Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Оральный гомеостаз у детей с бронхиальной астмой

На правах рукописи

АБАДЖИДИ Мария Андреевна

ОРАЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14 00 09 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород - 2004

Работа выполнена в ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница»

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Лукушкина Е Ф Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Е И Шабунина кандидат медицинских наук ИВ Кузнецова

Ведущее учреждение «ГУ Научный центр здоровья детей» РАМН г Москва

Защита диссертации состоится « » июня 2004 г

в часов

на заседании диссертационного совета Д 208 061 02 в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации» 603605, г Нижний Новгород, пл Минина, 1/ 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО НижГМА (ул Медицинская, д 4)

Автореферат разослан « » мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Е Ф Лукушкина

44L4S

H?f?09

Актуальность работы. Бронхиальная астма принадлежи1 к наиболее распространенным и тяжелым аллергическими заболеваниям детского возраста, рост которой не прекращается Особенностью бронхиальной астмы у детей является преобладание атопической формы Атопические болезни принадлежат к группе мультифакгорных заболеваний, развитие которых определяется генетическими и средовыми воздействиями (Балаболкин И.И ,2003).

В основе бронхиальной астмы лежит хроническое воспаление слизистой оболочки бронхов, которое протекает как (отсроченная) фаза немедленных (IgE -зависимых) аллергических реакций и поддерживается периодическим антигенным раздражением в сложных взаимодействиях клеток и гуморальных факторов (Гущин И С , 1998, Балаболкин И И, 1998, Гервазиева В Б и соавт, 2003, Fireman Р, 2003) Проявления этого процесса выходят за рамки респираторного тракта и могут быть зафиксированы в различных системах организма (Полосухина В А. и соавт., 1989, Маянский А Н, Пикуза О И, 1993; Пыцкий В.И и соавт, 1999), что позволяет косвенно судить об активности аллергического воспаления, прогнозировать его течение и эффективность терапевтических и оздоровительных мероприятий

Немало работ посвящено изучению нормальной микрофлоры у детей с аллергическими заболеваниями Почти все они ограничены анализом микрофлоры толстого кишечника (точнее фекалий) и единодушно констатируют наличие дисбакгериоза (дисбиоза) на фоне аллергической патологии, в том числе при бронхиальной астме (Полосухина В А и соавт, 1989, Ужегова ЕБ, 1989) Вопрос о причинно-следственных связях между дисбактериозом и соматической патологией остается дискуссионным, что, однако, не мешает практическому использованию (в том числе в аллергологии) препаратов, нацеленных на воспроизведение или усиление позитивных эффектов нормальной микрофлоры в системе местного и общего гомеостаза (Шендеров Б А, 1998; Коршунов В.М и соавт., 2002; Бляхер М С и соавт, 2002; Лыкова Е.А. и соавт., 2001, Dugas В et al, 1999; Isolauri Е et al., 2002, Korhonen R et al, 2001)

Патогенетическая значимость нарушений в микрофлоре слизистых оболочек обретает новое содержание в связи с концепцией о функциональных вариантах CD4 Т-лимфоцитов (Т-хелперов, Th) Из двух альтернативных субпопуляций (Thl и Th2) в развитии аллергического воспаления доминируют

ТЬ2-клетки, которые благодаря своим цитокинам (ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13) направляют дифференцировку В-лимфоцитов в IgE продуцирующие клетки, а также содействуют другим событиям, связанным с данным процессом Одним из ключевых факторов, определяющих Thl/Th2 поляризацию, являются стимулы, исходящие из нормальной микрофлоры (Rescigno М, 2002) Отсюда не исключено, что извращения ее качественного и/или количественного состава влияют на взаимодействия клеток иммунной системы С этих же позиций можно оценить и клинические результаты применения препаратов типа пробиотиков (Коршунов В М, 2002, Dugas В et al, 1999, Isolauri Е et al, 2002, Matsuzaki T , Chin J, 2000, Pessi T et al, 2000)

В исследованиях, проведенных по инициативе кафедры микробиологии и иммунологии Нижегородской медицинской академии, было показано, что удобным объектом для изучения нормальной микрофлоры являются буккальные эпителиоциты (Маянский АН, 1999) Это согласуется с наблюдениями о том, что буккальный эпителий может быть индикатором дестабилизационных процессов, протекающих в организме (Рыжавский Б Я, Холодок ГН, 1995, Хусаинова И С и соавт, 1997) Опираясь на эти данные, представляло интерес более тщательно проанализировать масштаб нарушений микрофлоры буккального эпителия в проекции на клиническую патологию

Много внимания исследователями уделяется изучению секрета ротовой полости в качестве субстрата, альтернативного сыворотке крови Это связано с неинвазивностью забора материала, что особенно важно в педиатрической практике и в связи с опасностью контаминации при парентеральных манипуляциях Накоплен большой материал по изучению саливарных показателей, позволивший сформулировать концепцию о гемато-саливарном барьере и обосновать дополнительные подходы к патогенетической и прогностической диагностике (Комарова Л Г , Алексеева О П, 1994, Гриневич И Б и соавт, 1995, Григорьев ИВ, Чиркин А А, 1998, Баранов А А, Дорофейчук В Г ,1999) Казалось целесообразным использовать этот опыт для характеристики орального гомеостаза, сравнив клиническую информативность разных тестов

В ряде исследований для суждения о специфической и неспецифической реактивности организма использовались нейтрофилы ротовой полости, которые эмигрируют сюда из кровеносного русла главным образом через десневые карманы (Адо А Д и соавт, 1986, Ашкинази В И, 1998, Сивовол С И, 2001,

4

Сукманский ОИ, 1991) Нейгрофилы обладают мощным эффекторным потенциалом, мобилизация которого существенно влияет на физиологию и патологию слизистых оболочек, в частности на стабилизацию хронической фазы аллергического воспаления (Маянский АН, Маянский ДН, 1989) В связи с этим мы сочли целесообразным включить в комплексную оценку орального гомеостаза показатель мобилизационной активности саливарных нейтрофилов

Таким образом, изучение орального гомеостаза может оказаться полезным в анализе больных бронхиальной астмой для выделения фазы заболевания, определения эффективности терапевтических воздействий и выявления патогенетического своеобразия

Цель исследования. Совершенствование диагностических критериев прогноза течения бронхиальной астмы у детей на основе изучения функциональных сдвигов в системе орального гомеостаза в проекции на нозологическую специфику и клиническую информативность

Задачи исследования:

1 Определить количественные и качественные показатели естественной микробной колонизации буккального эпителия у детей в зависимости от тяжести течения бронхиальной астмы; изучить резистентность буквальных эпителиоцитов к искусственной микробной колонизации (адгезии) у наблюдаемых детей

2 Исследовать саливарные показатели местного иммунитета иммуноглобулины, секреторный компонент, лизоцим, коэффициент сбалансированности факторов местного иммунитета, особенности цитокинового профиля секрета ротовой полости (ИЛ-1Р, ФНОа, ИЛ-4), показателя мобилизации оральных нейтрофилов у больных бронхиальной астмой

3 Выявить диагностические критерии прогнозирования течения бронхиальной астмы у детей на основе установленных функциональных сдвигов орального гомеостаза

4 Провести сравнительный анализ показателей орального гомеостаза у детей с бронхиальной астмой и другой патологией аллергического (атопический дерматит) и неаллергического (рецидивирующие респираторные инфекции, хронический гастродуоденит) генеза

Научная новизна работы. Изучены количественные и качественные показатели микробной колонизации буккальных эпителиоцитов у детей с бронхиальной астмой и определен масштаб их нарушений в зависимости от тяжести и фазы заболевания На основании сравнительного анализа детей с разной патологией (бронхиальная астма, атопический дерматит, острые респираторные заболевания, гастродуоденальная патология) сделан вывод об универсализме дисбиотических сдвигов в системе буккального эпителия, отражающих состояние общего гомеостаза При изучении адгезивного взаимодействия кандид (С albicans) с буккальными клетками получены данные, доказывающие возможность избирательного ослабления колонизационной резистентности мукозального эпителия у больных с бронхиальной астмой

Установлено, что бронхиальная астма сопровождается нарушением саливарного гомеостаза, которое проявляется в дисбалансе факторов местного иммунитета и изменении цитокинового профиля секрета ротовой полости

На основании количественного содержания цитокинов (интерлейкин-1|3, интерлейкин-4, фактор некроза опухолей-а) в слюне здоровых детей и больных с бронхиальной астмой обоснована степень автономии саливарного цитокинового статуса и его реактивная перестройка в зависимости от патологии

Практическая значимость работы. Сформулировано представление о дисбактериозе (дисбиозе) в системе буккального эпителия Индекс естественной бактериальной колонизации буккальных эпителиоцитов рекомендовано использовать в педиатрической практике в качестве универсального индикатора здоровья и слежения за динамикой эффективности лечения и реабилитационных мероприятий Установлено значение данного критерия в спектре саливарных показателей, отражающих состояние гомеостаза ротовой полости при системной патологии Обоснована возможность использования секрета ротовой полости (неинвазивного, адекватного субстрата) для оценки цитокинового статуса в клинической характеристике детей с бронхиальной астмой

Основные положения, выносимые на защиту

1 Показатель естественной микробной колонизации буккального эпителия отражает нарушения общего гомеостаза и может быть использован в

качестве диагностического и прогностического критерия в педиатрической практике, в частности, у больных бронхиальной астмой

2 Бронхиальная астма сопровождается избирательным ослаблением колонизационной (адгезивной) резистентности буккального эпителия по отношению к атипичным для данного биотопа микроорганизмам

3 Цитокиновый дисбаланс является элементом нарушения саливарного гомеостаза у детей с бронхиальной астмой

4 Среди показателей орального гомеостаза (иммуноглобулины, секреторный компонент, лизоцим, коэффициент сбалансированности факторов местного иммунитета, показатель мобилизации оральных нейтрофилов) наибольшей спецификой при бронхиальной астме отличались сдвиги по коэффициенту сбалансированности факторов местного иммунитета

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на аллергологической секции общества педиатров (г Нижний Новгород, 2001, 2002), на Международной научно- практической конференции "Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002 г.), на конференции "Здоровье и образование XXI века" (Москва,2003 г.).

Внедрение результатов работы. Практические рекомендации, изложенные в диссертации, используются в работе пульмонологической клиники детской областной больницы г Нижнего Новгорода и в клиническом отделении НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ По материалам исследования опубликовано 12 работ

Структура диссертации Диссертация написана на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, пяти глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, который включает 247 источников (150 отечественных и 97 зарубежных) Работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 25 рисунков и 9 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объем и методы исследования.

Клинические наблюдения и инструментально-лабораторные

исследования проведены у 66 детей с атопической бронхиальной астмой в возрасте от 5-15 лет, находившихся на стационарном лечении в ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница» (главный врач Кадников О Ю.)

Дети были разделены на 3 группы в зависимости от степени тяжести заболевания 1-ю группу составили дети с тяжелым течением бронхиальной астмы - 17 чел (25, 7 %), вторую группу - 32 ребенка (48, 6 %) со средней степенью тяжести, 3-ю группу - 17 детей (25,7 %) с легким течением заболевания При постановке диагноза пользовались положениями Национальной программы РФ «Бронхиальная астма у детей Стратегия лечения и профилактика» (1997 г) Группы сравнения составляли 32 здоровых ребенка (5-15 лет), 62- атопическим дерматитом (5-16 лет), 57 - часто болеющих острыми респираторными заболеваниями (10-15 лет), 19 детей с хроническим гастродуоденитом и 24 больных целиакией (4-10 лет) в стадии неполной клинической ремиссии

Специальные исследования включали следующие методы

1 Определение общего в сыворотке крови и секрете ротовой полости (слюне) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем ЬаЬо<Иа - Хема ( фирма «Хема», Россия -Швейцария), показатели выражали в МЕ / мл;

2 Определение цитокинов (пг/мл) в секрете ротовой полости и сыворотке крови (ИЛ-10, ИЛ -4, ФНОа ), методом ИФА с использованием тест-систем «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург),

3 Определение саливарных иммуноглобулинов ( г / л) класса А, Б, секреторного компонента (вС) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием диагностических моноспецифических сывороток («ИМБИО», г Нижний Новгород; предприятие по производству бактерийных препаратов ЦНИИВС им И И Мечникова),

4 Определение лизоцима в слюне ( % ) (Дорофейчук В Г , 1968),

5 Определение коэффициента сбалансированности (Кеб) факторов местного иммунитета (Дорофейчук В Г , 1987) согласно формуле, в которой учитываются функциональные взаимосвязи между лизоцимом и

иммуноглобулинами Кеб = IgG х 40 / IgA х 0,6 х л а , где IgG, IgA ила -концентрация иммуноглобулинов и лизоцима в слюне; 40 и 0,6 - условные нормы лизоцима и соотношения IgG / Ig А, результаты выражали в условных единицах (уел ед )

6. Определение миелопероксидазы (МПО) саливарных нейтрофилов ортодианизидиновым методом (К Suzuki et al, 1983 ), результаты выражали в нг/ мл по калибровочному графику, построенному на основе раствора пероксидазы («Sigma») с известным содержанием фермента

7 Определение индекса естественной колонизациии буккальнного эпителия (ИЕКБЭ)

Буккальные эпиггелиоциты получали путем соскоба со слизистой оболочки щеки стерильным шпателем утром натощак, взвешивали в физиологическом растворе, отмывали дважды (по 2 мин) путем центрифугирования (1500 об / мин) и наносили тонким слоем на предметное стекло Мазок высушивали на воздухе и после фиксации смесью Никифорова окрашивали азуром А (20 сек) Просматривали (при увеличении х 630) 50 клеток под микроскопом, дифференцируя их в баллах по числу адгезированных бактерий' 0 - 0-30 прикрепившихся бактерий, 1 - > 30-60, 2 - > 60-100, 3 - > 100-300, 4 - более 300 бактерий На основании этих данных подсчитывали индекс естественной колонизации буккального эпителия (ИЕКБЭ) по формуле (0 х n„ + 1 х П| + 2 х П; 13 х nj + 4 х п4 ) 50, где п - число эпителиальных клеток с различной степенью ( 0-4 ) колонизации Значения ИЕКБЭ более 1,0 считали нормальными, 0,5-1,0 - умеренным снижением, менее 0,5 - выраженным снижением (Маянский А Н, 1999).

8 Качественная характеристика микрофлоры буккального эпителия Проводили изучение микрофлоры буккальных эпителиоцитов путем посева их взвеси на 4 типа питательных сред • кровяной, желшчно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро Идентификацию бактерий и грибов осуществляли при помощи классических питательных сред и наборов "СИБ" ("ИмБио", Н Новгород)

9 Определение колонизационной (адгезивной) резистентости буккальных эпителиоцитов Исследовали адгезивные реакции в системе «буккальные эпителиоцигы - С. albicans» с использованием штамма С albicans «601» из коллекции Нижегородского НИИ гигиены и профпатологии МЗ РФ Результат оценивали по количеству кандид в пересчете на один эпителиоцит Нормальными считали показатели при адгезии 10 и менее кандид, они

наблюдались более чем у 80 % здоровых детей Показатели более 10 считались повышенными

Для статистической обработки результатов применяли методы вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента Обработка данных проводилась на ШМ-совместимом персональном компьютере при помощи прикладных пакетов Microsoft Exel 2000 для Windows NT ( ТМ)

Результаты исследования и их обсуждение.

Естественная колонизация буккального эпителия

Задачей настоящего раздела исследований явилось изучение микрофлоры буккального эпителия у практически здоровых детей, детей с бронхиальной астмой, атопическим дерматитом и часто болеющих острыми респираторными инфекциями Использовали прямую микроскопию, определяя индекс естественной колонизации буккальных эпителиоцитов (ИЕКБЭ) В серии опытов проводили микробиологический анализ буккальной микрофлоры с выделением и идентификацией чистых культур

Здоровые дети. У подавляющего большинства здоровых детей (29 человек, 90,6% ) ИЕКБЭ составлял 1,0-2,4 и только в двух случаях был ниже 1,0 ( 0,6 и 0,8 ) На этом основании ИЕКБЭ >1,0 был принят за условную норму; значения 0,5-1,0 и менее 0,5 расценивались соответственно как умеренное и выраженное снижение Средний показатель ИЕКБЭ у здоровых был 1,7 ± 0,1

Бронхиальная астма: обострение. В периоде обострения у детей с бронхиальной астмой (общая группа, 66 больных) ИЕКБЭ составил 0,88 + 0,06 и был существенно ниже, чем у здоровых (рк, достоверность различий относительно контроля, <0,01) Индивидуальные значения колебались от 0,0 до 2,3 У 17 детей (25,7%) этот показатель был в пределах нормы, у 32 ( 48,5 %) наблюдалось умеренное, у 17 (25,7 %) - выраженное снижение

В зависимости от тяжести бронхиальной астмы получены следующие результаты У детей с легким течением (3-я группа) средний показатель составлял 1,19 + 0,12 и был достоверно ниже контроля (рк < 0,01) Индивидуальные значения колебались от 0,01 до 1,8 У 13 (76,5 %) детей показатель был в пределах нормы, в трех случаях (17,6 % ) - отмечено умеренное, в двух (11,8% ) - выраженное снижение

У детей со среднетяжелым течением (2-я группа) средний показатель составлял 0,86 + 0,1 (рь < 0,01), индивидуальные значения колебались от 0,0 до 2,3 У 13 (40,6 %) детей показатель был в пределах нормы, у 10 (31,2 %) - имел умеренное, у 9 (28,2 % ) - выраженное снижение У детей с тяжелым течением заболевания средний показатель составлял 0,63 + 0, 09 (рк < 0,01), индивидуальные значения колебались от 0,0 до 1,1 У 2 (12,0 %) детей ИЕКБЭ был в пределах нормы, у 6 (35,3 %) имел умеренное, у 9 (52,9 % ) - выраженное снижение

Достоверных отличий по ИЕКБЭ между 1-й и 2-й группами детей в период обострения не выявлено, они обнаружены между детьми 1-й и 3-й, 2-й и 3-й группами ( р < 0,01).

Таким образом, у большинства больных бронхиальной астмой в периоде обострения выявлены существенные изменения нормальной микрофлоры ротовой полости, что выражалось в снижении индекса естественной колонизации буккальных эпителиоцитов Наиболее ярко это проявлялось при тяжелом течении заболевания

Бронхиальная астма: ремиссия. Под наблюдением находилось 35 детей с бронхиальной астмой, проходивших курс медикаментозной терапии После лечения показатели возросли у 22 (62,9 %) детей, у 11( 31,4 %) остались без изменений и в двух случаях ( 5,7 % ) стали ниже Средний ИЕКБЭ поднялся до 1,45 ± 0,1, что было достоверно выше исходного (период обострения) показателя (р < 0,05 ), приближаясь к уровню здоровых (рк > 0,1).

Это говорит о том, что ИЕКБЭ отражает клиническую эволюцию заболевания, имея тенденцию к восстановлению при выходе из острого периода Вместе с тем у ряда больных (особенно тяжелого течения) сохранялись низкие значения ИЕКБЭ несмотря на клиническое улучшение Это может указывать на неполноценность ремиссии, сохраняющей остаточные нарушения гомеостаза Дальнейшие исследования должны уточнить значимость данного показателя при контроле за эффективностью терапии, включая стабильность клинической ремиссии

С учетом выявленных изменений в состоянии нормальной микрофлоры буккального эпителия у больных бронхиальной астмой представляло интерес оценить ИЕКБЭ у детей с другой патологией

Атопический дерматит. Под наблюдением находились 62 ребенка с атопическим дерматитом в периоде обострения У большинства (54,4 %) детей

И

отмечалось диссеминированное, у 15 (26,3 %) - диффузное, у 11 (19,3 %) -ограниченное поражение кожи

Средний ИЕКБЭ в этой группе детей составлял 0,7 + 0,07, что существенно ниже контроля У 28 детей (45, 1 %) отмечено выраженное и у 16 (25,8 %) умеренное снижение показателя, нормальные значения зарегистрированы в 18 случаях (29,0 %) Это говорит о том, что нарушение микрофлоры буккального эпителия наблюдается при различных аллергических состояниях Снижение ИЕКБЭ было примерно одинаковым при респираторном (бронхиальная астма) и кожном (атопический дерматит) аллергозах

Дети, часто болеющие острыми респираторными заболеваниями. Обследовано 57 детей (возраст 13-15 лет), отнесенных в группу часто болеющих (ЧБД) Это были дети, у которых острые респираторные заболевания повторялись 4 и более раз в год Заболевания проявлялись в виде инфекций верхних дыхательных путей ангина, ринит, назофарингит, ларинготрахеит

Средний уровень ИЕКБЭ составил 0,5 + 0,1, что существенно ниже, чем у здоровых детей (рк< 0,01), больных бронхиальной астмой (р < 0,05) и недостоверно меньше показателей при атопическом дерматите Сниженные значения отмечены у 46 детей (80,7 %), из которых 29 (50,9 %) имели выраженное и 17 (29, 8 %) - умеренное снижение, нормальные показатели наблюдались в 11 случаях (19,3 %)

Применение рибомунила в качестве оздоровительного средства у детей с рецидивирующими острыми респираторными инфекциями, дало положительный клинический эффект, который сочетался с повышением индекса естественной колонизации буккального эпителия Это подтверждает возможность использования ИЕКБЭ для слежения за динамикой восстановления здоровья детей, о чем говорилось выше в связи с обследованием больных бронхиальной астмой

Таким образом, подавление нормофлоры буккального эпителия характерно не только для большинства детей с аллергическими заболеваниями, но и для детей, страдающих повышенной чувствительностью к острым респираторным инфекциям Это говорит об универсальности факторов, влияющих на состояние слизистых оболочек ротовой полости и вторично - на их микробиоценоз В целом, ИЕКБЭ следует трактовать как неспецифический

индикатор здоровья и его нарушений, связанных с различными дестабилизирующими воздействиями

Культуральный анализ микрофлоры буквального эпителия. Занимаясь изучением индекса естественной колонизации буккального эпителия, мы обратили внимание на более высокую разнородность его микрофлоры у больных детей бронхиальной астмой по сравнению с контрольной группой Это явилось основанием для анализа микробного спектра буккальных эпителиоцитов при помощи культурального метода

У здоровых детей высевалось от 2 до 4 видов бактерий, в среднем 2,9 + 0,1, причем в большинстве случаев (80 %) встречалось не более 3 видов В основном это были а-стрегггококки и нейссерии (встречались у всех детей), а также у-стрептококки (73 %) В единичных случаях высевались р-гемолитические стрептококки, негемолитические энтерококки, грамположительные палочки (АгсапоЬайепиш Ьаето1кусит) и микрококки В общей сложности изолировано 7 видов бактерий

От детей с бронхиальной астмой выделено 15 видов Число видов, выделявшихся от каждого ребенка, колебалось от 3 до 7; присутствие 5 и более видов отмечено в 60 % Средний показатель составил 4,8 + 0,2 и был достоверно выше, чем в контрольной группе (2,9 + 0,1, р ^ 0,01), свидетельствуя об ослаблении колонизационной резистентности буккального эпителия и его неспособности к самоочищению от нетипичных для данного биотопа микроорганизмов

Уместно говорить о буккальном дисбактериозе / дисбиозе, который имеет количественное и качественное выражение, отражая дестабилизационные процессы в системе орального гомеостаза Буккальный дисбиоз не является символом строго определенной патологии Это индикатор различных нарушений здоровья, которые преломляются через гомеостаз слизистых оболочек Просматривается сходство с микроэкологическими сдвигами в других биотопах, в частности с «классическим дисбакгериозом», фиксируемым по состоянию кишечной микрофлоры, а также по перестройке эпидермального микробиоценоза (Клемпарская НН, Шальнова Г А, 1966) И то и другое наблюдается при многих патологических состояниях

Колонизационная (адгезивная) резистентность буккального эпителия. Исследуя микрофлору буккальных эпителиоцитов больных детей, мы обратили внимание то, что сокращение «нормальных» бактерий

сочеталось у них с расширением видового спектра за счет микроорганизмов, не свойственных здоровым детям К их числу относились кандиды (С. albicans), процент выделения которых от детей с бронхиальной астмой заметно превосходил тот же показатель в контрольной группе Представляло интерес проанализировать устойчивость буккальных эпигелиоцитов к искусственной колонизации в группах детей с различной патологией

Моделью служила адгезия убитых клеток С. albicans. Под наблюдением находились 38 детей в возрасте 4-12 лет Из них 19 были в периоде обострения бронхиальной астмы и 19 с обострением хронического гастродуоденита Контрольную группу составили 36 практически здоровых детей в возрасте 5-12 лет.

У 83,4 % здоровых детей показатели адгезии С. albicans на буккальных эпигелиоцитах были ниже 10 (количество дрожжевых клеток в пересчете на один эпителиоцит) и в среднем составили 6,8 + 0,9 Больные гастродуоденитом не отличались от контрольной группы: 84,2 % имели показатели ниже 10, средний результат 6,7 ±1,4 Иная картина наблюдалась в группе детей с бронхиальной астмой лишь в одном из 19 случаев (5,3 %) результат оказался ниже 10, при среднем показателе 15,3 + 2,8 (р < 0,05) В тоже время индекс естественной колонизации буккального эпителия у больных бронхиальной астмой и гастродуоденитом был одинаково снижен, значительно (р < 0,01) отличаясь от контроля 0,5 + 0,07 - бронхиальная астма, 0,5 + 0,08 -гастродуоденит, 1,6 + 0,1 - здоровые

Представленные данные подтверждают мнение о том, что соматическая патология существенно влияет на состояние буккальных эпителиоцитов Вместе с тем, направленность этих изменений различна Наряду с универсальными сдвигами (в наших наблюдениях этому соответствовали колебания индекса естественной колонизации буккального эпителия), возможны и более избирательные события Именно так можно расценить наши наблюдения об усилении фиксации С. albicans буккальными клетками больных бронхиальной астмой при нормальных показателях у детей с гастродуоденитом

Показатели саливарного гомеостаза. Проанализирован ряд саливарных показателей содержание иммуноглобулинов, секреторного компонента, лизоцима, цитокинов и коэффициент сбалансированности факторов местного иммунитета Кроме самостоятельного значения, они интересовали нас в

сравнительном аспекте, в связи с суждением о клинической информативности индекса естественной колонизации буккального эпителия

Обследовано 66 детей с бронхиальной астмой разной степени тяжести в фазе обострения и ремиссии (после лечения) Контролем служили 32 здоровых ребенка того же возраста Группами сравнения служили дети, страдающие острыми рецидивирующими инфекциями дыхательного тракта и больные целиакией (анализ саливарных цитокинов)

Содержание в общей группе больных бронхиальной астмой и у больных разной степени тяжести не отличалось от здоровых детей - 0,04 + 0,003 г/л Это было справедливо как для периода обострения, так и для фазы ремиссии

^А. В контроле средний показатель был 0,17 + 0,07 г/л У больных бронхиальной астмой содержание саливарного 1§А было значительно (рк < 0,01) снижено - 0,03 + 0,003 г/л Это в равной степени проявлялось у больных с разным течением заболевания Ремиссия сопровождалась тенденцией к нормализации показателей, однако они оставались существенно ниже контрольных значений.

^Е. В группе здоровых средний показатель составил 19,8 + 3,4 МЕ/мл В общей группе больных саливарный уровень был выше - 31,7 + 9,2 МЕ/мл Из трех групп больных существенное повышение саливарного ^ обнаружено только при тяжелом течении - 39,9 + 8,6 МЕ/мл (рк < 0,05), у больных с легким и среднегяжелом течении показатели были близки к контрольным цифрам При переходе в фазу ремиссии содержание саливарного 1$Е у больных с тяжелым течением снижалось до уровня здоровых-20,8+ 1,1 МЕ/мл (рц> 0,05)

Отмеченные сдвиги не отличались нозологической спецификой Это проявилось при сравнительном изучении уровня саливарных иммуноглобулинов у детей (57 человек), часто болеющих острыми респираторными инфекциями Подобно больным бронхиальной астмой, у них обнаружено существенное снижение (0,06 + 0,003 г/л, рк < 0,05), повышение (36,9 + 7,6 МЕ/мл, рк < 0,05) и отсутствие изменений в содержании (0,04 + 0,01) Переход в состояние ремиссии (сокращение

числа рецидивов), которому способствовало назначение рибомунила, сопровождался нормализацией саливарного уровня (22,8 + 7,3 МЕ/мл, р„ > 0,05), но не оказывал влияния на содержание IgA (0,04 + 0,001 г/л) Как было

показано выше, сходная картина наблюдалась и в ходе клинической эволюции бронхиальной астмы

Секреторный компонент (БС). Содержание 8С при различных заболеваниях остаются малоизученным Ясно, однако, что он синтезируется железистыми эпителиальными клетками с большим избытком, и его значение не ограничено образованием мукозальной формы ф^)

В контрольной группе показатели БС составляли 0,66 + 0,05 В общей группе больных они оставались без существенных изменений как в периоде обострения (0,59 + 0,04), так и в фазе ремиссии (0,6 + 0,06) Различия между группами с разным течением были тоже недостоверны

Сопоставление с колебаниями саливарного 1{>А у тех же больных говорит об отсутствии параллелей в динамике показателей 1{»А и БС Это говорит о том, что данные анализы отражают содержание свободного вС слюны и что данный показатель существенно не меняется при бронхиальной астме

Иная картина наблюдалась в группе детей с рецидивирующими респираторными инфекциями У них отмечено снижение уровня саливарного вС (0,25 + 0,02, рк < 0,05), которое сохранялось (несмотря на тенденцию к повышению) и в фазе относительной ремиссии, достигнутой после лечения рибомунилом (0,34 + 0,04, р, < 0,05).

Лизоцим. Известно множество публикаций, в которых сообщалось о колебаниях уровня саливарного лизоцима в связи с различной (местной и общей) патологией Результаты нашего изучения не обнаружили различий в содержании лизоцима слюны как у детей общей группы, так и больных с разной тяжестью бронхиальной астмы по сравнению со здоровыми детьми В ремиссии показатели оставались практически без изменений

В отличие от больных бронхиальной астмой у детей, подверженных частым рецидивам острых респираторных инфекций, отмечено небольшое, но достоверное снижение среднего уровня саливарного лизоцима - 38,8 + 1,4 против 47,0 + 1,4 в контроле (рк < 0,05) Нормализация противоинфекционной резистентности на основе лечения рибомунилом сопровождалась восстановлением лизоцимной активности слюны (45,9 + 1,7, рк > 0,05)

Коэффициент сбалансированности факторов местного иммунитета (Кеб). Кеб предложен в качестве интегративного критерия резистентности, учитывающего соотношение саливарных факторов специфического (1^, 1&А) и неспецифического (лизоцим) иммунитета (Дорофейчук В Г и соавт, 1987,

16

1992) При анализе уровней Кеб (уел ед ) мы пользовались представлением о том, что степень повышения Кеб служит количественным сигналом неблагополучия о состоянии здоровья, при этом значения, равные или менее 1,0, соответствуют условной норме, > 1,0-2,0 означают умеренное и > 2,0 -выраженное нарушение

У здоровых детей средний показатель составил 0,79 + 0,07 В группе больных бронхиальной астмой Кеб был повышен, причем степень повышения находилась в прямой зависимости от тяжести течения (тяжелое > среднетяжелое > легкое) и фазы (обострение > ремиссия) заболевания При обострении показатели Кеб в каждой из трех категорий больных находились в границах выраженного нарушения (повышения) тяжелое течение - 3,8 + 0,2, среднетяжелое - 2,7 + 0,4, легкое - 2,5 + 0,5, общая группа — 3,1 + 0,6 (во всех случаях рк < 0,05) В периоде ремиссии отмечено достоверное снижение Кеб во всех группах больных, однако полной нормализации не наблюдалось Общий показатель (1,54 + 0,3) и уровень в группе с тяжелым течением заболевания (2,2 + 0,7, рк < 0,05) оставались достоверно выше нормы, а значения у больных со среднетяжелым и легким течением вплотную приближались к ней, но оставались в зоне умеренного нарушения (1,1 + 0,4 и 1,2 + 0,3, р„ > 0,05)

Сопоставление полученных данных с группой часто болеющих детей позволило обнаружить определенную нозологическую специфику в нарушениях Кеб они были значительно интенсивнее при бронхиальной астме (3,1 + 0,6 - обострение астмы и 1,4 + 0,1 - ЧБД, р < 0,05) Различия касались и обратимости нарушений Кеб в периоде ремиссии При бронхиальной астме снятие обострения сопровождалось двухкратным снижением среднего показателя в общей группе больных (3,1 + 0,6 и 1,54 + 0,3, р < 0,05) В группе часто болеющих детей ремиссия (на фоне лечения рибомунилом) тоже приводила к снижению Кеб, но это было недостоверным - (1,4 + 0,1 и 1,1 + 0,2, Р > 0,05)

Цитокины. Изучению цитокинов у больных бронхиальной астмой посвящена серия работ, проводившихся с сывороткой крови Почти единодушным является признание повышенного содержания в сыворотке таких цитокинов, как ИЛ- 1р, ФНОа , ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ИЛ-18 (Зайцева О В и соавт , 2001, Ка1ауа а1, 2000, Намазова Л С и соав , 2001, Диел Ф, 2001)

Альтернативным субстратом для определения маркеров системной иммунной активации может быть секрет ротовой полости Их клиническому изучению посвящены единичные работы, связанные с патологией слизистой оболочки ротовой полости (Black R Р , 2000, Kagami, 2000)

Нашей задачей было изучение цитокинового профиля (ИЛ-lß, ФНОа и ИЛ-4) секрета ротовой полости у детей с бронхиальной астмой в проекции на тяжесть и стадию заболевания (обострение - ремиссия) Параллельно определяли содержание тех же цитокинов в сыворотке крови

Под наблюдением находилось 60 детей, из них 19 - с тяжелым ( группа 1), 27 - среднетяжелым (группа 2 ) и 14 - легким течением ( группа 3 ) Для сравнения обследовано 25 детей с целиакией Контрольную группу составили 25 практически здоровых детей того же возраста

ИЛ-lß. В группе здоровых детей содержание ИЛ-lß ( М ± ш ) в слюне составило 22,0 ± 0,6 Значения < 30,0 (верхняя граница сигмальных колебаний) определялись в 88,0 % случаев и были приняты за условную норму Показатели в диапазоне > 30-100 рассматривались как умеренное повышение (три случая в контрольной группе), > 100 - выраженное повышение (ни одного случая в контроле)

В общей группе детей с обострением бронхиальной астмы концентрация ИЛ-lß в слюне составила 195,2 ± 45,6 (рк < 0,01) Повышенные показатели отмечены у 93,3 %, в том числе умеренное повышение у 26,6 %, выраженное -у 66,7 % больных

По группам больных получены следующие результаты тяжелое течение - 219,3 ± 32,6, среднетяжелое - 130,2 ± 18,2, легкое - 101,7 ± 17,5 (для всех показателей рк < 0,01) После лечения обнаружена тенденция к снижению показателей Она проявлялась в группах с тяжелым и среднетяжелым течением, при легком течении динамика отсутствовала В целом показатели оставались значительно выше, чем в контроле (рк< 0,01)

Не обнаружено корреляции между саливарной и сывороточной концентрациями ИЛ-lß (г = -0,03)

ФНОа. В контрольной группе содержание ФНОа в слюне составило 30,1 ±2,1 Значения < 40,0 (верхняя граница сигмальных колебаний) определялись в 87,5 % случаев и были приняты за условную норму. Показатели в диапазоне > 40- 100 рассматривались как умеренное

(три случая в контрольной группе), > 100 - выраженное повышение (ни одного случая в контроле)

В общей группе детей с обострением бронхиальной астмы концентрация ФНОа в слюне составила 79,8 ± 12,1 (рк < 0,01) Повышенные показатели отмечены в 48,3 % случаев, из них 31,7 % - с умеренным и 16,7 % - с выраженным повышением.

По группам больных получены следующие результаты тяжелое течение

- 89,3 ± 15,9, среднетяжелое - 37,1 ± 2,3, легкое - 42,5 ± 7,2 (для всех показателей рк < 0,05-0,01). Максимальное число случаев с выраженным повышением показателей ФНОа наблюдалось в группе 1 - 36,8 %, в группах 2 и 3 они составили 7,4 % и 7,1 %.

Определенной тенденции в динамике показателей на фоне ремиссии не наблюдалось' небольшое снижение при тяжелом течении сочеталось со столь же незначительным повышением в группах со среднетяжелыми и легкими формами заболевания В целом значения оставались достоверно выше, чем в контроле (р„ < 0,05).

Не обнаружено корреляции между содержанием ФНОа в слюне и сыворотке (г = -0,18).

ИЛ-4. У здоровых детей содержание ИЛ-4 в слюне составило 26,2 + 0,8 Значения < 30,0 (верхняя граница сигмальных колебаний) определялись в 96,0 % случаев и были приняты за условную норму Показатели в диапазоне > 30-100 рассматривались как умеренное (одно наблюдение в контрольной группе), > 100 - выраженное повышение (ни одного случая в контроле)

При обострении бронхиальной астмы (суммарная группа) концентрация ИЛ-4 в слюне составила 48,6 ± 3,9 (р* < 0,01). Повышенные показатели отмечены у 68,3 %, в том числе 61,6 % - с умеренным и 6,7 % - выраженным повышением

По группам больных получены следующие результаты тяжелое течение

- 62,9 ± 10,0, среднетяжелое - 42,7 ± 3,3, легкое - 44,9 ± 3,8 (для всех показателей рк < 0,01)

Ремиссия сопровождалась снижением показателей во всех трех группах (в среднем в 1,5-2,0 раза) Это привело к выравниванию межгрупповых значений и разницы с контролем- 38,0 ± 4,5 (группа 1), 28,4 ± 3,9 (группа 2) и 21,8 ± 0,8 (группа 3) Достоверные различия (р < 0,05) сохранялись лишь между больными с тяжелым течением (группа 1) и здоровыми детьми

Не было корреляции между саливарной и сывороточной концентрациями ИЛ-4 (г = 0,001)

Полученные данные свидетельствуют о том, что состояние орального гомеостаза может быть индикатором дистантных патологических процессов, в том числе аллергического воспаления В наших исследованиях это проявилось при изучении цитокинового профиля (ИЛ-1 (3, ФНОа и ИЛ-4) секрета ротовой полости у детей с бронхиальной астмой. В острой фазе заболевания содержание всех трех цитокинов существенно возрастало В этом отношении наши результаты совпадают с наблюдениями большинства других авторов, исследовавших сывороточные уровни цитокинов (Зайцева О В и соав., 2001, Намазова Л.С и соав, 2001)

Наиболее значительное и постоянное повышение отмечено для ИЛ-1р По усредненным данным (общая группа больных) его содержание в слюне было в 8,9 раз больше, чем у здоровых детей, повышенные показатели имели 93,3% больных детей, 66,7% имели выраженное повышение Для ФНО-а и ИЛ-4 эти цифры были заметно меньше' 2,6- и 1,8-кратное увеличение относительно контроля, число случаев с повышенными значениями - 48,3% и 68,3%, в том числе с выраженным повышением - 16,7% и 6,7%

Клиническая ремиссия сопровождалась реальными сдвигами (снижение саливарной концентрации) только по ИЛ-4 Это наблюдалось при всех формах заболевания, причем при среднетяжелом и легком течении показатели достигали уровня контрольной группы Для ИЛ-1 (3 и ФНОа динамика отсутствовала или была несущественной, затрагивая главным образом больных с тяжелым течением Если снижение саливарного ИЛ-4 при переходе в клиническую ремиссию согласуется с наблюдениями других авторов, сделанными при тестировании сыворотки крови, то стабилизация повышенных показателей саливарных ИЛ-1Р и ФНОа отличается от результатов изучения сывороточных уровней данных цитокинов Это может быть следствием того, что саливарные и сывороточные цитокины происходят из разных источников, продуктивность которых неодинаково меняется в динамике патологического процесса, в частности, на фоне клинической реабилитации О независимости (или по крайней мере неполном совпадении) источников саливарных и сывороточных цитокинов свидетельствуют и наши данные об отсутствии корреляции между их содержанием у больных с обострением бронхиальной астмы

Стабилизация повышенного содержания HJI-ip и ФНОа в слюне говорит о нестойкой ремиссии, отражая патогенетическую незавершенность терапии Это подчеркивает хронический характер патологии, при которой остаточное воспаление в бронхах поддерживает вероятность очередных обострений С этой точки зрения саливарные показатели более устойчивы (и в этом смысле более информативны), чем сывороточный уровень тех же цитокинов

Полифункциональность предполагает участие цитокинов в различных физиологических и патологических процессах В то же время элементы функциональной специфики, присущие каждому из цитокинов, допускают своеобразие их дисбаланса в зависимости от патологии Мы сопоставили концентрацию саливарного уровня ИЛ-ip и ФНО-а при бронхиальной астме с принципиально иной (неатопической) патологией - целиакией На фоне общей тенденции (повышение содержания ИЛ-ip и ФНОа в слюне) отмечена достоверная разница цитокинового профиля при одинаковых показателях для ФНО-а (79,3 ± 29,3 и 79,8 ±12,1) саливарный уровень ИЛ-ip у детей с целиакией ( 595,8 ± 179,7) был в три раза выше, чем при обострении бронхиальной астмы (195,2 ± 45,6) (р < 0,05) Это говорит о перспективности использования саливарного профиля цитокинов для суждения о патогенетическом своеобразии заболеваний

Мобилизационная активность оральных нейтрофилов.

В условиях организма происходит непрерывная эмиграция лейкоцитов из крови в ротовую полость Более 95% мигрирующих клеток составляют нейтрофилы, выходящие в роговую полость через десневые карманы (Робустова Т Г и соавт, 1990) По аналогии с мобилизационными реакциями нейтрофилов в других участках тела (Заславская МИ, Маянский АН, 1992, Ley et al, 1993, Hechtman et al, 1991, Normann et al., 1991), можно думать, что процесс находится под контролем позитивных и негативных регуляторов, определяющих количество клеток, выходящих из сосудистого русла Показано, например, что количество саливарных нейтрофилов падает при ополаскивании ротовой полости больных аллергозами причинно-значимыми аллергенами (Адо АД и соавт, 1986) В основе эффекта, по мнению авторов, лежит антигениндуцированная секреция цитокинов (лимфокинов), блокирующих подвижность лейкоцитов подобно тому, что наблюдается в системах in vitro

В наших исследованиях маркером нейтрофилов служила миелопероксидаза - фермент азурофильных гранул, который специфичен для нейтрофилов и поэтому может быть индикатором их аккумуляции в зоне мобилизационных (воспалительных) реакций разной локализации (Erdo et al, 1993, Peralta et al, 1993) Миелопероксидазную активность (МПО) определяли в экстрактах из осадка смыва ротовой полости, степень активности выражали в нг/мл по калибровочному стандарту, построенному на основе тестирования разных концентраций пероксидазы хрена

В группе здоровых средний показатель МПО составлял 11,0 + 0,9 нг/мл В периоде обострения бронхиальной астмы МПО-активность была снижена во всех трех группах больных (легкая, среднетяжелая и тяжелая формы), но существенные (р < 0,05) отличия от контроля зарегистрированы только при среднетяжелом (6,1 + 1,5 нг/мл) и тяжелом (4,6 + 1,6 нг/мл) течении При легком течении снижение было недостоверным (8,0 + 1,3 нг/мл) Средний показатель МПО в общей группе больных был достоверно ниже, чем у здоровых - 6,9 + 1,2 нг/мл (р < 0,05).

Ремиссия сопровождалась нормализацией показателей у больных с легким и среднетяжелым течением - 11,3 + 1,2 нг/мл и 10,8 + 2,8 нг/мл, у больных с тяжелой формой МПО - активность не имела позитивной динамики, оставаясь значительно ниже контроля - 4,06 + 1,6 нг / мл

Для изучения нозологической специфики изменений МПО -активности была обследована группа детей (57 человек), часто болеющих острыми респираторными заболеваниями (ЧБД) Средний показатель составил 5,5 + 1,0 нг/мл и был значительно ниже, чем у здоровых (11,0 + 0,9 нг/мл, р < 0,05). Переход в состояние ремиссии (сокращение числа рецидивов), которому способствовало назначение рибомунила, сопровождался повышением МПО, и после полного курса лечения показатели соответствовали контрольным цифрам - 10,5 + 2,1 нг/мл

Таким образом, подавление мобилизации нейтрофилов в ротовую полость лишено нозологической специфики и отражает нарушения гомеостаза, общие для разных патологий Это сочетается с высокой реактивностью нейтрофилов к широкому спектру эндогенных и экзогенных стимулов, действующих при различных заболеваниях Кроме реактивных изменений, следует учитывать возможность прямых воздействий на нейтрофилы Показано, в частности, что некоторые из респираторных вирусов ингибируют ключевые функции нейтрофилов, в том числе хемотаксис (Маянский А Н, ПикузаОИ, 1993).

выводы

1 У большинства детей с бронхиальной астмой обнаружено количественное и качественное нарушение микрофлоры буккального эпителия, которое было наиболее выражено при тяжелом течении заболевания и сопровождалось отчетливой тенденцией к нормализации в периоде клинической ремиссии Количественным признаком дисбиоза было снижение индекса естественной колонизации буккальных эпителиоцитов (ИЕКБЭ), качественным отражением служило расширение видового спектра буккальной микрофлоры за счет нетипичных для данного биотопа микроорганизмов

2 Дисбиотические сдвиги в системе буккального эпителия не являются специфичными для бронхиальной астмы и возникают также при аллергических (атопический дерматит) и неаллергических (рецидивирующие инфекции респираторного тракта, хронический гастродуодентит) заболеваниях

3 В остром периоде бронхиальной астмы установлено снижение колонизационной резистентности буккального эпителия при изучении адгезивных реакций в системе «буккальные эпителиоциты - Candida albicans» Этот феномен отличался нозологической спецификой и не проявлялся у детей с хроническим гастродуоденитом

4 Обострение бронхиальной астмы (независимо от тяжести течения) характеризуется снижением саливарной защиты, проявляясь низким уровнем I gA, гиперпродукцией Ig Е (при тяжелом течении) В ремиссию заболевания наступала нормализация содержания только Ig Е Такие же изменения выявлены у часто болеющих детей

5 Снижение индекса естественной колонизации буккальных эпителиоцитов, повышение адгезивности буккальных клеток к Candida albicans и увеличение коэффициента сбалансированности факторов местного иммунитета в 2 и более раз, являются признаками обострения бронхиальной астмы

6 Степень повышения уровня цитокинов (ИЛ-ip, ФНОа, ИЛ-4) в секрете ротовой полости отражает тяжесть течения бронхиальной астмы, отсутствие снижения высоких саливарных показателей ИЛ-ip и ФНОа свидетельствует о сохранении патологического процесса и необходимости продолжения терапии

7 У детей с бронхиальной астмой при среднетяжелых и тяжелых формах, а также при острых респираторных заболеваниях, наблюдалось снижение показателя мобилизации оральных нейтрофилов Положительная динамика при переходе в ремиссию отмечена у больных с бронхиальной астмой с легким и среднетяжелым течением

8 Реактивные сдвиги в системе орального гомеостаза позволяют дифференцированно судить о тяжести бронхиальной астмы, полноте ремиссии и эффективности реабилитационных мероприятий Оптимальным показателем (техническая простота, доступность) является индекс естественной колонизации буккального эпителия

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Предложен информативный, неинвазивный и доступный критерий оценки фазы, тяжести течения бронхиальной астмы и эффективности реабилитационных мероприятий на основе определения индекса естественной колонизации буккального эпителия (ИЕКБЭ)

2 Секрет ротовой полости (слюна) служит альтернативным и адекватным субстратом для выявления маркеров иммунологической активации и отражает течение бронхиальной астмы у детей

3 Метод определения индекса естественной колонизации буккального эпителия предложен в связи с технической простотой и доступностью и может применяться в педиатрической практике в пульмонологических, аллергологических, гастроэнтерологических, соматических отделениях

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Естественная колонизация буккального эпителия у детей с аллергическими заболевани-ями//Российский педиатрический журнал -1999

- № 3 - С 47-49 (соавт Маянский А Н, Маянская ИВ)

2 Новые лабораторные критерии оценки состояния здоровья детей и подростков// Материалы V Конгресса педиатров России «Здоровый ребенок»

- Москва - 1999 - С 304 - 305 (соавт Маянская ИВ, Ашкинази ВИ, ТолкачеваНИ)

3 Состояние естественной колонизации буккальных эпителиоцитов у детей, часто болеющих острыми респираторными инфекциями //Нижегородский медицинский журнал - 2000 - №3.-С 16-18.

24

4 Микрофлора буккального эпителия у детей, часто болеющих респираторными инфекциями // Российский педиатрический журнал - 2002 -№ 1 - С 56 - 57 (соавт Молодцов С А, Ашкинази В И , Салина ЕВ)

5 Уровень цитокинов в секрете ротовой полости у детей с бронхиальной астмой//Цитокины и воспаление -2002- № 3 - С 9-13 (соавт Лукушкина Е Ф , Маянская И В , Толкачева Н И, Ашкинази В И)

6 Адгезивные реакции буккальных эпителиоцитов на Candida albicans у детей с бронхиальной астмой и гастродуоденитом // Педиатрия - 2002 - №3 -С 41-43 (соавт Маянский АН, Салина ЕВ, Ашкинази В И, Заславская МИ)

7 Феномен избирательного ослабления колонизационной (адгезивной) резистентности в системе «Candida albicans - буккальные эпителиоциты» // Журн микробиол - 2002- № 4 - С 17-20 (соавт Маянский АН, Заславская М И , Салина Е В , Ашкинази В И, Махрова ТВ)

8 Микробилогический дисбаланс в системе буккальных эпителиоцитов у детей // Международная практическая конференция «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» Москва - 2002 - С 39 (соавт Талаева Е Б , Махрова Т В, Ерзутова М В , Маянская ИВ)

9 Оральный гомеостаз у детей с бронхиальной астмой // П Всероссийский конгресс по детской аллергологии - Москва - 2003 - С 3

10 Буккальные эпителиоциты как инструмент клинико-лабораторных исследований //Нижегородский медицинский журнал - 2003 -№ 3 - 4 - С 105-110 (соавт Махрова Т В , Маянская И В , Заславская М И, Строгова ЮЮ, Маянский АН)

11 Цитокиновый спектр секрета ротовой полости у детей с бронхиальной астмой//Материалы IV международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» Москва - 2003 - С 12

12 Провоспалительные цитокины секрета ротовой полости у детей с заболеваниями тонкой кишки// Материалы X Конгресса детских гастроэнтерологов России «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей» Москва- 2003 - С 150 (соавт Маянская ИВ, Толкачева НИ, Степаненко С Ф , Ерзутова MB)

Список используемых сокращений.

ИЛ-1,3,4,5,13 - интерлейкины ИФА - иммуноферментный анализ

ИЕКБЭ - индекс естественной колонизации буккальных

эпителиоцитов

Кеб - коэффициент сбалансированности факторов

местного иммунитета МПО - миелопероксидаза

МЕ /мл - международные единицы /мл

НГ / мл - нанограмм / мл

вС - секреторный компонент

ТЬ 1 - Т-лимфоциты хелперы 1-го класса

ТЬ 2 - Т- лимфоциты хелперы 2-го класса

Автор выражает глубокую признательность и благодарность д м н, профессору, директору Нижегородского научно-исследовательского института детской гастроэнтерологии Волкову А И и группе клинической иммунологии лабораторно-диагносгического отдела этого института за помощь и содействие в работе

Подписано в печать 05 05 2004 г Заказ № 93, тир. 100 экз ООО «Стимул-СТ» г Н Новгород, ул Трудовая, 6

РНБ Русский фонд

2006-4 14245

Л

Актуальность

Бронхиальная астма принадлежит к наиболее распространенным и тяжелым аллергическими заболеваниям. В ее основе лежит хроническое воспаление слизистой оболочки бронхов, которое протекает как поздняя (отсроченная) фаза немедленных (IgE-зависимых) аллергических реакций и поддерживается периодическим антигенным раздражением в сложных взаимодействиях клеток и гуморальных факторов (11, 35, 38, 174). Проявления этого процесса выходят за рамки респираторного тракта и могут быть зафиксированы в различных системах организма (95, 118). Это позволяет косвенно судить об активности аллергического воспаления, прогнозировать его течение и эффективность терапевтических и оздоровительных мероприятий.

Немало работ посвящено изучению нормальной микрофлоры у детей с аллергическими заболеваниями. Почти все они ограничены анализом микрофлоры толстого кишечника (точнее фекалий) и единодушно констатируют наличие дисбактериоза (дисбиоза) на фоне аллергической патологии, в том числе при бронхиальной астме (118, 130). Вопрос о причинно-следственных связях между дисбактериозом и соматической патологией остается дискуссионным, что, однако, не мешает практическому использованию (в том числе в аллергологии) препаратов, нацеленных на воспроизведение или усиление позитивных эффектов нормальной микрофлоры в системе местного и общего гомеостаза (18, 66, 78, 145, 146, 166, 168, 187, 194).

Патогенетическая значимость перекосов в микрофлоре слизистых оболочек обретает новое содержание в связи с концепцией о функциональных вариантах CD4 Т-лимфоцитов (Т-хелперов, Th). Из двух альтернативных субпопуляций (Thl и Th2) в развитии аллергического воспаления доминируют ТЪ2-клетки, которые благодаря своим цитокинам (ИЛ-З, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13) направляют дифференцировку В-лимфоцитов в

IgE продуцирующие клетки, а также содействуют другим событиям, связанным с данным процессом (38, 150, 201, 244). Одним из ключевых факторов, определяющих Thl/Th2 поляризацию, являются дендритные клетки покровных тканей (слизистых оболочек, кожи). Именно их продукты (ИЛ-12 и др.) вносят, по-видимому, решающий вклад в профилизацию Т-лимфоцитов (81, 110, 135, 150). Имеются данные о том, что в дифференцировке дендритных клеток прямо или косвенно участвуют стимулы, исходящие из нормальной микрофлоры (218, 219). Отсюда не исключено, что извращения ее качественного и/или количественного состава влияют на взаимодействия клеток иммунной системы. С этих же позиций можно анализировать и клинические результаты применения препаратов типа пробиотиков (66,168,187, 202,212).

Принимая во внимание иммунологическое единство слизистых оболочек, позволяющее говорить об общей (относительно автономной) иммунной системе мукозального тракта (113, 150, 156, 189, 216), логично ожидать, что реактивные изменения в резидентной микрофлоре, сопутствующие различным заболеваниям, могут затрагивать разные отделы / слизистых оболочек. В исследованиях, проведенных проведенным по инициативе кафедры микробиологии и иммунологии Нижегородской медицинской академии, было показано, что удобным объектом для такого рода наблюдений являются буккальные эпителиоциты (89). Это соответствует наблюдениям о том, что буккальный эпителий может быть индикатором дестабилизационных процессов, протекающих в организме (123, 139). Опираясь на эти данные, представляло интерес более тщательно проанализировать масштаб нарушений микрофлоры буккального эпителия в проекции на клиническую патологию.

Много внимания уделяется исследованию секрета ротовой полости в качестве субстрата, альтернативного сыворотке крови. Это связано с неинвазивностью забора материала, что особенно важно в педиатрической практике и в связи с опасностью контаминации при парэнтеральных манипуляциях. Накоплен большой материал по изучению саливарных показателей, позволивший сформулировать концепцию о гемато-саливарном барьере и обосновать дополнительные подходы к патогенетической и прогностической диагностике (14, 36, 37, 60, 62). Казалось целесообразным использовать этот опыт для характеристики орального гомеостаза, сравнив клиническую информативность разных тестов.

В этом контексте представляет интерес и изучение цитокинов, которое стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и объективных методов их количественной регистрации. Этому вопросу уделяется большое внимание в связи с диагностическими и лечебными перспективами, в том числе при заболеваниях аллергического генеза (40, 41, 47, 48, 72). Уже сейчас делаются осмысленные попытки перестроить цитокиновый баланс с целью воздействия на патологические процессы (220, 244). Универсальность проблемы определяется изобилием, полифункциональностью и кооперативным участием цитокинов в таких базисных процессах, как индукция и реализация иммунного ответа, воспаление, кроветворение, репарация, апоптоз и др. (54, 149, 150). В большинстве клинических работ материалом для анализа служила сыворотка крови. Исследования цитокинов с позиций реактивности слизистых оболочек практически отсутствуют. Между тем подобные сведения могут существенно дополнить информацию о мукозальном статусе и его взаимоотношениях с общим гомеостазом. Это касается и больных с аллергическими заболеваниями, в том числе бронхиальной астмой.

В ряде исследований для суждения о специфической и неспецифической реактивности организма использовались нейтрофилы ротовой полости, которые эмигрируют сюда из кровеносного русла главным образом через десневые карманы (7, 126, 127, 129). Нейтрофилы обладают мощным эффекторным потенциалом, мобилизация которого существенно влияет на физиологию и патологию слизистых оболочек, в частности на стабилизацию хронической фазы аллергического воспаления (87,241).

В связи с этим мы сочли целесообразным включить в комплексную оценку орального гомеостаза показатель мобилизационной активности саливарных нейтрофилов. ^

Цель:

Совершенствование диагностических критериев прогноза течения бронхиальной астмы у детей на основе изучения функциональных сдвигов в системе орального гомеостаза в проекции на нозологическую специфику и клиническую информативность.

Задачи:

1. Определить количественные и качественные показатели естественной микробной колонизации буккального эпителия у детей в зависимости от тяжести течения бронхиальной астмы; изучить резистентность буккальных эпителиоцитов к искусственной микробной колонизации (адгезии) у наблюдаемых детей.

2. Исследовать саливарные показатели местного иммунитета : иммуноглобулины, секреторный компонент, лизоцим, коэфициент сбалансированности факторов местного иммунитета, особенности цитокинового профиля секрета ротовой полости (ИЛ-1(3, ФНОа, ИЛ-4), показателя мобилизации оральных нейтрофилов у больных с бронхиальной астмой.

3. Выявить диагностические критерии прогнозирования течения бронхиальной астмы у детей на основе установленных функциональных сдвигов орального гомеостаза.

4. Провести сравнительный анализ показателей орального гомеостаза у детей с бронхиальной астмой и другой патологией аллергического (атопический дерматит) и неаллергического (рецидивирующие респираторные инфекции, хронический гастродуоденит) генеза.

Научная новизна

Изучены количественные и качественные показатели микробной колонизации буккальных эпителиоцитов у детей с бронхиальной астмой и определен масштаб их нарушений в зависимости от тяжести и фазы заболевания. На основании сравнительного анализа детей с разной патологией (бронхиальная астма, атопический дерматит, острые респираторные заболевания, гастродуоденальная патология ) сделан вывод об универсализме дисбиотических сдвигов в системе буккального эпителия, отражающих состояние общего гомеостаза. При изучении адгезивного взаимодействия кандид (С. albicans) с буккальными клетками получены данные, доказывающие возможность избирательного ослабления колонизационной резистентности мукозального эпителия у больных с бронхиальной астмой.

Установлено, что бронхиальная астма сопровождается нарушением саливарного гомеостаза, которое проявляется в дисбалансе факторов местного иммунитета и изменении цитокинового профиля секрета ротовой полости.

На основании количественного содержания цитокинов (интерлейкин-ip, интерлейкин-4, фактор некроза опухолей-а) в слюне здоровых детей и больных с бронхиальной астмой обоснована степень автономии саливарного цитокинового статуса и его реактивная перестройка в зависимости от патологии.

Научно-практическая значимость

Сформулировано представление о дисбактериозе (дисбиозе) в системе буккального эпителия. Индекс естественной бактериальной колонизации буккальных эпителиоцитов рекомендовано использовать в педиатрической практике в качестве универсального индикатора здоровья и слежения за динамикой эффективности лечения и реабилитационных мероприятий. Определена позиция данного критерия в спектре саливарных показателей, отражающих состояние гомеостаза ротовой полости при системной патологии. Обоснована возможность использования секрета ротовой полости для оценки цитокинового статуса в клинической характеристике детей с бронхиальной астмой. Положения, выносимые на защиту

1. Показатель естественной микробной колонизации буккального эпителия отражает нарушения общего гомеостаза и может быть использован в качестве диагностического и прогностического критерия в педиатрической практике, в частности, у больных бронхиальной астмой.

2. Бронхиальная астма сопровождается избирательным ослаблением колонизационной (адгезивной) резистентности буккального эпителия по отношению к атипичным для данного биотопа микроорганизмам.

3. Цитокиновый дисбаланс является элементом нарушения саливарного гомеостаза у детей с бронхиальной астмой.

4. Среди показателей орального гомеостаза (иммуноглобулины, секреторный компонент, лизоцим, коэффициент сбалансированности факторов местного иммунитета, показатель мобилизации оральных нейтрофилов) наибольшей спецификой при бронхиальной астме отличались сдвиги по коэффициенту сбалансированности факторов местного иммунитета.

Апробация и внедрение результатов

Материалы диссертации доложены и обсуждены на аллергологической секции общества педиатров (г. Нижний Новгород, 2001,2002), на Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использованию) (Москва, 2002 г.), на конференции «Здоровье и образование XXI века» (Москва, 2003 г.). г

Практические рекомендации, изложенные в диссертации, используются в работе аллергопульмонологического отделения детской областной больницы г.Нижнего Новгорода и в клиническом отделении НИИ детской гастроэнтерологии МЗ РФ. По материалам исследования опубликовано 12 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объема и методов исследования, собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, который включает 150 отечественных и 96 зарубежных публикаций. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. У большинства детей с бронхиальной астмой обнаружено количественное и качественное нарушение микрофлоры буккального эпителия, которое было наиболее выражено при тяжелом течении

7 о

V заболевания и сопровождалась отчетливой тенденцией к нормализации в периоде клинической ремиссии. Количественным признаком дисбиоза было снижение индекса естественной колонизации буккальных эпителиоцитов (ИЕКБЭ), качественным отражением служило расширение видового спектра буккальной микрофлоры за счет нетипичных для данного биотопа микроорганизмов.

2. Дисбиотические сдвиги в системе буккального эпителия не являются специфичными для бронхиальной астмы и возникают также при других аллергических (атопический дерматит) и неаллергических (рецидивирующие инфекции респираторного тракта, хронический гастродуодентит) заболеваниях.

3. В остром периоде бронхиальной астмы установлено снижение колонизационной резистентности буккального эпителия при изучении адгезивных реакций в системе «буккальные эпителиоциты - Candida albicans». Этот феномен отличался нозологической спецификой и не проявлялся у детей с хроническим гастродуоденитом.

4. Обострение бронхиальной астмы (независимо от тяжести течения) характеризуется снижением саливарной защиты, проявляясь низким уровнем IgA, гиперпродукцией IgE (при тяжелом течении). В ремиссию заболевания наступала нормализация содержания только IgE. Такие же изменения выявлены у часто болеющих детей.

5. Снижение индекса естественной колонизации буккальных эпителиоцитов, повышение адгезивности буккальных клеток к Candida albicans и увеличение коэффициента сбалансированности факторов местного иммунитета в 2 и более раз, являются признаками обострения бронхиальной астмы.

6. Степень повышения уровня цитокинов (ИЛ-ip, ФНОа, ИЛ-4) в секрете ротовой полости отражает тяжесть бронхиальной астмы; отсутствие снижения высоких саливарных показателей ИЛ-ip и ФНОа свидетельствует о сохранении патологического процесса и необходимости продолжения терапии.

7. У детей с бронхиальной астмой при среднетяжелых и тяжелых формах, а также при острых респираторных заболеваниях, наблюдалось снижение показателя мобилизации оральных нейтрофипов. Положительная динамика при переходе в ремиссию отмечена у больных с бронхиальной астмой с легким и среднетяжелым течением.

8. Реактивные сдвиги в системе орального гомеостаза позволяют дифференцированно судить о тяжести бронхиальной астмы, полноте ремиссии и эффективности реабилитационных мероприятий. Оптимальным показателем (техническая простота, доступность) является индекс естественной колонизации буккальиого эпителия.

Практические рекомендации

1. Предложен информативный, неинвазивный и доступный критерий оценки фазы, тяжести течения бронхиальной астмы и эффективности реабилитационных мероприятий на основе определения индекса естественной колонизации буккальиого эпителия (ИЕКБЭ).

2. Секрет ротовой полости (слюна) служит альтернативным и адекватным субстратом для выявления маркеров иммунологической активации и отражает течение бронхиальной астмы у детей.

3. Метод определения индекса естественной колонизации буккальиого эпителия предложен в связи с технической простотой и доступностью и может применяться в педиатрической практике: в пульмонологических, аллергологичеких, гастроэнтерологических, соматических отделениях.