Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Ослабление побочного действия радиации на почки с помощью общей гипоксии при моделировании условий лучевой терапии

^ На правах рукописи

С>

о

/

ОСТРОВСКАЯ Светлана Сергеевна

Ослабление побочного действия радиации на почки

с помощью общей гипоксии при моделировании

условий лучевой терапии (14.00.14 - Онкология )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН и Днепропетровской государственной медицинской академии

Научные руководители Доктор биологических наук

А.А.Вай неон

Доктор биологических наук; профессор Е.Г.Слесаренко

Официальные опппоненты

Доктор медицинских наук, профессор К.Н.Костромина

Доктор биологических наук, профессор А.Г.Коноплянников

Ведущая организация Научно-исследовательский

онкологический институт им. Н.Н.Петрова МЗМП РФ

Защита состоится " _1996 г.

в часов на заседании диссертационного совета К.001.17.01 в Онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН Автореферат разослан * "__ 1996 г.

. Ученый секретарь совета, д.м.н., профессор

В.С .Турусов

1. ОБШАЯ ХАРАКТЕ РИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Дыхание газовыми смесями с пониженным по сравнению с воздухом содержанием кислорода используется в Онкологическом научном центре РАМН, ряде других Российских учреждений и в зарубежных клиниках для селективного уменьшения глубины поражения нормальных тканей организма при лучевой терапии опухолей. Наиболее яркие примеры защитного действия гипоксии получены при широкопольном облучении опухолей органов брюшной полости и малого таза, а именно рака желудка, шейки матки и забрюшинных новообразований (Амосов И.С. с соавт.,1984; Коссэ В.А. с соазт.,1984; Мардынский Ю.С. с соавт.,1985; Асляев ПЛ. с соавт.,1986; Тачев Т, с соавт.,1990).

Использование для дыхания смесей, содержащих 8 или 9% кислорода, дало возможность увеличить на 20-40% подводимую к опухоли дозу излучения и, тем самым, улучшить результаты лучевой терапии. Степень увеличения лозы излучения определяется глубиной зашиты наиболее радиочувствительных органов, попадающих в зону воздействия, среди которых должны быть названы почки (ШхГоп 1?.\№.,1953; 1?озег. Э е1 а1.,1964; Тареев Е.М. 1982; СаэагеП в. W. 1968).

Целью данного исследования явилась оценка эффективности использования гипоксической газовой смеси, содержащей 8% кислорода, для зашиты нефроэпителия и сосудов почки, а также снижения активности склероза интерстииия по количественно учитываемым изменениям в структуре этих тканей после локального однократного и фракционированного облучения.

Аля достижения поставленной иели решались следующие задачи:

V. определялась степень альтеративных изменений в гломерулярном аппарате почек по величине коэффициента поражения клубочка;

2. изучались морфология и морфогенез радиационного поражения в тубулярном аппарате коркового слоя почек путем выявления в нефроэпителии активности сукшнатдегидрогеназы (СДГ) и щелочной фосфатазы (ШФ), обшего количества ядер, ядер с признаками лучевого патоморфоза и количества двуядерных клеток;

3. определялась степень склероза внутриорганных сосудов артериального типа по величине сосудистого индекса;

4. характеризовалась степень склероза структур почки по величине относитолъксгб абшма интерстииия коркового вещества;

5. устанавливалась, отдельно для каждой исследованной структурной единицы почки, степень защитного действия гипоксии по величине фактора изменения дозы (ФИЛ)

Научная новизна полученных результатов. Впервые дана количественная характеристика степени радиационного поражения' различных морфо-функииональных структур почек после однократного и фракционированного облучения на воздухе и в гипоксии. По величине коэффициента поражения клубочка оиенен морфологический феномен повышения плотности капиллярных петель клубочка после облучения и определена степень зашиты экзогенной гипоксией гломерулярного аппарата, которая оказалась равной 1,25 - 1,29. Установлено, что степень зашиты канальиевого эпителия коркового слоя почек, определенная по величине индекса активности ШФ и СЛГ, по обшему количеству ядер, количеству ядер с признаками лучевого патоморфоза и количеству двуядерных клеток находится в пределах 1,21 -1,41. Обнаружено, что между обшим количеством ядер в составе нефроэпителия и количеством ядер с признаками лучевого патоморфоза, а также между количеством ядер лучевого патоморфоза и количеством двуялерных клеток нефроэпителия существует выраженная обратная зависимость. Дан анализ содержания двуядерных клеток в нефроэпителии коркового слоя облученных почек в аспекте развития неспеиифических адаптационных реакций, при этом показано, что после облучения в гипоксии процесс полиплоияизаиии нёфроэпителия протекает более активно, чем после облучения на воздухе, что, вероятно, обеспечивает более длительную адаптацию тубулярного аппарата почек к пострадиационному повреждению. Показано также, что наиболее низкий защитный эффект экзогенной гипоксии определяется для сосудов артериального типа по величине сосудистого индекса и наиболее высокий для интегрального показателя нефросклероза - относительного объема интерстииия коркового слоя почек. Впервые на основании сопоставительного анализа морфометрических данных о склерозе различ-ых структур почек после облучения сделан вывод о том, что наиболее аффективно гипоксия 8ашишает, очевидно, эндотелий перитубулярных и клубочковых капилляров. Зашитное действие гипоксии при этом увеличивается при переходе от однократного к фракционированному облучению. Использование данного" радиомодификатора позволило, таким образом.

выязить новью патоморфологические аспекты известных ранее структурных феноменов.

Научно - практическая ценность' результатов. На основании полученных данных определены границы безопасного применения гипоксической газовой смеси, содержащей 8% кислорода, во время облучения опухолей, локализованных в брюшной полости; когда в зону облучения попадают почки. Применение гипоксии во время облучения позволяет повышать подводимую к очагу суммарную дозу на 20-30% без увеличения тяжести лучевых реакиий со стороны почки как органа лимитирующего дозу в данном регионе. Выводы, полученные при использовании методов количественной оиенки поражения почечных структур, могут найти применение в лабораториях радиобиологического и токсикологического профиля,

Апробация диссертации. Диссертация апробирована на заседании Днепропетровского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов 15 февраля 1994 года.

Основные материалы доложены и обсуждены: на XIII Пленуме Правления Всесоюзного общества патологоанатомов по проблеме радиационной патологии (г. Обнинск, 9.10.1991 г.); на научно-практической конференции Днепропетровской медицинской академии '(1994 г.); на I Национальном конгрессе анатомов, гистологов, эмбриологов Украины (г.Ивано-Франковск, 1994); на V Конгресс© мировой федерации украинских врачебных обществ (Днепропетровск, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ. Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, содержащей экспериментальные данные с обсуждением результатов, заключения, выводов, указателя литературы, включаюшего 84 отечественных и 79 зарубежных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Исследования проведены на 350 мышах самиах Р, (СВАхС57 ВО, массой 22-26 г, полученных из питомников "Рапполово" и "Столбовая". Животные находились в лабораторных клетках по 8 особей и содержались на стандартном рационе, У

- б -

8 течение одной недели до и после облучении мышей поили )% раствором соляной кислоты для поддержания кислого рН желудочно-кишечного тракта.

Методика облучения. Почки неанестезированных мышей облучали локально на воздухе и в гипоксии в двух вариантах опытов: однократно и в.вида 5 ежедневных фракций. Каждая экспериментальная группа содержала fl животных. При однократном облучении на воздухе дозы составляли 11-18 Гр, при облучении в гипоксии - 13-19 Гр. с дозным интервалом между группами в 1 Гр; при 5-кратном облучении суммарные дозы на воздухе равнялись 25. 30, 35 Гр; в гипоксии 30, 35, 40 Гр; контролем служили необлученныо мыши того же возраста. Однократное и фракционированное облучение проводили на рентгеновском аппарате "Stablllpan" фирмы "Siemens' при напряжении 220 кВ, силе тока 15 мА, КФР - 30 см, фильтре 0,5 мм Си + 6 мм оргстекла, мошности дозы 1,84 Гр/мин. (Остапенко В.В.. 1992).

Приготовление препаратов почки и их окраска. Животных выводили из эксперимента через 6 и 10 месяцев после облучения, извлекали почки, часть материала фиксировали в растворе CVCD по Лилли, Материал обрабатывали по общепринятой методике и изготавливали парафиновые блоки. Срезы толшиной 3-5 мкм после депарафинаиии окрашивали гематоксилин -эозином, по Маллори-Слинченко (1964) и по Мак-Манусу (Шик-реактивом). Другую часть материала замораживали в жидком азоте, изготавливали криостатные срезы толшиной 10 мкм и проводили гистохимические реакции. Аля изготовления полутонких и ультратонких срезов почек брали кусочки размером 2x2 мм. помешали в раствор 2,5% глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере, заключали в аралдитовую смолу, изготавливали прлу-тонкие срезы, которые окрашивали метиленовым синим • Азур II фуксином. Ультратонкие срезы изготавливали по стандартной методике.

Определение коэффициента поражения клубочка. На препаратах, окрашенных по. Маллори-Слинченко, просматривали 100 почечных телаи, отмечая при этом сегментарные (поражения части клубочка) и генерализованные (поражения всего клубочка) изменения, которые возникают в результате развития фибропластических процессов (Шулутко Б.И.,1983). Учитывая тот факт, что эти изменения находят отражение преимущественно в расширении юны матрикса клубочка, в основу классификации поражения

клубочка были положены стадии мезангиальных изменений при пролифера-гизных гломерулонефритах с обяитераииэй капиллярного пространства (Шулутко Б.И., 1983,1993).

Эти стадии характеризуются следующими признаками:

1 - весьма ограниченное, разбросанное, носяшеэ выраженный сегментарный характер увеличение мезангиальной зоны с незначительным ростом числа ядер мезангиальных клеток, последние расположены в виде локусов по 2-3 крупных ядра с явными признаками лучевого патоморфоза;

2 - гаметное увеличение матрикса по осевым отделам клубочка, образование спаек между отдельными петлями, сужение просветов капилляров, больше 4-х яаер с признаками лучевого патоморфоза в локусах пролиферации мезангия; отдельные капилляры резко расширены и расположены по периферии клубочка. I

3 -резкое снижение числа ядер в клубочках, доминирование внеклеточного Шик-позитивного материала, значительная спаянность капиллярных петель, иногда наблюдающееся сражение их с капсулой, выраженное уменьшение диаметре клубочка.

4-клубочек полностью склерозирован и выглядит в виде небольшого резко Шик-позитивного узелка.

Коэффициент поражения клубочка определяли по методу Кар1о\л/ (1973).

. Определение коэффициента активности ферментов. Выявление активности СДГ определяли по Нахласу и Ззлигману с использованием нитро-синего тетразолия, активность ШФ проводили с помошью реакции азосо-четания по Ви^опе (Лойда 3. с соовт. 1982). Уровень активности и характер распределения исследуемых ферментоз оценивали полуколичественным методом с оценкой активности+1, +2, +3,+4, при увеличении микроскопа х 10 х 40 и обработкой данных по Кар!о\м (1973)

Оценка состояния ядерного аппарата нефроэпшелиз. На препаратах, окрашенных гематоксилин - эозином, при увеличении микроскопа х 10 х 40 в < корковом слое почек находили от .10 до 25 канальцев со строго поперечными срезами, в которых подсчитывали общее количество ядер с последующим пересчетом на 1 каналеи определяли содержание среди них ядер с признаками лучевого патоморфоза и количество двуядерных комплексов

- Ö -

(Количество двуядерных клеток). Величины выражали в процентах от общего числа ядер.

Морфометрическое исследование сосудов артериального русла. На препаратах, окрашенных по Маллори - Слинченко. определяли сосудистый индекс (СИ) - отношение толшины стенки сосуда к диаметру его просвета (Kernohaan J.W., 1929, Яргин C.B., 1986). Исследовали сосуды артериального типа среднего калибра с диаметром от 20 до 50 мкм в корковом- и кортикомедулярном слое почек. Измерения проводили с помошыо окулярной линейки при увеличении микроскопа х 10 х 40.

Определение объема интерстииия коркового вещества почки. На 10 случайно выбранных полях зрения препарата, окрашенного по Маллори -Слинченко, с помощью окулярной сетки Г.Т. Автандилова при увеличении микроскопа х 10 х 40 устанавливали соотношение тест-точек, приходящихся на паренхиму и интерстииий о корковом веществе почек, определяя, тем самым, обьем интерстииия (ОИК) (Bohle, 1977). Данные выражали в процентах.

По всем морфометрическим показателям вычисляли средние значения от 6 животных. „

Определение фактора изменения дозы (ФИШ гипоксии. ФИО гипоксии определяли по соотношению равноэффективных доз при облучении животных в гипоксии и на воздухе, как правило, на уровне эффекта, проявляющегося при средней из взятого диапазона дозе однократного облучения на воздухе.

Статистическая обработка экспериментального материала проводилась по Стьюденгу, для построения графиков использовали программу Multiple Regression из пакета Statlstlca фирмы Stat.Soft., 1993.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Радиационное поражение гломерулярного аппарата почки при облучэ: нии на воздухе и в гипоксии. Морфологическая картина лучевого поражения гломерулярного аппарата почек не отличается большим многообразием и сводится, в основном, к более или менее выраженным признакам склероза клубочков (Мостофи Ф.К., 1972; .Casarer C.W., 1963; Glatsteln Е., 1977), и не только в общих чертах, но и в деталях сходна с той, которая характерна для пролиферативных гломерулонефритов (Серов В.В., Варшавский В.Н., Куприянова /I.A., 1983; Шулутко Б.И. 1983). При этом выявляется увеличение числа ядер мезангия и мезангиального матрикса.

Во всех опытных группах проведенного эксперимента на гистологических препаратах обнаруживаются клубочки с повышенной плотностью капиллярных петель. Плотность петель возрастает по мере увеличения дозы облучения. При однократном облучении на воздухе наибольших значений этот показатель достигает через 10 месяцев после облучения в дозе 18 Гр (Рис. 1), При фракционированном облучении на воздухе через 8 месяцев величина этого показателя в интервале суммарных поз 25 - 35 Гр находится на уровне интервала доз 11 - 17 Гр при однократном облучении на воздухе. Через 10 месяцев соответствующие значения показателя в интервале доз 25-35 Гр сопоставимы с таковыми в интервале доз 11 -15 Гр. Эти факты свидетельствуют о том. что одна и та же гломерулярная плотность при фракционированном облучении вызывается значительно более высокими суммарными дозами, чем при однократном облучении. Пораженных клубочков через 10 месяцев после облучения было больше, чем через 8 месяиев после облучения. Во всех случаях четко прослеживается выраженный защитный эффект гипоксии, свидетельствующий о том, что газовая смесь, содержащая 8% кислорода, значительно снижает скорость развития патологических процессов в клубочковом аппарате.

Полученные данные показывают, что стадийность поражения клубочков, имеюшая место при пролиферативном гломерулонефрите, характерна и для радиационной нефропатии. Количественное распределение клубочков по стадиям поражения объективно характеризует зашитный эффект гипоксии, Изменения в сукиинатной и фосфатазной системах нефроэпителия. Начальные отделы : извитых канальцев характеризуются интенсивной реад-сорбиионной функцией, требующей больших затрат энергии (Наточин Ю.В., 1982; Скулверт А.К., 1984). Поэтому важной физиологической особенностью эпителия канальцев коркового отдела почки является высокий уровень аэробного клеточного обмена, который и определяет его структурные особенности: значительное содержание митохондрий и ферментов аэробного обмена, в частности, фермента щеточной каемки канальцев щелочной фосфатазы и маркерного фермента митохондрий сукиинатдегидрогеназы.

Активность этих фермеыов в эп**елии канальиев в корковой зоне почек в опытных-.группах^'¡снижаетсяУ;по'''м0рэ;с'увеличения дозы облучения. Так,

ю -

о -81* о, (рид- 1.25

о - 21% О, • - 8М О,

ФИД « 1.20

Доза однократного облучения, Гр

Доза однократного облучения, Гр

о - 21% О, • -8% О,

и »0 и «о Доза за б фракций, Гр

о -21% О, » -8%Оа фид • 1.29

Доза за 5 фракций, Гр

Рио.1.

Коэффициент поражения клубочков после однократного (А,В) и фракционированного облучения (Ь, Г). Срок облучения 8 (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев

активность сукиинатдегидрогеназы после однократного и фракционированного облучения на воздухе через 8 месяцев уменьшается, Через 10 месяиев посла облучения на воздухе фермента в канальиевом эпителии становится еше меньше. После облучения в гипоксии активность сукиинатдегидрогеназы также достоверно снижается в сравнении с контролем, но менее интенсивно, чем после облучения на воздухе. При всех дозах четко выражен защитный эффект, гипоксии (таблица, стр 22), Анализ полученных данных иллюстрирует 1аюке степень снижения поражающего действия радиации при переходе от одномоментного к фракционированному воздействию. Например, через 8 месяцев после облучения на воздухе одинаковая степень снижения активности сукиинатдегидрогеназы происходит при однократной дозе 14 Гр и фракционированной - 30 Гр. Примерно такое же двукратное ослабление поражающего действия радиаиии наблюдается и для щелочной фосфатазы (таблица), т.е. используемый критерий хорошо отражает такую известную радиобиологическую закономерность, как эффект фракционирования. В иелом полученные данные соответствуют имеющимся в литературе (Мостофи Ф.К., 1972) сведениям о том, что' изменения в сукиинатной и фосфатазной системах идут параллельно утрате паренхимы и прогрессирующему почечному фиброзу, характерным для пострадиационного процесса а почках.

сааалонек. Результаты подсчета количества ядер свидетельствуют, что чем выше доза облучения, тем меньше ядер остается в стенке канальцев (г =« - 0,68) (рис. 2), Так, через 8 месяиев после минимальной дозы однократного облучения на воздухе-11 Гр - количество ядер в нефро-эпителии снижается на 19,5 % по сравнению с контролем, после максимальной дозы -18 Гр - в 3,2 раза. Дозы фракционированного воздействия удалось подобрать таким образом, чтобы получить примерно-такую же степень снижения числа ядер, что позволяет надежно определять величину" радиозашитного действия гипоксии по этому важному критерию поражения почек. Так, через . месяцев после облучения в дозе 25 Гр количество ядер уменьшается на 58,4 %:, после Максимальной дозы 35 Гр - в 4,5 раза. Через^Ю месяцев сохраняется отмеченная выше зависимость динамики

11 13 15 17 1»

Доза однократного облучения, Гр

К 11 <5 1Г 19

Дозе однократного облучения, Гр

Ъ Г

Рис. 2. Количество ядер на поперечном срезе одного канальца о корковом веществе почек после однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облучения. Срок наблюдения 8 (А,Б) и 10 (В,Г) иасяцев.

показателя от дозы облучения, однако снижение количества ядер выражено в меньшей степени, чем через 8 месяцев после облучения. Четко просматривается тенденция к возрастанию количества ядер через 10 месяцев после облучений по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Это происходит не за счет увеличения в составе нефроэпителия ядерных клеток, а, очевидно, за счет норастания количества двуядерных клеток. Особенно четко вклад двуядерности в увеличение общего количества ядер в нефроэпителии просматривается после облучения в гипоксии, где коэффициент корреляции между абсолютным количеством ядер и количеством двуядерных клеток составляет 0,84 (р < 0,001); после облучения на воздухе г = ОД) (р < 0,05). Кроме того, при всех дозах облучения в гипоксии ядер в нефроэпителии сохраняется значительно больше, чем при соответствующих дозах облучения на воздухе, что сшютельствует о шраженном защитном эффекте гипоксии по данному показателю.

канальцев коркового вешестшлочек. Исследуя морфологические аспекты лучевого поражения почек, авторы отмечают наличие в нефроэпителии после, облучения, особенно после воздействия больших доз, дегенеративных, неправильной формы клеток с гигантскими гиперхромными ядрами (Мостофи Ф.К., 1972, 01Бика М. еК а1., 1988). Эти патологические ядерные формы получили в радиобиологии название ядер "лучевого патоморфоза".

В данном эксперименте в канальиевом эпителии также обнаруживаются клетки с ядрами, имеюшими признаки лучевого патоморфоза. Их количество прогрессивно нарастает по мере увеличения дозы облучения как на воздухе, тка и в гипоксии (рис. 3). Через 10 месяцев после однократного облучения на воздухе и в гипоксии количество этих ядер обнаруживает тенденцию к увеличению по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Обращает на себя внимание большая степень возрастания клеток с признаками лучевого патоморфоза при фракционированном облучении, Так, после пятикратного . облучения на воздухе в юзе 35 Гр количество клеток с ядрами лучевого патоморфоза увеличивается почто в 2 раза по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, достигая 36,0 ± 3,6% • (р < 0,001;. Такая же картина наблюдается и после облучения в гипоксии1 в дозе 40 Гр, где число таких клеток увеличивается почти в 2 раза и достигает 312 ± 1,9% (р < 0,001). Таким образом,

«о

19.0 110 110 <0 7.0

о -21% О, « -о%о2 ФИД - 1.32

11 II II 17 II

Доза однократного облучения, Гр

19.0

£ 1Т.0

? 1)0

§ «0

с 11.0

р

$ •.0

ё 7.0

1 »0

¡2 за

о- 21% Ог ■8% О, ФИД -1.20

11 13 II 17 11

Доза однократного облучения, Гр

О - 21% Ог

а » за Доза за 5 фракций, Го

43.0

£

<00

I 550

§ 30.0

( 300

&

3 200

1 160

* 100

о * 21% 04 • • 8%Ог ФИД - 1.29

и к и Доза за 5 фракций, Гр

А

Рис. 3 Количество ядер с признаками лучевого патоморфоза

в нефроэпителии коркового вещества почек после однократного (А, В) и фракционированного ¡(Б, Г) облучения. Срок наблюдения Р (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев

чем больше проходит времени после облучения, тем большее проявление получает результат прямого поражения радиацией ядер нефроэпителия. Полученные данные согласуются с имеющимися в;литературе фактами о том, что клетки нефроэпителия извитых канальцев почек относятся к медленно обновляющейся стационарной популяции, тяжесть поражения которых усиливается с течением времени после воздействия и проявляется через многие месяцы. Между общим количеством ядер и количеством среди них ядер с признаками лучевого патоморфоза существует выраженная обратная зависимость. Значения коэффициента корреляции варьируют в каждом конкретном случав от - 0,88 (р < 0,001) до - 0,99 (р < 0,001).

Таким образом, количество ядер с признаками лучевого патоморфоза, являясь показателем прямого поражения радиацией нефроэпителия, может количественно характеризовать степень этого поражения и степень защитного эффекта гипоксии.

Содержание а состазе нефроэпителия лвуядерных-клакж, Адаптация организма к меняющимся условиям среды и компенсация нарушенных функций структурно обеспечивается не только на основе пролиферации клеток и внутриклеточной регенерации, но и в не меньшей степени путем гиперплазии, т.е. увеличением числа ядерных и иитоплазматических структур (Саркисов й.С.. Аруин Л.И., 1987). Наиболее четко эта способность реализуется в дифференцированных и высокоспеииолизированных клеточных популяциях с невыраженным камбием (Бродский В.Я., Урывавва И.В., 198)). К таковым относится, а частности, почечный эпителий, в котором увеличение рабочих единиц начинается с гиперплазии мер, что приводит к образованию полиплоидных, в том числе, двуядерных клеток (Саркисов Д.С., 1987). Число этих клеток через 8 месяцев после облучения на воздухе в интервале доз 11-15 Гр увеличивается, но обратно пропорционально дозе облучения. В интервале 16-17 Гр их количество незначительно выше контроля и при дозе 18 Гр остается равным контрольному уровню. В гипоксии интервал максимальной однократной дозы, при которой данный показатель значимо отличается от контроля, увеличивается до 17 Гр. В дозе 18 и 19 Гр это увеличение недостоверно. Через 10 месяцев после облучения на воздухе содержание двуядерных клеток выше нормы только в аозе* 11 Гр, в интервале 12-16 Гр эти изменения недостоверны и при дозе 17 и 18 Гр число этих клеток проявляет

тенлениию к снижению. После фракционированного облучения через 8 месяцев и на воздухе, и в гипоксии этих клеток в нефроэпителии становится • в 2-3 раза больше. Через 10 месяиев после фракционированного облучения количество двуядерних клеток снижается и при дозе 35 Гр становится достоверно ниже контроля. В гипоксии эти изменения недостоверны (рис 4).

Исходя из биологической значимости феномена двуядерности клеток как структурного резерва популяции и рассматривая закономерность его функционирования после облучения в аспекте концепции формирования в организме адаптационных реакций (Гаркави АХ. с соавт., 1979; Саркисоз Д.С., 1976), можно сделать вывод, что степень адаптации нефроэпителия к пострадиационному повреждению тем выше, чем Ниже доза облучения. Во всех случаях гипоксия эффективно зашишает резерв нефроэпителия, благодаря чему компенсаторные процессы протекают с большей активностью и в большем интервале доз, что обеспечивает, очевидно, более длительную адаптацию тубулярного аппарата почки к пострадиационному повреждению. Полученные данные свидетельствуют также о том, что компенсаторные процессы в нефроэпителии через 8 месяиев после фракционированного облучения развиваются более активно, чем после однократного. Однако через Ю месяцев наблюдается обратная картина. К этому сроку при однократном облучении двуядерных клеток значительно больше в паренхиме, чем при фракционированном, а при дозах 35 и 40 Гр даже в гипоксии их число свидетельствует о срыве адаптации. Очевидно, 8 этом случае также проявляется одно из свойств нефроэпителия как стационарной системы - кумуляция эффекта лучевого повреждения при длительном фракииоированном облучении (Ярмоненко С.П., 1982).

Склеротические изменения сосудов артериального типа в почках после облучения. По наблюдениям СагагеМ вЖ (1968), радиационная нефропатия развивается в форме прогрессирующего артериолярного нефросклероза. Склероз или гиалиноз сосудов артериального типа тйкже отмечается иелым ршом авторов как один из морфологических феноменов облученной почки (Серов В.В., Варшавский В.А„ Куприянова Л.А., 1983). В иелоги количественная оценка склероза сосудов артериального типа по сосудистому индексу может явиться объективным показателем поражения радиацией сосудистого русла почки и выяснения эффективности защитного эффекта гипоксии.

I

190 |«0 Е «9 4.0 10.0

• О

• о

40

о .2114 0, I4 • • В* О, ФИД» 1.22

К 0 Н т (• 0 Л

II II II 17 II

Доза однократного овпуманип, Гр

110

& * но

е ! 140

110

1 10 0

1 II

«•

* 4 0

о -21%О,: • -8% о,

ФИД-1.33

К О Н Т Р С

II и |>

Дом однократного облучения, Гр

га х зз Доза за б фракций, Гр

И » м Доза за 5 фракций, Гр

в

Рис. 4.. Количество двуядерных клеток в канальцах коркового вещества почек посла однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облучения. Срок наблюдения 8 (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев.

Действительно, величины СИ в опытных серия?: эксперимента выше, чем в контроле, просматривается лозовая зависимость показателя (рис 5). Однако в • гипоксии наблюдается некоторое нарушение отмеченной закономерности. Так, величина СИ через 8 месяцев после однократного облучения в дозе 16 Гр составляет 1,05 ± 0,23, а в дозах 17 и 18 Гр остается одинаковой и составляет 0,91 ± 0,11, через 10 месяцев в интервале доз 15 - 17 Гр показатель также практически не меняется. Этот факт свидетельствует о слабо выраженном защитном эффекте гипоксии. Склерозируюший эффект минимальных и максимальных суммарных доз фракционированного облучения на воздухе ив' гипоксии через 8 месяцев приблизительно соответствует таковым при однократном облучении и несколько превышает показатели через 10 месяцев после облучения. Этот факт свидетельствует, во-первых, о более шадяшем воздействии фракционированного облучения, во-вторых, о наличии, уж© отмеченном выше, хотя и слабо выраженного,, кумулятивного эффекта на более поздних сроках после облучения, который характерен.для медленно обновляющихся тканей и к которым также относится сосудистый эндотелий.

Таким образом, локальное облучение почек приводит к прогрессирующему склерозу внутриорганных сосудов артериального типа. Полученные результаты свидетельствуют также о том, что процесс склероза сосудов артериального типа характеризуется значительной неравномерностью и большой индивидуальной вариабельностью. В силу этого, очевидно, гипоксическая газовая смесь, содержащая 8% кислорода, с малым эффектом защищает сосуды. Это касается однократного и фракционированного облучения.

духе и. й .гипоксии, В качестве отдаленных последствий общего облучения организма или локального облучения почек развивается нефросклероз (Bennet с соавт., 1953; Guttman et al., 1960.1963; Rosen S. et al. 1964; Мостофи Ф.К., 1972; Melstrlch M.N, et al., 1984).

По данным морфометрии в контрольной группе животных ОИК составляет 4 $5 ± 1,3%, что, приблизительно, соответствует результатам, которые были получены на биопсийном материале почек человека (Яргин. 1985, 1986). В опытных группах ОИК выше, чем в контроле, за исключением двух групп животных, исследованных через 8 месяцев после облучений в гипоксии в дозе 13 Гр (р>0,05) и 14 Гр (р>0,01) (рис. 6). Через 8 и 10 месяцев после одно-

о -214 0, • - 8% 0} ФИД. 1.15

11 I] 11 17 II

Доза однократного облучения, Гр

II 11 II 17 к

Дом однократного облучен1 ■ Гр

о - 21% 04 • • 6% Ог ФИД«= 1.13

п *з м « Доза за 6 фракций, Гр

г» 90 39

Доза 5а 5 фракций, Гр

Рис. б. Сосудистый индекс арторлЛ коркового вещества почек посла ' однократного (А, В) и фракционированного (6, г) облучения.

Срок наблюдения О (АД?) и 10 (В,Г) месяцев.

И 13 16 17

Доза однократного облучения, Гр

О - 21% О, • -8% О,

11 11 И 17 1»

Доза однократного облучения, Гр

2 500 •8

О - 21% О,

• • о.

ФИД= 1.47

-АА И.иЛ Г , 13

¡5 30 40

Доза за 5 фракций, Гр

30.0 20.0

0 -21% О, • -8%Ог ФИД = 1.49

25 ЭО .40

Доза за 5 фракций, Гр.

Рис. 6.

Относительный объем интерстиция коркового вещества почек после однократного (А, В) и фракционированного (Б, Г) облучения. Срок наблюдения 8 (А,Б) и 10 (В,Г) месяцев.

кратного облучения на воздухе в максимальных дозах 17 Гр и 18 Гр больше половины объема органа приходится на соединительную ткань. После облучения в гипоксии в дозе 19 Гр ОИК составляет через ,Ь месяцев только 36,4 ±. 1,6% (р<0,001), а через 10 месяцев - 38.0 ± 0,4% (р<0,001). При всех дозах облучения четко просматривается защитный эффект гипоксии. Через 8 месяцев после фракционированного облучения на воздухе в интервале доз 25 - 35 Гр, а в гипоксии в интервале доз 30 - 40 Гр, величины ОИК не отличаются достоверно от значений ОИК при однократном облучении на воздухе и в гипоксии в интервале доз 13 - 16 Гр и 16 - 18 Гр соответственно. Эти данные иллюстрируют снижение поражающего действия радиации при переходе от одномоментного к фракиионированому воздействию. Через 10 месяцев после фракционированного облучения на воздухе и в гипоксии величины ОИК достоверно выше, чем при соответствующих дозах через 8 месяцев после облучения, что является свидетельством того, что темпы склерозирования почек в интервале 8-10 месяцев после фракииоированного облучения гораздо выше, чем после однократного. В этом факте также находит отражение кумулятивный эффект, характерный для медленно обновляющихся тканей.

Таким образом, динамика ОИК свидетельствует о том, что этот показатель адекватно отражает результат процесса склерозирования почек после облучения - относительное увеличение в корковом слое обьема соединительной ткани и пропорциональное снижение клеточной массы паренхимы. Интенсивность процесса находится в зависимости от дозы, сроков и способа облучения. Эти результаты согласуются с имеющимися в литературе (Мостофиф. К., 1972; MelstrlchM.V. étal, 1984).

Из всех факторов, которые могут способствовать прогрессированию склероза в почках после облучения, наиболее вероятным является, интенсификация синтеза коллагена фибробластами интерстииия под медиаторным воздействием клеток инфильтрата (Яргин C.B., 1985, 1986; Серов В.В., Яргин C.B. 1986; Яргин C.B. 1986). В данном эксперименте также обнаруживается постоянное наличие в стромэ облученных почек, особенно в периваскулярных пространствах, лимфоплазмаиитарных клеток. Этот факт может быть косвенным подтверждением наличия в интерстииии облученной почки медиаторных "пусковых" факторов коллагенизаиии стромы. Их включение происходит, очевидно, в самые ранние сроки после облучения

I

вследствие сосудистых расстройств, характерных для периода острого лучевого поражения (Ярмоненко С.П., 1988) и, вс можно, связанных с-■ повреждением мембран самых мелких сосудов интерстииия почек -перитубулярных капилляров. Действие модификатора, значительйо замедляю -шего развитие с^слеротических процессов. показывает, что гипоксическая смесь, содержащая 8% кислорода, эффективно защищает, по-видимому, прежде всего перитубулярные капилляры, что ингибирует, коллаген-синтетическую функцию фибробластов - инициальную фазу склеротических изменений в строме органа,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные показывают, что применение во время облучения дыхательной смеси с пониженным до 8% содержанием кислорода увеличивает толерантность гломерулярного аппарата, канальиевой системы нефрона и снижает активность склероза стромы почек в 1,21 - 1/49 раза. Это означает, что при использовании гипоксической газовой смеси во время лучевой терапии опухолей -в случаях, когда почки являются. региональным дозолимитируюшим органом, суммарная доза лучевого воздействия на опухоль может быть безопасно повышена не менее чем на 20%.

Сравнительный анализ данных о степени зашиты отдельных морфофункци-ональных структур почек приведен в нижеследуюшой таблице.

Таблица.

Степень защитного эффекта гипоксии по показателям ФИЛ

Срок после облучения (месяцев) Коэф. поражения клубочков Кпнальиевый эпителий СИ ОИК

Кол-во Кол-во Кол-во СДГ . 1Ш> ядер ядер с двуядер-луч. па- ных клеток юмор.

Однократное облучение

6 1,25 1,31 1,31 1,21 иг 1,22 1,15 1,32

10 1,28 1,34 1,29 1,31 1,28 ■ 1,33 1,13 1,37

Фракционированное излучение

8 1.28 1,37 1,34 1,35. 1,37 1,31 1,16 147

10 Ь29 1,35 1,30. 1,29 1,29 1,41 1,18 1,49

Как видно, зашитое действие гипоксии варьирует в определенных рамках. Наиболее низкие значения ФИЛ смеси, содержащей 8% кислорода, получены при оценке по величине СИ, наиболеь высокие - по величине ОИК. Учитывая интегральную природу показателя ОИК. это может означать, что наиболее эффеюивно гипоксия защищает либо »пителий перитубулярных капилляров интерстииия, ингибируя инициальные мвханиамы коллагенизаийи стромы органа, либо эндотелий капилляров клубочков, препятствуя в конечном счете развитию гломерулярного блока кровотока, а скорее всего, и то и другое. Зашитое действие гипоксии увеличивается при переходе от однократного к фракционированному воздействию при оиенке эффекта облучения по всем морфологическим тестам. Этот феномен отражает одно из свойств стационарных клеточных систем - способность кумулировать эффект лучевого повреждения при фракционированном воздействии. •Гипоксия, таким образом, препятствует накоплению в эндотелии и эпителии почек лучевых повреждений. Из представленных результатов видно, что использование гипоксии в момент облучения приводит к удлинению латентного периода до начала развития изменений, достоверно значимо отличающихся от контрольных показателей. Однако его продолжительность для различных тостов варьировала. Все регистрируемые показатели как на воздухе, так и в гипоксии имели тенденцию к лрогрессированию во времени, что соответствует общим представлениям о характере течения радиационной нофро паши.

В заключении обзора полученных данных следует еше раз обратиться к результатам, полученным при оиенке ФИД по величине СИ, Известно, что облитерация приносящих сосудов играет ведущую роль в развитии ииемической гипоксии почек (Наточин Ю.В., 1982), Этот процесс, по видимому, в том временном интервале, который исследовался в данном эксперименте, а именно спустя 8-10 месяцев после облучения, в генезе нефросклероза существенного значения не имеет. Доминирующую роль в развитии патологии здесь играет поражение паренхимы и, очевидно, поражение капиллярной системы органа - эндотелия клубочков и перитубулярных капилляров.

ВЫВОДЫ

' ■ I

1. Применение во время локального облучения почек дыхательной смеси, содержащей 8% кислорода, что моделирует условия применяемого в лучевой тэрапии опухолей метода "гипоксирадио терапии", снижает тяжесть отваленной лучевой патологии с фактором уменьшения дозы (ФИД), варьирующим для большинства структур почки от 1,21 до М9. Таким образом,' при лучевой терапии опухолей, локализация которых делает почку дозолимитируюшим органом, использование в момент облучения обшей газовой гипоксии, дает возможность безопасного повышения курсовой дозы на 20%.

2. Наиболее высоким радиозашитный эффект гипоксии является для такого интегрального показателя тяжести лучевого нефросклероза, как относительный обьем интерстииия коркового вещества: при однократном облучении и оиенке эффекта через 8 мес после облучения ФИД составил 1,32, при оценке через 10 мес - 1,37; при фракииони-рованном облучении ФИД через 8 мес после воздействия был равен 1,47, через 10 мес -1.49.

3. Гломерулярный аппарат почек, в качестве критерия лучевого поражения которого использовано повышение плотности капиллярных петель клубочка, при однократном и фракционированном воздействии 'радиации защищается изученной дыхательной смесью с ФИД, равным 1,25 - 1.29.

. 4. Степень зашиты канальцевого эпителия коркового слоя почек, определенная по пяти показателям - величинам индекса активности сукиинатдэгидрогеназы и шелочной фосфатазы, количеству ядер на поперечном срезе канальца, числу ядер с признаками лучевого потоморфоза и количеству двуядерных клеток соответствует ФИД = 1,21 -1.41.

5. Защитное действие гипоксии для артерий среднего Калибра, определенное по сосудистому индексу, характеризующему ' изменение просвета сосудов и, таким образом, объем почечного кровотока, находится в пределах 1,13 -1,18, т.е. грраздо меньше, чем для других структур почки, что связано с.. прямым контактом эндотелия с .. кровью.

- 2b -

\

p02 в которой и в условиях дыхания животными смесью, содержащей18% 02 , остается на уровне, при котором защитное действие гипоксии еше но проявляется в полной мере.

6. Существенно меньшая зашита гипоксией артерий по сравнению с ее радиомоаифииируюшим действием в отношении нефросклероза является доказательством правильности представлений, что ведущим фактором развития поздних осложнений лучевой терапии является поражение клеток тканевой паренхимы и эндотелия пёритубулярных и клубочковых капилляров, а не крупных и средних сосудов, как это считается некоторыми авторами.

7. Радиозашитное действие гипоксии .для клубочков, ¿анальиев и стромы почек, в отличив от изученных ранее по этому параметру пишевоаа, тонкого кишечника и костного мозга, не уменьшается при переходе от однократного к фракционированному облучению, что позволяет прогнозировать сохранение радиозашитного эффекта и при переходе от крупнофракиионированного облучения больных, для которого накоплен положительный опыт гипоксирадиотерапии, к ее использованию в режиме мелкофракиионированного облучения.

8. Установлено, что изменение морфологических показателей поражения почки линейно зависит от поглощенной дозы в диапазоне 11 -18 Гр при однократном воздействии и 25 - 35 Гр при фракционированном облучении, что позволяет количественно оценивать поражение отдельных тканевых элементов этого органа, . являющегося для радиационной онкологии моделью медленнообновляюшихся дозолимитируюшйх органов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1, Гистохимическое и биохимическое изучение лучевого поражения почек е условиях обшей газовой гипоксии (Соавт. Е. Г, Оюсаренко, В.В. Остапенко, A.A. Вайнсон, Н.Т. Райхлин) - Архио патологии, N 4, 1993, с, 72 - 76.

2. Морфофункииональная характеристика почек мышей при облучении на воздухе и в гипоксии (Соавт. Е.Г. Слесаренко, Л.А.Палиенко,

А.А.Вайнсон) - Актуальные вопросы медшдены и биологии, Днепропетровск, 1993, с. 49.

3. Протекторная роль гипоксии при радиационном поражении почек -Актуальные вопросы медицины и биологии, Днепропетровск, 1993, с. 207.

4. Молиф1каи1йна д1я ПпоксИ при рал1аи1йному ураженн! нирок

(Соавт. О.Г. Слесаренко) - Матер1али V конгресу св1юво1 федераиН л1-карських товариств. ДнИропетровськ. 1994, с, 43,

5. Морфог1стох1м!чн1 вм1ни нирок при раоиаи1йному ураженн! - Матер1али V конгресу cbItoboI федераиН л1карських товариств, Дн!пропетровськ, 1994, с. 41. *

6. Влияние жесткой гипоксии на функциональную морфологию почек при облучении - Актуальные вопросы морфологии и клинической медицины, Днепропетровск, 1994, с. 97 - 98,

7. Морфологическое исследование почек мышей при облучении (Соавт. Слесаренко Е.Г.,Вайнсон А.А.) - Матер, междунар. конф. лосв. 80-летию проф. Т.В. Золотаревой . Полтава, 1994, с. 178.

8. Элекронно-микроскопическая характеристика почек мышей при лучевом поражении (Соавт. Слесаренко Е,Г.,Вайнсон А.А.) - Межд. бюлл. развития лазерной медицины N 1, Днепропетровск. 1994, с.80.

9. Воздействие однократного облучения на структуру почек мышей -Междунар. бюлл. развития лазерной медицины N I Днепропетровск. 1994, с. 81.

10 Effect of mouse Irradiation In air and In hypoxic conditions on the hystologlcal changes In kidney. ( Co-authors: V.Ostapenko, Pallenko L.A.. Slesarenka E.G. and Tanaka Y.) Indian J. of Experimental Biology. 1996, (In press).

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Тираж 400 эк.

Поди, к печати\ЪА 96-

Заказ 7-4