Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Опухолевый супрессор ARF и его роль в селективной и неселективной аутофагии

На правах рукописи

БУДИНА Анна Павловна

Опухолевый супрессор АКР и его роль в селективной и неселективной аутофагии

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 / НОЯ 2014

Санкт-Петербург 2014

005555700

005555700

Рабат выполнена на кафедре биологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в отделе молекулярной и клеточной онкологии «The Wistar Institute», Филадельфия, США. Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Смоленская государственная медицинская

академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,

заведующий кафедрой биологии

Соловьев Александр Семенович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ онкологии им. НЛ. Петрова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, руководитель отдела канцерогенеза и онкогеронтологии Анисимов Владимир Николаевич Доктор медицинских наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, руководитель лаборатории гибридомной технологии Климович Владимир Борисович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии российской академии наук», Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится « $ » 2014 г. в V/ часов

на заседании Диссертационного совета Д001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский инсппуг экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской Академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской Академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан « 3 » 2014 г.

Ученый секретарь д иссертационного совета

доктор медицинских наук

ДыбанПА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Несмотря на существенные достижения современной медицины, смертность от злокачественных новообразований имеет тенденцию к постоянному увеличению. Успех в разработке новых методов диагностики и лечения опухолей вряд ли возможен без глубокого изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе их развития. Как известно, одной из главных особенностей современной патофизиологии является привлечение методов молекулярной биологии и генетики в исследование патогенеза различных заболеваний, что дает возможность определить конкретные клеточные и молекулярные мишени для воздействия на определенные патологические процессы. С полным правом это можно отнести и к изучению механизмов опухолевого роста. По современным представлениям опухолевый процесс развивается вследствие либо активации онкогенов, либо утраты функции генов - супрессоров опухолевого роста. В этой связи изучение функционирования опухолевых супрессоров является необходимой предпосылкой в раскрытии механизмов клеточной онкотрансформации.

К группе онкосупрессоров относится опухолевый супрессор ARF (pl4ARF у человека, pl9ARF у мышей) - продукт альтернативной рамки считывания гена INK4a/ARF. Это второй по частоте встречаемости мутаций ген в опухолях человека после гена ТР53, кодирующего опухолевый супрессор р53 (Saporita, Maggi et al. 2007). Показано, что потеря функции опухолевого супрессора ARF является необходимым этапом трансформации нормальных клеток в опухолевые (Sherr, Bertwistle et al. 2005, Saporita, Maggi et al. 2007). Несмотря на имеющееся мнение, что ARF подавляет развитие опухоли посредством стабилизации р53, накапливается все больше данных, указывающих на существование р53-независимых супрессорных функций белка ARF (Sherr, Bertwistle et al. 2005).

Внимание исследователей привлекло существование трансляционной модификации белка ARF с митохондриальной локализацией, получившей название укороченная форма онкосупрессора ARF (smARF, от англ. short mitochondrial form of ARF) (Reef, Zalckvar et al. 2006). Однако данные литературы о роли smARF в клетках немногочисленны и противоречивы.

В последние годы активно изучается участие онкосупрессоров в регуляции аутофагии (Kung, Budina et al. 2011). Аутофагия - механизм лизосомальной деградации собственных компонентов клетки, который направлен на обновление клеточных структур. В то же время аутофагия - это компенсаторный механизм, обеспечивающий питание и снабжение клеток энергией в условиях метаболического голода (Pimkina, Humbey et al. 2009). Повышенный интерес к изучению аутофагии связан с тем, что она вовлечена во многие патологические процессы, в том числе и канцерогенез (White 2012). Показано, что эффективная работа некоторых супрессоров зависит от их способности активировать аутофагию, которая, в свою очередь, обладает различными механизмами противоопухолевой защиты (Kung, Budina et al. 2011).Ha сегодняшний день роль аутофагии в канцерогенезе рассматривается в зависимости от стадии развития опухоли. На этапе инициации опухолевого процесса аутофагия может подавлять канцерогенез, а на этапе прогрессирования опухоли аутофагия позволяет опухолевым клеткам выжить в условиях метаболического стресса (Wei, Pattingre et al. 2008).

Аутофагия представляет собой сложный многоступенчатый процесс с большим числом сигнальных путей, которые участвуют в ее регуляции (Yang and Klionsky 2009). Несмотря на большое количество публикаций по данной проблеме, до настоящего времени нет ясного понимания как регулируется данный процесс и какую роль в нем играют онкосупрессоры, в частности, опухолевый супрессор ARF.

Необходимость раскрытия этих механизмов регуляции и определила актуальность данного исследования.

Цель работы. Изучить роль опухолевого супрессора ARF и его укороченной митохондриальной формы в процессах селективной и неселективной аутофагии.

Задачи исследования:

1. Определить участки опухолевого супрессора pl9ARF, ответственные за его митохондриальную локализацию и активацию аутофагии.

2. Изучить роль укороченной формы белка ARF - smARF в процессе неселективной и селективной аутофагии в клетках человека.

3. Исследовать роль С - концевого участка опухолевого супрессора р14АИ* в активации неселективной аутофагии в клетках человека.

4. Изучить влияние точечных мутаций гена ПЧК4а/АЯР, встречающихся в опухолевых клетках человека, на АИР — опосредованную аутофагию.

5. Оценить взаимное влияние экспрессии АКР и р53 на регулируемую ими аутофагию.

Научная новизна исследования. Впервые в работе раскрыт механизм селективной деградации митохондрий (митофагии) с участием укороченной формы АШ7 - вшАШ7. В результате исследований впервые определены участки белка р19АКР, ответственные за его митохондриальную локализацию и активацию аутофагии. В работе впервые определена физиологическая значимость консервативного С-концевого участка опухолевого супрессора АКР мыши и человека. Приоритетными являются данные по изучению влияния точечных мутаций гена ШК^а/АШ7 на способность опухолевого супрессора АШ7 активировать аутофагию в опухолевых клетках человека. Определена роль АЮ7 как посредника в р53-зависимой аутофагии.

Практическая значимость работы. Комплекс проведенных исследований позволил определить конкретные, ранее не известные молекулярные механизмы процесса аутофагии, как одного из составляющих патогенеза опухолевого роста. Идентифицированные молекулы, участвующие в реализации этого процесса, могут являться потенциальными мишенями для разработки новых фармакологических методов лечения онкологических заболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Последовательность аминокислот в опухолевом супрессоре Р19АШ7 с 45 по 100 отвечает за его митохондриальную локализацию; активацию неселективной аутофагии контролирует гомологичный консервативный С-концевой участок белков рМАЮ7 и р19АШ\

2. Укороченная форма опухолевого супрессора АШ7, расположенная в митохондриях, активирует процесс селективной деградации митохондрий - митофагию.

3. Опухоль-ассоциированные точечные мутации гена INK4a/ARF, нарушающие структуру С-концевого участка молекулы, блокируют ARF — опосредованную аутофагию.

4. Опухолевый супрессор ARF выполняет роль посредника в р53-зависимой аутофагии.

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе, а также в лекционном курсе и на практических занятиях на кафедрах патологической физиологии, патологической анатомии и онкологии Смоленской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии «Иммунология, иммунопатофизиология, иммунопатоморфология» Смоленской государственной медицинской академии (2011-2014) и на международных конференциях: «16 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2011), «Wistar Institute Cancer Center Retreat» (Филадельфия, США, 2012), «Tumor metabolism Keystone symposia on Molecular and Cellular Biology» (Keystone, США, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 странице машинописного текста и включает 28 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, а также заключения и выводов. Библиографический указатель содержит 235 источника литературы (9 работ отечественных и 226 зарубежных авторов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование клеток. В работе были использованы клеточные линии U20S-ARF, Н1299, Сарап2 и РСЗ.Культивирование перечисленных клеточных линий проводили в среде DMEM (U20S-

ARF, HI299), RPMI 1640 (РСЗ) и McCoy 5a (Capan2)c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10000 ед/мл стрептомицина в атмосфере 5% С02 при 37°С.Для клеточной линии U20S-ARF в среду добавляли 50 мкг/мл зеоцина.

Конструирование плазмид. Для получения рекомбинантных плазмид, содержащих делеции в гене ARF мыши и человека, была проведена амплификация фрагментов гена ARF с помощью полимеразной цепной реакции и синтезированных нами специфичных праймеров. В качестве белок-кодирующей части кДНК pl9ARF мы использовали плазмидную конструкцию pcDNA 4/TO-ARF(Pimkina, Humbey et al. 2009). Для получения мутантных pl4ARFMbi использовали кДНК, полученную из РНК, выделенной из клеток опухоли поджедудочной железы человека.

Иммуноблоттинг. Экспрессию исследуемых белков в клеточных лизатах оценивали путем переноса разделенных белков с полиакриламидного геля на поливинилиденфторидную мембрану (PVDF) с последующим применением поли- и моноклональных антител к изучаемым белкам.

Выделение митохондрий. Выделение митохондриальной фракции из эукариотических клеток производилось при помощи набора Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells (Abeam, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Метод сайт-направленного мутагенеза. Введение в ген ARF сайт-специфических мутаций, встречающихся в опухолях человека, осуществляли с использованием коммерческого набора QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, США) в соответствии с протоколом производителя. В качестве исходной матрицы была использована плазмида pcDNA 4/ТО с геном ARF дикого типа.

Иммуноцитофлюоресцентный анализ. Для оценки уровня аутофагии клетки трансфецировали плазмидой GFP-LC3, кодирующей маркер аутофагосом - белок LC3 и зеленый флуоресцентный белок GFP.Формирование аутофагосом анализировали через 48 часов после суперэкспрессии ARF с помощью конфокальной микроскопии. Общее количество митохондрий оценивали по интенсивности флюоресценции

митотракера зеленого и белка митохондрий Тош20, меченного красителем FITC.

Инфицирование клеток ретровирусами. Для инфицирования мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) ретровирусами shARF 157 и shE, описанными ранее (Pimkina, Humbey et al. 2009), использовали линию пакующих клеток эмбриональной почки Феникс (Phoenix, Stanford University, США). Трансфекцию Феникс клеток векторами осуществляли с использованием реагента Fugene 6.0 по стандартной методике. Сбор вируса с клеток - упаковщиков и инфицирование фибробластов проводили трижды (через 24, 36 и 48 часов) с добавлением 8мг/мл полибрена. Селекцию инфицированных клеток проводили в среде, содержащей 1,5 мкг/мл пуромицина.

Статистическая обработка результатов исследования.

Статистическую достоверность различий измеряемых параметров оценивали путем расчета t-критерия Стьюдента в программе SigmaPlot V.10. Различия считали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение участка митохондриальной локализации опухолевого супрессора pl9ARF.

Данные литературы свидетельствуют, что опухолевый супрессор pl9ARF, расположенный на наружной мембране митохондрий, отвечает за активацию неселективной аутофагии(Рипкта, Humbey et al. 2009). В то же время специфические последовательности аминокислот, которые обеспечивают транспорт молекулы в митохондрии, а также ответственные за активацию аутофагии до настоящего времени не были установлены. Для определения участка митохондриальной локализации pl9ARF была создана серия делеционных форм белка с удаленными С-концевыми участками различной длины, а также укороченная форма супрессора - smARF. Таким образом, были получены варианты ARF: 1-140, 1-120, 1-100 и 45-169-smARF (рис. 1 -А). В качестве матрицы при мутагенезе использовался плазмидный вектор pcDNA4/TO, содержащий ген полноразмерного ARF (1-169). Для получения регулируемой экспрессии генов каждого варианта ARF была создана клеточная линия остеосаркомы человека U20S-ARF. Инкубация U20S-ARF клеток в присутствии доксициклина приводила

к повышению экспрессии гена дикого типа АИР и мутантных генов (рис. 1 - Б).

Рис. 1. Данные, полученные при анализе экспрессии АИР дикого типа и мутантов в клетках остеосаркомы человека. А - Схема структуры гена АКР дикого типа и его мутантов. Б - Уровень экспрессии АИР дикого типа и его мутантов в клетках ШОБ-АКР при воздействии доксициклина.

Для определения участка р19АКБ, отвечающего за локализацию белка в митохондриях, мы проверили способность мутантных форм АИР перемещаться в митохондрии. Используя метод Вестерн блотгинга (рис. 2 - А) и электронной микроскопии (рис. 2 - Б) было установлено, что количество 1-140, 1-120, 1-100 АИР в митохондриях соответствовало уровню \vtARF в этой фракции. Результаты данного эксперимента свидетельствуют о том, что делеция С-концевого участка АКР (100-169) не повлияла на нормальный транспорт этих форм в митохондрии. Также было установлено, что белок втАКР был доминирующей формой АКР в митохондриях.

клеточный лизат митохондриальная фракция

+ < доксициклин

и20Б - и* АКР

В

1 контроль

ДОКСИЦИКЛИН

\

I

«ЛАЙР 1-100 АЯР втАЯР Ш контроль ■ доксициклин

Рис. 2. Выявление содержания \vtARF и мутантов в митохондриях методом иммуноблоттинга митохондриальной фракции клеток остеосаркомы (А) и методом иммуноэлектронной микроскопии клеток ШОв-АКБ (Б, В).

Учитывая, что втАМ7 в своей структуре не содержит участок молекулы 1-44 и это не ограничивает его митохондриальную локализацию, можно сделать вывод, что последовательность аминокислот белка р19АИБ с 45-100 отвечает за его локализацию в митохондриях.

Выявление участка белка р19АИР, отвечающего за активацию неселективной аутофагии

Для выявления участка молекулы АЮ*, отвечающего за активацию неселективной аутофагии, сравнивали уровень аутофагии в клетках остеосаркомы после суперэкспрессии полноразмерного белка АЯБ с уровнем аутофагии, наблюдаемым после активации делеционных мутантов (1-100, 1-120, 1-140). Методом иммуноблоттинга было выявлено, что повышенная экспрессия 1-140 и 1-120 мутантов АКБ сопровождалась деградацией белка р62 и накоплением белка ЬСЗ-П, что характерно для активации

неселективной аутофагии. В то же время при повышении экспрессии 1100 АКР подобного эффекта не наблюдалось (рис. 3 - А).

Поскольку точно идентифицировать функционально значимые сайты белка позволяет индукция мутаций этого участка, мы провели замену аминокислоты валин на аланин в 113 положении белка АШ7 с помощью метода направленного мутагенеза. Исследование влияния этой мутации на АМ7 - опосредованную аутофагию методом иммуноблоттинга показало, что точечная мутация полностью нарушила способность супрессора АЫ7 к активации аутофагии (рис. 3 -Б). Полученные данные свидетельствуют, что за АКР — опосредованную аутофагию отвечает участок полипептидной цепи белка АЮ7 100-120.

1-140 АРР

0 24 48 72 0 24 48 72

1 Г

1-120 АРН1

0 24 48 72

1 Г

1-100 АР!Р

0 24 48 72

< доксициклин <р62 ч актин

игоЭАНР

. *~ ■ * ц5з ¡1

Рис. 3. Участок полипептидной цепи белка АЮ7 100-120 отвечает за активацию неселективной аутофагии. А - Вестерн-блоттинг анализ конверсии белка ЬСЗ-1 в ЬСЗ-И и деградации белка р62 после индукции АИ7 дикого типа (\\1 АЮ7) и его мутантов доксициклином в течение указанных промежутков времени. Б — Суперэкспрессия белка У113А АЮ7 не сопровождается образованием ЬСЗ-П или деградацией р62, определенных методом Вестерн-блоттинга.

Исследование роли С-концевого участка р14АЯР в активации неселективной аутофагии в клетках человека

До настоящего времени исследования роли опухолевого супрессора АИР в аутофагии проводились только на примере мышиного белка р19А11Р. В наших экспериментах мы определили способность АИ7 человека (р14А11Р) к выполнению этой функции. АКР человека содержит на своем Ы-конце два метионина в 1 и 42 положениях (рис. 5 - А). Инициация трансляции может начинаться с любого из них, в результате чего могут синтезироваться полипептдные цепи белка различной длины - 1-173 АКР и 42-173 АИР1. До настоящего времени исследований по изучению формы 1-173 АШ7 не проводилось. С помощью методов конфокальной и электронной микроскопии было показано, что индукция 1-173 АИР и 42-173 АКР приводила к формированию вРР-ЬСЗ вакуолей и аутофагосом. В тоже время экспрессия делеционной формы 1-140 АШ7 не сопровождалась подобными изменениями (рис. 4).

А Б ,

1-173 42-173 1-140 |

площадь о.г% аутафвгасом

Рис. 4. Измерение аутофагии в клетках ШОВ-АИР в результате индукции р14АКР и мутантов доксициклином с помощью конфокальной (А, Б) и электронной микроскопии (В).

Таким образом, была подтверждена консервативность функции аутофагии у человека. Оказалось, что делеция консервативного С-

конца участка у обоих белков (р14АИР и р^АЛР) нарушает АКР -опосредованную аутофагию в клетках мыши и человека.

Влияние точечных мутаций гена 1пк4а/АЯР, индуцируемых в опухолевых клетках человека, на АМ? - опосредованную аутофагию

Несмотря на то, что аминокислотные последовательности мыши и человека перекрываются только на 50%, участок 100-120 является одним из двух наиболее гомологичных участков р14АКР и р19АЯР, функциональная значимость которого ранее была не известна (рис. 5 -А). Кроме того, эта последовательность располагается в экзоне 2 локуса ШК4а/АКР, где встречается наибольшая частота мутаций в опухолях человека (Барогйа, Maggi е1 а1. 2007). Мы экспериментально показали, что индукция подобных мутаций полностью блокирует способность опухолевого супрессора АКР к активации аутофагии в опухолевых клетках человека (рис. 5 - Б, В).

Рис.5.Изучение влияния аминокислотных замен Р94Ь, Я98Ь, Ы041 и Я155С в р14АЯР на АЯР - зависимую аутофагию путем определения накопления вБР-ЬСЗ вакуолей (Б) и аутофагосом (В).

Изучение роли укороченной формы белка ARF - smARF в процессе митофагии

В последнее время в литературе накапливаются данные о связи между нарушениями процесса митофагии и развитием новообразований (Zhou, Yazdi et al. 2011, Lu, Li et al. 2013). В этой связи изучение молекулярных механизмов митофагии представляет особый интерес. Для доказательства роли укороченной формы ARF виндукции селективной аутофагии - митофагии мы использовали несколько подходов. Электронно-микроскопическое исследование клеток U20S-ARF выявило грубые нарушения структуры митохондрий - «набухание» органелл после суперэкспрессии smARF (рис. 6 - А). По данным литературы такие повреждения митохондрий являются стимулом к селективной деградации митохондрий. Индукция smARF действительно сопровождалась фрагментацией и кластеризацией митохондрий в околоядерном пространстве клетки и снижением общей массы митохондрий (рис. 6 - Б, В). Таким образом, полученные результаты, при всех используемых методических подходах, позволяют сделать вывод, что укороченная форма ARF (smARF) активирует селективную аутофагию - митофагию.

Рис. 6. Индукция вгшШР в клетках U20S-smARF вызывает «набухание» митохондрий (А), кластеризацию митохондрий в околоядерном пространстве (В) и снижает их общую массу в клетке (Б).

Оценка взаимного влияния экспрессии АИР и р53 на регулируемую ими аутофагию в клетке

Пока остаются малоизученными р53-независимые функции АКР, хотя работа в этом направлении ведется активно в последние годы. Нами предпринята попытка рассмотреть некоторые механизмы взаимного влияния АКР и р53 в активации неселективной аутофагии. Во-первых, мы проверили влияние присутствия р53 в клетке на АКР -опосредованную аутофагию. Опыты показали, что экспрессия гена АКР в клетках карциномы легких Н1299, в которых отсутствует р53, стимулировала накопление ОРР в цитоплазматических вакуолях, что характерно для аутофагии (рис. 7 - А). При электронной микроскопии этих клеток наблюдалось увеличение числа аутофагосом в цитоплазме (рис. 7 - Б). Эти результаты свидетельствуют, что активация неселективной аутофагии опухолевым супрессором АИР не зависит от экспрессии р53 в клетке.

Д Б 1-173 А!^

Рис. 7. Определение уровня аутофагии в клетках Н1299 до и после индукции 1-173 и 42-173 АКР доксициклином. См. Пояснения в тексте.

В взаимоотношениях опухолевых супрессоров АКР и р53 нерешенным, в частности, оставался вопрос: влияет ли активность опухолевого супрессора АКР на способность р53 активировать/подавлять ауофагию. Известно, что ингибирование р53 приводит к активации аутофагии и увеличению уровня АИ7 (Рипкша, НитЬеу й а1. 2009). В этой связи представлялось важным определить:

может ли аутофагия, наблюдаемая при подавлении экспрессии р53, быть опосредована супрессором АМ\ Для раскрытия подобной взаимосвязи мы провели опыты на фибробластах мышей в условиях блокирования экспрессии генов р53 и АЯР. Установлено, что нокдаун р53 в клетках с нормальным функционированием гена АКР вызывало повышение экспрессии АМ7 и активацию аутофагии. Однако нокдаун гена р53 в клетках с отсутствием АКР не приводил к индукции аутофагии (рис. 8). Это позволило сделать вывод, что подавление экспрессии р53 активирует аутофагию вследствие индукции АИР.

Рис. 8. Результаты исследования взаимного влияния р53 и АИР не регулируемую ими аутофагию методом иммуноблоттинга (А) и электронной микроскопии (Б).

выводы

1. В составе онкосупрессора pl9ARF выявлены две функционально значимые аминокислотные последовательности. Последовательность с 45 по 100 определяет митохондриальную локализацию супрессора, а с 100 по 120 активацию неселективной аутофагии.

2. Укороченная митохондриальная форма опухолевого супрессора ARF (smARF) инициирует процесс селективной деградации митохондрий (митофагию).

3. Активация неселективной ARF-опосредованной аутофагии у мышей и человека происходит с участием консервативного С-концевого участка белков pl9ARF и pl4ARF, являющегося имманентной составляющей этого процесса.

4. Опухоль - ассоциированные точечные мутации гена INK4a/ARF, нарушающие структуру С-концевого участка молекулы, блокируют ARF - опосредованную аутофагию.

5. Опухолевый супрессор ARF индуцирует неселективную аутофагию независимо от экспрессии гена р53 и является посредником р53-зависимой аутофагии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Kung CP, Budina A, Balaburski G, Bergenstock MK, Muiphy M.Autophagy in tumor suppression and cancer therapy // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 21(1). - 2011. -C. 71-100.

2. Anna Budina, Robert D. Hontz, Julia Pimkina and Maureen E. Murphy. A conserved domain in exon 2 of the human and murine ARF tumor suppressor protein is required for autophagy induction // Autophagy 9(10). - 2013. - C. 1553-1565.

3. Gregor M. Balaburski, Anna Budina, and Maureen E. Murphy. Oncogenes and Tumor Suppressor Genes in Autophagy// Autophagy and Cancer by Springer Science+Business Media, LLC. - 2013. - C. 127-143.

4. Будина А.П., Соловьев А.С. Роль опухолевого супрессора ARF в активации селективной аутофагии// Медико-биологические проблемы жизнедеятельности. — 2014. - №2 (12). - С. 48-54.

Статьи, опубликованные в других изданиях:

5. Будина А. П., Соловьев А. С. Опухолевый супрессор ARF активирует селективную аутофагию митохондрий - митофагию // Вестник Смоленской государственной Медицинской Академии. -2013.-Т. 12, №3,-С. 13-17.

Тезисы докладов:

1. Anna Budina and Maureen E. Murphy. The ARF tumor suppressor and autophagy // Abstracts of the 16 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference. - Philadelphia, 2011. - C. 7.

2. Anna Budina and Maureen E. Murphy. Identification of the domain(s) necessary for ARF-mediated autophagy // Abstracts of the Wistar Institute Cancer Center Retreat. - Philadelphia, 2012. — C. 7.

3. Будина А.П., Соловьев А.С. Роль опухолевого супрессора ARF в молекулярных механизмах селективной и неселективной аутофагии // VIII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 220-летию со дня рождения академика К.М. Бэра. - Санкт-Петербург, 2012,- С. 43-44.

4. Будина А. П. Опухоли человека содержат мутации в локусе Ink4a/ARF, которые инактивируют ARF-опосредованную аутофагию // Вестник Смоленской государственной Медицинской Академии, специальный выпуск. - Смоленск, 2013. - С. 95-96.

5. Будина А.П. Мутации в локусе Ink4a/ARF инактивируют ARF-опосредованную аутофагию в процессе канцерогенеза // XVI Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей с международным участием. - Санкт-Петербург, 2013.-С. 69-70.

6. Anna Budina and Maureen Murphy. Two conserved domains of the human and murine ARF tumor suppressor proteins are required for the induction of autophagy // Abstracts of the Tumor metabolism Keystone symposia on Molecular and Cellular Biology. - Keystone, Colorado, 2013.-C. 113.

Подписано в печать 05.11.2014 Формат 60x84 716 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ 03/11 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)