Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Ослабление побочного действия радиации на почкис помощью общей гипоксии при моделированииусловий лучевой терапии

На правах рукописи

Ослабление побочного действия радиации на почки

с помощью общей гипоксии при моделировании

условий лучевой терапии (14.00.14 - Онкология )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН и Днепропетровской государственной медицинской академии

Научные руководители Доктор биологических наук

А.А.Вайнсон

Доктор биологических наук; профессор Е.Г.Слесаренко

Официальные опппоненты

Доктор медицинских наук, профессор К.Н.Костромина

Доктор биологических наук, профессор А.Г.Коноплянников

Ведущая организация Научно-исследовательский

онкологический институт им. Н.Н.Петрова МЗМП РФ

Защита состоится -Я- (С¡¿Т'/гШ^т г. в / Ь часов на заседании диссертационного совета К.001.17.01 в Онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН

Автореферат разослан \ 996 г.

, Ученый секретарь совета, д.м.н., профессор У' В.С.Турусов

J. ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Лыхониэ газовыми смесями с пониженным по сравнению с воздухом содержанием кислорода используется в Онкологическом научном иентре РАМН, ряде других Российских учреждений и в зарубежных клиниках для селективного уменьшения глубины поражения нормальных тканей организма при лучевой терапии опухолей, Наиболее яркие примеры защитного действия гипоксии полумены при широкопольном облучении опухолей органов брюшной полости и малого таза, а именно рака желудка, шейки матки и эабрюшинных новообразований (Амосов И.С. с соавт.,1984; Коссэ В.А. с соавт.,1984; Мардынский Ю.С, с соавт.,1985; Асляев /I.A. с соавт.,1986; Тачев Т. ссоавт.,1990).

Использование для дыхания смесей, содержащих 8 или 9% кислорода, дало возможность увеличить на 20-40% подводимую к опухоли дозу излучения и, тем самым, улучшить результаты лучевой терапии. Степень увеличения дозы излучения определяется глубиной зашиты наиболее радиочувствительных органов, попадающих в зону воздействия, среди которых должны быть названы почки (Luxton R.W.,1953; Roser. S et al.,1964; Тареев E.M.1982; Casarett G, W. 1968).

иелью данного исследования явилась оценка эффективности использования гипоксической газовой смеси, содержащей 8% кислорода, для зашиты нефроэпителия и сосудов почки, а также снижения активности склероза интерстииия по количественно учитываемым изменениям в структуре этих тканей после локального однократного и фракиионированного облучения.

Для достижения поставленной иели решались следующие задачи:

1. определялась степень альтеративных изменений в гломерулярном аппарате почек по величине коэффициента поражения клубочка;

2. изучались морфология и морфогенез радиаиионного поражения в тубулярном аппарате коркового слоя почек путем выявления в нефроэпителии активности сукиинатдегидрогеназы (СДО и /щелочной фосфатазы (ШФ), общего количества ядер, ядер с признаками лучевого патоморфоза и количества двуядерных клеток;

3. определялась степень склероза внутриорганных сосудов артериального типа по величине сосудистого индекса;

4. характеризовалась степень склероза структур почки по величине относительней. объема интейстшиякоркового вещества;

5. устанавливалась, отдельно для каждой исследованной • структурной единицы почки, степень зашитного действия гипоксии по величине фактора изменения дозы (ФИЛ)

Научная новизна полученных результатов. Впервые дана количественная

характеристика степени радиационного поражения' различных морфо-

»

функциональных структур почек после однократного и фракционированного облучения на воздухе и в гипоксии. По величине коэффициента поражения клубочка оценен морфологический феномен повышения плотности капиллярных петель клубочка после облучения и определена степень зашиты экзогенной гипоксией гломерулярного аппарата, которая оказалась равной 1,25 - 1,29. Установлено, что степень зашиты канальиевого эпителия коркового слоя почек, определенная по величине индекса активности ШФ и СДГ, по обшему количеству ядер, количеству ядер с признаками лучевого патоморфоза и количеству двуядерных клеток находится в пределах 121 -1,41. Обнаружено, что между обшим количеством ядер в составе нефроэпителия и количеством ядер с признаками лучевого патоморфоза, а также между количеством ядер лучевого патоморфоза и количеством двуядерных клеток нефроэпителия существует выраженная обратная зависимость. Дан анализ содержания двуядерных клеток в нефроэпителии коркового слоя облученных почек в аспекте развития неспецифических адаптационных реакций, при этом показано, что после облучения в гипоксии процесс полиплоидизации 'нёфроэпителия протекает более активно, чем после облучения на воздухе, что, вероятно, обеспечивает более длительную адаптацию тубулярного аппарата почек к пострадиационному повреждению. Показано также, что наиболее низкий зашитный эффект экзогенной гипоксии определяется для срсудов артериального типа по величине сосудистого индекса и наиболее высокий для интегрального показателя нефросклероза - относительного обьема интерстиция коркового слоя почек. Впервые на основании сопоставительного анализа морфометрических данных о склерозе различ-ых структур почек после облучения сделан вывод о том, что наиболее эффективно гипоксия зашишает, очевидно, эндотелий перитубулярных и клубочковых капилляров. Зашитное действие гипоксии при этом увеличивается при переходе от однократного К" фракционированному облучению. Использование данного'радиомодификатора позволило, таким образом,

выязить новые пспоморфологические аспекты известных ранее структурных феноменов.

Научно - практическая ценность- результатов. На основании полученных данных определены границы безопасного применения гипоксической газовой смеси, содержашей 8% кислорода, во время облучения опухолей, локализованных в брюшной полости, когда в зону облучения попадают почки. Применение гипоксии во время облучения позволяет повышать подводимую к очагу суммарную оозу на 20-30% без увеличения тяжести лучевых ' реакций со стороны почки как органа лимитируюшего дозу в данном регионе. Выводы. , полученные при использовании методов количественной оценки поражения почечных структур, могут найти применение в лабораториях радиобиологического и токсикологического профиля,

Апробация диссертации. Диссертация апробирована на заседании Днепропетровского научного общества айатомов, гистологов, эмбриологов 15 февраля 1994 года.

Основные материалы доложены и обсуждены: на XIII Пленуме Правления Всесоюзного общества патологоанатомов по проблеме радиационной патологии (г. Обнинск, 9.10.1991 г.); на научно-практической конференции Днепропетровской медицинской академии (1994 г.); на I Национальном конгрессе анатомов, гистологов, эмбриологов Украины (г.Ивано-Франковск, 1994); на V Конгрессе мировой федерации украинских врачебных обществ (Днепропетровск, 1994).

Публикации. По материаламдиссер'тации опубликовано 7 научных работ. Структура и абьем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, содержащей экспериментальные данные с обсуждением результатов, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 84 отечественных и 79 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Исследования проведены на 350 мышах самцах (СВАхС57 В1), массой 22-26 г, полученных из питомников' "Рапполово" и "Столбовая". Животные! находились в лабораторных клетках по 8 особей и содержались на стандартном рационе. V

В течение одной недели до и после облучения мышей поили 1% раствором соляной кислоты для полдержания кислого рН желудочно-кишечного тракта.

Методика облучения. Почки неанестезированных мышей облучали локально на воздухе и в гипоксии в. двух вариантах опытов: однократно и в . виде 5 ежедневных фракций. Каждая экспериментальная группа содержала в животных, При однократном облучении на воздухе дозы составляли 11-18 Гр. при облучении в гипоксии - 13-19 Гр, с дозным интервалом между группами в 1 Гр; при 5-кратном облучении суммарные дозы на воздухе равнялись 25. 30, 35 Гр; в гипоксии 30, 35, 40 Гр; контролем служили необлученные мыши того же возраста. Однократное и фракционированное облучение проводили на рентгеновском аппарате "Stablllpan" фирмы "Siemens' при напряжении 220 кВ, силе тока 15 мА, КФР • 30 см, фильтре 0,5 мм Си + 6 мм оргстекла, мощности дозы 1.84 Гр/мин. (Остапенко В.В., 1992).

Приготовление препаратов почки и их окраска. Животных выводили из эксперимента через 8 и 10 месяцев после облучения, извлекали почки, часть материала фиксировали в растворе CVCD по Лилли. Материал обрабатывали по обшепринятой методике и изготавливали парафиновые блоки. Срезы толшиной 3-5 мкм после депарафинаиии окрашивали гематоксилин -эозином, по Маллори-Слинченко (1964) и по Мак-Манусу (Шик-реактивом). Другую часть материала замораживали в жидком азоте, изготавливали криостатные срезы толшиной 10 мкм и проводили гистохимические реакции. Для изготовления полутонких и ультратонких срезов почек брали кусочки размером 2x2 мм. помешали в раствор 2,5% глютаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере, заключали в аралдитовую смолу, изготавливали прлу-тонкие срезы, которые окрашивали метиленовым синим • Азур II фуксином. Ультратонкие срезы изготавливали по стандартной методике.

Определение коэффициента поражения клубочка. На препаратах, окрашенных по. Маллори-Слинченко. просматривали 100 почечных телец, отмечая при атом сегментарные (поражения части клубочка) и генерализованные (поражения всего клубочка) изменения, которые возникают ■ результате развития фибропластических процессов (Шулутко Б.И..1983). Учитывая тот факт, что эти изменения находят отражение преимущественно • расширении зоны матрикса клубочка, в основу классификации поражения

клубочка были положены стадии мезснгиальных изменений при пролифера-тиеных гломерулонефритах с облитерацией капиллярного пространства (Шулутко Б,И., 1983, 1993).

Эти стадии характеризуются следующими признаками:

1-весьма офаниченное, разбросанное, носящее выраженный сегментарный характер увеличение мезангиальной зоны с незначительным ростом числа ядер мезангиальных клеток, последние расположены в виде локусов по 2-3 крупных ядра с явными признаками лучевого патоморфоза;

2 - заметно© увеличение матрикса по осевым отделам клубочка, образование спаек между отдельными петлями, сужение просветов капилляров, больше 4-х ядер с признаками лучевого патоморфоза в локусах пролиферации мезангия; отдельные капилляры резко расширены и расположены по периферии клубочка.

3 • резкое снижение числа ядер в клубочках, доминирование внеклеточного Шик-позитивного материала, значительная спаянность капиллярных петель, иногда наблюдающееся срашение их с капсулой, выраженное уменьшение диаметре клубочка.

А - клубочек полностью склерозировдн и выглядит в 8ид© небольшого резко Шик-позитивного узелка.

Коэффициент поражения клубочка определяли по метолу Кар1о\*/ (1973).

Определение коэффициента активности ферментов. Выявление активности СДГ определяли по Нахласу и Зелигману с использованием нитро-синего тетразолия, активность Ш© проводили с помошью реакиии азосо-четания по Виге1опе (Лойда 3. с соавт. 1982). Уровень активности и характер распределения исследуемых ферментов оценивали полуколичественным методом с оиенкой активности+1, +2, +3,+4, при увеличении микроскопа х 10 х 40 и обработкой данных по Кср'ом (1973)

Оценка состояния ядерного аппарата нефроэлителия. На препаратах, окрашенных гематоксилин - эозином, при увеличении микроскопа х 10 х 40 в корковом слое почек находили от 10 до 25 канальцев со строго поперечными срезами, в которых подсчитывали обшее количество ядер с последующим пересчетом на 1 каналеи. определяли содержание среди них ядер с признаками лучевого патоморфоза и количество двуядерных комплексов

-,.e -

(количество двуядерных клеток). Величины выражали в процентах от обшего числа ядер.

• Морфометрическое исследование сосудов артериального русла, На препаратах, окрашенных по Маллори - Слинченко, определяли сосудистый индекс (СИ) - отношение толшины стенки сосуда к диаметру его просвета (Kernohaan J.W., 1929, Яргин C.B., 1986). Исследовали сосуды артериального типа среднего калибра с диаметром от 20 до 50 мкм в корковом и кортикомедулярном слое почек. Измерения проводили с помошью окулярной линейки при увеличении микроскопа х 10 х 40.

Определение обьема интерстиция коркового вещества почки. На 10 случайно выбранных полях зрения препарата, окрашенного по Маллори -Слинченко, с помошью окулярной сетки Г.Т. Автандилова 'при увеличении микроскопа х 10 х 40 устанавливали соотношение тест-точек, приходящихся на паренхиму и интерстииий в корковом веществе почек, определяя, тем самым, обьем интерстиция (ОИК) (Bohle, 1977). Данные выражали в процентах. По всем морфометрическим показателям вычисляли средние значения от 8 животных.

Определение фактора изменения дозы (ФИД) гипоксии. ФИД гипоксии определяли по соотношению равноэффективных доз при облучении животных в гипоксии и на воздухе, как правило, на уровне эффекта, проявляющегося при средней из взятого диапазона дозе однократного облучения на воздухе.

Статистическая обработка экспериментального материала проводилась по Стьюденту, для построений графиков использовали программу Multiple Regression из пакета Statlstlca фирмы Stat.Soft., 1993.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Радиационное поражение гломерулярного аппарата почки при облучат нии на воздухе и в гипоксии. Морфологическая картина лучевого поражения гломерулярного аппарата почек не отличается большим многообразием и сводится, в основном, к более или менее выраженным признакам склероза клубочков (Мостофи Ф.К., 1972; Casaret C.W.. 1968; Glatste|n Е., 1977), и не только в обших чертах, но и в деталях сходна с той, которая характерна для пролиферативных гломерулонефритов (Серов В.В., Варшавский В.Н.. Куприянова /I.A.. 1983; Шулутко Б.И. 1983). При этом выявляется увеличение числа ядер мезангия и мезангиального матрикса.

Во всех опытных группах провешенного эксперимента на гистологических препаратах обнаруживаются клубочки с повышенной плотностью капиллярных петель. Плотность петель возрастает по мере увеличения лозы облучения, При однократном облучении на воааухе наибольших значений этот показатель достигает через 10 месяцев после облучения в дозе 18 Гр (Рис. 1). При фракционированном облучении на воздухе через 8 месяиев величина этого показателя в интервале суммарных доз 25 - 35 Гр находится на уровне интервала лоз 1 1 - 17 Гр при однократном облучении на воэяухе, Через 10 месяиев соответствующие значения показателя в интервале доз 25-35 Гр сопоставимы с таковыми в интервале доз 11 -15 Гр. Эти факты свидетельствуют о том, что одна и та же гломерулярная плотность при фракционированном облучении вызывается значительно более высокими суммарными дозами, чем при. однократном облучении. Пораженных клубочков через 10 месяиев после облучения было больше, чем через 8 месяиев после облучения. Во всех случаях четко прослеживается выраженный защитный эффект гипоксии, свидетельствующий о том, что газовая смесь, содержащая 8% кислорода, значительно снижает скорость развития патологических процессов в клубочковом аппарате.

Полученные данные показывают, что стадийность поражения клубочков, имеюшая место при пролиферативном гломерулонефрите, характерна и для радиационной нефропатии, Количественное распределение клубочков по стадиям поражения объективно характеризует защитный эффект гипоксии.

Изменения в сукиинатной и фосфатазной системах нефроэпителия. Начальные отделы _ извитых канальцев характеризуются интенсивной реал-сорбиионной функцией, требующей больших затрат энергии (Наточин Ю.В., 1982; Скулверт А.К., 1984). Поэтому важной физиологической особенностью эпителия канальцев коркового отдела почки является высокий уровень аэробного клеточного обмена, который и определяет его структурные особенности: значительное содержание митохондрий и ферментов аэробного обмена, в частности, фермента щеточной каемки канальиев щелочной фосфатазы и маркерного фермента митохондрий сукиинатдегидрогеназы.

Активность этих фермеыов в эпЛелии канальиев в корковой зоне почек в опытных группах • снижается г;по" мере, увеличения дозы облучения. Так,

О -814 0,

• *вчо,

ФИЛ - 1.25

<1 II К 17 <«

Доза однократного облучения, Гр

Доза однократного оОлучения, Гр

о - 21% О, • -8% О,

ФИД ■ 1.2а

а к и «о Доза аа 6 Фракций, Гр

о • 214 о,

• -8% о,

ФИД

»ми Доза за б фракций, Гр

Рио.1.

Коэффициент поражения клубочков посла однократного (А,6) и фракционированного облучения (Б, Г). Срок облучения 6 (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев

актианостъ сукиинагаегиарогеназы после однократного и фракционированного облучения на воздухе через 8 месяцев уменьшается. Через 10 месяцев после облучения на воздухе фермента в канальиевом эпителии становится еше меньше. После облучения в гипоксии активность сукиинатдегидрогеназы также достоверно снижается в сравнении с контролем, но менее интенсивно, чем после облучения на воздухе. При всех дозах четко выражен зашитный эффект гипоксии (таблица, стр 22). Анализ полученных данных иллюстрирует 1акже степень снижения поражающего действия радиации при переходе от одномоментного к фракционированному воздействию. Например, через 8 месяцев после облучения на воздухе одинаковая степень снижения активности сукиинатдегидрогеназы происходит при однократной дозе 14 Гр и фракционированной - 30 Гр. Примерно такое же двукратное ослабление поражающего действия радиации наблюдается и для шелочной фосфатазы (таблица), т.е. используемый критерий хорошо отражает такую известную радиобиологическую закономерность, как эффект фракционирования. В целом полученные данные соответствуют имеющимся в литературе (Мостофи Ф.К., 1972) сведениям о том, что изменения в сукиинатной и фосфатазной системах идут параллельно утрате паренхимы и прогрессирующему почечному фиброзу, характерным для пострадиационного процесса в почках.

сдшлочек, Результаты подсчета количества ядер свидетельствуют, что чем выше доза облучения, тем меньше ядер остается в стенке канальцев (г » - 0,68) (рис. 2), Так, через 8 месяцев после минимальной дозы однократного облучения на воздухе -11 Гр - количество ядер в нефро-эпителии снижается на 19,5 % по сравнению с контролем, после максимальной дозы -18 Гр - в 3,2 раза. Лозы фракционированного воздействия удалось подобрать таким образом, чтобы получить примерно такую же степень снижения числа ядер, что позволяет надежно определять величину радиозашитного действия гипоксии по этому важному критерию поражения почек. Так, через . месяцев после облучения в дозе 25 Гр количество ядер уменьшается на 58,4 %:, послё Максимальной дозы 35 Гр - в 4,5 раза. Через. 10 месяцев • сохраняется отмеченная . выше " зависимость динамики

11 11 19 1? »

Доза однократного облучения, Гр ,

11 и 19 1Г 19

Доза однократного облучения, Гр

Б Г

Рис. 2. Количество ядер на поперечном срезе одного канальца в корковом веществе почек после однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облучения. Срок наблюдения 8 (А,Б) и 10 (8.Г) месяцев.

показателя от дозы облучения, однако снижение количества мер выражено в меньшей степени, чем через 8 месяцев после облучения. Четко просматривается тенденция к возрастанию Количества ядер через 10 месяцев после облучения по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Это происходит не за счет увеличения в составе нефрозпителия ядерных клеток, а, очевидно, за счет нарастания количества лвуялерных клеток. Особенно четко вклад двуядерности в увеличение обшего количества ядер в нефроэпителии про-сматризсЗгтся поели облучения в гипоксии, где коэффициент корреляции между абсолютным количеством ядер и количеством двуядерных клеток составляет 0,84 (р < 0,001); после облучения на воздухе г = 0/0 (р < 0,05). Кроме того, при всех дозах облучения в. гипоксии ядер в нефроэпителии сохраняется значительно больше, чем при соответствующих дозах облучения на воздухе, что свидетельствует о выраженном защитном эффекте гипоксии по данному показателю.

Количество ядер с признакамилучеаотлсгшморфоза_п нефроэпителии канальцев коркового вещества почек. Исследуя морфологические аспекты лучевого поражения почек, авторы отмечают наличие в нефроэпителии после облучения, особенно после воздействия больших доз, дегенеративных, неправильной формы клеток с гигантскими гиперхромными ядрами (Мостофи Ф.К., 1972, ^гика М. е! а1„ 1988). Эти патологические ядерные формы получили в радиобиологии название ядер "лучевого патоморфоза". '" Т" В данном эксперименте в канальиевом эпителии также обнаруживаются клетки с ядрами, имеющими признаки лучевого патоморфоза. Их количество прогрессивно нарастает по мере увеличения лозы облучения как на воздухе, тка и в гипоксии (рис. 3). Через 10 месяцев после однократного облучения на воздухе и в гипоксии количество этих ядер обнаруживает тенденцию к увеличению "по сравнению-с предыдущим сроком наблюдения. .Обращает на себя внимание большая степень возрастания клеток с признаками лучевого патоморфоза при фракционированном облучении. Так, после пятикратного. облучения на воздухе в дозе 35 Гр количество клеток с ядрами лучевого патоморфоза увеличивается почти 6 2 раза па сравнению с предыдущим сроком наблюдения, достигая 36,0 ± 3.6% (р < 0,001;. Такая же картина наблюдается и после облучения в гипоксии в дозе 40 Гр, где число таких клеток увеличивается почти в 2 раза ^достигает 31,2 ± 1.9% (р < 0,001). Таким образом, .

I

1

2 юо

0 -21% О,

• • 8% Ог

ФИД »1.37

И

/ И

40 0 33 0 ЭО.О 280 »0 160 10.0

о-2»% О, • -8% О, ФИД» 1.29

25 К и

Доза за 5 фракций. Гр

м ю м Доза за 5 фракций, Гр

Рис. 3 Количество ядер с признаками лучевого патоморфоза

в нефроэпителии коркового вещества почек после однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облучения. Срок наблюдения Р (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев

чем больше проходит времени поел® облучения, тем большее проявление получает результат прямого поражения радиацией ядер нефроэпителия, Полученные данные согласуются с имеющимися в-литературе фактами о том, что клетки нефроэпителия извитых канальиев почек относятся к медленно обновляющейся стационарной популяиии, тяжесть поражения которых усиливается с течением времени после воздействия и проявляется через многие месяцы. Между общим количеством ядер и количеством среди них ядер с признаками лучевого патоморфоза существует выраженная обратная зависимость. Значения коэффициента корреляции варьируют в каждом конкретном случае от - 0,88 (р < 0,001) до - 0,99 (р < 0,001).

Таким образом, количество ядер с признаками лучевого патоморфоза, являясь показателем прямого поражения радиацией нефроэпителия, может количественно характеризовать степень этого поражения и степень защитного эффекта гипоксии,

Содержание а составе нефроэпителия двумерных клеток. Адаптация организма к меняющимся условиям среды и компенсация нарушенных функций структурно обеспечивается не только на основе пролиферации клеток и внутриклеточной регенерации, но и в не меньшей степени путем гиперплазии, т.е. увеличением числа ядерных и иитоплазматических структур (Саркисов Л.С., Аруин Л.И., 1987). Наиболее четко эта способность реализуется в дифференцированных и вьюокоспеииализированных клеточных популяциях с невыраженным камбием (Бродский В.Я., Урываева И.В., 1981). К таковым относится, в частности, почечный эпителий, в котором увеличение рабочих единиц начинается с гиперплазии ядер, что приводит к образованию полиплоидных, в том числе, двуядерных клеток (Саркисов Л.С.. 1987). Число этих клеток через 8 месяцев после облучения на воздухе в интервале доз 11-15 Гр увеличивается, но обратно пропорционально дозе облучения. В интервале 16-17 Гр их количество незначительно выше контроля и при дозе 18 Гр остается разным контрольному уровню. В гипоксии интервал максимальной однократной дозы, при которой данный показатель значимо отличается от контроля, увеличивается до 17 Гр. В дозе 18 и 19 Гр это увеличениэ недостоверно. Через 10 месяцев после облучения на воздухе содержание двуядерных клеток выше нормы только в дозе 11 Гр, в интервате 12-16 Гр эти изменения недостоверны и при дозе 17 и 18 Гр число этих клеток проявляет

тенденцию к снижению. После фракционированного облучения через 8 месяцев и на воздухе, и в гипоксии этих клеток в нефроэпителии становится • в 2-3 раза больше. Через 10 месяцев после .фракционированного облучения количество двуядерних клеток снижается и при дозе 35 Гр становится достоверно ниже контроля. В гипоксии эти изменения недостоверны (рис 4).

Исходя из биологической значимости феномена двуядерности клеток как структурного резерва популяции и рассматривая закономерность его функционирования после облучения в аспекте концепции формирования в организме адаптационных реакций (Гаркави /1.Х. с соавт.. 1979; Саркисов Д.С., 1976), можно сделать вывод, что .степень адаптации нефроэпителия к пострадиационному повреждению тем выше, чем ниже доза облучения. Во всех случаях гипоксия эффективно зашишает резерв нефроэпителия, благодаря чему компенсаторные процессы протекают с большей активностью и в большем интервале доз, что обеспечивает, очевидно, более длительную адаптацию тубулярного аппарата почки к пострадиационному повреждению. Полученные данные свидетельствуют также о том, что компенсаторные процессы в нефроэпителии через 8 месяцев после фракционированного облучения развиваются более активно, чем после однократного, Однако через 10 месяцев наблюдается обратная картина. К этому сроку при однократном облучении двуядерных клеток значительно больше в паренхиме, ч'ем при фракционированном, а при лозах 35 и 40 Гр даже в гипоксии их число свидетельствует о срыве адаптации. Очевидно, в этом случае также проявляется одно из свойств нефроэпителия как стационарной системы - кумуляция эффекта лучевого повреждения при длительном фракииоированном облучении (Ррмоненко С.П., 1982).

облучения. По наблюдениям Сазаге^ вЖ (1968), радиационная нефропатия развивается в форме прогрессирующего артериолярного нефросклероза. Склероз или гиалиноз сосудов артериального типа тйкже отмечается целым рьдом авторов как один из морфологических феноменов облученной почки (Серов В,В., Варшавский В,А., Куприянова Л.А., 1983). В целого количественная оценка склероза сосудов артериального типа по сосудистому индексу может явиться объективным показателем поражения радиацией сосудистого русла почки и выяснения эффективности защитного эффекта гипоксии.

но

2. 19 0

Й 14 0

£

3 110

| 10 0

• 0

| • 0

У:

4.0

0-21% О, »•8* О,

ФИД • 1.22

о н т С О пь^

1> II 17 <•

Доза однократного облучения, Гр

О -2(4 су

• • 8% Оа ФИД ш 1.33

^ Ч'

К О н т Р О Л

11 1) К 1Г 11

Доза однократного ОС пучения, Гр

МО

£ 18 0

¿5 100

п»

§ 14 0

п. ио

ш

« ¡с 10 0

1 90

I «0

* 40

+=

о -21У.0а • • 8% Ог фид» 1,31

КОНТРОЛЕ

29 30 39

Доза за 5 фракций, Гр

£ 8

I

8.

I

О -21%0г

• -а%ог ФИД - 1.41

я и м Доза за 5 фракций, Гр

Рис. 4.. Количество двуядорных клеток а канальцах коркового вещества почек поело однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облученип. Срок наблюдения 8 (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев.

Действительно, величины СИ в опытных серия, эксперимента выше, чем в контроле, просматривается лозовая зависимость показателя (рис 5). Однако в ■ гипоксии наблюдается некоторое нарушение отмеченной закономерности. Так, величина СИ через 8 месяиев после однократного облучения в дозе 16 Гр составляет 1,05 ± 0,23, а в дозах 17 и 18 Гр остается одинаковой и составляет 0,91 ± 0,11, через 10 месяиев в интервале доз 15 - 17 Гр показатель также практически не меняется. Этот факт свидетельствует о слабо выраженном защитном эффекте гипоксии. Склерозируюший эффект минимальных и максимальных суммарных доз фракционированного облучения на воздухе и в гипоксии через 8 месяцев приблизительно соответствует таковым при однократном облучении и несколько превышает показатели через 10 месяиев после облучения. Этот факт свидетельствует, во-первых, о более шадяшем воздействии фракционированного облучения, во-вторых, о наличии, уже отмеченном выше, хотя и слабо выраженного, кумулятивного эффекта на более поздних сроках после облучения, который характерен, для медленно обновляющихся тканей и к которым также относится сосудистый эндотелий.

Таким образом, локальное облучение почек приводит к прогресси-

i

руюшему склерозу внутриорганных сосудов артериального типа. Полученные результаты свидетельствуют также о том, что процесс склероза сосудов артериального типа характеризуется значительной неравномерностью и большой индивидуальной вариабельностью. В силу этого, очевидно, гипоксическая газовая смесь, содержащая 8% кислорода, с малым эффектом защищает сосуды. Это касается однократного и фракционированного облучения.

Активность .с клеротическихярошссоав почках после облучения на воз-" духе .и. в.-гипоксии В качестве отдаленных последствий обшего облучения организма или локального облучения почек развивается нефросклероз (Bennet с соавт., 1953; Guttman et al., 1960,1963; Rosen S. et al. 1964; Мостофи (D.K., 1972; Melstrlch M.N, et al., 1984).

По данным морфометрии в контрольной группе, животных ОИК составляет <$5 ± 1,3%, что, приблизительно, соответствует результатам, которые были получены на биопсийном материале почек человека (Яргин. 1985, 1986). В опытных группах ОИК выше, чем в контроле, за исключением двух групп животных, исследованных через 8 месяцев после облучения в гипоксии в дозе 13 Гр (р>0,05) и 14 Гр (p>0,0t) (рис. 6). Через 8 и 10 месяиев после одно-

$ 0«

о -21% О, » -0%О, ФИД - 115

11 11 11 1Т к Доз» однократного облучения, Гр

о-214 О, • • 8% О, ФИД» 1.13

и 1) II 17 11 Дом однократного облучен • Гр

3

5 1»

^ ОВД ^ 0«

й - 21% Ог

• -а%ог

ФИД я 1.16

то

Г Г

--•}--1-«ТГ Т УГП-

:з м и Доза за 5 фракций, Гр

о • 21% Оа • -0%0г ФИД= 1.18

п 30 м

Доза за 5 фракций, Гр

Рис. б.

Сосудистый индекс артерий коркового веи;сства почек после однократного (А, В) и фракционированного (6, Г) облучения. Срок наблюдения О (А,Ь) и 10 (В,Г) месяцев.

И 13 1« 17

Доза однократного облучения, Гр

11 11 1» 17 м

Доза однократного облучения, Гр

о • 21% О,

• -а%о,

ФИД = 1.47

29 30 <0

Доза за 5 фракций, Гр

0 • 21% 0; * -8% О,

ФИД = 1.49

25 30

Доза за 5 фракций, Гр

Рис. 6.

Относительный объем интерстиция коркового вещества почек после однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облучения. Срок наблюдения 8 (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев.

кратного облучения на воздухе s максимальных дозах 17 Гр и 18 Гр больше половины обьема органа приходится на соединительную ткань. После облучения в гипоксии в дозе 19 Гр ОИК составляет через .8 месяиев только 36,4 ± 1.6% (р<0,001), а через 10 месяцев - 38.0 ± 0,4% (р<0,001). При всех дозах облучения четко просматривается защитный эффект гипоксии. Через 8 месяиев после фракционированного облучения на воздухе в интервале доз 25 - 35 Гр, а в гипоксии в интервале доз 30 • 40 Гр, величины ОИК не отличаются яосювврно от значений ОИК при однократном облучении на воздухе и в гипоксии в интервале доз 13 - 16 Гр и 16 - 18 Гр соответственно. Эти данные иллюстрируют снижение поражающего действия радиации при переходе от одномоментного к фракиионированому воздействию. Через 10 месяцев после фракционированного облучения на воздухе и в гипоксии величины ОИК достоверно выше, чем при соответствующих дозах через 8 месяиев после облучения, что является свидетельством того, что темпы склерозирования почек в интервале 8-10 месяцев после фракциоированного облучения гораздо выше, чем поело однократного. В этом факте также находит отражение кумулятивный эффект, характерный для медленно обновляющихся тканей.

Таким образом, динамика ОИК свидетельствует о том, что этот показатель адекватно отражает результат процесса склерозирования почек после облучения - относительное увеличение в корковом слое обьема соединительной ткани и пропорциональное снижение клеточной массы паренхимы. Интенсивность процесса находится в зависимости от дозы, сроков и способа облучения, Эти результаты согласуются с имеющимися в литературе(МостофиФ.К., 1972; MelstrlchM.V. étal, 1984).

Из всех факторов, которые могут способствовать прогрессированию склероза в почках после облучения, наиболее вероятным является, интенсификация синтеза коллагена фибробластами интерстииия под меаиаторным воздействием клеток инфильтрата (Яргин С.В,, 1985, 1986; Серов В.В., Яргин C.B. 1986; Яргин С,В. 1986). В данном эксперимента также обнаруживается постоянное наличие в строме облученных почек, особенно в периваскулярных пространствах, лимфоплазмацитарных клеток. Этот факт может быть косвенным подтверждением наличия в интерстииии облученной почки медиаторных 'пусковых" факторов коллагенизаиии стромы. Их включение происходит, очевидно, в самые ранние сроки после облучения

вследствие сосудистых расстройств, характерных для периода острого лучевого поражения (Ярмоненко С.П., 1988) и, вс можно, связанных с • повреждением мембран самых мелких сосудов интерстииия почек -перитубулярных капилляров, Действие модификатора, значительйо замедляо-шего развитие склеротических процессов, показывает, что гипоксическая смесь, содержащая 8% кислорода, аффективно зашишает. по-видимому, прежде всего перитубулярные капилляры, что ингибирует коллаген-синтетичёскую функцию фибробластов - инициальную фазу склеротических изменений в строме органа,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные показывают, что применение во время облучения дыхательной смеси с пониженным до 8% содержанием кислорода увеличивает толерантность гломёрулярного аппарата, каналыювой системы нефрона и снижает активность склероза стромы почек в 1,21 - 1,49 раза. Это означает, что при использовании гипоксической газовой смеси во время лучевой терапии опухолей -в случаях, когда почки являются. региональным дозолимитируюшим органом, суммарная доза лучевого воздействия на опухоль может быть безопасно повышена не менее чем на 20%.

Сравнительный анализ данных о степени зашиты отдельных морфофункш-ональных структур почек приведен в нижеследующей таблице.

Таблица

Степень защитного эффекта гипоксии по показателям ФИЛ

Срок после облучения (месяцев) Коэф. поражения клубочков Кннальиевый эпителий СИ ОИК

Кол-во Кол-во Кол-во СДГ . ШФ ядер , ядер с двуядер-луч. па- ных клеток томор.

Однократное облучение

е 1,25 1,31 1,31 1,21 1,32 1,22 1,15 1.32

10 1.28 1.34 1,29 1.31 1,28 1,33 1,13 1,37

Фракционированное излучение

8 1,28 1,37 ; 1,34 1,35. К37 и1 1,16 М7

10 • 1,29 1,35 1.30. 1.29 1,29 1,41 1,18 1,49

Как видно, защитное действие гипоксии варьирует в определенных рамках Наиболее низкие значения ФИД смеси, содержащей 8% кислорода, получены при оиенке по величине СИ, наиболее высокие - по величине ОИК. Учитывая интегральную природу показателя ОИК, это может означать, что наиболее эффеюивно гипоксия защищает либо »пителий перитубулярных капилляров интерстииия, ингибируя инициальные механ^мы коллагенизации стромы органа, либо эндотелий капилляров клубочков, препятствуя в конечном счет' развитию гломерулярного блока кровотока, а скорее всего, и то и другое. Защитное действие гипоксии увеличивается при переходе от однократного к фракционированному воздействию при оценке эффекта облучения по всем морфологическим тестам. Этот феномен отражает одно и« свойств стационарных клеточных систем - способность кумулировать эффект лучевого повреждения при фракционированном воздействии. Гипоксия, таким образом, препятствует накоплению в эндотелии и эпителии почек лучевых повреждений. И» представленных результатов видно, что использование гипоксии в момент облучения приводит к удлинению латентного периода до начала развития изменений, достоверно значимо отличающихся от контрольных показателей. Однако его продолжительность для различных тестов варьировала. Все регистрируемые показатели как на воздухе, так и в гипоксии имели тенденцию к прогрессированию во времени, что соответствует обшим представлениям о характере течения радиационной нефропатии

В заключении обзора полученных данных следует еще раз обратиться к результатам, полученным при оценке ФИД по величине СИ. Известно, что облитерация приносящих сосудов играет ведущую роль в развитии 1шемической гипоксии почек (Наточин Ю.В., 1982), Этот процесс, по видимому, в том временном интервале, который исследовался в данном эксперименте, а именно спустя 8-10 месяцев после облучения, в генезо нефросклероза существенного значения не имеет Доминирующую роль в развитии патологии здесь играет поражение паренхимы и, очевидно, поражение капиллярной системы органа - эндотелия клубочков и перитубулярных капилляров.

\

ВЫВОДЫ

1. Применение во время локального облучения почек дыхательной смеси, содержащей 8% кислорода, что моделирует условия применяемого в лучевой терапии опухолей метода "гипоксирадио-терапии", снижает тяжесть отдаленной лучевой патологии с фактором уменьшения дозы (ФИД), варьирующим для большинства структур почки от 1,21 до М9. Таким образом,' при лучевой терапии опухолей, локализация которых делает почку дозолимитируюшим' органом, использование в момент облучения обшей газовой гипоксии, дает возможность безопасного повышения курсовой дозы на 20%.

2. Наиболее высоким радиозашитный эффект гипоксии является для такого интегрального показателя тяжести лучевого нефросклероза, как относительный обьем интерстииия коркового вешества: при однократном облучении и оценке эффекта через 8 мес после облучения ФИД составил 1,32, при оценке через 10 мес - 1,37; при фрашиони-рованном облучении ФИД через 8 мес после воздействия был равен 1,47, через 10 мес -1.49.

3. Гломерулярный аппарат почек, в качестве критерия лучевого поражения которого использовано повышение плотности капиллярных петель клубочка, при однократном и фракиионирозанном воздействии 'раоиаиии защищается изученной дыхательной смесью с ФИД, равным 1,25 • 1,29.

4. Степень зашиты канальиевого эпителия коркового слоя почек, определенная по пяти показателям - величинам индекса активности сукиинагаегидрогеназы и щелочной фосфатазы, количеству ядер на поперечном срезе канальца, числу ядер с признаками ' лучевого патоморфоза и количеству двуядерных клеток соответствует ФИД = 1,21 -1.41,

5. Защитное действие гипоксии для артерий среднего калибра, определенное по сосудистому индексу, характеризующему изменение просвета сосудов и, таким образом, обьем почечного кровотока, находится в пределах 1,13 -1,18, т.е. гораздо меньше, чем для других структур почки, что связано с/.: прямым контактом эндотелия с. кровью,

рОг в которой и в условиях дыхания животными смесью, содержащей' 8% 02 , остается на уровне, при котором защитное действие гипоксии еше не проявляется в полной мере.

6. Существенно ' меньшая зашита гипоксией артерий по сравнению с ее радиомоаифииируюшим действием в отношении нефросклероза является доказательством правильности представлений, что ведущим фактором развития поздних осложнений лучевой терапии является поражение клеток тканевой паренхимы и эндотелия перитубулярных и клубочковых капилляров, а не крупных и средних сосудов, как это считается некоторыми авторами.

7. Радиозашитное действие гипоксии .для клубочков, ¿аналыаев и стромы почек, в отличие от изученных ранее по этому параметру пищевода, тонкого кишечника и костного мозга, не уменьшается при переходе от однократного к фракционированному облучению, что позволяет прогнозировать сохранение радиозашитного эффекта и при переходе от крупнофракиионированного облучения больных, для которого накоплен положительный опыт гипоксирадиотерапии, к ее использованию в режиме мелкофракнионированного облучения.

8. Установлено, что изменение морфологических показателей поражения почки линейно зависит от поглощенной дозы в диапазоне 11 -18 Гр при однократном воздействии и 25 - 35 Гр при фракционированном облучении, что позволяет количественно оценивать поражение отдельных тканевых элементов этого органа, являющегося для радиационной онкологии моделью медленнообновляюшихся дозолимитирующих органов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ЛИССЕРТАУИИ

1, Гистохимическое и биохимическое изучение лучевого поражения почьк в условиях обшей газовой гипоксии (Соавт. £. Г, Слесарокко, 8.В. Остапенко, А.А. Вайнсон Н.Т. Райхлин) - Архив патологии, N А, 1993, с. 72 - 76.

2. Морфофуншиональная характеристика почек мышей при облучении на воздухе и в гипоксии (Соавт. Е.Г. Слесаренко, /1,А.Палиенко,

А.А.Вайнсон) - Актуальные вопросы медианы и биологии, Днепропетровск, 1993, с, 49.

3. Протекторная роль гипоксии при радиационном поражении почек.-Актуальные вопросы медицины и биологии, Днепропетровск, 1993, с. 207,

4. Модиф1каи1йна' о1я г1покс11 при рап1аи1Йному ураженн! нирок

(Соавт. О.Г. Слесаренко) - Матер1али V конгресу св1гово1 федераиН л1-карських товариств. Дн1пропетровськ. 1994. с. 43.

5. Морфог1стох1м1чн1 эм1ни нирок при радиаи1йному ураженн! - Матер1али V конгресу cetTOBoi федераиН л!карських товариств, Дн1лропетровськ, 1994, с. 41.

6. Влияние жесткой гипоксии на функциональную морфологию почек при облучении - Актуальные вопросы морфологии и клинической медицины, Днепропетровск, 1994, с. 97 - 9В.

7. Морфологическое исследование почек мышей при облучении (Соавт. Слесаренко Е.Г.,Вайнсон А.А.) - Матер, .междунар, конф, поев. 60-летию 'проф, Т.В. Золотаревой , Полтава, 1994, с. 178.

8. Элекронно-микроскопическая характеристика почек мышей при лучевом поражении (Соавт. Слесаренко Е,Г.,Вайнсон А.А,) - Межд. бюлл. развития лазерной медицины N 1, Днепропетровск, 1994, с.80.

9. Воздействие однократного облучения на структуру почек мышей -Междунар. бюлл, развития лазерной медицины N 1, Днепропетровск. 1994, с. 81.

10 Effect of mouse Irradiation In air and In hypoxic conditions on the hystological changes In kidney. ( Co-au1hors: V.Ostapenko, Pallenko I.A., Slesarenko E.G. and Tanaka Y.) Indian J. of Experimental Biology, 1996, (In press).

Участок множительной техник« ОНЦ РАМН

Тираж 100 эк

'Заказ

Подп. к печати 4 . 9 &