Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Диагностическая значимость и интерпретация неоднозначных результатов исследования серологических маркеров вирусного гепатита C

На правах рукопит^

ПОТАПОВА Александра Анатольевна

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

НЕОДНОЗНАЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

14.03.10 -Клиническая лабораторная диагностика

21 ОКТ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2015

005563624

005563624

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения города Москвы «Московский научно-практический Центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения города Москвы»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Сюч Наталия Иосифовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Кузин Станислав Николаевич Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ведущий научный сотрудник лаборатории неспецифической профилактики инфекционных заболеваний

Доктор медицинских наук Годков Михаил Андреевич

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы», заведующий отделом лабораторной диагностики

Доктор медицинских наук Лавров Вячеслав Федорович

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», заведующий лабораторией диагностики вирусных инфекций

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова»

Защита состоится " ■¿Гг. в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д208.072.08 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте http://rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1)

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Гордеев И.Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Инфекция, вызываемая вирусом гепатита С (ВГС), в конце 20 века стремительно превратилась в одну из наиболее острых проблем в мировом здравоохранении. По данным ВОЗ, в мире более 170 миллионов человек (примерно 3%) больны хроническим гепатитом С (ГС), 3-4 миллиона человек заражаются ежегодно [Chen S.L. et al., 2006]. Между тем многие особенности развития заболевания препятствуют его своевременной диагностике. К ним, в первую очередь, относится бессимптомное течение острого гепатита С (ОГС), наблюдающееся у 70-80% заболевших [McCaughan G.W. et al., 1992]. Высокую распространенность вирусного гепатита С (ГС) регистрируют практически во всех регионах Российской Федерации, при этом в 2009 г. регистрация клинически скрытых бессимптомных форм ГС составила 87,5%ооо. [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. У 75-85% лиц, заразившихся ВГС, наблюдается переход заболевания в хроническую форму, а через 20 лет после инфицирования 10-15% мужчин и 1-5% женщин заболевают циррозом печени [Chen S.L. et al., 2006]. Прогрессирование цирроза печени часто не имеет клинических признаков, и заболевание может диагностироваться уже на стадии тяжелых осложнений в виде заболеваний печени терминальной стадии или гепатоцеллюлярной карциномы [Fattovich G. et al., 1997; Serfaty L. et al., 1998; Hu K.Q. et al. 1999]. Ежегодно приблизительно 280000 смертельных случаев связаны с ВГС-инфекцией [Yu M.L. et al., 2009]. Учитывая длительное развитие ГС без клинических проявлений, в Москве признана целесообразной проверка на наличие маркеров ГС сыворотки крови большинства лиц, обращающихся за медицинской помощью. В настоящее время выявление лиц, инфицированных ВГС, обеспечивается главным образом проведением скрининга сыворотки крови на наличие антител к вирусу (анти-ВГС) в тест-системах на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА является высокочувствительным и специфичным, но проблема ложных результатов анализа стоит и в настоящее время очень остро. Уровень противоречивых и ложноположительных реакций при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [Shroter М. et al., 1999; Маянский А.Н. и др., 2003; Кузина JI.E. и др., 2004]. Для повышения достоверности исследований российскими и зарубежными исследователями разработаны критерии отбора проб, в которых с низкой позитивной оптической плотностью (ОП) определены суммарные анти-ВГС, в верифицирующие исследования в иммуноблотах (ИБ), которые содержат критерии не только позитивного и негативного, но и неопределенного

результата [Suslov А.P. et al., 2002; Alter M.J. et al., 2003]. В многочисленных исследованиях отмечена более низкая чувствительность ИБ по сравнению с твердофазным ИФА планшетного формата [Zer Y. et al., 2009], что обуславливает необходимость поиска иных способов верификации. В России разработаны и внедрены в качестве подтверждающих тестов диагностические системы для ИФА планшетного формата с раздельным определением структурного (Core) антигена и комплекса неструктурных (NS) антигенов ВГС. По приказу МЗ РФ в данных тест-системах должны быть исследованы все пробы, позитивные в первичном скрининге, однако результаты тестирования низкопозитивных проб в подобных диагностикумах разных производителей также могут быть противоречивыми [Кузина Л.Е. и др., 2004]. Характеристики биопроб, которые могут быть связаны с ложной позитивностью в ИФА, до настоящего времени не определены.

Причины неопределенного результата исследования наиболее активно и сравнительно успешно изучаются в гемотрансфузиологии, чему способствует подробное и длительное обследование состояния здоровья доноров [Piro L. et al., 2008]. В отличие от донорства, на этапе первичного скрининга анти-ВГС в группах населения с различным риском инфицирования необходимость правильной интерпретации результатов исследования осложняется практически полным отсутствием знаний о пациентах. Определенную помощь в решении проблемы диагностической значимости неопределенного результата тестирования анти-ВГС может оказать исследование специфических (РНК ВГС) и неспецифических биохимических (ферментов и проч.) маркеров инфицированности. По данным J.M. Pawlotsky с соавт., полученных в первое десятилетие исследования вирусного гепатита С, в половине случаев "неопределенных" результатов исследования анти-ВГС удавалось обнаружить РНК ВГС [Pawlotsky J.M. et al., 1994]. По-видимому, на современном этапе развития лабораторных технологий изучение значимости отдельных серологических маркеров как возможных показателей репликации вируса также является актуальной задачей. Вышеизложенное подтверждает необходимость дальнейшего совершенствования лабораторной диагностики гепатита С на этапе первичного скрининга с разработкой новых методов и алгоритмов исследования.

Цель исследования

Установление диагностической значимости неопределенных результатов исследования маркеров вирусного гепатита С для повышения качества клинико-лабораторной диагностики инфекции на этапе первичного скрининга антител к вирусу гепатита С.

Задачи исследования

1) Определить частоту и динамику распространения антител к вирусу гепатита С (2000-2011 годы) среди пациентов лечебно-профилактических учреждений г.Москвы с разным риском гемоконтактного инфицирования.

2) Оптимизировать внутрилабораторный контроль качества исследований на наличие анти-ВГС, для чего провести сравнительный анализ показателей воспроизводимости и сходимости результатов при использовании контрольных материалов промышленного производства и материалов, изготовленных в лаборатории, при выполнении ИФА-исследований в ручном, полуавтоматическом и автоматическом режимах.

3) Установить критерии отбора проб сыворотки крови с разноречивыми и низкими положительными результатами при скрининге анти-ВГС для проведения дополнительного верифицирующего исследования.

4) Разработать алгоритм исследования анти-ВГС, который обеспечит достижение максимально достоверного результата и исключит получение ложных результатов.

5) Установить группы пациентов с высокой частотой неспецифических ложноположительных результатов при тестировании антител к ВГС в ИФА.

6) Определить значимость сывороточных компонентов: ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), фракций белков крови, иммуноглобулинов классов А, М, в, парапротеинов, С-реактивного белка (СРБ), - для проявления неспецифических реакций при тестировании антител к ВГС в ИФА.

7) Изучить взаимосвязь между уровнем продукции антител к ВГС и концентрацией а-фетопротеина как биохимического маркера, ассоциированного с поражением печени.

8) Определить диагностическую значимость ПЦР для подтверждения инфицированности ВГС лиц с неопределенными результатами исследования анти-ВГС.

9) Выяснить референсные возможности иммуночипов при исследовании проб с противоречивыми и неопределенными результатами определения анти-ВГС в ИФА планшетного формата и иммуноблотах.

Научная новизна

Впервые разработан экономически доступный алгоритм исследования антител к ВГС, эффективный при массовых объемах исследований, с хорошо воспроизводимыми и информативными для врачей и пациентов результатами, основанный на использовании тест-систем российского производства.

Показано, что пробы с разноречивыми результатами тестирования анти-ВГС, не подтвердившимися как позитивные в расширенных исследованиях, принадлежат лицам с возрастной физиологической и транзиторной иммунной недостаточностью (соответственно пожилым людям и детям первого года жизни).

Впервые установлено, что РНК ВГС выявляется в пробах с неопределенными результатами исследования, обусловленными наличием только анти-ЫБЗ, что сочетается с позитивностью по анти-ВГС в хемилюминесцентном иммунном анализе на микрочастицах (ХИАМ). При неопределенном результате исследования вследствие обнаружения в ИФА только aHTH-NS4 РНК ВГС не обнаруживается.

Впервые показано, что пробы сыворотки крови пожилых лиц с отрицательными и ложнопозитивными результатами тестирования анти-ВГС не отличаются по количеству Ig-содержащих патологических белков (по ревматоидному фактору - РФ и циркулирующим иммунным комплексам - ЦИК), а также по частоте выявления повышенного уровня С-реактивного белка (СРБ). В сыворотке крови пожилых людей с анти-ВГС повышено содержание ЦИК по сравнению с пробами с ложнопозитивными результатами тестирования и с пробами без анти-ВГС. Образцы сыворотки крови пожилых лиц с ложнопозитивными результатами исследования отличаются от проб, содержащих анти-ВГС, повышенным уровнем al-глобулинов. Высокая концентрация РФ, ЦИК, у-глобулинов, наличие парапротеинов не влияет на качество тестирования анти-ВГС в современных диагностических системах на основе твердофазного ИФА.

Установлено, что диагностическая значимость определения сывороточного a-фетопротеина (АФП) при неопределенном результате тестирования анти-ВГС зависит от возрастной категории пациентов. В группах молодых мужчин и женщин в первом триместре беременности с неопределенными результатами исследования анти-ВГС сывороточная концентрация АФП повышена в 2 раза по сравнению с пациентами, в крови которых не обнаруживались анти-ВГС. Повышение концентрации АФП было статистически значимым в пробах с антителами, направленными к Core- либо к NS3-, но не к NS4-aHTnreHy. У пожилых лиц с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС установлен

широкий диапазон сывороточной концентрации АФП, при этом не выявлено отличий этой группы по содержанию АФП от групп с положительными и неопределенными результатами определения анти-ВГС.

Впервые доказано, что метод иммуночипов позволяет верифицировать наличие антител — маркеров ВГС-инфекции (в том числе характерных для активной стадии патологического процесса) более чем в 80% проб с неопределенными результатами исследования в ИФА планшетного формата, поскольку в них выявляются антитела не к одному, а к нескольким белкам ВГС.

Практическая значимость работы

• Разработанный алгоритм повышает диагностическую ценность результатов массового скрининга населения на наличие антител к вирусу гепатита С. В предложенном алгоритме разработаны критерии отбора проб, ограничивающие количество дополнительных исследований.

• Включение иммуноферментных тест-систем с расширенным спектром определения антител к вирусу гепатита С российского производства в дополнительные исследования способствует повышению точности результата, что особенно важно при исследовании так называемых проблемных проб. Результаты, полученные при использовании разработанного алгоритма, соответствуют значениям: позитивным, негативным и неопределенным.

• Созданный алгоритм обеспечивает оптимальные точность и объем информации для пациентов и лечащих врачей, поскольку содержит информацию о направленности обнаруженных антител к определенному антигену и величине коэффициента позитивности, что позволит оценить динамику изменения этих показателей.

• Использование для дополнительных исследований при массовом скрининге иммуноферментных тест-систем планшетного формата с расширенным спектром определения антител российского производства значительно удешевляет верифицирующее тестирование по сравнению с иммуноблотом.

• Выделение групп с противоречивыми результатами в ИФА: лиц с возрастным иммунным дисбалансом (пожилых людей и новорожденных) и беременных женщин, - способствует дополнительному проведению верифицирующих исследований в этих группах для предотвращения сообщения ложноположительного результата.

• Показана эффективность использования ПЦР (с чувствительностью 50 МЕ/мл) для выявления РНК ВГС при обнаружении в ИФА только анти-N83, но не анти-Ы84.

• Отсутствие неспецифических реакций в тест-системах для ИФА планшетного формата у больных моноклональными гамма-глобулинопатиями, пациентов с высокими концентрациями ревматоидного фактора, циркулирующих иммунных комплексов, С-реактивного белка свидетельствует о специфичности реакции в ИФА и подтверждает необходимость расширенного обследования на наличие инфекции данных пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС.

• Определение сывороточной концентрации АФП может быть дополнительным биохимическим верифицирующим маркером повреждения/репарации печени при неопределенном результате исследования анти-ВГС у лиц моложе 60 лет.

• Применение иммуночипов способно существенно улучшить лабораторную диагностику гепатита С. Высокая эффективность иммуночипов для верификации наличия антител к ВГС в образцах с неопределенным результатом исследования обусловлена высокой чувствительностью иммуночипов; расширением спектра выявляемых антител к ВГС по сравнению с иммуноблотом и ИФА; возможностью раздельного выявления в одной постановке и ^М (показателей активности инфекционного процесса). Для полного комплексного обследования требуется небольшое количество материала (не более 30 мкл на весь анализ).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования используются в практике работы клинико-иммунологической лаборатории по диагностике ВИЧ-инфекции МНПЦДК ДЗ г.Москвы, лаборатории вирусных гепатитов ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» и лаборатории инфекционной иммунологии лабораторного отделения ФКУ «Медицинского учебно-научного клинического центра имени П.В. Мандрыка» МО РФ для повышения качества лабораторной диагностики вирусного гепатита С. Полученные новые сведения используются в процессе обучения на кафедре клинической лабораторной диагностики Факультета дополнительного профессионального образования Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан алгоритм расширенного исследования проб сыворотки крови с противоречивыми результатами исследований на наличие антител к ВГС. Алгоритм основан на использовании диагностикумов российского производства и обеспечивает необходимую достоверность и информативность результатов.

2. Алгоритм исследования анти-ВГС содержит критерии отбора проб для дополнительного исследования с целью подтверждения наличия маркеров гепатита С, что ограничивает количество необходимых тестов и позволяет исключить ложнопозитивные результаты.

3. При массовом скрининге на антитела к ВГС сомнительные результаты исследования в ИФА часто регистрируются у пациентов с физиологическим иммунным дисбалансом: пожилых пациентов и детей первого года жизни.

4. Повышенное содержание фракции белков крови - а1- глобулинов — ассоциировано с ложнопозитивными реакциями у пожилых пациентов. Ревматоидный фактор, высокие концентрации у-глобулипоп у больных моноклональными у-глобулинопатиями, циркулирующие иммунные комплексы, С-реактивный белок не влияют на результаты исследования анти-ВГС в современных диагностических наборах для твердофазного ИФА в планшетном формате.

5. В группе пациентов моложе 60 лет с неопределенными результатами исследования антител к ВГС биохимическим маркером заболевания печени является повышенная по сравнению с нормой сывороточная концентрация альфа-фетопротеина. У пожилых пациентов без анти-ВГС наблюдаются значительные отклонения концентрации АФП от нормы, что не позволяет использовать данный маркер в комплексной диагностике гепатита С в этой возрастной группе.

6. Использование ПЦР в качестве метода подтверждения наличия ВГС-инфекции путем выявления РНК ВГС у лиц с неопределенными результатами исследования антител к ВГС эффективно при обнаружении в ИФА только анти-Ы83; при обнаружении только анти-Н84 использование ПЦР при чувствительности метода 50 МЕ\мл нецелесообразно.

7. Эффективным способом проведения референсного исследования при разноречивых и неопределенных результатах тестирования антител к ВГС в ИФА и иммуноблотах являются иммуночипы.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на научно-практической конференции ГБУЗ г.Москвы МНПЦЦК ДЗ г.Москвы 10. 02. 2015.

Материалы диссертации доложены на заседании Ученого совета ГБУЗ г.Москвы МНПЦДК ДЗ г.Москвы, на научных конференциях и съездах в России и за рубежом, в числе которых: 5th Annual Meeting FOCIS (Federation of clinical immunology societies), май 2005, Бостон, США; 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology and 16th European Congress of Immunology, сентябрь 2006, Париж, Франция; VIII Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», июнь 2007, Москва, Россия; Международная научная конференция Российской академии естествознания "Наука и образование в современной России" в разделе "Инновационные медицинские технологии", ноябрь 2010, Москва, Россия; IV междисциплинарная научно-практическая конференция «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия», март 2011 г., Москва, Россия; Национальные дни лабораторной медицины России-2011, октябрь 2011, Москва, Россия; II Московский Форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». 1719 октября 2012, Москва, Россия.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно осуществил выбор направления исследования, определил цели и задачи, выбор необходимых методов исследования. Автор непосредственно участвовал как в проведении рутинных скрининговых и конфирматорных исследований на наличие антител к ВГС, так и самостоятельно проводил отбор проб для дополнительной специфической иммунодиагностики и исследования факторов, влияющих на результаты иммуноферментного анализа и ассоциированных с заболеваниями печени. В совместных исследованиях (описанных в разделе «Материалы и методы») вклад автора также являлся определяющим и заключался в непосредственном участии на всех этапах, от пробоподготовки до получения и анализа результатов. Автор играл ведущую роль на всех этапах исследования, от постановки задач и проведения исследований до обсуждения и обобщения результатов и формулировки выводов, а также в подготовке научных публикаций и докладов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работы в российских и зарубежных журналах, из них 13 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и выпущено руководство для практических врачей.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 277 страницах и включает 8 глав. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 40 таблицей. Список литературы включает 295 источников, в том числе 117 работ отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом исследования являлись пробы сыворотки крови пациентов, направленные для определения в них наличия анти-ВГС из 380 разнопрофильных лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) города Москвы в клинико-иммунологическую лабораторию по диагностике ВИЧ-инфекции Московского научно-практического Центра дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения г.Москвы. Материал для исследования был получен при соблюдении всех правил пробоподготовки.

Проанализированы архивные материалы за 2000-2014 годы и истории болезни отдельных пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС.

Пробы сыворотки крови были разделены на группы по пациентам, от которых пробы были получены: 1 - пациенты без выявленных факторов риска; 2 - беременные женщины; 3 - дети первого года жизни; 4 -медработники; 5 - пациенты с высоким риском заражения (отделения гемотрансфузий и пр.); 6 - пациенты с болезнями печени; 7 - пациенты наркологических учреждений; 8 - пациенты Московского научно-практического Центра дерматовенерологии и косметологии ДЗМ; 9 - все обследованные лица.

В различных группах пациентов ЛПУ г. Москвы в 2000-2014 гг. непосредственно автором работы исследовано в подтверждающих диагностических системах более 43000 проб, анти-ВГС-положительных в первичном скрининге.

При разработке лабораторного диагностического алгоритма массового скрининга на наличие анти-ВГС использовано более 3000 проб с противоречивыми результатами в нескольких диагностических системах, и проанализированы результаты исследования более чем 7000 проб, положительных в первичном скрининге.

При описании групп пациентов, для которых характерны проблемы интерпретации результатов тестирования анти-ВГС в массовом скрининге, исследовано 1444 «проблемных» проб и проанализированы результаты исследования 5167 проб.

Контрольные материалы, использованные для внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК) исследований анти-ВГС: «Внутрилабораторный контроль анти-ВГС» (ЗАО «Вектор-Бест»); панели образцов, содержащих и не содержащих антитела к ВГС, - имеют разрешение на применении в Российской Федерации. Кроме них, был использован самостоятельно приготовленный слабоположительный контрольный материал.

Методы исследования

Твердофазный иммуноферментный анализ для определения анти-ВГС. Исследование наличия анти-ВГС в пробах сыворотки крови пациентов осуществлялось в диагностических системах, зарегистрированных в РФ. Использованы иммуноферментные тест-системы (ИФТС) российских и зарубежных производителей, а именно 1) скрининговые ИФТС с общим определением антител: «РекомбиБест анти-ВГС тест» (ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск), «Гепаскрин» («Биосервис», г.Москва) и «Monolisa anti-HCV plus» («BioRad», Франция);

2) три подтверждающие ИФТС с раздельным определением анти-Core и анти-NS: ВГС «ВГС-ДСМ-подтверждающий тест» (ЗАО «Медико-биологический союз», г.Новосибирск), «РекомбиБест анти-ВГС подтверждающий тест» (ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск) и «ИФА-анти-НСУ-спектр-GM» (НПО «Диагностические системы», г.Н-.Новгород),

3) три ИФТС этих же производителей с раздельным определением 4 видов антител: анти-Core, aHTH-NS3, aHTH-NS4, aHTH-NS5 ВГС.

Определение результатов ИФА производилось по измерению оптической плотности и вычислению коэффициента позитивности (КП), равного отношению величины ОП образца к величине ОП критической.

Иммуноблоты. Референсные подтверждающие исследования проведены с использованием тест-систем для линейного иммуноферментного анализа (ЛИА) «INNO-LIA HCV Ab III update» («Innogenetics», Бельгия), «ЛИА ВГС» («Ниармедик плюс», РФ) и иммуноблота «RecomBlot HCV IgG 2.0» («Mikrogen», Германия).

Определение наличия РНК ВГС методом ПЦР с детекцией продуктов реакции в геле и в режиме реального времени в 132 образцах с противоречивыми и неопределенными результатами исследования анти-ВГС и в 40 пробах, содержащих анти-ВГС, проводилось совместно с сотрудниками ООО «Диасан» к.м.н. Ж.В. Евсегнеевой и Н.Ю. Сафроновой. При проведении качественной ПЦР для обратной транскрипции РНК ВГС и ПЦР-амплификации кДНК использованы тест-системы «Реверта» и «АмплиСенс-100-R для амплификации участка кДНК 240 п.н. вируса гепатита С» (пр-во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) с заявленной чувствительностью 400 копий/мл. Детекцию продукта ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, под УФ-светом с длиной волны 310 нм, регистрацию результата проводили визуально после сканирования видеосистемой; данные сохраняли в виде файла на компьютере. ПЦР в режиме реального времени проводили с помощью прибора «АНК» (пр-во Института аналитического приборостроения РАН; МГТУ им.Н.Э.Баумана; ЗАО «Синтол» г. Москва). Пробоподготовка к ПЦР проведена с использованием комплекта реактивов для универсальной пробоподготовки «GenePak™ Quantitative» (НПФ «ГЕНТЕХ», Москва). Для проведения ПЦР на приборе «АНК» использован «Комплект реагентов для проведения обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК вирусных гепатитов (HCV)» (пр-во НПФ «ДНК-технология», Москва).

Кроме того, совместно с к.м.н. Т.А. Туполевой (ФГБУ Государственный гематологический центр МЗ РФ) проведено определение РНК ВГС в клиническом материале с использованием наборов реагентов «АмплиСенс HCV-FL», формат FRT, и «АмплиСенс HCV-Mohhtop-FRT» (гибридизационно-флуоресцентная детекция результатов в режиме реального времени, производство ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) на приборе Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия). При экстракции РНК из 200 мкл образца с помощью комплекта реагентов «Магно-сорб» аналитическая чувствительность составляла 50 МЕ/мл.

Количественное определение концентрации иммуноглобулинов классов G, М, А в пробах сыворотки крови людей старше 60 лет с отрицательными (11 проб), ложноположительными (8 проб) и положительными (6 проб) результатами тестирования анти-ВГС методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле агарозы с использованием

диагностических наборов «Моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов человека» («ИмБио», Россия). Совместно с сотрудниками ГУ ГНЦ РАМН к.м.н. Варламовой ЕЛО. и с.н.с. Сариди Э.Ю. проводили определение содержания фракций белков сыворотки крови (альбумина, al-, a2-, ß- и у-глобулинов) методом электрофореза в геле агарозы на системе «Beckman-Paragon» с использованием наборов «Gel Protein 100» фирмы «Cormay» (Польша). Выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в 11 пробах с отрицательным, в 8 пробах с ложноположительным и в 6 пробах с положительным результатом тестирования анти-ВГС проводили осаждением в 4,16% растворе полиэтиленгликоля по методу В. Гашковой.

Ревматоидный фактор определяли двумя методами: с помощью диагностического набора для ИФА «ВектоРевматоидный фактор суммарный - стрип» (ЗАО «ВекторБест», Россия) и с помощью теста для латексной агглютинации «Humatex RF» («Human», Германия) в пробах сыворотки крови пожилых пациентов с положительным (33), отрицательным (77) и ложноположительным (30) результатом исследования анти-ВГС.

Для определения С-реактивного белка в пробах сыворотки крови пожилых лиц с положительными (6), отрицательными (12) и ложноположительными (11) результатами исследования анти-ВГС использовали набор реагентов "СРБ—ИФА—Бест" (ЗАО «Вектор-Бест»).

Сывороточную концентрацию а-фетопротеина (АФП) определяли методом твердофазного ИФА с помощью наборов реагентов «ИФА-АФП-Бест-400-стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) в пробах сыворотки крови мужчин моложе 60 лет (58 проб), женщин в первом триместре беременности (56 проб) и пожилых лиц (82 пробы) с положительными, отрицательными и неопределенными результатами тестирования анти-ВГС.

Для определения авидности антител к ВГС (100 проб) использован набор реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-НСУ-Авидность» (НПО «Диагностические системы», Россия).

Экспериментальная серия иммуночипов была изготовлена в ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Исследования в иммуночипах проведены совместно с сотрудниками ФБУН ЦНИИЭ к.б.н. Т.А. Чекановой, к.б.н. МЛ. Маркеловым, м.н.с. Е.А. Пудовой, к.м.н. Г.А. Шипулиным. В иммуночипах были исследованы пробы, в которых методом ИФА были обнаружены антитела к одному из антигенов ВГС (71). Положительную контрольную группу составляли 9 проб с высоким КП в первичном скрининге и в подтверждающих ИФТС. Отрицательная контрольная группа включала 60 образцов с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС в ИФА. В состав

иммуносорбента иммуночипа входили 9 иммуногенных антигенов, которые относились к четырем группам антигенов ВГС: Core, NS3, NS4, NS5. Обработку результатов серологического анализа на иммуночипе проводили с помощью флуоресцентного сканера MarS (Ditabis, Германия) и вспомогательного программного обеспечения (ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Статистическая обработка результатов исследования

Для разработки критериев отбора проб в дополнительное исследование была использована тактика достижения диагностического консенсуса, согласно которой результат определяется по совокупности исследований в нескольких диагностических системах [Suslov А. Р. et al., 2002], с внесенными нами изменениями: включением в алгоритм консенсуса подтверждающих тест-систем планшетного формата с раздельным определением антител к Соге-белку и комплексу NS-белков ВГС.

Статистическая обработка проведена с помощью компьютерных программ MS Excel, «BioStatistica», «Statistica 6» и «Clinic» [Бенсман B.M., 2002]. В работе использовались параметрические и непараметрические критерии. Автоматическая обработка данных внутрилабораторного контроля качества проводилась с помощью программы «Altey Laboratory Quality Control», v.4.1 и v.4.2 (ЗАО «Алтэй»).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ЧАСТОТА И ДИНАМИКА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВГС В РАЗЛИЧНЫХ ГРУППАХ ПАЦИЕНТОВ ЛПУ Г. МОСКВЫ В 2000-2011 гг.

Результаты исследования анти-ВГС получены при массовом скрининге проб сыворотки крови. Количество пациентов, обследованных в 2000, 2006 и 2011 годах, составило соответственно: 234696, 463373 и 626150 человек. Распространение анти-ВГС среди различных групп представлено на рисунке 1.

В 2000-2011 гг. наибольшее распространение анти-ВГС наблюдалось среди пациентов наркологических учреждений г.Москвы (гр. 7), наименьшее - среди беременных женщин (гр. 2). В указанные годы в этих же группах, а также в группах пациентов без выявленных факторов риска (гр. 1), пациентов с высоким риском парентерального заражения (отделения гемотрансфузий и пр., гр. 5), пациентов МНПЦДК (гр. 8) происходило последовательное уменьшение относительного количества

лиц с анти-ВГС.

1 2 4 5 6 7 8 9

группы

Рисунок 1. Распространение анти-ВГС среди пациентов ЛПУ г.Москвы в 2000 г., 2006 г. и 2011 г. Группы описаны в разделе «Материалы и методы». Отличия показателей 2006 г. от 2011 г.: в группах 5 и 7 при р<0,05, в остальных -прир<0,001.

Полученные нами данные о снижении распространения анти-ВГС в г.Москве соответствуют современной эпидемиологической характеристике ГС в Российской Федерации, свидетельствующей о снижении заболеваемости острым гепатитом С [Онищенко Г.Г. и Жебрун А.Б, 2010]. Широкое распространение анти-ВГС среди пациентов ЛПУ общего профиля с неустановленными факторами риска заражения (3,93%, гр.1), в 2 раза превышающее распространение в соответствующей группе в США [Сипп И..А. е1 а!., 2001], указывает на необходимость совершенствования подходов к установлению факторов инфицирования и к ранней диагностике гепатита С.

Среди внутривенных наркоманов, несмотря на существование региональных отличий, отмечено снижение распространения ВГС-инфекции [Daniels D et al.,2009; Amon J. et al., 2008]. Причины этого процесса не выяснены, но, возможно, они отражают некоторую коррекцию рискованного поведения в среде потребителей внутривенных наркотиков.

За период с 2006 по 2011 гг. распространение анти-ВГС в г.Москве увеличилось среди контингента больных с хроническими заболеваниями печени (гр. 6, р<0,05). В нашей работе впервые зарегистрировано увеличение распространения анти-ВГС среди медицинского персонала отделений с высоким риском инфицирования ВГС и сотрудников лабораторий (гр.4, р<0,001). Вероятно, в настоящее время, при отсутствии средств специфической профилактики ГС, раннее, на доклиническом этапе, выявление инфицированных лиц является одним из наиболее значимых способов предупреждения распространения инфекции среди населения с разной степенью риска заражения.

2. СПОСОБЫ ОПТИМИЗАЦИИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ МАССОВОГО СКРИНИНГА НА АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С

ИФА является основным методом массового скрининга сыворотки крови на наличие анти-ВГС в России, вследствие чего возрастает роль внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК) данного вида исследований. В нашей работе изучена возможность использования для ВЛКК массового скрининга анти-ВГС контрольных материалов, приготовленных самостоятельно из проб, присланных в лабораторию на исследование (так называемая сливная сыворотка), и контрольных материалов промышленного производства. При сравнении воспроизводимости результатов измерения ОП и вычисления КП контрольных материалов получены следующие результаты: CV (Coefficient of Variation) КП лиофилизированного и восстановленного материала «Внутрилабораторный контроль анти-ВГС» равен 10,6-19,0%; CV самостоятельно приготовленного контрольного материала - более 23%; отрицательного контрольного материала, входящего в состав ИФТС (в качестве группы сравнения - высокостабильного контрольного материала) -5,4%. В дальнейшем (с 2006 г.) для оценки воспроизводимости результатов определения анти-ВГС использован только материал промышленного производства, предназначенный для ВЛКК.

Определена сходимость результатов измерения ОП и вычисления КП контрольного материала собственного изготовления. CV КП «сливной»

сыворотки не превышал 3,5%. Учитывая удовлетворительные результаты исследования, в дальнейшем для оценки сходимости результатов использовали самостоятельно приготовленную, так называемую сливную сыворотку. Для построения и ведения контрольных карт использовали только материал промышленного производства, предназначенный для ведения BJIKK.

Сопоставлены результаты оперативного контроля качества исследований анти-ВГС методом ведения контрольных карт:

а) при «ручном» проведении ИФА - внесении исследуемых проб и контрольного материала автоматическими пипетками, количество исследований более 400 проб на 1 оператора; б) при использовании для внесения контрольного материала и исследуемых образцов системы автоматического пипетирования проб биологического происхождения «Freedom Evo Clinical»; в этих двух вариантах проведения ИФА карты были построены и велись по средним значениям КП в серии, CV был от 8% до 15%; в) при полностью автоматизированном проведении ИФА с помощью автоматического иммуноферментного анализатора «Freedom Evolyzer» в картах использовали значения КП контрольного материала на каждом планшете (не в серии); CV был выше, чем при ручном и аппаратном раскапывании (что связано с использованием неусредненных показателей), однако не превышал 19%. При использовании контрольного материала промышленного производства на контрольных картах имелись единичные предупредительные критерии; как правило, это были значения КП более 2а. Количество результатов, выходящих за границы 2ст, не превышало 4,5%, т.е. составляло статистически ожидаемую величину.

При включении в ВЛКК повторных исследований, проводимых в день первичного исследования, ошибка составляла 0,14%.

Все представленные далее результаты получены при систематическом и регулярном проведении не только внутреннего, но и внешнего контроля качества исследований анти-ВГС.

3. ЛАБОРАТОРНЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ СКРИНИНГА НАСЕЛЕНИЯ НА АНТИТЕЛА К ВИРУСУ ГЕПАТИТА

С

В работе проанализированы противоречия между результатами подтверждения анти-ВГС в разных диагностических системах: А) в ИФТС разных производителей; Б) в иммуноблотах разных производителей, В) в ИФТС и ИБ. Получены следующие результаты:

1) Более чем для 20% проб с низкими КП характерна противоречивость результатов в ИФТС разных производителей. Так, при

КП анти-NS = 2,35±2,45 в ИФТС «РекомбиБест анти-ВГС-подтверждающий тест» (РБ) (результат позитивный), в другой диагностической системе для ИФА «ДС-ИФА-АНТИ-НСУ-СПЕКТР-GM» (ДС) в 20% результат является отрицательным.

Б) В иммуноблотах «RecomBlot HCV IgG 2.0» и «INNO-LIA HCV Ab III update» полное совпадение результатов исследования низкопозитивных проб наблюдалось примерно в 50%. Противоречия между результатами, полученными в двух иммуноблотах, обнаруживались не только при исследовании проб сыворотки крови пациентов, но и при исследовании образцов, поступивших по программе Федеральной системы внешней оценки качества исследований.

В) Учитывая проблемы лабораторной диагностики ВГС-инфекции на этапе массового первичного скрининга, следовало выяснить, насколько ИФТС с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4 и NSS-антигенам ВГС могут решать референсные задачи. Проведено сравнение результатов исследования проб в данных ИФТС с результатами исследования в двух иммуноблотах. Пробы (74 образца) с низкой позитивной оптической плотностью в скрининге (КП 3,14±1,78) и в подтверждающей ИФТС с раздельным выявлением антител к Core (КП 1,68±1,12) и к комплексу NS-антигенов (КП 2,35±2,45) исследованы в ИФТС с раздельным выявлением антител к Core-, NS3-, NS4- и NSS-антигенам ВГС и в иммуноблоте «INNO-LIA HCV Ab III update». Полное совпадение результатов, полученных в ИФТС с расширенным спектром выявляемых антител и в «INNO-LIA HCV Ab III update», наблюдается в 47% случаев, неполное - в 28%. Противоречивые результаты в ИФТС и в ЛИА наблюдаются в 25% случаев.

Для обеспечения максимально объективного результата исследования нами разработаны критерии отбора проб в дополнительное тестирование. Использованы три скрининговые ИФТС с общим определением анти-ВГС и три конфирматорные ИФТС планшетного формата с раздельным определением антител к Соге-антигену и комплексу NS-антигенов. В первичном скрининге отбирали пробы с КП менее 6. По результатам достижения диагностического консенсуса в общей группе из 117 проб выделены подгруппы интегрально-отрицательных (инт-, 78 проб) и интегрально-положительных проб (инт+, 39 проб). Следующим шагом стало определение согласно статистическим критериям различий между подгруппами интегрально-отрицательных (инг) и интегрально-положительных (инт+) проб. Поиск различий между подгруппами с интегрально-отрицательными и интегрально-положительными результатами тестирования провели: 1) в первичном скрининге, 2) в дополнительной скрининговой тест-системе «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2», 3) в тест-

системах, разрешенных приказом МЗ РФ для подтверждения наличия анти-ВГС, с раздельным выявлением анти-Core и антител к комплексу NS.

Результаты проведенного статистического анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1

Отличие групп интегрально-отрицательных и интегрально-положительных образцов по дисперсиям выборок и среднему значению КП маркеров: Анти-Соге и Анти-NS в подтверждающих ИФТС и общих анти-ВГС в скрининговых ИФТС 1, 2, 4 - соответствующие маркеры определены в ИФТС российского производства, 3 - общие анти-ВГС определены в ИФТС «Monolisa anti-HCV

PLUS. Version 2»

№ п\п Маркер Характеристика выборки Инт+ Инт-

1 Анти-Соге Средняя величина КП 2,28 *1,66 (р<0,05)

Дисперсия **Различаются (р<0,05)

2 Анти-NS Средняя величина КП 4,16 *2,26 (р<0,05)

Дисперсия **Различаются (р<0,01)

3 Общие анти-ВГС Средняя величина КП 0,372 * 1,78 (р<0,05)

Дисперсия ^Различаются (р<0,05)

4 Общие анти-ВГС Средняя величина КП 1,59 *2,22 (р<0,05)

Дисперсия Не различаются

* Различие средних значений по двухвыборочному г-тесту ** Различие дисперсий по двухвыборочному Р-критерию

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что группы интегрально-положительных и интегрально-отрицательных образцов сыворотки крови различаются по показателям КП в скрининговых ИФТС и

в подтверждающих ИФТС, в последних по величине КП и дисперсиям выборок как анти-Core, так и анти-NS ВГС.

Как минимум 95% значений КП в первичном скрининге проб из интегрально-отрицательной выборки попадает в интервал (0; 2,1), а 99% - в интервал (0; 2,48).

В подтверждающей тест-системе при выявлении реактивности антител к Core АГ 95% значений КП анти-Core проб из интегрально-отрицательной выборки попадают в интервал (0; 1,87), а 99% - в интервал (0; 2,02). Как минимум 95% значений КП анти-NS проб из интегрально-отрицательной выборки попадают в интервал (0; 3,2), а 99% - в интервал (0; 4,16).

Соответствующие величины КП: в скрининге КП анти-ВГС менее 2,1, округленно 2; при подтверждении КП анти-Core менее 2,13, округленно 2; КП анти-NS менее 3,2, округленно 3; р<0,05, - приняты за пограничные значения для проведения дополнительных исследований, подтверждающих наличие анти-ВГС в образцах сыворотки, которые в первой подтверждающей тест-системе были низкопозитивными. Второй упрощенный вариант алгоритма, обеспечивающий объективность и информативность результатов с использованием минимального количества тест-систем одного производителя, представлен в практических рекомендациях. Алгоритм включает последовательные исследования проб сыворотки на анти-ВГС 1) в скрининговой ИФТС с общим определением анти-ВГС, 2) в подтверждающей ИФТС с определением анти-Core и анти-NS, 3) в ИФТС с раздельным определением анти-Core, aHra-NS3, aHTH-NS4, 3HTH-NS5.

При использовании в 2014 г. соответствующих тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) показано, что 100% всех проб, наличие в которых анти-Core не подтверждается в дополнительных исследованиях в ИФТС «спектр», характеризуются 1<КП анти-Соге<2; 100% проб, в которых в тест-системе «спектр» не подтверждается наличие анти-NS, характеризуются 1<КП anTn-NS<3. Ранее 95% отрицательных результатов при последующих расширенных исследованиях находились в интервалах 1<КП анти-Соге<3 и 1<КП aHTH-NS<6. Приведенные данные свидетельствуют о том, что критерии для выборки проб в дополнительные исследования необходимо периодически пересчитывать.

При сравнении результатов дополнительных исследований низкопозитивных проб, полученных в различных подтверждающих тест-системах (рис. 2), установлено статистическое различие между количеством положительных результатов.

□ неопределенные И отрицательные

□ положительные

Рисунок 2. Распределение положительных, отрицательных и неопределенных ответов и различие долей положительных ответов (*р<0,001) при разных вариантах дополнительного подтверждения: с помощью ИФТС разных производителей (п=436), ИФТС «спектр» (п=283), линейного иммунного анализа (п=181).

Исходя из полученных нами данных, рассчитано количество необходимых дополнительных исследований и увеличение стоимости массового скрининга анти-ВГС. В разделе «Практические приложения» представлен алгоритм массового скрининга и количество проб, которых следует дополнительно исследовать в ИФТС «спектр» для получения объективного результата.

Стоимость массового скрининга анти-ВГС, включающего первичный скрининг и обязательное подтверждение положительных проб в ИФТС с определением анти-Соге и анти-Ы8, при использовании для дополнительного выборочного исследования проб с низким КП (не более

10% проб) в ИФТС «спектр», возрастает не более чем на 4-5%, исходя из цен на диагностические системы 2013 г. (по стоимости диагностических систем производства ЗАО «Вектор-Бест»), Таким образом, проведение ограниченного дополнительного тестирования в ИФТС российского производства позволяет повысить информативность и снизить риск сообщения ложнопозитивного результата.

4, ПРОБЛЕМЫ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ МАССОВОГО СКРИНИНГА АНТИТЕЛ К ВГС У ПАЦИЕНТОВ ЛПУ г. МОСКВЫ

В условиях массового скрининга анти-ВГС выделены контингента, в которых обнаруживается большое количество «проблемных» проб: с низкой позитивной ОП, с противоречивыми результатами в разных тест-системах. Результаты дополнительного подтверждения наличия анти-ВГС в низкопозитивных пробах сыворотки крови разных групп пациентов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Частота выявления проблемных проб в группах пациентов лечебно-профилактических учреждений г.Москвы (описание групп дано в разделе «Материалы и методы исследования»)

| '№ группы Количество положительных результатов Количество «проблемных» проб (%) Количество «проблемных» проб с подтвержденными положительными результатами % подтвержденных положительных результатов

1 6875 933 (13,57%) 317 33,98%

2 797 102(12,79%) 44 43,13%

3 61 15 (24,6%) 2 13,13%, р<0,05*

4 77 25 (32,5%, <0,001*) 7 28%

5 495 58 (11,7%) 20 34,48%

6 419 50(11,9%) 25 50%, *

7 3334 150 (4,5%, <0,001*) 56 37,33%

Все 12058 1333 471 35,33%

* Отличие от соответствующего показателя в группе 1 (р<0,05)

В дополнительное исследование включали пробы сыворотки с КП в первичной скрининговой постановке от 1,0 до 3,0, в среднем 1,67±0,07, в которых в первой подтверждающей тест-системе обнаруживались а) антитела только к Соге-АГ, КП не более 3, б) антитела только к N8, КП не более 6. За 8 месяцев 2002 года это количество составило 1333 пробы (11% от общего количества положительных проб). Получены следующие

Максимальное количество (32,5%) низкопозитивных проб наблюдалось в группе медработников (группа 4), а наименьшее (4,5%) - в группе потребителей наркологических препаратов (группа 7). Различия достоверны при сравнении с лицами, обследованными по общим показаниям (группа 1; 13,57%, р<0,001).

У пациентов с заболеваниями печени (группа 6) процент подтвержденных при дополнительном исследовании положительных результатов исследования анти-ВГС был выше (р<0,05), чем у лиц, обследованных по общим показаниям, что свидетельствует об истинном наличии при заболеваниях печени антител к ВГС, которые определяются с низкой ОП.

В группе 3 (дети первого года жизни) процент подтвержденных положительных результатов был ниже по сравнению с группой 1 (р<0,05). По данным литературы, риск выдачи ложноположительного результата повышен в группе беременных женщин. За январь - август 2002 г. проанализировано 40799 сывороток крови беременных женщин, что составило 20,08% от всех исследованных проб. При использовании в качестве первичной скрининговой ИФТС «ИФА- апО-НСУ» а в качестве подтверждающей — «ВГС-ДСМ - подтверждающий тест» не выявлено различий между количеством условно-положительных результатов (положительных на первом этапе скрининга с общим определением антител к ВГС), получаемых ежемесячно, среди беременных женщин и среди пациентов с невыявленными факторами риска заражения (81,81+2,56%, 81,77%+1,88%, соответственно). Такие же результаты были получены при использовании скрининговой ИФТС «МопоНбэ апН-НСУ» (ВюЯас!). Однако при использовании в качестве первичной скрининговой ТС «ВекторБест-анти-ВГС», а в качестве подтверждающей - ТС «ВекторБест - анти-ВГС-подтверждающий тест», в общей группе подтверждалось наличие анти-ВГС в 67,62% проб, положительных при первичном скрининге, а в группе беременных женщин - только в 57,14% проб, положительных в первичном скрининге (р<0,05).

Анализ первично-положительных результатов, подтвержденных в конфирматорных ТС, показал, что относительное количество низкопозитивных проб у людей старше 60 лет было выше, чем среди более

молодых пациентов (от 17 до 60 лет), а количество анти-ВГС-позитивных проб составило соответственно 25,22% и 38,83% (р<0,001). Пробы сыворотки крови пациентов старше 60 лет составляют примерно 18,5% всех образцов, направляемых на исследование в скрининговую лабораторию. В данной возрастной группе распространение анти-ВГС в 2,58 раза ниже, чем в группе лиц моложе 60 лет (соответственно 2,72% и 7,03%, р<0,001). Таким образом, согласно нашим данным, наибольшее количество неподтвержденных низкопозитивных результатов наблюдается у пожилых и у детей первого года жизни, то есть среди лиц с возрастной иммунной недостаточностью.

5. ВЫЯВЛЕНИЕ РНК ВГС В ОБРАЗЦАХ С НЕОПРЕДЕЛЕННЫМИ РЕЗУЛЬТАТАМИ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИ-ВГС.

Определение РНК ВГС проведено в образцах сыворотки крови пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФТС «спектр» и в двух ИБ («Deciscan» и «ЛИА ВГС») в ПЦР 1) с детекцией продуктов реакции в геле, 2) с детекцией продуктов реакции в режиме реального времени. В ИФТС средняя величина (т±а) КП aHTH-NS4 была равна 3,84± 3,65; КП анти-ЫЭЗ - 1,51 ±0,42.

В двух из 20 проб с неопределенными результатами исследования в ИФА (вследствие обнаружения с низкими КП aHTH-NS3) выявлено расхождение результатов. При исследовании РНК ВГС с помощью ПЦР при регистрации результатов в геле результат был положительным, при регистрации результатов «в режиме реального времени» - отрицательным.

Кроме того, было проведено исследование наличия РНК ВГС в пробах с неопределенными результатами в ИФА, протестированных также в хемилюминесцентном иммунном анализе на микрочастицах (ХИАМ). При чувствительности теста 50 МЕ\мл РНК ВГС обнаруживается в пробах с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФА, обусловленными выявлением с высокой оптической плотностью только антител к анти-ЫБЗ (КП aHTH-NS3>3), в которых в ХИАМ также наблюдается высокопозитивная реактивность антител к комплексу антигенов ВГС. Пробы с неопределенными результатами в ИФА вследствие обнаружения только aHTH-NS4 (с КП как более, так и менее 3) в ХИАМ идентифицировались как не содержащие анти-ВГС; РНК ВГС в данных пробах не обнаруживалась.

Полученные нами данные в целом совпадают с результатами проведенного ретроспективного исследования Sayan М. с соавт. [Sayan М. et al., 2006], сделавших вывод о том, что для подтверждения ВГС-

инфицирования в образцах с низким S/Co в скрининге (ниже 3,8), более обоснованным и экономически доступным, чем тестирование образцов на РНК ВГС, является исследование тех же образцов в иммуноблотах, повторное тестирование в других тест-системах для ИФА или исследование новой пробы. По нашим данным, при обнаружении в ИФА только aHTH-NS3 с КП более 3, выявление РНК ВГС в пробе для подтверждения факта инфицирования пациентом вирусом гепатита С может быть эффективным.

6. СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ, В ТОМ ЧИСЛЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ, В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПОЖИЛЫХ ПАЦИЕНТОВ С ПОЗИТИВНЫМИ, НЕГАТИВНЫМИ И ЛОЖНОПОЗИТИВНЫМИ РЕЗУЛЬТАТАМИ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИ-ВГС

Для выявления факторов, способных вызывать или быть ассоциированными с неспецифической реакцией в ИФА, проведено исследование проб сыворотки крови с ложноположительными результатами определения анти-ВГС, полученных от пожилых пациентов, для которых характерны проблемы интерпретации результатов тестирования анти-ВГС. Контрольными группами были пробы с отрицательными и положительными результатами тестирования анти-ВГС.

Ревматоидный фактор (РФ) в концентрации более 10 МЕ/мл обнаруживался в группах проб сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов с положительными (п=33), отрицательными (п=77) и ложноположительными (п=30) результатами исследования анти-ВГС соответственно в 18,18%, в 5,19% и в 6,67% проб. Различий между группами биопроб по частоте выявления проб с РФ не было, однако можно отметить тенденцию к увеличению этой частоты примерно втрое в группе анти-ВГС-позитивных образцов по сравнению с анти-ВГС-отрицательными и ложноположительными результатами определения анти-ВГС. РФ в концентрации 96 МЕ/мл и более не вызывал неспецифическую реакцию в ИФА.

Различий по частоте выявления С-реактивного белка (СРБ) в концентрации более 5 мг/мл в группах проб сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов с положительными (6), отрицательными (12) и ложноположительными (11) результатами исследования анти-ВГС не было.

Результаты определения иных белков в сыворотке крови пожилых пациентов представлено в таблице 3.

Таблица 3

Содержание иммуноглобулинов, фракций белков крови и ЦИК у пожилых лиц с положительными, отрицательными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС

№ п/п Белки сыворотки крови Результаты определения анти-ВГС Границы нормы

Отрицательные (п=11) Положительные (п=6) Ложнопо-ложитель-ные (п=8)

1 Иммуноглобулины (МЕ/мл)

138,4±12,3 154±15,3 137,5+16,8 95-235

1кМ 109±14,5 165±25,6 169,9+43,1 60 - 405

1ёА 287,6+37,8* 220,7± 34,1 217,3+49,2 55 -250

2 Фракция белка крови (%)

Альбумин 58,1±1,1 56,3±1,3 56,7+1,7 52,4-69,4

а 1-глобулины . 4,1±1,8 | 3,8±0,1 4,6+0,3 Ж *(р=0,019)1 1,3-3,9

а2-глобулины 10,4±0,6 9,2±0,6 9,6+0,7 5,4-1,6

р-глобулины 12,8±0,5 12,1±0,5 11,6+0,6 9,0 -17,4

у-глобулины 14,5±0,7 18,5±0,9 17,4+1,1 9,3- 0,3

3 ЦИК(ед) 44,09±3,72 *(р<0,05) 80,83+ | 15,85 1 48,38+5,23 *(р<0,05) до 55 ед.

Примечания: ^ - выход за верхнюю границу нормы; * * - отличие от группы проб с анти-ВГС

Таким образом, между образцами сыворотки крови пожилых лиц с положительными и ложноположительными результатами тестирования анти-ВГС впервые выявлены различия по концентрации ЦИК (повышенной в пробах с анти-ВГС по сравнению с ложнопозитивными образцами) и а1-глобулинов (биомаркеров хронического воспаления), содержание которых повышено в ложнопозитивных пробах. Повышение уровня РФ, ЦИК, у-глобулинов не влияло на качество тестирования анти-ВГС в современных ТС на основе твердофазного ИФА.

6. СЫВОРОТОЧНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ а-ФЕТОПРОТЕИНА КАК МАРКЕР БИОХИМИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ГЕПАТИТА ПРИ НЕОПРЕДЕЛЕННОМ РЕЗУЛЬТАТЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С

Концентрацию а-фетопротеина (АФП) определяли в сыворотке крови молодых мужчин (от 17 до 59 лет, средний возраст 33,6±12,9 года), женщин на раннем сроке беременности (8-10 недель) и пожилых лиц (от 60 до 93 лет, средний возраст 74,0±6,5 лет) с различными результатами исследования анти-ВГС. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Концентрация а-фетопротеина в пробах сыворотки крови с различными результатами тестирования анти-ВГС: отрицательными (группа Анти-ВГС-), положительными (группа Анти-ВГС+), неопределенными (группа

Анти—ВГС-но)

№ п/п Группы Средняя концентрация АФП [верхние и нижние пределы], МЕ/мл. Количество проб в группе (п)

Анти-ВГС- Анти-ВГС+ Анти-ВГС-но

1 Мужчины до 60 лет 4,15 [1,07-13,04] п =19 12,57 (р=0,045)* [2,28 - 96,05] п =20 6,28 (р=0,026)* [0,72-13,68] п =26

2 Беременные женщины 10 [8,18-19,85] п =23 99,44 (р=0,003)* [8,5-357,75] п =14 26,32 (р=0,001)* [8,49-89,84] п =19

3 Пожилые 8,25[3,741-29,71] п =16 14,73 [3,80-111,82] п =30 9,69 [2,94-83,16] п =42

*по сравнению с группами Анти-ВГС- (по критерию Манна-Уитни).

А именно, при исследовании образцов на наличие анти-ВГС в ИФТС выделяли следующие группы проб:

• пробы без анти-ВГС в первичном скрининге (Анти-ВГС-);

• пробы с анти-ВГС с высоким КП в первичном скрининге и в подтверждающих исследованиях в планшетном формате ИФТС с раздельным определением анти-Соге и анти-^ ВГС (Анти-ВГС+);

• образцы с низким КП в первичном скрининге и неопределенным результатом исследования в ИФТС с раздельным определением анти-Соге, airrH-NS3, aHm-NS4, aHTH-NS5 ВГС (анти-ВГС неопределенный).

Согласно данным, представленным в таблице 4, концентрация АФП в пробах, полученных от мужчин моложе 60 лет и женщин на раннем сроке беременности с положительными и неопределенными результатами исследования анти-ВГС, была выше, чем в пробах без анти-ВГС.

В группе беременных женщин между пробами с отрицательными, неопределенными и позитивными результатами определения анти-ВГС было также различие по величине МоМ (от англ. multiply of median), принятой в практике обследования беременных женщин, которая вычислялась как частное от деления медианы концентрации АФП в исследуемых группах на величину медианы в контрольной группе образцов без анти-ВГС (Анти-ВГС-) [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. В группах Анти-ВГС-, Анти-ВГС-но, Анти-ВГС+ величины МОМ были соответственно равны 1; 1,95 и 2,56. Пороговыми уровнями АФП, которые рассматриваются как отклонение от нормы и как показание к проведению дальнейших диагностических исследований, являются показатели, в 1,5-2,5 раза превышающие средние значения (1,5-2,5МоМ), характерные для патологий развития плода. Кроме отражения неблагоприятной акушерской ситуации, в нашем исследовании показано, что повышенные уровни АФП характерны не только для беременных с позитивными, но и с неопределенными результатами исследования анти-ВГС, что требует дальнейшего обследования женщин на наличие ВГС-инфекции.

Между пробами сыворотки крови, полученными от лиц старше 60 лет, с разными результатами исследования анти-ВГС (положительными, отрицательными и неопределенными) не выявлено различий по концентрации АФП, возможно, вследствие более высокой концентрации АФП в группе проб сыворотки крови без анти-ВГС.

Образцы сыворотки крови молодых мужчин с неопределенными результатами в ИФТС были исследованы в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0». В пробах с отрицательными результатами исследования в ИБ (19 из 26; 73,1%) концентрация АФП не отличалась от группы анти-ВГС-. При этом в 17 из них в ИБ, также как в ИФТС, обнаруживалась реактивность только к NS4 либо только к NS5 (по правилам интерпретации в ИБ результат рассматривался как отрицательный). В образцах с неопределенными результатами исследования в ИФТС и с положительными либо неопределенными результатами исследования в ИБ концентрация АФП была равна 7,41±2,12 МЕ/мл или 9,26±2,65нг/мл (выше, чем в группе Анти-ВГС-, р=0,008).

По данным литературы, для хронического ГС характерен подъем концентрации АФП, чего не наблюдается при скрытом ГС (без специфических маркеров в сыворотке крови анти-ВГС и РНК ВГС) [Pardo М. et al., 2007]. В нашей работе впервые показано, что увеличение концентрации АФП происходит не только при позитивном, но и при неопределенном результате тестирования анти-ВГС. По-видимому, этот подъем в основном связан с наличием низких количеств антител к антигенам Core и NS3, а не к антигену NS4.

Группа образцов сыворотки крови пожилых людей с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС была крайне гетерогенной по концентрации АФП, по-видимому, вследствие разнообразных приобретенных заболеваний и наличия иных, кроме ВГС, гепатотоксических факторов, вследствие чего не отличалась ни от одной из соответствующих возрастных групп по концентрации АФП. Таким образом, в лабораторной диагностике гепатита С необходима комплексная оценка серологических и биохимических маркеров ВГС-инфекции с учетом возрастной категории пациента.

7. ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОЧИПОВ для ВЕРИФИКАЦИИ НАЛИЧИЯ АНТИ-ВГС В ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ КРОВИ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТИТЕЛ

В иммуночипах (рисунок 3) были исследованы на наличие антител к ВГС классов G и М 72 образца сыворотки крови, в которых в ИФТС планшетного формата с низкой ОП были обнаружены антитела только к одному из антигенов ВГС.

Контрольные группы составляли образцы, не содержащие анти-ВГС (негативная контрольная группа) и образцы с анти-ВГС с высоким КП (позитивная контрольная группа, образец №60 на рис. 3). Результаты исследования контрольных проб в иммуночипах соответствовали результатам, полученным в ИФТС.

В иммуночипах протестировано 16 образцов, в которых в ИФА с низкой ОП были выявлены анти-Core (КП анти-Соге = 1,95±0,876). В ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» результат тестирования двух проб был позитивным (анти-ВГС+, например, проба №14 на рис. 3), пяти -негативным (анти-ВГС-), 9-ти - неопределенным. В иммуночипах 13 образцов (81%) были признаны анти-ВГС+ по IgG (дополнительно выявлены антитела к нескольким неструктурным антигенам), в трех пробах результат исследования был неопределенным. В одной пробе обнаружены антитела класса IgM к антигенам двух неструктурных протеинов ВГС -

анти-ЫБЗ и анти-^4. В пяти пробах результат определения антител класса М был неопределенным, причем в трех пробах с низкой позитивностью детектировались анти-Соге ВГС, в одной - анти-Ы85, в одной - анти-ЫБ4

вгс.

Рисунок 3. Иммуночипы: слайды и отдельно представленные эрреи с флуоресцентной меткой антител к ВГС в исследуемых пробах (обозначен порядковый номер пробы).

При исследовании 27 проб, в которых в ИФТС были обнаружены только анти-ЫБЗ (КП анти-NSS = 5,0±3,9), позитивный результат в ИБ получен в трех образцах (11,1%), негативный — в 8-ми, неопределенный - в 16-ти. В иммуночипах 23 пробы из 27 (85,1%) были определены как анти-ВГС+ по наличию IgG к нескольким антигенам ВГС. В 7 пробах содержались анти-ВГС класса IgM; в двух из них при определении РНК ВГС в ПЦР кривые накопления флуоресцентного сигнала имели характерный для продуктов реакции вид, но с количеством ниже порогового уровня.

В 31 пробе с низким КП в ИФТС планшетного формата определялись только aHTH-NS4 (КП aHTH-NS4 = 2,98±1,72). Результаты исследования данных проб в ИБ были отрицательными (22,2%) или неопределенными (77,8%) в соответствии с правилами интерпретации в ИБ. В иммуночипах 26 из 31 проб (83,9%) признаны положительными по наличию антител класса IgG к структурным и неструктурным протеинам ВГС. Результат исследования 5 проб на наличие антител класса G к ВГС в иммуночипах был неопределенным вследствие обнаружения реактивности только к антигенам белка NS4. Анти-ВГС класса М были обнаружены в иммуночипах в двух образцах (6,45%), результат исследования двух образцов (6,45%) был неопределенным. Таким образом, из 31-й протестированной пробы, содержащей только aHTH-NS4 по данным ИФТС (результат неопределенный), 26 проб (83,9%) в иммуночипах признаны анти-ВГС позитивными по наличию IgG, а две из них содержали также антитела к ВГС, относящиеся к IgM.

При исследовании двух проб с антителами в ИФА только к белку NS5 ВГС, результаты исследования одной пробы были отрицательными в ИБ и в иммуночипе, второй пробы. - неопределенными в ИБ и положительными в иммуночипе (по наличию антител к антигенам Core и NS5 ВГС).

Сравнение результатов исследования проб различными методами (ИФА, иммуноблот, иммуночип) представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5

Сравнение количества неопределенных результатов исследования проб сыворотки крови на наличие антител к ВГС в иммуночипах и в ИФА

№ группы п/п Группы с антителами к одному антигену ВГС в ИФА (суммарные антитела классов в и М) Интерпретация результатов ИФА Результаты определения анти-ВГС (классов О и М) в иммуночипе Изменение количества неопределенных результатов в иммуночипе но сравнению с ИФА (^в + 1§М) Количество позитивных результатов тестирования анти-ВГС класса М в иммуночипе

неопределенные позитивные

1 Анти-Соге (п=16) Позитивные (100%) 19% 81% недостоверно 6,25%

2 Анти-Ы83 (п=22) Неопределенные (100%) 9% 91% Р<0,001 | 22,7%

3 Анти-Ы84 (п=31) Неопределенные (100%) 16% 84% Р<0,001 ^ 6,45%

Из данных, представленных в таблице 6, видно, что в иммуночипах количество анти-Соге позитивных проб (учтенных как сумма проб с антителами класса О и проб с антителами класса М) не отличалось от количества позитивных проб в ИФА.

По сравнению с ИФА, в котором были выявлены только анти-ЫБЗ (результат неопределенный), в иммуночипах количество неопределенных результатов было ниже примерно в 10 раз (Р<0,001); в 90% случаев результат в иммуночипах был анти-ВГС позитивным. При выявлении в

ИФА только анти-Ы84 (результат в ИФА неопределенный) в иммуночипах количество неопределенных результатов было меньше в 6 раз (Р<0,001).

Таблица 6

Сравнение частоты позитивных результатов исследования проб сыворотки крови в иммуноблотах и в иммуночипах

№ группы п/п Наличие AT к ВГС (низкие КП в ИФА) Позитивные результаты в ИБ (%) Позитивные результаты в иммуночипах (%) Статистическая достоверность различий

1 Анти-Соге (п=16) 2% | 81% Р<0,0001

2 Ahth-NS3 (п=13) 15% | 70% Р<0,005

3 Ahth-NS4 (п=17) 0% | 88% Р<0,001

В иммуночипах по сравнению с иммуноблотами количество позитивных результатов было выше примерно в 40 раз при исследовании наличия анти- Core и в 4,6 раза при исследовании Ahth-NS3. В 88% проб, определенных в иммуноблотах как не содержащих анти-ВГС, в иммуночипах анти-ВГС были обнаружены.

Таким образом, проведенное исследование показало большую чувствительность иммуночипов по сравнению с иммуноблотами и ИФА при исследовании сывороток с низким количеством антител к ВГС.

В представленной работе впервые показано, что в образцах с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФТС и отрицательными результатами в ИБ, результат исследования в иммуночипе может быть положительным не только по наличию анти-ВГС, относящихся к IgG, но и анти-ВГС, относящихся к IgM, что свидетельствует об активной фазе инфекционного процесса. При проведении исследований в динамике заболевания обнаружено, что анти-ВГС выявляются в иммуночипах на несколько месяцев раньше, чем в ИФА.

выводы

1. Установлено увеличение распространения антител к ВГС среди медработников г.Москвы (с 1,64% до 3,92%) и среди пациентов с хроническими заболеваниями печени (с 1,72% до 4,04%) за период с 2008 г. по 2011 г. Относительно устойчивое снижение количества показателя в период с 2000 по 2011 г.г. наблюдалось среди пациентов с высоким риском гемотрансмиссивного заражения (с 8,19% до 4,22%), беременных женщин (с 2,78% до 1,31%), пациентов МНПЦЦК (с 9,63% до 3,69%), пациентов ЛПУ г.Москвы без выявленного риска заражения (с 6,19% до 3,93%).

2. Для оценки воспроизводимости результатов массового скрининга населения на наличие антител к ВГС методом ИФА при проведении внутрилабораторного контроля качества исследований следует использовать контрольный материал промышленного производства (СУ менее 19%), а для оценки сходимости может быть использован контрольный материал, самостоятельно приготовленный в лаборатории, не подвергшийся замораживанию и оттаиванию (СУ менее 10%). Показатели внутрилабораторного контроля качества исследований сопоставимы при ручном, автоматическом и полуавтоматическом режимах проведения ИФА.

3. Разработанные критерии отбора проб ограничивают количество верифицирующих тестов, необходимых для исключения ложнопозитивных результатов. При использовании диагностических систем для ИФА разных производителей следует отбирать пробы с коэффициентом позитивности анти-Соге менее 2, с коэффициентом позитивности анти-Ыв менее 3. При использовании диагностических систем для ИФА одного производителя показана необходимость периодического перерасчета критериев отбора.

4. Алгоритм дополнительного исследования проб сыворотки крови с неоднозначными результатами определения антител к ВГС разработан в двух вариантах: 1) полном — с использованием диагностических систем нескольких производителей и иммуноблота, и 2) упрощенном - с использованием только планшетных иммуноферментных тест-систем российского производства, которые являются недорогим аналогом иммуноблота. Упрощенный вариант алгоритма при экономической доступности обеспечивает необходимые врачу и пациенту достоверность и информативность результатов.

5. Высокая частота ложноположительных результатов при скрининге на антитела к ВГС наблюдается среди лиц с физиологическим

иммунодефицитом (дети первого года жизни и лица старше 60 лет). Низкие значения позитивности по анти-ВГС пациентов с заболеваниями печени и пациентов наркодиспансеров соответствуют истинному наличию у них антител к ВГС.

6. В группе лиц старше 60 лет маркером истинной позитивности при исследовании анти-ВГС является повышенное содержание ЦИК в сыворотке крови, а маркером ложной позитивности - повышенное содержание al-фракции сывороточных белков.

7. Концентрация a-фетопротеина увеличена у мужчин моложе 60 лет (в 2,9 раза) и женщин в первом триместре беременности (в 2,6 раза) с антителами к ВГС в сыворотке крови. При неопределенных результатах исследования анти-ВГС концентрация АФП в данных группах увеличена соответственно в 1,7 и 1,95 раза. Увеличение концентрации АФП характерно для проб с антителами к Core или к NS3, но не к NS4 антигенам ВГС.

8. РНК ВГС выявляется в пробах сыворотки крови пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС вследствие обнаружения только an™-NS3. В пробах сыворотки крови пациентов с реактивностью антител только к NS4 антигену ВГС при чувствительности метода ПЦР 50 МЕ/мл РНК ВГС не выявляется.

9. Метод иммуночипов позволяет верифицировать наличие антител к ВГС в 80% проб с неопределенными результатами исследования в ИФА, и в 50% проб, признанных в иммуноблотах не содержащими антитела к ВГС. В иммуночипах в данных пробах обнаруживаются антитела, направленные не к одному, а к нескольким антигенам ВГС, относящиеся и к IgM, и к IgG. Дополнение скрининга в ИФА исследованием в иммуночипе способствует выявлению так называемого скрытого гепатита С.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) АЛГОРИТМ МАССОВОГО СКРИНИНГА НАСЕЛЕНИЯ НА НАЛИЧИЕ АНТИ-ВГС И ОТНОСИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ПРОБ НА КАЖДОМ ЕГО ЭТАПЕ

1

Примечания.

* Границы выборки в дополнительное исследование периодически рассчитываются

^Дополнительные исследования необходимы при исследовании лиц из контингентов массового скрининга с физиологическим иммунным дисбалансом (детей первого года жизни и лиц старше 60 лет) и беременных женщин

***При неопределенном результате исследования в ИФТС «спектр» этот этап не требуется

2) МЕТОДЫ И СПОСОБЫ СОКРАЩЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА «ЛОЖНЫХ» РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ МАССОВОМ СКРИНИНГЕ АНТИТЕЛ К ВГС

№ - Методы и способы достижения достоверного результата Преимущества и недостатки использования Следующее действие

1 Дополнительно исследовать пробы с низкими КП антител к Core (КП менее 2) и комплексу NS (КП менееЗ) антигенов ВГС* Определение границы КП для дополнительного тестирования проб минимизирует их количество и обеспечивает качество исследований См. пункты 2, 3, 4,5

2 Использовать диагностические системы для ИФА нескольких производителей для проб с низкими КП Позволяют избежать ложнопозитивного результата При противоречивости исследований использовать иммуноблоты или ИФТС планшетного формата с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенами ВГС

3 Диагностические системы для ИФА планшетного формата с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС Позволяют избежать ложной позитивности и ложной негативности при использовании критериев неопределенного результата В массовом скрининге может быть окончательным; дополнительно могут использоваться иммуноблоты или иммуночипы

Продолжение практических рекомендаций №2

4 Иммуноблоты Вследствие относительно низкой чувствительности следует критически оценивать отрицательные результаты при наличии изолированной реактивности к Core или к NS3 антигенам ВГС Иммуночипы

5 Иммуночипы Верифицируют наличие анти-ВГС в пробах с неопределенным результатом в ИФА, поскольку в них выявляется более широкий спектр антител, относящихся как к IgG, так и к IgM ПЦР

6 ПЦР При чувствительности 50 МЕ/мл позволяет выявить РНК ВГС в образцах с анти-NS3, но не с анти-NS4 Возможно, использование метода ПЦР с большей аналитической чувствительностью

*При использовании тест-систем одного производителя критерии отбора периодически пересчитываются

**Дополнительные исследования необходимы при обследовании лиц из контингентов массового скрининга с физиологическим иммунным дисбалансом (новорожденных и пожилых лиц) и беременных женщин

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК

1. Богуш, П.Г. Внутрилабораторный контроль качества определения маркеров вирусных гепатитов В и С и анализ тест-систем в скрининговой лаборатории / П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, A.A. Потапова, В.М. Дронова, А.В.Гусев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - №2. — С. 11 -15.

2. Богуш, П.Г. Распространение антител к вирусу гепатита С среди различных групп риска в г. Москве / П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, A.A. Потапова, В.М. Дронова, A.B. Гусев // Клиническая дерматология и венерология - 2004.-№1. -С. 19-21.

3. Потапова, A.A. Возрастной аспект лабораторной диагностики вирусного гепатита С / A.A. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, Э.Ю.Сариди, ЕЛО. Варламова // Клиническая геронтология. - 2006. - Т. 12. - №3. - С.41- 45.

4. Потапова, A.A. Повышение достоверности результатов массового скрининга крови на наличие антител к вирусу гепатита С / A.A. Потапова, Л.В Ковальчук // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2006. - № 5 (52). - С. 63-67.

5. Потапова, A.A. Способы оптимизации внутрилабораторного контроля качества исследований антител к вирусу гепатита С при массовом скрининге сыворотки крови / A.A. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, В.М. Дронова // Клиническая лабораторная диагностика. -2008. -№3,-С. 35-38.

6. Потапова, A.A. Отсутствие РНК вируса гепатита С в сыворотках с неопределенными результатами исследования антител к ВГС при массовом скрининге крови / A.A. Потапова, Е.Б. Редченко, Р.Т. Тогузов, Л.В. Ковальчук, Н.Ю. Сафронова, Ж.В. Евсегнеева, Д.С. Щербо // Клиническая лабораторная диагностика. -2008. - №6. -С. 41-43.

7. Потапова, A.A. Концентрация АФП в сыворотке крови с неопределенным результатом исследования антител к вирусу гепатита С в иммуноферментном анализе/ A.A. Потапова // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4 (13). -№2. - С.173-181.

8. Потекаев, H.H. Возрастной аспект изменения концентрации альфа-фетопротеина при неопределенном результате исследования антител к вирусу гепатита С / H.H. Потекаев, A.A. Потапова, В.А. Науменко // Клиническая дерматология и венерология. - 2011. - №6. -С. 10-14.

9. Потапова, A.A. Концентрация сывороточного альфа-фетопротеина у беременных женщин с неопределенным результатом исследования антител к вирусу гепатита С / A.A. Потапова, JI.B. Ковальчук / Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2011. -№2. - С. 48-53

10. Потапова, A.A. Проблемы лабораторной диагностики у пожилых пациентов: сывороточная концентрация а-фетопротеина при неопределенном результате исследования антител к вирусу гепатита С/

A.A. Потапова, JT.B. Ковальчук // Фундаментальные исследования. -2011.-№5. -С. 141-147.

11. Потапова, A.A. Верификационные возможности иммуночипов при выявлении в иммуноферментных тест-системах антител только к неструктурному протеину NS3 вируса гепатита С / A.A. Потапова, Т.А.Чеканова, M.JI. Маркелов, Е.А.. Пудова, Н.П. Кирдяшкина, Г.А. Шипулин, JI.B. Ковальчук, В.М. Дронова, Н.Н.0020Потекаев // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6(15). - №1. - С. 14-21.

12. Потапова, A.A. Выявление с помощью иммуночипов антител к нескольким белкам вируса гепатита С у пациентов с реакцией сыворотки крови в иммуноферментном анализе только на белок NS4 / А.А Потапова, Т.А Чеканова, МЛ. Маркелов, Е.А. Пудова, Н.П. Кирдяшкина, Г.А. Шипулин, Е.Ю. Калугина, Е.Б. Редченко, Н.И. Сюч, H.H. Потекаев.// Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. - 2012. - №2 (21). - С. 20-25.

13. Потапова, A.A. Верификационные возможности иммуночипов при низком содержании антител к Соге-антигену вирусного гепатита С / A.A. Потапова, Т.А. Чеканова, М.Л. Маркелов, Е.А. Пудова, Н.П. Кирдяшкина, Г.А. Шипулин, В.М. Дронова, H.H. Потекаев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - №1- 2. - С. 45- 48

Прочие публикации в российских и зарубежных изданиях

14. Богуш, П.Г. Показатели внутрилабораторного контроля качества определения маркеров вирусного гепатита В и С методом ИФА в скрининговой лаборатории / П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, A.A. Потапова,

B.М. Дронова, A.B. Гусев // Новое образование, приложение Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: материалы XI межд. конф. - Украина, Крым - 2003 г. - С.282-283.

15. Богуш, П.Г. Анализ неопределенных результатов, полученных при исследовании сывороток крови на наличие антител к вирусу гепатита С в скрининговой лаборатории /П.Г. Богуш, A.A. Потапова, Е.Б. Редченко,

В.М. Дронова, A.C. Гусев, Л.Д. Богалей // Russian J. Immunol. - 2004.-V.9, Suppi.l. - P.354

16. Bogush, P.G. The prevalence of antibodies to hepatitis С virus in different groups in Moscow population / P.G. Bogush, A.A. Potapova, E.B. Redchenko, V.M. Dronova, A.S. Gusev, L.D. Bogaley // Consensus Conference on Hepatitis C: Abstract Book . - UK, Edinburgh, 2004. - P.24

17. Богуш, П.Г. Динамика распространения HBs-антигена в контингентах с различным риском инфицирования в г. Москве в 2001-2003 г. / П.Г. Богуш, A.A. Потапова, Е.Б. Редченко, В.М. Дронова, А.С.Гусев, Л.Д. Богалей // Вирусный гепатит В - диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HBsAg): тез. докл. Росс, науч.-практ. конф. с междунар. участием. - М., 2004. - С.10-11.

18. Потапова, A.A. Особенности лабораторной диагностики вирусного гепатита С у пожилых пациентов / A.A. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, A.C. Гусев // Медицина для пожилых и инвалидов: материалы науч.-практ. конф. - М., 2004. - С.73.

19. Богуш, П.Г. Опыт исследования проблемных сывороток крови на наличие антител к вирусу гепатита С в скрининговой лаборатории г.Москвы / П.Г. Богуш, A.A. Потапова, Е.Б. Редченко, В.М. Дронова, A.C. Гусев, Л.Д. Богалей // Успехи совр. естествознания. - 2004. - №6, приложение 1. - С. 173-174.

20. Богуш П.Г. Динамика распространения антител к вирусу гепатита С в различных контингентах г.Москвы в 2000-2004 гг. / П.Г. Богуш, A.A. Потапова, Е.Б. Редченко, A.C. Гусев // Открытое образование: приложение Новые информ. технологии в мед., биол., фармакол. и экологии: материалы XIII межд. конф. -Украина, 2005. -С. 179-181.

21. Потапова, A.A. Проблемы диагностики ВГС-инфекции у лиц пожилого возраста (некоторые характеристики сывороток крови, в которых зарегистрирован ложнопозитивный результат обнаружения анти-ВГС) / A.A. Потапова // Мир вирусных гепатитов. - 2005 . - №11. - С. 2-5.

22. Богуш, П.Г. Иммунодиагностика вирусного гепатита С у пожилых пациентов / П.Г. Богуш, A.A. Потапова, Е.Б. Редченко, Л.В. Ковальчук, Д.С. Щербо, Э.Ю. Сариди // Аллергология и иммунология. - 2005.- Т.6.-№2.-С. 170.

23. Потапова, A.A. Анализ сыворотки крови пожилых пациентов с неспецифической положительной реакцией на антитела к вирусу гепатита С / A.A. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, В.М. Дронова, Э.Ю. Сариди, ЕЛО. Варламова, O.E. Ягужинская, Г.М. Семенова, Н.Ю. Бугарь, Н.Ю. Сафронова, С.Н. Щербо // Геронтология и гериатрия: альманах. - М., 2005. - Вып. 4. -С.204-207.

24. Potapova, A.A. Problems of Immunodiagnosties of Hepatitis С In Senior Patients / A.A. Potapova,, P.G. Bogush, E.B. Redchenco // Clinical immunology. - 2005, suppl. 1. -P. 262.

25. Потапова, A.A. Некоторые характеристики проб сыворотки крови с неспецифической положительной реакцией в ИФА при исследовании наличия антител к вирусу гепатита С / А.А. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, Л.Д. Богалей // Открытое образование, приложение Новые информ. технологии в мед., биол., фармакол. и экологии: материалы XIII межд. конф. -Украина, 2006. - С.171-172.

26. Potapova, A.A. Some characteristics of blood sera with false positive results of anti-HCV antibodies detection in screening/ A.A. Potapovas P.G. Bogush, E.B. Redchenco // 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology, 16th European Congress of Immunology: book of abstracts. -France, 2006. -P. 366.

27. Потапова, A.A. Неопределенные результаты как проблема иммунодиагностики вирусного гепатита С при массовом скрининге сыворотки крови / А.А. Потапова, Л.В Ковальчук, Е.Б. Редченко, Н.А. Кузнецова // Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3, приложение 1. - С. 270.

28. Потапова, А.А. Опыт построения контрольных карт при массовом скрининге сыворотки крови на наличие антител к вирусу гепатита С / А.А. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, В.М. Дронова, П.А. Ипатов, А.С. Гусев, Л.Д. Богалей, М.М. Шульгина // Новости «Вектор-Бест». - 2007. -№1 (43).-Стр.7-10.

29. Потапова, А.А. Беременные женщины как группа риска ложнопозитивных реакций сыворотки крови при исследовании маркеров вирусного гепатита С / А.А. Потапова, Е.Б. Редченко, А.С. Гусев // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. -Архангельск, 2007. - №1 (выпуск XVIII). - С. 126-128.

30. Потапова, А.А. Достоверность результата и экономическая целесообразность: критерии повторного подтверждения результата при иммунодиагностике ВГС-инфекции / А.А. Потапова // Российский аллергологический журнал. - 2008. - №1, приложение 1. - С.230-231.

31. Потапова, А.А. Алгоритм исследования «проблемных» образцов при массовом скрининге сывороток крови на антитела к вирусу гепатита С /А.А. Потапова, Е.Б. Редченко, В.А. Науменко // Мир вирусных гепатитов. - 2008.-№4. - С. 8-12.

32. Потапова, А.А. Содержание а-фетопротеина (АФП) в крови беременных женщин с неопределенным результатом исследования антител к вирусу гепатита С /А.А. Потапова, Е.Б. Редченко, А.С. Гусев, М.М.

Шульгина, И.А. Волкова // Росс. Иммунол. журнал. -2008. - Т.2 (11). -№23. -С.295.

33. Потапова, A.A. Концентрация а-фетопротеина при исследовании антител к ВГС в «проблемных» образцах сыворотки крови / A.A. Потапова, П.Г. Богуш., JI.B. Ковальчук, Р.Т. Тогузов, Е.Б. Редченко, М.М. Шульгина, М.К. Ксенофонтова, И.А. Волкова // Мир вирусных гепатитов. - 2009. -№3. - С.28.

34. Потапова, A.A. Повышение концентрации а-фетопротеина (АФП) в сыворотке крови , содержащей антитела только к NS3 или Соге-антигенам ВГС, но не к антигену NS4 /A.A. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, М.К. Ксенофонтова, М.М. Шульгина, И.А. Волкова // Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года: труды научно- практической конференции. - М, 2009 - С. 79-80.

35. Потапова, A.A. Алгоритм массового скрининга крови на антитела к вирусу гепатита С: критерии дополнительного тестирования при использования подтверждающих российских тест-систем на основе твердофазного ИФА/ A.A. Потапова // Молекулярная диагностика - 2010: сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том 1. - М., 2010. - Стр. 284 - 287.

36. Потапова, A.A. Различия по спектру антител и концентрации альфа-фетопротеина сыворотки крови молодых и пожилых пациентов при неопределенном результате исследования антител к вирусу гепатита С в твердофазном иммуноферментном анализе / A.A. Потапова // Молекулярная диагностика - 2010: сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том 1. — Москва, 2010. - С. 281- 284.

37. Потапова, A.A. Расширение возможностей серологической диагностики инфекции, вызываемой вирусом гепатита С (ВГС), с помощью иммуночипов / A.A. Потапова, В.М. Дронова, Т.А. Чеканова, Г.А. Шипулин, М.Л. Маркелов, Е.А. Пудова, Н.П. Кирдяшкина, Т.А. Туполева, Ф.П. Филатов, Д.С. Тихомиров, E.H. Овчинникова, H.H. Потекаев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. -№10. - С. 3.

38. Потапова, A.A. Зависимость сывороточной концентрации альфа-фетопротеина при неопределенном результате исследования антител к вирусу гепатита С от возраста пациента / H.H. Потекаев, A.A. Потапова, В.А. Науменко., A.C. Гусев // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия: сборник материалов IV междисциплинарной научно-практической конференции. — М., 2011 г.-С. 62.

39. Potapova, A.A. Elevated alpha-fetoprotein (AFP) in blood sera of young, but not of senior patients with uncertain results of antibodies to virus hepatitis С / A.A. Potapova, V.A. Naumenko, N.N. Potekaev // J. Antivir. Antiretrovir. - 2011. - V.3. - P. 4.

40. Потапова, A.A. Перспективы использования иммуночипов для диагностики инфекции, вызываемой вирусом гепатита С / A.A. Потапова, В.М. Дронова, Т.А. Чеканова, Г.А. Шипулин, M.JI. Маркелов, Е.А. Пудова, Н.В. Красун, Н.П. Кирдяшкина, Е.Б. Редченко, H.H. Потекаев // ЕвроАзиатская ассоциация дерматовенерологов: сборник тезисов 2-го Конгресса ЕАДД. - М„ 2012. -С.110.

41. Потапова, A.A. Частота и динамика распространения антител к вирусу гепатита С в различных контингентах г.Москвы / A.A. Потапова, В.М. Дронова, A.C. Гусев, A.M. Борисова, П.А. Ипатов, М.И. Ермолаева, O.A. Моденова, Н.В. Красун, Н.И. Сюч, С.И. Трифонов // Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики: материалы II Московского форума. - М., 2012. - С.54-55.

42. Потапова, A.A. Выявление антител к вирусу гепатита С: алгоритмы верификации в сложных случаях / A.A. Потапова, В.М. Дронова, М.М. Шульгина, Н.И. Сюч // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Междисциплинарные аспекты дерматовенерологии, косметологии и эстетической гинекологии». - М., 2013. - С. 27.

Научно-методическая литература:

Потапова, A.A. Иммунодиагностика вирусного гепатита С при массовых исследованиях в скрининговой лаборатории: руководство для практических врачей, ЦКМС ГОУ ВПО РГМУ // A.A. Потапова, Е.Б. Редченко, П.Г. Богуш, JI.B. Ковальчук. — Москва: Гипрософт, 2008. — 108 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

AJIT - аланинаминотрансфераза

Анти-Соге - антитела к Core- антигену вируса гепатита С

Анти-NS - антитела к комплексу NS антигенов вируса гепатита С

Ahth-NS3 - антитела к NS3 - антигену вируса гепатита С

Ahth-NS4 - антитела к NS4 - антигену вируса гепатита С

Анти-NSS - антитела к NS3 - антигену вируса гепатита С

Анти-ВГС — антитела к вирусу гепатита С

AT - антитело

АФП - альфа-фетопротеин

ВГС - вирус гепатита С

BJIKK - внутрилабораторный контроль качества ГС - гепатит С

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

ИБ - иммуноблот

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФТС - иммуноферментная тест-система

КП - коэффициент позитивности

ЛИА - линейный иммунный анализ

ЛПУ - лечебно-профилактические учреждения

ОГС - острый гепатит С

ОП - оптическая плотность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РФ - ревматоидный фактор

СРБ - С-реактивный белок

УЕ - условная единица

ХГЦ - хронический гепатит С

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Core - белок ядра вируса гепатита С

CV - коэффициент вариации

I g - иммуноглобулины

М±т - среднее с ошибкой определения среднего NS - неструктурный белок вируса гепатита С

Подписано в печать:

06.10.2015

Заказ № 10930 . Тираж - 80 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru