; П грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; * - различия статистически значимы (/КО,05) по парному /-критерию Стьюдента к контролю

При оценке гормональной регуляции продукции цитокинов тимоцитами установлено, исследуемые гормоны в концентрациях, характерных для беременности, действуя как самостоятельно, так и совместно усиливают синтез IL-4 тимоцитами, но не влияют на выработку IFN-y (таблица 15). Только лептин в концентрации характерной для I триместра беременности усиливал продукции IFN-y тимоцитами. Следует отметить, что сходные эффекты гормоны оказывают и на зрелые Т-лимфоциты периферической крови, усиливая выработку II .-4, как CD4+, так и CD8'лимфоцитами. Таким образом, можно предполагать, что гормональная

регуляция ТЬ2-девиации начинается уже на этапе тимической дифференцировки Т-клеток.

Таблица 15 - Модуляция гормонами продукции 1L-4 и IFN-y тимоцитами в системе in vitro (n=8)______

Экспериментальное воздействие IL-4, пг/мл IFN-y, пг/мл

Контроль 4,06+1,29 5,56+1,36

Лептин, 10 нг/мл 4,64+0,79 19,83±1,47*

Лептин, 35 нг/мл 40,25±9,98* 8,94±3,57

Грелин, 1,25 нг/мл 76,26± 11,24* 5,65+2,14

Грелин, 0,83 нг/мл 76,18± 10,04* 5,11 ± 1,52

Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 64,19±22,15* 8,21+3,89

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 59,28± 15,25* 7,54±3,35

Примечание: * - различия статистически значимы (р<0.05) по парному /-критерию Стъюдента к контролю

Таким образом, лептин и грелин эффективно регулируют тимичеекий этап развития Т-лимфоцитов. Не влияя на фенотипическое созревание, гормоны модулируют продукцию IL-4 тимоцитами и препятствуют дексаметазон-индуцированному апоптозу тимоцитов. Лептин, возможно, опосредует свои антиапоптотические и тимопоэтические эффекты путем увеличения экспрессии рецептора к IL-7 на С04'тимоцитах.

Роль лелтина и грелина в регуляции тимического формирования натуральных Thl7 и Treg и контроле их функциональной активности. Учитывая значимую роль лептина и грелина в контроле функций Т-регуляторных клеток периферической крови, важно было оценить влияние гормонов на формирование естественных (натуральных) регуляторных Т-клеток (nThl7/nTreg), которые образуются в тимусе из С04+тимоцитов (Annunziata F., Cosmi L.. Liotta F. el al. The phenotype of human ТЫ 7 cells and Iheir precursors, the cytokines that mediate their differentiation and the role of Thl7 cells in inflammation. Int Immunol. 2008. V. 20, P. 1361-1368). Для этого тимоциты культивировали с гормонами в присутствии факторов, создающих условия для преимущественного формирования либо nTreg (в присутствии TGF-ßl), либо в nThl7 (в присутствии IL-1/J/IL-6).

Установлено, что лептин препятствует формированию nTreg, снижая количество CD4+CD25br'6l,,FOXP3+KneTOK в культурах TGF-ßl-примированных тимоцитов (таблица 16). Грелин не оказывает влияния на формирование nTreg тимусе. Сочетанное действие лептина и грелина в комбинации, соответствующей первой половине беременности не влияет, а в комбинации второй половины беременности - снижает число CD4+CD25br'BhlFOXP3+iuieTOK в культурах TGF-ßl -примированных тимоцитов. Лептин и грелин не оказывают значимых эффектов на экспрессию иммуносупрессорных молекул CTLA-4 и GITR на nTreg в тимусе (таблица 16). Таким образом, исследуемые гормоны угнетают генерацию nTreg на тимическом этапе, но не влияют на их супрессорный потенциал.

CTLA-4+, % GITR', %

Таблица 16 - Влияние гормонов на формирование nTreg (CD4fCD25b"6hlFOXP3+) в культурах TGF-pi-примированных тимоцитов и экспрессию на них иммуносупрессорных молекул CTLA-4 и GITR in vitro (n=7) i Экспериментальное С04;сЬ25ЬпеЬТОХРЗ+, ! воздействие %

I Контроль 57,71 ±9,81 59,62±14,5 32,57±7,17

j Лептин, Юнг/мл 36,27±4,34* 61^64±J7,69___30,90±7,50

Лептин, 35нг/мл 40,31±2,58* 73,56± 10,88 31.00+6,05

I релин. 1,25 нг/мл 35.87119.83 60,8± 10,69 23,91 ±6,71

I релин. 0.83 нг/мл 61,33+13,97 51,98± 13,90____25,78±4,99

Лептин. Юнг/мл ' 48.89) 12.53 65,03 40.31 28,95+11,30 Грелин, 1,25 нг/мл ____________ _ ___________

Лептин, 35 нг/мл + 43,69±2,14* 62,99± 14,41 20,45±5,66 Г^релин, 0,83 нг/мл ___________________

Примечание: * - различия статистически значимы (р<0,05) по парному /-критерия Стьюдента с контролем

На формирование пТЫ7 в тимусе гормоны оказывают противоположные эффекты. Грелин в концентрации 1-11 триместров беременности угнетает образование пТЫ7 в тимусе и не влияет на продукцию 1Ь-17А тимоцитами (таблица 17). Лептин снижает продукцию 1Г-17А в супернатантах культур тимоцитов в первой половине беременности, а во второй половине повышает число пТЫ7. Действуя совместно, гормоны нивелируют разнонаправленные эффекты друг друга и не влияют на генерацию п'ГЫ7.

Таблица 17 - Влияние гормонов на генерацию пТЫ7 (С04+Я0Яу1+1Ь-17А+) и продукцию 1Ь-17А в культурах 1Ь-1 (У1Ь-6-примированных тимоцитов в модели ¡п уЦго (п=8) ___________________________

Экспериментальное воздействие ' „. 1Ь-17А, пг/мл ______________________тимоциты, %_ _ ___________

Контроль ______0,53±0116 5,87+2,57

Лептин, Юнг/мл 0,64±0,21 2,42±1,14*

Лептин, 35 нг/мл 0,76±0,06* _______2,69+1,36____

Грелин, 1,25 нг/мл 0,21 ±0,02* 6,53:4,35 ^

Грелин. 0,83 нг/мл ' 0.36-0,16 6,02±3,44 ^

Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 0,65±0,38 3,71±2,18

Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 0,61±0,21 3,31 + 1,49

Примечание: * - различия статистически значимы (ут<0,05) по парному /-критерия Стьюдента с контролем

Таким образом, самостоятельные эффекты лептина и грелина на тимическом этапе сходны по направленности с влиянием гормонов на образование адаптивных регуляторных Т-клеток из зрелых СЭ4 Т-клеток периферической крови, что, очевидно, объясняется общими закономерностями регуляции экспрессии транскрипционных факторов, ответственных за формирование ТЫ 7 и Тге§. Однако в отличие от влияния на зрелые Т-лимфоциты, в тимусе реализуется преимущественно угнетающие эффекты гормонов на формирование Tгeg, что, возможно, связано с незрелостью тимоцитов.

Влияние лептииа и грелина на формирование iNKT-кпеток в тимусе.

Поскольку лептнн и грелин регулируют функциональную активность NKT-клеток периферической крови, необходимо было оценить роль гормонов на формирования этих клеток в тимусе, где они дифференцируются из дубль-позитивных CD4+CD8+thmouhtob (Bendelac A., Savage Р.В., Teyton L. The biology of NKT cells. Annu. Rev. Immunol. 2007. V. 25, P. 297-336). У человека популяция NKT-клеток в основном представлена 1NKT, экспрессирующими в отличие от неинвариантных (минорная субпопуляция) Т-клеточный рецептор, имеющий только один вариант V-домена а-цепи (Va24), комплексированный с Vßll. Поэтому количество iNKT-клеток оценивали как процент Уа24-позитивных клеток в гейте СОЗ+тимоцитов после культивирования с гормонами. Установлено, что грелин в концентрации III триместра беременности препятствует формированию iNKT-клеток (таблица 18). Лептин в концентрации II-III триместров беременности, напротив, увеличивает число iNKT-клеток в культуре тимоцитов. При совместном внесении гормонов лептин и грелин нивелируют оппозитные эффекты друг друга и не оказывают действия на количество iNKT-клеток в культуре тимоцитов.

Таблица 18 - Модуляция гормонами количества iNKT-клеток (CD3+Va24+) в культуре тимоцитов в системе in vitro (n=8)

Экспериментальное воздействие Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл

"релин, 1,25 нг/мл

Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл

CD3'Va24'THMOUHTbi. %

___0.93 t 0.12

0.82.10.15

___1.31 ±0,22*__

0.65*0.21

0,65±0,11* 0,88±0, j j 0.9010.21

Примечание: * - различия статистически значимы (/КО,05) по па()ному_/-|д)итерия Стьюдента с контролем

Однонаправленность эффектов гормонов на формирование nThl7 и iNKT-клеток в тимусе, по-видимому, объясняется общими закономерностями регуляции экспрессии RORyt С04+тимоцитами, необходимого для начальных стадий развития, как iNKT-клеток, так и nThl7 (Bendelac A.. Savage Р.В., Teyton L. The biology of NKT cells. Annu. Rev. Immunol. 2007. V. 25, P. 297-336). Очевидно, что лептин. усиливая экспрессию RORyt С04+тимоцитами, способствует их преимущественной дифференцировке в nThl7 и iNKT-клетки в тимусе. В то время как грелин стимулирует экспрессию транскрипционного фактора ГОХРЗ, являющегося ингибитором для RORyt, что объясняет угнетающий эффект грелина на формирование nThl7 и iNKT-клеток (lchiyama К., Yoshida H., Wakabayashi Y. et al. Foxp3 inhibits RORyt-mediated IL-I7A mRNA transcription through direct interaction with RORyt. J. Biol. Chem. 2008. V. 283, P. 17003-17008).

Рассматривая действие лептина и грелина на уровне тимуса в контексте беременности, можно полагать, что гормоны, угнетая апоптоз тимоцитов и усиливая выработку IL-4 и экспрессию IL-7R тимоцитами, способствуют сохранению массы и клеточности тимуса, препятствуя его временной инволюции, характерной для беременности. Тогда как ограничение гормонами генерации nTreg во второй половине беременности, по-видимому, направлено уже на подготовку иммунной

системы матери для выхода из состояния толерантности после беременности, на фоне усиления гормонами формирования aTreg в периферической крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Характеризуя основные иммуномодулирующие эффекты лептина и грелина, можно заключить, что на уровне клеток врожденного иммунитета действие гормонов направлено на сохранение защитных свойств организма матери и фетопротекцию, тогда как в регуляции адаптивного иммунитета эффекты гормонов способствуют перестройке иммунных реакций, формируя состояние иммунной толерантности на периферии. Полученные данные открывает новые перспективы в исследовании гормональной регуляции иммунных процессов, ассоциированных с феноменом толерантности (беременность, канцерогенез). Гипотетическая схема, суммирующая механизмы участия лептина и грелина в формировании иммунной толерантности представлена на рисунке 14.

С1)4 I-КЛЕТКИ

Рисунок 14 - Гипотетическая схема реализации совместных эффектов лептина и грелина в формировании иммунной толерантности на уровне клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Примечание: сплошная стрелка стимулирующий эффект, пунктирная стрелка - угнетающий эффект

ВЫВОДЫ

1. Лептин в концентрациях, характерных для беременности, угнетает фагоцитарную активность и стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию моноцитов в отношении бактериальных объектов, но не влияет на продукцию окиси азота. Лептин в концентрации II-III триместра беременности снижает спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию моноцитов, но повышает активность индоламин-2,3-диоксигеназы. Грелин в исследуемых концентрациях угнетает фагоцитарную активность моноцитов в отношении бактериальных объектов и продукцию окиси азота, но не влияет на стимулированную и спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию и активность индоламин-2,3-диоксигеназы. Физиологические комбинации лептина и грелина не влияют на фагоцитарную активность, спонтанную и стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию моноцитов, но в комбинации первой половины беременности (I-I1 триместр) угнетают продукцию окиси азота моноцитами, тогда как во второй половине (II-III триместр) усиливают активность индоламин-2,3-диоксигеназы.

2. Лептин в концентрации 1 триместра беременности повышает, а во 11-111 триместре снижает количество CD56 'NK-клегок, экспрессирующих CD 16. Грелин не влияет на экспрессию CD 16 на СОббЧМК-клетках. Комбинация гормонов, характерная для второй половины беременности (11-111 триместр) увеличивает количество С056'Ь]К-клеток, экспрессирующих CD16. Одновременно исследуемые гормоны, а также их комбинация второй половины беременности (11-111 триместр) повышают число С056Ьпв1">]К-клеток и экспрессию L-селектина на них, но снижают экспрессию рецептора ß-хемокинов 7 типа на NK-клетках.

3. Лептин в концентрации II-III триместра беременности повышает уровень CD16'CD56'NKT-iuieTOK периферической крови. Грелин, а также сочетания лептина с грелином в исследуемых концентрациях не влияют на количество CD16+CD56+NKT-FOjeTOK периферической крови.

4. Грелин в концентрации I-II триместра беременности повышает количество активированных Th-клеток и апоптоз лимфоцитов, а в концентрации 111 триместра не влияет на эти показатели. Лептин снижает уровень активированных Th-клеток и апоптоз лимфоцитов. Комбинации лептина и грелина не влияют на апоптоз лимфоцитов, но усиливают экспрессию маркера активации/готовности к вступлению в апоптоз (CD95) С04+Т-лимфоцитами. Грелин и комбинации лептина с грелином не влияют на внутриклеточный синтез интерферона-у, но стимулируют синтез интерлейкина-4 Th-клетками и цитотоксическими лимфоцитами. В комбинации I-II триместров беременности гормоны не влияют, а в сочетании II-III триместра увеличивают количество активированных Th-клеток.

5. Лептин в концентрации II-III триместров беременности усиливает дифференцировку С04+Т-лимфоцитов периферической крови в адаптивные Thl7 при участии фосфатидилинозитол-3-киназы и продукцию интерлейкина-17А. Одновременно лептин препятствует образованию адаптивных Treg. Грелин в концентрации 1-11 триместров беременности, напротив, усиливает формирование адаптивных Treg, но угнетает поляризацию в адаптивные Th 17 и продукцию интерлейкина-17А. Реализация регуляторных эффектов грелина на формирование адаптивных Th 17/Treg задействует фосфатидилинозитол-3-киназу и протеинкиназу А. Совместное действие лептина и грелина приводит к протеинкиназа А-зависимому усилению образования адаптивных Treg. Лептин и комбинации лептина с 1релином

препятствуют апоптоэу СЛМ'Т-лимфоцитов периферической крови. Грелин и лептин в концентрациях, характерных для беременности, разнонаправлено регулируют экспрессию иммуносупрессорных молекул на Treg периферической крови.

6. Лептин и грелин не влияют на экспрессию корецепторных молекул CD4/CD8 тимоцитами и продукцию интерферона-у, но усиливают выработку интерлейкина-4 тимоцитами. Исследуемые гормоны угнетают кортикостероид-индуцированный апоптоз тимоцитов. Лептин в комбинации с грелином в I-II триместрах беременности и сам лептин в концентрации II-III триместра беременности усиливают экспрессию рецептора к интерлейкину-7 на CD4 гимоцитах.

7. Лептин угнетает формирование натуральных Treg в тимусе, а в концентрации II-III триместра беременности усиливает генерацию натуральных Thl7 и инвариантных NKT-клеток в тимусе. Грелин не влияет на формирование натуральных Treg в тимусе, а в концентрации I-II триместра снижает уровень натуральных Thl7, а в III триместре - угнетает генерацию инвариантных NKT-клеток в тимусе. Совместное действие гормонов не оказывает эффектов на уровень натуральных Thl7 и инвариантных NKT-клеток в тимусе, но препятствует образованию натуральных Treg во второй половине беременности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Орлова, Е.Г. Модуляция лептином фагоцитарной активности и продукции цитокинов моноцитами периферической крови женщин / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции, 11-14 апреля 2005 г. - Russian Journal of immunology. - 2005. - V. 9, Suppl. 2. - P. 246.

2. Ширшев, C.B. Молекулярные механизмы регуляции лептином функциональной активности мононуклеарных фагоцитов / C.B. Ширшев, Е.Г, Орлова // Биохимия. - 2005. - JV« 8. - С. 1021-1030.

3. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином фагоцитарной и секреторной активности моноцитов периферической крови женщин / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы IX Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 23-26 мая 2005 г. -Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, № 2-3. - С. 315-316.

4. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином функциональной активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови женщин in vitro / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы IV конференции иммунологов Урала. 17-19 октября 2005 г. -Иммунология Урала. -2005. -№ 1(4). - С. 20-21.

5. Ширшев, C.B. Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности лимфомиелоидных клеток /C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова // Успехи современной биологии. - 2006. -Т. 126, №5. - С. 481-491.

6. Орлова, Е.Г. Механизмы модуляции лептином фагоцитарной активности и продукции цитокинов моноцитами и нейтрофилами периферической крови женщин / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА. - 2006. - С. 81 -85.

7. Орлова Е.Г. Лептин как возможный модулятор микробицидной активности моноцитов при беременности / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы X Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 23-26 мая 2006 г. - Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 164-165.

8. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином окислительной и фагоцитарной активности моноцитов женщин в разные фазы менструального цикла / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы V конференции иммунологов Урала. 17-19 октября 2006 г. -Иммунология Урала. -2006.-№ 1 (4).-С. 164-165.

9. Орлова, Е.Г. Модуляция лептином функциональной активности моноцитов человека / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Вестник Уральской Медицинской академической науки. - 2006. - № 3(1). - С. 170-173.

10. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином микробицидной активности моноцитов человека / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Физиология человека. - 2007. - Т. 33, № 4.-С. 109-113.

11. Орлова, Е.Г. Модуляция лептином функциональной активности нейтрофилов и моноцитов периферической крови женщин / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Цитокины и воспаление. - 2007. - № 3. - С. 44-49.

12. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином окислительной и фагоцитарной активности моноцитов женщин в разные фазы менструального цикла / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Проблемы эндокринологии. - 2007. - № 3. - С. 26-29.

13. Орлова, Е.Г. Исследование роли лептина как возможного модулятора иммунной системы матери при беременности / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Вводные лекции и тезисы докладов 2-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» Сочи, 15-18 мая 2007г- Russian Journal of immunology. - 2007. - С. 97-98.

14. Орлова, Е.Г. Механизмы регуляции лептином микробицидного потенциала моноцитов периферической крови женщин / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Вестник Пермского университета - Вып. 9(25), серия Биология. - 2008. - С. 81-86.

15. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином экспрессии активационных маркеров разными субпопуляциями Т-лимфоцитов / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Тезисы докладов VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», Пермь-Ы.Новгород-Пермь, Россия, 29 сентября -5 октября 2008 - С. 73.

16. Орлова, Е.Г. Влияние лептина на функциональную активность моноцитов периферической крови женщин / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев, Е.М.Трофимова // Биология - Наука XXI века: 13-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 28 сентября-2 октября 2009 г). - 2009. - С. 125.

17. Орлова, Е.Г. Лептин как возможный фактор регуляции иммунитета при физиологически протекающей беременности / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Материалы XIII Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 8-11 июня 2009 г. - Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 330.

18. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином экспрессии активационных маркеров разными субпопуляциями Т-лимфоцитов / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // VIII Молодежная научная конференция Института физиологии Коми НЦ УрО РАН,- Сыктывкар. 2009,- Тез.докл (14-16 апреля 2009). - 2009. - С. 146-149.

19. Орлова, Е.Г. Роль лептина в контроле экспрессии активационных мембранных молекул разными субпопуляциями Т-лимфоцитов / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Известия РАН. - 2009. - № 4. - С. 401-405.

20. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином функциональной активности моноцитов женщин в модели in vitro / Е.Г. Орлова, C .B. Ширшев // Вестник Уральской Медицинской академической пауки. - 2009. - Лв 2/1(24). - С. 287-289.

21. Орлова, Е.Г. Лептим как фактор иммунорегуляции мри физиологически протекающей беременности / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Г.147, № 7. -С. 88-92.

22. Orlova, E.G. Leptin and ghrelin regulate the expression of membrane molecules and an apoptosis of lymphocytes / E.G. Orlova, S.V. Shirshev // Internantional Immunology. 14th International Congress of Immunology. - V. 22, №1. -2010. - P. 182.

23. Орлова, Е.Г. Изучение совместных эффектов лептина и грелина в регуляции функциональной активности моноцитов человека / Е.Г. Орлова // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т.4 (13), № 4. - С. 390.

24. Орлова, Е.Г. Некоторые аспекгы иммуномодулирующей активности лептина / Е.Г. Орлова // Вестник Уральской Медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1(24). - С. 62-63.

25. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и апонтоза лимфоцитов человека при беременности / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Проблемы эндокринологии. - 2010. - Т.56, № 3. - С. 26-30.

26. Орлова, Е.Г. Регуляция грелином функциональной активности моноцитов человека в модели in vitro / Е.Г. Орлова, С'.В. Ширшев // Доклады академии наук. - 2010. - Г. 434, X« 6. - С. 821-824.

27. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином и грелином индукции Т-регуляторных лимфоцитов / Е.Г. Орлова // Весгник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 35, № 2/1. - С. 55-56.

28. Орлова, Е.Г. Влияние лептина и грелина на синтез ингерферона-у и ингерлейкина-4 Т-лимфоцигами периферической крови в системе in vitro / Е.Г. Орлова // Весгник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -№ 4/1.-С. 144-145.

29. Ширшев, C.B. Влияние гормонов репродукции на индукцию CD4+CD25bn,l1'Foxp3+ Т-регуляторных лимфоцитов / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. )аморина, И.В. Некрасова // Доклады академии наук. - 2011. - Г. 440, № 1. -С. 132-135.

30. Ширшев, C.B. Регуляция лептином и грелином активности индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитов / С'.В. Ширшев, Е.Г. Орлова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1. - С. 161.

31. Ширшев, C.B. Гормональная регуляция тимического этапа дифференцировки инвариантных NKT-клеток / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Замирина, И.В. Некрасова //Доклады академии наук. - 2012. - Т. 446, № 5. -С. 587-589.

32. Орлова, Е.Г'. Изучение роли лептина и грелина в индукции тимического этапа дифференцировки инвариантных NKT-клеток / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев //Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6(14), № 2(1). - С. 128-129.

33. Орлова, Е.Г. Роль лептина и грелина в индукции дифференцировки Thl7-лимфоцитов / Е.Г. Орлова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - № 4/(41). - С. 56-57.

34. Ширшев, C.B. Гормональная регуляция продукции IFN-y и IL-4 тимоцитами / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. )аморина, И.В. Некрасова // Весгник Уральской медицинской академической науки. - 2012. -№ 4/(41). - С". 76-77.

35. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином и грелином продукции иптерферопа-гамма и интерлейкина-4 в системе in vitro / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Вестник Пермского

университета. - Вып. 3, серия Биология. - 2012. - С. 81-83.

36. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином и грелином апоптоэа С04+-лимфоцитов in vitro / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Вестник Пермского университета. - Вып. 3, серия Биология.-2013.-С. 100-104.

37. Орлова, Е.Г. Роль лепгина и грелина в инлукцни дифференцировкн регуляторных Т-лимфоцитов / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7(16), № 2(3). - С. 132-133.

38. Орлова, Е.Г. Регуляция грелином функциональной активности моноцитов. Роль блокады кальциевых каналов L-типа верапамилом / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев//Иммунология.-2013.-Т. 34, № 1.-С. 19-24.

39. Орлова, Е.Г. Роль лептина и грелина в индукции дифференцировкн ИЛ17-продуцируюших и Т-регуляторных лимфоцитов / Е.Г. Орлова, C.B. Ширшев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 12. - С. 786-791.

40. Ширшев, C.B. Гормональная регуляция тимического этапа дифференцировкн IL-17-продуцирующих и Т-регуляторных лимфоцитов / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморина, И.В. Некрасова // Доклады Академии Наук.-2014.-Т. 454,№ 1.-С. 103-106.

41. Орлова, Е.Г. Регуляция лептином и грелином свойств дендритных клеток / Е.Г. Орлова // Российский иммунологический журнал. — 2014. - Т. 8(17), № 1. -С. 16-19.

42. Ширшев, C.B. Гормоны репродукции в регуляции экспрессии молекулы CDI6 интактными NK-клеткамн / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморииа, И.В. Некрасова, OJ1. Горбунова // Российский иммунологический журнал -2014. - Т. 8(17), № 1 - С. 20-24.

43. Орлова, Е.Г'. Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и продукции цитокинов натуральными Т-рс1уляторными клетками / Е.Г. Орлова. C.B. Ширшев, O.A. Логинова // Вестник Пермского университета. - Вып. I, серия Биология. - 2014. - С. 49-52.

44. Ширшев, C.B. Роль гормонов, ассоциированных с гестацией, в регуляции экспрессии молекул, отвечающих за функциональную активность NK-клеток / C.B. Ширшев, Н.В. Некрасова, С.А. Заморина, О.Л. Горбунова, Е.Г. Орлова, И.В. Масленникова // Доклады Академии Наук. - 2014. - Т. 457, № 5. - С. 618621.

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода ИФА - индекс фагоцитарной активности ЛЗХЛ - люминолзависимая хемилюминесценция ЛПС - липополисахарид

МГ1К - мононуклеарпыс лейкоциты периферической крови

1ДТЛ - цитотоксическис лимфоциты

АМРК - АМР-активирусмая протеипкиназа

сАМР - аденозин-3'5'-циклофосфат

СаМКК2 - кальмодулин-зависимая протеипкиназа

CCR6 - рецептор ß-хемокинов 6 типа

CCR7 - рецептор ß-хемокинов 7 типа

CD (cluster of differentiation) - мембранные маркеры клеток

CREB (cAMP response element binding protein) - белок, связывающий cAMP-

чувствительный элемент CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) - ассоциированный с цитотоксическими

лимфоцитами антиген 4 ERK1/2 - экстраклеточно-регулируемая протеинкиназа FOXP3 (forkhead box РЗ) - транскрипционный фактор Treg GARP (Glycoprotein A repetitions predominant) - рецептор для латентного

трансформирующего фактора роста (TGF-pi) GITR - индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухоли

(TNF-a) GHS-R - рецептор грелина lFN-y - интерферон-у IDO - индоламин-2,3-диоксигеназа IL - интерлейкин JAK2 - янус-киназа

МАРК - мигоген-активированные киназы

MSK1 -митоген-и-стресс-активированная протеинкиназа 1

mTOR - мишень рапамицина млекопитающих

NFAT - ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов

NF-kB - ядерный фактор кВ

NK (Natural killer) - натуральные киллеры

NKT - Т-клетки с функциями натуральных киллеров

Ob-R - рецептор лептина

PDE - фосфодиэстераза

РКА - протеинкиназа А

Р13К - фосфотидилинозитол- 3-киназа

RORyt (retinoic acid-related orphan receptor yt) - транскрипционный фактор Smad2/3 - фактор транскрипции TGF-P

STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)- передатчик сигнала и

активатор транскрипции Th 1, Th2 - Т-хелперы 1 и 2 типа Th 17 - интерлейкин-17-продуцирующие Т-хелперы TGF-P - трансформирующий фактор роста р TNF-a - фактор некроза опухоли a Treg - Т-регуляторные лимфоциты

Орлова Екатерина Григорьевна

ОСНОВНЫЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск - 2015

Подписано в печать 15.01.2015. Формат 60x90/16.Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 2,0 Набор компьютерный. Отпечатано в ФГБУН ИЭГМ УрО РАН 614081, Пермь, ул. Голева, 13

15 --7446

2015676209

2015676209