Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Оптимизация режимов коррекции антиоксидантного статуса организма при гипоксии с помощью мексидола и пробукола

1 ОН

1 Л1ИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СМОЛЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ!! МЕДИЦИНСКИ» ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Ч У К Л Е В

Сергеи Александрович

ОПТИМИЗАЦИЯ РЕЖИМОВ КОРРЕКЦИИ ЛНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ПРИ ГИПОКСИИ С ПОМОЩЬЮ МЕКСИДОЛА И ПРОБУКОЛА

14.00.25 — фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Смоленск 1993

Работа выполнена на кафедре молекулярной фармаколо mu и радиобиологии Российского государственного медицин ского университета.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских паук, профессо] П. В. Сергеев,

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудшп А. Г. Белых.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук П. И. Сизов, кандидат медицинских наук Г. В. Тананова.

Ведущая организация — НИИ фармакологии РАМН.

Защита состоится « . . . »...... 1993 г

в «... » часов на заседании специализированного ученой совета К-084.34.01 Смоленского государственного медицин ского института (г. Смоленск, ул. Крупской, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Смо ленского государственного медицинского института (214019 г. Смоленск, ул. Крупской, 28).

Автореферат разослан «... »..... 1993 г

Ученый секретарь специализированного ученого совета, профессор

Н. Ф. Фаращу!

БВКДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Проблема разработки катодов коррекции гипоксических состоя-рлзвкваодихсл после воздействия на организм различных Бкстре-гпых факторов и являющихся общим звеном патогене з многочислен-заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной, выделительной, той и других систем организма, а также факторами профессионала вредности, занимает в медико-биологической науке особое ме-В результате исследований, проведенных в течение последних 5 лет, была выработана тактика профилактики и коррекции данных •ояний, вкшочашая применение фармакологических препаратов, из-нально защищающих организм от действия повревдавдего фактора та-ипсксантов), немедикаментозных методов воздействия юкамерных и высокогорных тренировок, воздействия нормобаричес-гипоксии), покдиающих неспецифическув резистентность организ-а также проведение симптоматической терапии. В ряде работ тшн И.В. и др., 1984, Столярова Л.Г. и др., 1986, Бобков Ю.Г., ;ова H.A., 1937, Билонко Ы.В., 1989) показан положительный зф-■ при использовании препаратов, обладающих антиокислительной .вность»; причем практикуется песколько режимов их применения: юфилактической целью - непосредственно перед действием акстре-пого фактора, как средство фармакокоррекцда ухе развившихся 'логически состояний, в патогенезе которых ведущую роль играет лоция процессов свободнорадикального окисления (СРО), а также пастве адаптогенов - при курсовом введении. Однако внедрение оксидаатсв е клиническую практшсу ограничивается сущэствова-I ряда вырагинннх побочных эффектов, обусловленных правде всего ходимостью их применения в достаточно больших дозах (десяткв-и мг/кг), зачастую близких к токсическим. В связи о этим уси-исследоватолей направлены на разработку новых фэрмакологичес-пропаратов, обладающих достаточной широтой терапевтического твия. На основании данных, полученных в пооладпеэ время рядом ров (Смирнов Л.л., Дгааев K.M., 1989, Bulkley Ы.Н.- T. et.al., ), mosho предположить, что перспективным должно быть испольао-о антиоксвдантов из группы ß-оксипиридшюв (акоксипин, мекси-и пространственно затрудненных фенолов (фэноксан, пробукол). Другой путь целенаправленной фар<шкокоррвкцип заключается в

индивидуализаи,-! регммов терапевтического воздействия, поиске ¡ фективных и надежных экспресс-методов оценки характера алия указанных средств на организм пациента (т.е., применительно к : ставленной задаче - в разработке физиологичных и надеашых но то, динамической оценки состояния организма, его антиоксидантного с туса и устойчивости к гипоксии непосредственно в ходе курса фа макологического воздействия). Большинство существующих в настоя время экспериментальных методов по целому ряду причин (всладств относительно невысокой чувствительности. необходимости забора м роколичеств биологического материала для проведения анализа, н кой физпологичности) не могут быть применены при решении данной проблемы.

По нашему мнения перспективным является использование хеки иинесцентного метода, т.к. он даат возможность прямого и достов ного определения концентрации свободных радикалов в изучаемом о екто. Известна взаимосвязь между показателями хемшиминесцеь (ХЛ) с одной стороны и содержанием антиоксидантов в биологичас проб'", а такаэ глубиной развития тканевого гипоксического повр дения - с другой. Таким образом, данный метод ыожет быть приме для оценки антиоксидантного чтатуса организма при гипоксии, а т же с целью определения (эффективности использования фармакологач ких препаратов, обладапцих антиокислительной активностью в качо ве антигштоксантов. Однако необходимым условием является перехс анализу параметров ХЛ в образцах, содержащих микроколичества с логического материала, что требует проведения ряда нродварнтел* иссследований.

На основании излозаднного выше бшш определены цель а за; проведенного нами исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

Целью данной работы явился поиск путей повышешя еффоктш сти использования антиоксидантов для фарыакокоррокции гипокси* iaix состояний организма.

В связи о втш были поставлены следующие задачи:

Í .'Разработать чувствительный аксшрэос-метод оценки внтиоз дадтного отатуса организма ups действии вкстрэмальшх факторе антиоксидантов.

2. Изучьгь зависимость цзвду антиокендонтшм статуоом орп

-3* и его устойчивостью, к гипоксии.

3. Провести сравнительную спэнку антиокяслителыюй активности' lux антиоксилантных препаратов: мексидола и пробуколн в условиях vitro.

4. Изучить антиокислительное действие мексидол.« и пробукола в аэй популяции гзшотных и в грушах с различным антиоксидантннм зтусом.

5. Провоста сравнительный анализ действия кексидола и пробу-ш на показатели свободнорадикального окисления 1срови при острой гобарической гипоксии.

Научная новизна работа.

В данной работа впервые бил использован микрометод хемшкми-:цзятного анализа, который позволил проводить динамическую оцен-антиоксядантнаго статуса организма многократно в ходе фзрнако-ричоского эксперимента. Получены результаты, свидетольствушке о цестЕовании взаимосвязи между уровнем ХЛ плазмы крови и устойчи-:тье организма к гипоксии. Выявлены оптимальные дозы антиокси-1Т5шх препаратов мексидола и проболтала, приводящий к вырааепноку тибировагаш процессов СРО. При сравнительном изучении их йнтиок-laHTHoro действия в обвей популяции животных и в грушах с раз-t устойчивостью к гипоксия показано, что положительный аффект от ггонэния указанных препаратов проявляется, главным образом, в ,-nno жпвотких с низкой устойчивостью к кислородной недостаточно-I. Показано, что введение антиоксидантов сопровождается пере-юйксй работы эндогенной систомы штиокислительноЯ запиты, что солят свое Еырагопие в изменении нэкоторнх показателей, хврактв-зупцих уровень СРО крови (активности каталаза, содержания гоксфэрола, концентрации ТБК-актпЕЛых продуктов).

Практическая ценность.

Разработан экспрэсс-мотод оценки аятиохсидантного статусе ор-шама и определения эффективности действия антиоксыдантоя in iro, что ик&ет практическое значоше при ревении задача оптимиста режимов применения фармакологических препаратов^ обладаниях гискислительпой активностью. Отделены оптгаизлъшэ рвгпша шэнйкпя кексидола и пробукола в качества антиггатоксантов. сазано, что целесообразным является ах однократное введеппе зк-фиментальннм яотвотшм с исходно низкой устойчивостью к кисло—

родкой недостаточности в дозах 10-50 кг/кг.

Апробация работы.

Основные результаты работы дслокэны и обсувдены на Все союз конференциях:. "Оценка фармакологической активности химических единений: принципы и подхода" (Купаша, 1939) и "Фармакологамее коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), на учредите ном Международном патофизиологическом съезде (Москва, 1991), заседании Московского" общества фармакологов (1992), п также ка учных конференциях кафедры молекулярной фармакологии к радиобис гаи РГМУ.

Публикации. По материалам диссертации опубл!жовано 7 печ ных работ.

Объел и структура дассертеции.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текст состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и тодов исследования, результатов исследования и их обсуждения, водов и библиографического указателя, включающего 173 неточна Кллюстрбг/лзнкй материал представлен 10 рисунками и 18 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе была использована плазма крови белых беспороя крис-сакцов (400 кивотных). Пробы получали путем забора крон гепаринизировакные капилляры в количестве 0,02 мл из хвостовой ны последующего ее разведения в 1,0 мл фосфатного буфера, цент фугирования при 3000 об/мин. в течение 10 мин. и отбора супер танта. Полученные образцы исследовались тотчас ке после забоя вотных, либо хранились в видком азоте не более 2 суток.

В данной работе был разработан и в дальнейшем неполное ыикрокетод хеышпминесцентного анализа. Целесообразность его пользования определялась необходимостью проведения данамичест анализа параметров, характеризующих уровень СРО при работе о >. кими экспериментальными кивотными. Исследования проводили еле; пом образом. Регистрировали кинетику "быстрой веши ?вг+-индуцирсванной хемилшинесг нцин образцов, содержащих шш количества плазмы крови. При проведении ¡экспериментов 1п vJ.tr кювету хешшшшометра последовательно вносили 3.0 мл фосфата буфера, содержащего исследуемые соединения в концентрациях Б»1С 10-2Ы и 1,0 к.. 2.7 ыи раствора воэина (его концентрация была пс

зна зкспериментально путем определения минимального количества, зспечиващего предельный показатель интенсивности "быстрой вспы-■t" ХЛ). После 2-минутной инкубации при постоянном перемешивании темной камере в систему добавляли 1,0 мл 38,5 мМ раствора PeSO^ эогистрировали свечение в течение 20-30 секунд.

При исследовании антиохсидантных свойств препаратов в экспертах In vivo хемилзсминесцентный анализ биологических проб про-хился аналогичны!! образом с той лишь разницей, что изначально в за ту хемилиспгаматра вносили 3,0 мл фосфатного буфера, 4 шел ззмы крови и 1,0 мл 2,7 мМ раствора эозина. Затем расчитывали эдущие параметры ХЛ: интенсивность "быстрой вспышки" (lö в, в т.ед.), период ее полузатухания (t1/2» в сек.) и максимальную зрость ингибирования (У^^, в усл.ед. ) (см.рис.1)„ Затем реги-таровали свечение контрольных проб, пэ содержаздаж антиоксидан-з. Конечные результаты представляли в виде:

^.B.^-í t1/2(on) Won->

б.В. • "1/2 ' mas ~

хб.в.(к.) tl/2(K-)

Все ентиоксидактные препараты, использованные в эксперимэн-

п>ных исследованиях, подвергали предварительному тестировании на шчио антиокислительной активности (АОА) в модельной системе )гослойных липосом из липопротеидов желтка куриных яиц с помощью годики, оттнкой ранее (Лопухин D.M. и др.,1983).

Для оценки чувствительности вновь предлагаемого метода на звом этапе исследовании регистрация кинетики "быстрой вспышки" !+-индуцироваивой ХЛ проводилась в ходе воздействия на организм шгшых экстремальных факторов, повышающих интенсивность ПОЛ :трая гипобаричэская гипоксия, частичная ишемия головного мозга, шическая ингаляция табачным дымом) (Кеерсон Ф.З., 1983, Бнленко ).Д98Э, Prootor P.H., Reynolds E.S.,1934, Mo Cord J.M., 4988), a c<9 при воздействиях, приводящих к снижения интенсивности сво-даорадтсалышх решеций (введении экзогенного антноксидантв /оксфзрола и воздействии умеренной нормобарической гипоксии) ган А.Н., 1987, Стрелков Р.Б. и др., 1987, Меерсон Э.З. и др., ¡9).

Острую гипобарическую гипоксию (ОГБГ) моделировали в юказлере путем подъема животных "высоту" 9000 м со скоростью 33 !. Частичная ишемия головного мозга создавалась под эфирным нар-

По оси абсцисс - t - время, в сек.

По оси ординат - I - интенсивность свечения, в у од. о.

Хб в - интенсивность "CtiCTpOft вспышки" XJi,

период полузатухашш "быстрой вспышки",

v - максимальная скорость ингиоировашя "Састр

max. всшслки"

I30M путем перевязка аа. сагоtее ooranuníoanв. Дипаника процессов гснового поврехдвяш! прослеживалась в течение 360 минут с парал-:;гьгал.', забором проб для проведения хемилшинесцентного анализа на ■й, i5-й, 20-й, 60-й, 180 и 280-й минутах после ьачала экспэри-шта. Ингаляция крас дымом сигарет "Столичные" фабрики "Ява™ продалась п вакуумных каморах при соотношении воздухгдш * 1:4 на ютяагешга 3 месяцев 5 дней в неделю с двухдневным перерывом гаг.ш ежедневного воздействия - две сигареты,' "выкуриваемые" с [тсрзалом i О минут).

Норксбзрпчсскув гипоксии моделировали путем экспозиции яхвач-пс в срадо, содержащей 10,0+1,0« кислорода и §0,0+1,0% азота ТС-10), которую получали путем смешивания Еоздуха и газообразно-1 ) азота в строго подобранном соотношении в изолированной от внеш-ift среды камере. Концентрация кислорода в камере контролировалась помощью газового монитора "Datex" (Финляндия). Масляный раствор ■токоферола ацетата вводился внутримышечно однократно в дозах 10, ) и 100 мг/irr. Контрольная группа животных получала масляную ос~ )ву препарата; зффокт оценивался через 24 часа.

В экспериментах in vivo исследовались антиоксидантше в аяти-шсксичеciaie свойства двух фармакологических препаратов: ыаксидо-) и пробукола.

Жирорастворимый препарат пробукол еводился ЕнутриОржинно в ¡створа дикетилсульфоксида (ДМСО) в дозах 10, 50, .100 и 2СЮ '/кг. Эффект оценивался через 24 часа. Водный раствор кексидола юдился внутрпорксппшо в дозах 10,50, 100 и 200 мг/icr. Эффект дешгаолся через 4 часа. Контрольные группы яизотных получали ак-пзалентноо количество дасо и физиологического раствора. При кур-гасм введении животине получали аятиоксидаптпые препарата: ивкси-)л и пробукол в течение 5 дней (разовая ежедневная доза составля-) 50 i.-T/icr).

Индивидуальная устойчивость к кислородной недостаточности ¡учелась на модели (ОГБГ) путем определения резервного времени [зпл 2ШВ0ТПЫХ на "высоте" 11000 м. Подъем осуществлялся со сред-)й скоростью 33 м/с. Момент гибели тавотных регистрировался по :тановкэ дихания.

Антиоксидентшй статус организма п ангоокнслитзльнув актив-)сть фармакологических препаратов оценивали с помоцыо: разрабо-tinioro в данной работе микрсмотода хемилхминесцентного анализа, а

также определения активности каталазы, регистрации содержания а-токоферола и концентрации ТБК-активных продуктов.

Акг-пзность каталазы е крови определяли перманганатометрич гая/, методом .(Бах А.Н., Зубкова С.З., 1963). Принцип методики, пользованной для определения содержания а-токоферола в плазме к ви состоял в измерении флуоресценции данного соединения, экстра рованного из плазмы крови гексаном (Черняускене Р.Ч. и др., 193 Содержание ТБК-активных продуктов определяли спектрофотометрамо в двухволновом режиме: Л.,-- 522 нм, ^ - £30 нм. с помощьи метод 1Аеакака Т. еЪ.а1, 1980).

В работе били использованы стандартные методы статистическ анализа. Достоверность различий .между экспериментальными групп по изучаемым парамаг^ ¡м оценивалась с помощью паргметричэск т-критерия Стысдента и непараметрического и-хритерия Вилкоксо Манна-Уитни.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В данной работе в качества основного был предложен новый ; тод хемиллминесцантаого анализа, отличавдийся от известных ра: тем, что для изучения кинетики СРО брались не макро-, а микроко.

чества биологического материала„ Для доказательства еозмохно

1

получения с его помотьи адекватных результатов на первом этапе I ли проведены серии экспериментов, в ходе которых изучалось влия] ряда внешних воздействий, изменяющих интенсивность свободнора, кальных реакций в тканях организма, на показатели "быстрой всга ки" ?в2+-индуцировоиной ХЛ плазмы крови.

Проведенные исследования показали, что кратковременное дей< вив таких факторов как острая гипоксия и ишемия головного ыоз; внзывашие сдвига в системе регуляции СРО (главным образом, увэ. чэнив степени окисляемости субстратов) - не измененяют уров» параметров сверхслабого свечения. В то хе время более длителы воздействие, истощающее резервы эндогенных антиоксидантных сис* (трехмесячная ингаляция крыс табачным дымом) вызывает существенное увеличение показателя 1б>в< в среднем на 46»7Ж); данная ра! ция сопровоадается тенденцией к росту параметра У[Пах а неизмеш стыа продолжительности периода лолуингибировапия "быстрой вопили ХЛ. Как е следовало ожидать, при введении экзогенного антиоксид! та а-токоферс .а и воздействии умеренной вормобарической гипокся выявлен противоположный характер изменения интенсивности I

псямальной скорости ипгибироЕания "быстрой вспышки" ХЛ. Так, эдспкэ пиботкш витамина Е в дозе 50 мг/кг приводит к статически достоверному уменьшению значения показателя 10<в (в зднем па 11,2*); при этом проявляется тенденция к снижению пара-гра (наблюдается уменьшение среднего значеш: • н обхай группа 10,9$) Кратковременное воздействие нору.обарической гипоксии -часовая ингаляция 1ТС-10) приводит к уменьшению интенсивности ¿строй вспышки" ХЛ (в среднем на 12,335).

Тагам образом, полученные результаты свидетельствуют о том, з хемилгмишсцентшй анализ проб, содеряатмх микроколичэства би-мгачоского материала позволяет достаточно надежно регистрировать шмику процессов СРО, обусловленную изменением уровня антиокск-1тов в биологической пробе. Причем наиболее информативным являг :я параметр 10 в Следовательно, представляется целесообразным юльзованиэ данного микроматода хемилтаянесцвнтиого аначкза для >нки антиоксидантпого статуса организма в интактном состоянии, а же при применении фармакологических препаратов антиоксидантной фода в качество корректоров различных патологических состояний.

Физиологичность и достаточно высокая чувствительность вновь доагаемого метода анализа обусловила возможность проведения се-[ оксггприментов, имэхщих целью разработку нового экспресс-мето-прогяозкрования индивидуальной устойчивости организма к гкпок-:. Основани м для проведения такого рода исследований послужили 1ше литературы (БИрок .3., 1988, Шаназароз А.С.,1937), согласно орыч пэкоторыо численные параметры тканевых систем регуляции : коррелируют с устойчивостью организма к гипоксиио

По данным стандартного тестирования на модели ОГБГ общая экс-галентальнзя выборка была разделена на 3 группы: с низкой ( НУ, ,60^0,23 мин.-), средней (СУ, Т-5,44^0,44 мин.) и еысокой (ВУя 4,65-2,27 мш.) устойчивостью к кислородной недостаточности, илшиносцентный анализ проб плазмы крови, взятых до проведения оксической нагрузки, показал, что животные, составляющие группу характеризуются более высоким исходным значением параметра в , чем хивотныо двух других груш, достоверной разницы нваду орыми го изучаемому показателю не наблюдается (сн.таблЛ). При-впко данного критерия позволяет выделить кивотных с шзксй эйчивостью к гипоксии из общей популяции о 90-95-процэнтшй на-яостью. Достоверность определения особей о повышенной устойчи-

ТаОлица 1.

Значения параметров 'быстрой вспшпки" ХЛ в разных по устойчивости к гипоксии групах крыс.

Группа »ивотшх гб.в. (усл.ед.) ^1/2 (усл.ед.) V шах. (усл.ед.)

НУ 1,24-0,03 0,93-0,03 1,33*0,06

СУ 1,08^0,03* 0,94^0.03 1,29*0,06

ВУ 1,06-0,05* 0,96^0,06 1,10*0,16

Примечания: » - статистически достоверное различив (р<0,05) по указанному параметр;- мевду данной группой и группой ИУ.

востью к острой кислородной недостаточности несколько ниже (ошибю прогноза в сопоставлении с результатами стандартного тестирована составила 15-20«). При анализе степени варьирования индивидуальны: значений параметра Угоах в гтзуппах животных с разной чувствительностью к гипоксии было выявлено, что сроднее значение максимально* скорости ингибирования имеет тенденцию к понижению в груше ВУ (1 среднем на 14,7% - в сравнении с группой СУ и на 17,ЗХ - в сравнении с группой НУ)о Существенных различий мокду выделенными группами по показателю выявлено не било.

Таким образом, прогнозирование индивидуальной устойчтзосп шшотных к гипоксии возможно с помощью проведения хемилюминесцент-ного анализа проб, содоркащюс микроколичества плазмы крови и взятых в покое (без проведения какой-либо нагрузочной пробы).

Полученные в данной части работы результаты позволяют утверждать, что разработан новый метод прогнозирования индивидуально! устойчивости к гипоксии, основанный на использовании микроме тодг хемилюшшесцентного анализа. Тот факт, что кивотные с разно! устойчивостью к гипоксии характеризуются неодинаковым исходны» уровнен параметра 1б в , делает принципиально возможным проведение предварительного индивидуального тширования животных и решвнЕС задачи оптишззции реюаюв антиоксидантной коррекции гшоксическш с«стояний.

-11В следующей часта работа разработанный микрометод хемилвми-зцентного анализа был испольгован при изучении антиоксидантных ' зйств .двух новых фармакологических препаратов: мексидола и прокола с целью решения задачи оптимизации рогзмов их применения, ла прсзедена сравнительная оценка антиокислительисй и антигишк-ческой активности мексидолз и пробукола. На первом этапе нами ла проведена серия экспериментов по изучению влияния исследуемых гисксидантов на показатели "быстрой вспышки" Ре2+-кндуцировэшюй : I- r , t,/0 и V _ в модельной системе in vitre. Пелесообсаз-

и ■ Ь . х / «О ШЛА ■

сть такого рода исследований определялась необходимостью диффе-¡щировки прямых тушащих эффектов антаоксидантных препаратов в дней фазе от та аитиокислителыгого действия, кмовдего апосредо-гаше механизмы, при постановке экспериментов in vivo.

В результате было выявлено, что концентрациошшая зависимость яазателей "быстрой вспышки" ХЛ при добавлении е реакционную гтему мексидола и пробукола характеризуется уменьшением пзрамет-Хб в (см.табл.2), что указывает на наличие у данных препаратов зйств перехватчиков радикалов. Регистрируемое снижение•величины •созателя Vmas является следствием уменьшения амплитуда "быстрой тшки" ХЛ.

Сравнительный анализ полученных данных позволяет заключить, з пробукол проявляет умеренные антнраднкальные свойства в экспертах in V'tro при присутствии в модельной системе в более низ-х. концентрациях, чем моксидол. В физиологическом диапазоне кон-1трац-.:й эффективность мексидола и пробукола, как тушителей ХЛ, тоставимз. Высокая антирадикальная активность была зарагистриро-:ш только у мексидола при его добавлении в исследуемую пробу в щентрациях 1СГ2 - 1СГ3 М.

Затем были изучены антаокскдантнке свойства мексидола и прокола в экспериментах in vivo. В группа животных с нивкой устой-зостью к гипоксии (значением параметра rQ более 1,2) амплиту-"бпстрой еспншки" ХЛ практически не изменялась при однократном угтрибрюшинном введении мексидола в дозе 10 мг/кг и имела тэнден-о к уменьшению при использовании доз 100 ц 200 мг/кг л.рис.2а). Достоверное уменьшение интенсивности "быстрой вспыш-" ХЛ (в среднем на 13,3%) происходило только при введений анти-:иданта из расчета 50 мг/кг. При введении пробукола в дозах 50 и 3 мг/кг животным с исходно высокими значениями показателя lri

Таблица 2.

Параметры "быстрой вспышки" Fec -индуцированной ЗСЛ модально!

буферной системы в присутствии мексидола и пробукола.

Концентрация хб.в. h/2 Углах

препарата (усл.ад.) (усл.ед.) (усл.ед)

(моль/л)

МЕКСЮГОЛ

контроль 1,00*0,03 1,00-0,06 1,00-0,12

10~6 0,98*0,06 0,39-0,05 0,94-0,06 .

1Ü"5 0,г?*0,07* 0,93-0,10 0,76-0,13

кг« 0,75-0,04* 1,03*0,01 с,эа±о,13

0,52*0,02* 0,82-0,03 0,69-0,06*

10"2 0 0 0

ПРОВУКОЛ

К^.хтроль 1,00+0,05 1,00+0,03 1,00+0,11

5*10~8 0,84+0,03* 1,16+0,07 0,63+0,04*

5*10"^ 0,78+0,05 1,00+0,06 0,75+0,07*

5»10~^ 0,91+0,03 1,27+0.16 0.54+0,15*

5*10~5 0,99+0,04 1,20+0,09 0,80+0,06

5*10"4 0,81+0,03* 1,13+0,08 0,64+0,03*

Примечание: - статистически достоверное различие

(р<0,05) по изучаемому параметру от уровня контрольных значе-

ний.

(более 1,2;группа НУ) у них наблюдалось уменьшение его величин среднем на 16„1¡S и 10,3% соответственно)(см.рис.За). Применени препарата в других дозах (10 и 200 кг/кг) оказывало существ! менее выраженное влияние на интенсивность сверхслабого с печено логических пробе В противоположность вышеуказанным закономе; стям у животных с исходно высокой устойчивостью к гипоксии со: нялся исходный уровень значений параметра lQ в , либо даке npoi кивалась некоторая тенденция к его росту после введения антио: дантов (см.рис.26,30).

■О.Г.

л;

X

я

X

I

X

¿г,

1,0

1,4

1.3 1,2

1,1

1.0

т

4

Х!|

1 . ■'

¿Л!

I X ^ 4 о о I 2 3 4 о С

1С.2. Интенсивность "быстрой зепыгжи X.' .:лбзму кроЕн юис. с сходно высокой и низкой устойчивость» к гипоксии при однократном зедеики антиоксиданта мзксидола.

з оси абсцисс - Л - доза препарата, 1-5 - дозовые точки: 1 - О гонтроль), 2-10 иг/кг, 3-50 мг/кг, 4-100 мг/кг, 5 - 200 :/кг. По оси ординат 10_в<- интенсивность "быстрой вспьплси" УЛ. р

ЗЛ.8Д. 1 1 '"'"1

□

- значение исследуемого показателя до и зеле введения препарата соответственно; а) и О) - группы животных низкой и высокой устойчивость» к гипоксии-, * - статистически эстоверное отличие (р<0,05) значешш изучаемого показателя от сходного уровня

: а с.з

1,2 1.1 1,0

о

X

1,5 1,4

1,2 1.Т

1,0

г')

X

И А

X

4

5 В

йс.З. Интенсивность "быстрой вспышки" ХЛ плазмы крови крыс с

'СХОДНО ВЫСОКОЙ И НИЗКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ГИПОКСИИ Гф1. ОДНО!фаТНОМ ¡ведении антиокевданта пробукола.

'слоЕные обозначения и дозы препарата то зке, ито и-на рис.2.

На основании результатов, полученных в экспериментах с од кратны?/ введением мекспдола п пробуколэ для исследования эффек1 юс курсового применения оыла выбрана доза 50 мг/кг.

Достоверное снижение интенсивности "Сестрой вспышки" ХЛ среднем на 11,4") наблюдалось лишь в ответ на первое введение мс спдола (см.рис.4), что соответствует ранее полученным результат? К исходу первых сутг/.с значение показателя I. возвращалось первоначальному уровню. Последующие введения препарата вызывг лишь тенденция к незначительному снижению интенсивности "Ohctj вспышки" И плазмы квоеи- Значения показателя т.0 , достовот уменьшались чэрэз ?л чьсо посла первого и второго введения прос кола (соответственно на 16,4% и 23,3% по сравнению с исходным yj вкем), о при дальнейшем увеличении кратности приема проявлял.-: устойчивая тенденция возвращения интенсивности сверхслабого свеч ш'я к уровни исходных величин (см.рис.5). В результате к исхс пятых суток эксперимента уровень значений исследуемого паромет составлял 91,82 от начального и статистически но отличался него.

На основании данных хемилшинесцеитного анализа можно утвер дать, что при курсовом режиме введения проявлявтея две фазы в до ствии обоих антиоксидснтных препаратов. Вначале наблюдается сниж ние интенсивности свободнорадакальных реакций, а затем - восстан влгние их первоначального уроьня, что свидетельствует о развит состояния толерантности.

Итак, однократное введение кекевдола и пробукола в дозе ; мг/кг вызывает ингибировагаге реакций СРО; причем эффект проеден вается в группе животных с большей чувствительностью к кислород® недостаточности.

Для более полного изучения аптиоксидантпых свойств препарат) была использована модель ОГБГ. В данном случае гипобарическая п поксия играла роль стандартного экстремального воздействия, геш рируадаго образование свободных радикалов и способствующего боле« полном" вцявлвмш резервов антиоксидантдах систем организма. П; раллельно регистрировали динамику изменения показателей, характс ризуших уровень реакций СРО на разных этапах их развития. Бь также рассчитан интегральный показатель ([ВДА]/[а-Т]»[Екат ]), пс воляший оценивать Соотношение мощности работы про- и антиоксида! тных сиот°м.

)

16. я.

д.

I л

Л

Л, т

I 2 3 4 5 6*

:.4 Интенсивность "быстрой встгаки" ХЛ плазмы крови крыс при зсовом ежедневном введении антиоксиданта мексидола ;5С мг/кг, 5 )й).

оси абсцисс - I - время (цифрами сбзначоны сутки эксперимента», оси ординат - 10>в>- интенсивность "быстрой еспкхки" К, а кед.; » - статистически достоверное отлпие <р<0,С5) значения гчаемого показателя в данной временной точка по сравнения с :одныы уровнем. Остальные условные сбзначония то г:о, что и на ¡.2.

,5

,2 ,1 .0

I а

1 2.3 4 5 б *

;.б Интенсивность ""быстрой вспышки" ХЛ плазмы крови крыс при юовом экодневном введении антиоксиданта пробукола (50 мг/кг. 6 |Й).

юпныа обозначения те ее, что и на рис.4.

Таблица 3.

Устойчивость экспериментальных животпш: к гипоксии при применен антиоксиданов моксидола и пробукола.

Доза Показатели

препарата Т хизни ДВУ ПЛ т жизни ДВУ ПЛ

(МГ/КГ ) (!Ш1. ) (юа.) (*>

МЕКСИДОЛ ПРСБУКОЛ

контроль 3,70+1,22 0,3 10,0 3,70+1,22 8,3 10,0

десо - - - 6,93+1,97 16,7 10,0

10 4,94+1,69 8,3 0 9,35+3,24* 25,0 0

50 6,16+1,48* 25,0 0 5,02+1,75 16,7 0

100 4,03+0,75 8,3 30,0 4,84+1,90 8,3 0

200 5,09+1,64 8,3 30,0 4,29+1,03 8,3 20,0 .

курс (50*5) 2,67+0,64 0 41,7 3,81+1,18 8,3 25,0

Примечание: ТК!н1К - резервное врэмя игани на "высоте" 11000 м i нкн.); ДВУ - доля шсокоустойчивях к гипоксии ¡тавотных В Об21£ группа. (в процентах); Ш1 - процент летальности при проведении дс зированной гипоксической нагрузки; * -• статистически достоверно различие от контроля (р<0,05) по и-критория Вилкоксона-Маша-Уитк

Тестирование животных на модели 0ГБ1' показало, что мексздо проявляет наиболее выраженное антипшоксическое действие при при макании в дозе 50 мг/кг (см.табл.3), что выражается в повышена доли высокоустойчивых «квотных (ДВУ), увеличении их рвзервдог времени гизни на "высоте" 11000 и, отсутствии летальных случае при 10-мкнутной вкспозиии животных на "высота" 9QQQ ы.

Однократное профилактическое применение малых доз мексидол приводят к увеличению интенсивности "быстрой вспышки" Х.1 и акчивности катчлазы крови, а введение препарата из расчета 50-200 мг/кг сопроЕогздается аниканием содержания а-токоферола (чт< иосвэшзо указывает на достаточно высокуэ радик8лперехватыващу1 активность мексидолр) и тенданцпай к увеличению концентрации продуктов ПОЛ в плазме (что свидетельствует о возмогности

Таблица

ияние предварительного введения мекскдола и проо*кола на по-затели свободнорадикальнох-о окисления кров;: пр;: еоодойс-'ые: трсй гипобаротэской гипоксии.

Доза 1Й 'епатзата

кг/кг^ (усл.од.)

"каг. (усл.од.)

(мкМ/мл)

L ¿'иол 1

<кмэль/мг 1

?.{Екс/ла: (п— <п* ж ^ /

'Ятроль 1 ,25+0,05 3,87+0.34 33 О . о 1 V 1 С Г» . П г-

10 1 ,43+0,06* 6,40+1,00* ОС ,4^4 пг. 3, 153-» -, п.-

50 1 ,20+0,06 3,51+0,37 21 ,4+3 'гз* п ,70+ С,

00 1 А ,31+0,СВ 3,28+0,75 17 ♦ 2 у 1 . ' 'о

:00 1 ,22+0,05 4,11+2,15 ¡7РСЕУК0Л (п= 26 10) ,1+С .39 0, .51+0,

жтроль 1 ,25+0,05 3,8741,34 оо , ч. м 1 ,57+0, ОС5

З.'.СО 1 ,19+0,05 7,33+0,70* а«- ,8*4 1 ^^ ,СО гС,

10 1 ,14+0,06 11,П4+1,6С* зе ,0+5 ,06 0,

50 1 ,20+0.06 7,27+1,06* 25 ,7(5 .19 с, 43*0,

.00 1 ,23+0,04 4,16+0,82 13 ,2+2 .50* с» ,38+0, ,02'

:со 1 ,28+0,04 3,9910,90 13. .3+2, 1 ¿50 0,

яагачаниа: 10 - интенсивность "быстрой всшииг .С", Е ак тность каталази, [а-Г] - содержанке а-токоферола, (МЯА] -шентрация ТЕК-актаз них продуктов; * - статистически досто-фное различие от контроля (г .0,05).

13ьития побочных реакций при использовании высоких доз преьзратт :м.табл.4). В пользу последнего предположения говорит и тот Факт, го уровень значений интегрального показателя сохраняется при при-шении мексвдола в дозе 10 мг/кг и проявляет тенденции к росту зи введении препарате в более высоких дозах (см.табл.5).

При изучении антиокендантных свойств пробукола было выявлено, га повышение дозы препарата о 10 до 2С0 мг/кг обусловливает зпото1Шсз снижонио концентрации продуктов ПОЛ (на 12,3-и3,5я), также фазное изменение уровня а-токоферола плазмы

Табдица Б.

Влияние прздварительного введения мекскдола и пробукола на вна* ния интегрального показателя [1.!ДА]/[Е){ат ]í [а-Т] при воздейстс острой гипобарической гипоксии.

Доза прапа- Значение зштегралиюго показателя

рата (мг/кг) (в усл.ед.)

МЕКСИЦОЛ (п=10) ПРОБУКОД (п=10)

контроль 11,72+1,95 11,07+1,68

10 9,98+3,51 4,33+0,97°

50 30,12+7,30* 39,16+16,23*

100 29,37+12,80 29,37+12,86

200 14,48+4,94 106,07+35,43

Примечание: в - интенсивность "быстрой вспышки" ХЛ, Е - ск-'пилность каталазы, [а-Т] - содержание а-токоферола, [ЦДЛ] • концентрация ТЕК-активиых продуктов; * - статистически достоверное различие от контроля (р<0,05).

(см.табл.4). Тестирование на модели ОГБГ показало, что наилу-а ш.жнвзвг,:остью обладают яивотше, шлучаваив пробукол в дозе мг/кг (см.табл.3). Такой ре гам применения аытноксидапта приволи' повышении активности каталазы 1срови при гипоксии (см.табл.4). Д, ная реакция обусловлена суммарным дейсгвиом самого препарата и ¡ пользованного растворителя (ЛМСО). При увеличении дозы вводам; препарата от 10 до 200 мг/кг отмечается монотоннЕое снижение к< цеитращш продуктов ПОЛ. В то zea время при использовашош пробу! ла в высоких дозах наблюдается превышение контрольного уровня si чений интегрального показателя [ЩШ/ЕЕ^^, ]*[а-Т] (см.таОл.! что указывает не снижение защитного действия онтиоксиданта.

Курсовое применение, как мексидсла, таге п пробукола гя'/кг, 5 дней) негативно влияет на уровень устойчивости эспэрим! тальных киеотшх к гипоксии (си.табл.3), по при этом по-разно: изменяет показатели СРО крови. Введеппе мексидола шсывает пов! шание активности каталазы крови, увеличение содержа а-токоферола и ТБК-актившх продуктов в плавмо поело проведони стандартной гшокснчоской нагрузки, а всполыюзанпв пробуколн, о

Табдица 6.

?яшэ предварительного курсового введения кокгадола и прооукола некоторые пока за толп С.РО ¡сроки крыс при воздействии острой юбэричоской гипоксии.

М Е К С И Д О Л ПРОБУКОЛ Локозэтолъ Контроль Опыт Контроль Опыт

(п«10) <п=7) <п=10) (п»10)

Интенсисность астрой вспышзш" ХЛ,

усл.ед. 1,25-0,05 1,23±0,03 1,3440,07 1,18+0,06*

Каталазный индекс

(усл.ед.) 3,87±0,34 6,34*1,24* 3,87+0,34 3.87+1,56

Содержание а-токо-рола (ккм/мл) 25,2*0,87 56,6*11,3* 25,2+0,87 59,9+5,89*

Ксшентрация 'ГБК-тикгых продуктов

моль МДА/МЛ) 0,57*0,03 0,83*0,07* 0,57+0,03 0,44+0,02*

Интегральный по-затоль (усл.ед.) 11,72*1,95 17,83*5,76 И,72^1,95 19,65*7,45

шечание: обозначения то зш, что и в табл.4; » - статистичос-: достовернее различие от соответствующего контроля (риО,С5).

юпливавт достоверное уменъегние уровня значений показателя концентрации ТБК-ахтившх продуктов , а также увеличение содер-1пия а-токсферола в плазме крови акспорименталышх животных в от-I. на воздействие ОГБГ (см.табл.6). Зарегистрированная динамика 1ыенения параметров свободворадикальгого окисления отражает раз-то направленность реакции эндогенных систем антискисотельной залы на введение «экепдола и пробукола. При курсовом введении обо: препаратов эта реакция носит компонс-торпый характер.

На основании полученных результатов можно утверадать,, что оп-мвлышы режимом применения антиоксидантоп: кексядола и пробуколр ишэтея их однократное введение в дозах, пе правшаювих £0 кг/кг. ггпгигокенчаеккв аффекта данных препаратов определяются кекс паля-

чием свойств перехватчика радикалов, так и их апосродованным влиянием на эндогенные системы антиокисчитальной защиты.

Тагам образом, на примере изучения свойств двух препарато! мексидолз и пробукола продемонстрирован еоеый методический подхс к решению згдата оптимизации роякмов фармакокоррекпии антиоксидш тного статуса. Его суть состоит в том, что целесообразность ис пользования апткоксидгнтоз определяется исходным состоянием оргг низка, оцениваемым с помсг.ья мшсрсметоди хемштшиносцентпого анг лиза, а дозовыо &ффекта изучаются путем регистрации ряда парамет ров, характеризующих уровень реакций СРО в ткангк и бшлогичосга кидкостях и акткоксиданткый статус организма в целом. Физиологи^ ность используема экспериментальных методов обусловливают возмоз ность применения данного подхода не только е экспериментальной, 1 и в клинической практике.

ВЬЕОДЫ.

1. Разработан микремотод, основанный на анализе показателе "быстрой вспыеки" ?е£+-1Ядуцировшшой хемилшкносценции плазг 1фови, позволяющий оцэнпезть антиокевдантный статус организма антиокислительную активности химических соединений.

2. Реятаы коррекции антиоксидантного статуса организма долга выбираться с учетом исходного состояния организма, оценивать коте ров можно по уроЕна сверхслабого свачекая плазмы крови;, применен! фармакологических препаратов, обладащга антиокислительной актш ностью целесообразно 2 группе аявоткых с интенсивностью "Оыстрс вспышки" Рег+-ищц'цироЕанной хемиллминесценции, превышающей 1, усл.ед.

3. Антиокевдантный эффект мексидола и пробукола имеет дозову зависимость, причем его выраженность определяется исходным антион сидантным статусом организма;

а) Ыексидол проявляет наибольшее антиоксидантное действие группе низкоустойчивых к гипоксии ншотных при однократном внутри Орюшнном введении в дозэ 10-50 ыг/кг; при многократном ежедневно приеме чрепррата (60 мг/кг, 5 дней) ого антиокислительный вф^ек не выявляется.

0) цробукол проявляет наибольшее антиоксидантное действие группа высокочувствительных к кислородной недостаточности яивотны при одпокрач-ом внуг-лбрвшикноы введении в дозе 10-60 мг/кг; шо гокрвтное введение препарата в дозе 50 ыг/кг приводит к увеличена

ткжислительного аффекта па третьи сутки с последующим его юньтекием на 5-6-е сутки шсперимента.

4. Ыексидол и пробукол, действуя, как корректоры антиокси-штного ствтуса организма, повышают устойчивость эксперимонталь-гх животных к гипоксии;

а) защитное действие мексидола обуслозлено наличием у него эбсгвенной антирадикальной активности и сопровождается уменьшени-1 содержания а-токоферола в плазме крови;

б) защитнее действие пробукола обусловлено наличном у него эбственной антирадикальной активности и сспровокдается умотедоии-I концентрации ТЕК-активных продуктов плазмы.

Список опубликованных работ по тема диссертации.

1. "Прогнозирование устойчивости организма к острой кислород-зй недостаточности при изыскании адтигипокслческих средств" зоавторы: А.Г.Белых и В.М.Гукасоз) - В сб: Сценка флрмяколопггос-зй активности химических соедшошй: принципы и подхода. Тезисы эклйдов Всес. научной конференции, Купавна, 15-19 ноября 19S9 г. ., 1Э89 - с.354.

2. "Новый способ оценки анткокевдантной коррекции гипоксичес-нх состояний" (соавторы: А.Г.Белых, В.М.Гукасов) - В сб: Оармако-огичоская коррекция гяпоксических состояний. Материалы 2 Всес. энфзреншш, Гродно, 1991 - с.122.

3. "Пэрогсисноэ окисление липидоп ткаяэй экслорг.;знталышх хи-отных при дойствии нормббаричэской гипоксии" «соавторы: А.Г.Белых, .Ы.Гукасов) - В сб: Теоретические, экспериментальные и прикладные сследовашш биологических систем. Республиканский сборник научных рудов. М.„ 1991 - с.125-128.

4. "Влияние экстремальных воздействий и антиокгэданта -токоферола на интенсивность хешиплташеценции плазмы крови* соавторы: П.В.Сергеев, А.Г.Белых, В.М.Гукасов, Е.Я.Кттлвн, .В.Власова„ Т.В.Рясина) //Бвд.экспэриы.биол. я мед.».1991, т.112, 12 - 0.575-578.

5« "Влияние азтиоксидантов на показатели "быстрой вспышка" а^-нндуцированной хемилюминвсценщши (соавторы: Я.В. Сергеев, .Г.Бвлах, В.М.Гукасов) //.лссперим. ж клин, фармакологи", 19Э2, .55, кг - о.60-62.

б. "The иве of parameters of plaena lipid peroxydation for he prediction of the organic® T^euietonce to hypoxia at the вог!л~

ning Gl antihypoxaiitc" (oo-ßuthort;: Y.Y.QatBura, P,Y.Barga A.Q.Bolykh, Y.lï.Oukaeov) - Ins ¿batr. of Conf. Itegul. Утоэ F«iS Roaoticnc (Biomedloal Aepoots) Yarna, Sopt 13-16 1939. Sofie 1 - ÍM3„

7. "Elf eat, oí iatiömia and bypoxi» on tjaa iroa radioal oxy tlon of tiBBU3 lipide; r-peoulationo and appropriates cf impai homeostasis In prooxydant and antioxidant eyataus of tha bo (oo-authors: A.O.Belykh, Y.V.Gataura, Y.M.Guhaeov) - Ins Jibetr. Con etituont Congress Int. Eooiaty Pathophyeicl., Moscow, Uay 2 Juaa 1 1931, Hoboow, 1S91 - p,322.