Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение механизма взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками иммунной системы периферической крови человека in vitro
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Оглавление диссертации Дьяконова, Вера Анатольевна :: 2004 :: Москва
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Иммуномодуляторы.
Классификация иммуномодуляторов.
Клетки-мишени для иммуномодуляторов.
Принципы иммуномодулирующей терапии.
Основные подходы к изучению иммуномодуляторов.
Полиоксидоний - иммуномодулятор нового поколения.
Синтез полиоксидония.
Первая стадия синтеза полиоксидония.
Вторая стадия синтеза полиоксидония.
Третья стадия синтеза полиоксидония.
Изучение физико-химических и биологических свойств полиоксидония.
Разработка технологии производства полиоксидония.
Доклинические испытания препарата полиоксидония.
Клинические испытания препарата полиоксидония.
Применение полиоксидония в медицине.
Фагоциты - основные клетки-мишени полиоксидония.
Нейтрофилы.
Мононуклеарные фагоциты.
Анализ функциональной активности фагоцитов.
Активация клетки.
Адгезивная активность фагоцитов.
Поглощение бактерий - собственно фагоцитоз.
Кислород-независимые механизмы бактерицидности.
Кислород-зависимые механизмы бактерицидности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Реактивы и оборудование.
Выделение лейкоцитов на желатине.
Подготовка образцов для цитометрического исследования взаимодействия ФИТЦ-меченого полиоксидония с лейкоцитами.
Подготовка лейкоцитов для исследования методом лазерной сканирующей конфокальной цитоспектрометрии.
Подготовка лейкоцитов для электронно-микроскопического исследования.
Продукция внутриклеточного кальция лейкоцитами.
Продукция внутриклеточной перекиси водорода лейкоцитами.
Выделение мононуклеаров на градиенте фиколла-пака.
Стимуляция МНК для продукции цитокинов.
Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа.
Оценка поглотительной активности фагоцитов.
Анализ внутриклеточного киллинга бактерий.
Анализ хемилюминесценции нейтрофилов.
Статистическая обработка результатов.
Использованные в работе компьютерные программы и компьютерные базы данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Взаимодействие полиоксидония с лейкоцитами периферической крови.
Зависимость взаимодействия от концентрации.
Динамика взаимодействия во времени.
Сравнение степени взаимодействия полиоксидония с перевиваемыми клеточными линиями.
Изучение проникновения полиоксидония в клетку.
Лазерная сканирующая конфокальная цитоспектрометрия.
Электронно-микроскопическое исследование.
Анализ активации клетки под влиянием полиоксидония.
Внутриклеточный кальций.
Внутриклеточная перекись водорода.
Продукция цитокинов под влиянием полиоксидония.
Синтез провоспалительных цитокинов ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-6 в культуре нестимулированных и стимулированных мононуклеаров.
Синтез интерферонов а и у в культуре нестимулированных и стимулированных мононуклеаров.
Влияние полиоксидония на фагоцитарное звено иммунитета.
Поглощение и киллинг St. aureus.
Хемилюминесценция лейкоцитов.
ВЫВОДЫ.
Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Дьяконова, Вера Анатольевна, автореферат
Актуальность темы диссертацииВ настоящее время наблюдается снижение иммунологической реактивности населения, что в целом приводит к повышению уровня острых и хронических инфекционных заболеваний, связанных с условно-патогенными и оппортунистическими инфекциями. На фоне подавленной иммунореактивности действие антибиотиков, а также противогрибковых, противовирусных и других химиотерапевтических препаратов зачастую является малоэффективным, поскольку их действие направлено на подавление размножения возбудителя заболевания, а конечная его элиминация зависит от факторов иммунитета. В связи с этим необычайно большой интерес врачей проявлен в отношении использования иммунокорригирующих препаратов в комплексной терапии больных с заболеваниями, характеризующимися вялым, рецидивирующим течением с устойчивостью к адекватной этиотропной терапии [Karaulov A.V., 1999; Wichmann G., 2002].
Для восстановления нормального функционирования иммунной системы следует применять только те препараты, которые зарегистрированы в России, как иммуномодуляторы. К препаратам, прошедшим клинические испытания и соответствующим требованиям Фармакологического государственного комитета России, предъявляемым к иммунотропным лекарственным средствам, относятся полиоксидоний, миелопид, тактивин, имунофан, ликопид, лейкинферон и некоторые другие [Пинегин Б.В., Сараф А.С., 2001].
Сейчас препаратом первого выбора для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы, является полиоксидоний (ПО) -высокомолекулярное физиологически активное соединение, обладающее иммуномодулирующей, антиоксидантной, детоксицирующей имембранстабилизирующей активностью. Полиоксидоний является одним из немногих отечественных и зарубежных иммунотропных препаратов, полностью соответствующих определению иммуномодуляторов. Это лекарственные средства, обладающие иммунотропной активностью, которые в терапевтических дозах восстанавливают функции иммунной системы (эффективную иммунную защиту) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000]. На протяжении 7 лет полиоксидоний успешноприменяется при лечении заболеваний, связанных с нарушением иммунной системы. Наряду с этим накапливается все больше информации по изучению биологического действия данного препарата в лабораториях и лечебных учреждениях.
Использование метода проточной цитометрии на сегодняшний день является наиболее информативным при изучении функционального состояния клеточных популяций, изменение которого анализируется при исследовании действия различных лекарственных веществ, в том числе и иммуномодуляторов. Преимущества проточной цитометрии - это возможность исследовать метаболизм и сигнальные пути отдельно взятой клетки, анализ большого числа клеток, а также высокая скорость, точность и простота постановки реакции [Tarnok А., 1996; Kobayashi Т. et al., 2004]. Дополнительное использование методов электронной микроскопии и конфокальной цитоспектрометрии позволяет определять локализацию изучаемого препарата в клетке и степень его накопления.
Цель работыЦелью работы явилось исследование механизма взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками периферической крови человека на клеточном и молекулярном уровнях in vitro.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:1. Определить уровень взаимодействия полиоксидония с клетками периферической крови здоровых доноров in vitro.
2. Изучить взаимодействие полиоксидония с перевиваемыми клеточными линиями U-937 и Jurkat in vitro.
3. Оценить проникновение иммуномодулятора в клетки периферической крови доноров.
4. Проанализировать процессы активации клетки под действием полиоксидония.
5. Изучить иммуномодулирующий эффект полиоксидония на продукцию провоспалительных цитокинов и интерферонов мононуклеарными клетками.
6. Исследовать воздействие полиоксидония на фагоцитарную функцию лейкоцитов периферической крови человека.
Научная новизнаВпервые изучена степень взаимодействия полиоксидония с лейкоцитами периферической крови человека во времени и в зависимости от концентрации с помощью флуоресцеина-изотиоцианат (ФИТЦ)-меченого препарата - ФИТЦ-ПО -методом проточной цитометрии. Показано, что ПО в наибольшей степени связывается с фагоцитами и в меньшей - с лимфоцитами, имея линейную зависимость от концентрации.
Впервые проведено сравнение взаимодействия полиоксидония с перевиваемыми клеточными линиями U-937 и Jurkat методом проточной цитометрии. Выявлено сходное поведение ПО в отношении моноцитарной и лимфоцитарной линий, как с лейкоцитами периферической крови: наибольшая интенсивность взаимодействия ПО с линией U-937.
Впервые установлено, что ПО проникает в клетки периферической крови с помощью методов электронной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной цитоспектрометрии. Фракция ПО <5 кД проникает в фагоциты в 1,7 раз более интенсивно, чем в лимфоциты. Показаны моменты захвата ПО, меченого коллоидным золотом, с поверхности фагоцита и внутриклеточная его локализация в везикуле в цитозоле клетки.
Впервые проведен анализ активации клетки под влиянием ПО. Мобилизация внутриклеточнго кальция из клеточных депо, определенная с помощью флуоресцентного красителя Fluo-З на проточном цитометре, не повышается под влиянием ПО. Продукция другого маркера активации клетки, внутриклеточной Н2О2, оцениваемой по индикаторному красителю дихлорфлуоресцеина диацетату (ДХФ-ДА) проточной цитометрией, была статистически достоверно повышена после часовой инкубации лейкоцитов с ПО.
Впервые изучен иммуномодулирующий эффект ПО на продукцию провоспалительных цитокинов интерлейкина (ИЛ)-1р, фактора некроза опухоли (ФНО)-а, ИЛ-6 и интерферонов а и у в культуре мононуклеаров in vitro. ПО оказывает стимулирующее действие на секрецию ИЛ-1(5 и ИЛ-6. Выявлено, что в отношении ФНО-а ПО проявляет истинный иммуномодулирующий эффект, снижая повышенные и повышая пониженные уровни цитокина.
Практическая значимость работыДетальное изучение механизма действия полиоксидония позволит практикующим врачам различных специальностей более целенаправленно применять иммуномодулятор с учетом патологии, касающейся определенного типа клеток, зная, какой эффект может оказывать иммуномодулятор на функции лейкоцитов. Полученные данные будут способствовать существенному улучшению эффективности лечения и профилактики всех видов заболеваний, при которых наблюдаются нарушения иммунной системы.
Результаты проведенных исследований проникновения ПО в клетку позволят провести анализ возможности создания антибиотика, конъюгированного с иммуномодулятором. Необходимость такого комплексного препарата была описана выше.
Предложенный в работе расширенный вариант изучения действия иммуномодулятора на клеточном и молекулярном уровнях позволит более детально подходить к изучению механизма действия новых иммунотропных препаратов in vitro.
Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение механизма взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками иммунной системы периферической крови человека in vitro"
выводы
1. С помощью проточной цитометрии установлено, что полиоксидоний в дозо-и время-зависимой степени взаимодействует с клетками иммунной системы, преимущественно с моноцитами и нейтрофилами по сравнению с лимфоцитами.
2. С помощью проточной цитометрии выявлено, что полиоксидоний значительно более интенсивно взаимодействует с моноцитарной клеточной линией U-937, чем с лимфоцитарной - Jurkat.
3. С помощью лазерной сканирующей конфокальной цитометрии установлено, что полиоксидоний >5 кД взаимодействует, но не проникает в клетки. Фракция полиоксидония с молекулярной массой <5 кД взаимодействует и проникает в лейкоциты. С помощью электронной микроскопии показано, что в лейкоциты полиоксидоний проникает путем эндоцитоза и находится в эндосомальных везикулах.
4. С помощью проточной цитометрии при использовании флуоресцентных
Л | красителей показано, что полиоксидоний не усиливает мобилизацию Са внутри клетки, однако повышает продукцию внутриклеточной перекиси водорода, с чем может быть связан процесс активации клетки.
5. При анализе иммуномодулирующего эффекта полиоксидония выявлено стимулирующее действие на продукцию цитокинов ИЛ-1р и ИЛ-6. На синтез ФНО-а полиоксидоний оказывает модулирующий эффект, повышая пониженные и понижая повышенные показатели синтеза цитокина.
6. Полиоксидоний повышает на 44%-75% способность убивать St. aureus, поглощенный лейкоцитами периферической крови как здоровых доноров, так и больных хронической грануломатозной болезнью.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2004 года, Дьяконова, Вера Анатольевна
1. Аверкиев B.JL, Тарасенко B.C., Латышева Т.В., Аверкиева Л.В. Коррекция иммунологических нарушений у больных с панкреонекрозом. Иммунология, 2002, №6, с.356-359.
2. Аршинова С.С., Пинегин Б.В., Стаханов В.А., Симонова А.В., Мазуров Д.В., Голубева Н.М., Перевезенцева Е.О. Иммуномодулятор полиоксидоний в комплексной терапии больных туберкулезом легких. Иммунология, 2001, №3, с.35-40.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.
4. Гординская Н.А., Пылаева С.И., Сидоркин В.Г., Аминев В.А. Влияние полиоксидония на уровень интоксикации у ожоговых больных. Иммунология, 2002, № 6, с.359-363.
5. Гришина Т.И., Ларина В.Н., Сускова B.C., Полякова И.Н., Рвачева А.В., Летынская Е.В. Применение полиоксидония в комплексной терапии ревматоидного артрита. Иммунология, 2002, № 6, с.365-370.
6. Дамбаева С.В. Новые подходы к оценке фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 2001.
7. Дейл М.М., Формена Дж. К. Руководство по иммунофармакологии. М.,1998.
8. Дударев И.В., Сизякина Л.П., Дюжиков А.А. Эффективность полиоксидония в экстракорпоральной терапии сепсиса у больных с врожденными пороками сердца. Иммунология, 2002, № 6, с.353-356.
9. Земсков A.M., Земсков В.М., Караулов А.В. Иммунная реактивность и генетические маркеры крови. М., 1999.
10. Земсков В.М., Земсков A.M. Принципы дифференцированной иммунокоррекции. Иммунология, 1996, №3, с.4-7.
11. Иванова А.С., Некрасов А.В., Горькова В. А. Выведение N-окиси полиэтиленпиперазина у крыс. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Методы индивидуализации и оптимизации применения лекарств на основе изучения их фармакокинетики", 1982, Тбилиси, с. 64.
12. Клиническая иммунология и аллергология, т.1, под ред. Л.Йегера. М., "Медицина", 1990.
13. Конопля А.И., Шатохин М.Н., Серегин С.П., Шестаков С.Г., Новиков А.В. Использование полиоксидония в комплексном лечении хронического простатита. Иммунология, 2002, № 6, с.379-382.
14. Коробова С.В. Иммунореактивность рекомбинантных белков ВИЧ: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2002.
15. Кузина Т.Н., Сизякина Л.П., Андреева И.И., Терновой М.В., Руденко И.Г. Иммуномодулирующие и микробицидные эффекты полиоксидония в терапии ВИЧ-инфекции. Иммунология, 2002, № 6, с.346-349.
16. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., Сибиряк С.В. Рациональное применение иммуномодуляторов. Методические рекомендации, Уфа, 1991, с. 21.
17. Мазуров Д.В. Разработка методов оценки поглотительной и бактерицидной функций фагоцитов периферической крови человека с использованием проточной цитофлюорометрии. Диссертация . канд. мед. наук. М., 2000.
18. Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии. Иммунология, 2000, №2, с.57-59.
19. Мазуров Д.В., Хамидуллина К.Ф., Пинегин Б.В. Оценка поглощения гранулоцитами и моноцитами периферической крови методом проточной цитометрии. Иммунология, 2000, №1, с.57-61.
20. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспективы. Иммунология, 2002, № 3, с.132-138.
21. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., "Медицина", 1993, т.2, с.192-193.
22. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. Казань, "Магариф", 1993.
23. Некрасов А.В. Механизм катионной полимеризации азотсодержащих циклов. Автореф. дис. канд. хим. наук. М., 1971.
24. Некрасов А.В., Иванова А.С., Пучкова Н.Г. Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани. Пат. РФ № 2112542, 1998.
25. Некрасов А.В., Пучкова Н.Г. Кинетика и механизм деструкции гетероцепных полимерных N-окисей. Высокомолек. соед., 1983, т. 25Б, №9, с. 691-696.
26. Некрасов А.В., Пучкова Н.Г. Полиоксидоний: основы синтеза и свойства. Иммунология, 2002, № 6, с.329-333.
27. Петров Р.В. Иммунореабилитация и стратегия медицины. Int. J. Immunorheabil., 1994, 1 Suppl., p.5-6.
28. Петров P.B., Кабанов B.A., Хаитов Р.В., Некрасов А.В., Атауллаханов Р.И. Конъюгированные полимер-субъдиничные иммуногены и вакцины. Иммунология, 2002, № 6, с.324-329.
29. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов P.M., Некрасов А.В. Протективная эффективность конъюгатов бактериальных антигенов с синтетическими полиэлектролитами. Доклады АН СССР, 1983, т. 270, №5, с.1257-1260.
30. Петров Р.В., Хаитов P.M., Некрасов А.В., Атауллаханов Р.И., Пинегин Б.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С. Полиоксидоний иммуномодулятор последнего поколения: итоги трехлетнего клинического применения. Аллергия, астма и клин, иммунол., 1999, №3, с.3-6.
31. Петров Р.В., Хаитов P.M., Некрасов А.В., Атауллаханов Р.И., Пучкова Н.Г., Иванова А.С., Пинегин Б.В., Кулаков В.В., Климова С.В.,
32. Хамиддулина К.Ф., Мазуров Д.В., Дамбаева С.В. Полиоксидоний препарат нового поколения иммуномодуляторов с известной структурой и механизмом действия. Иммунология, 2000, №5, с.24-28.
33. Пинегин Б.В., Андронова Т.М. Некоторые теоретические и практические вопросы клинического применения иммуномодулятора ликопида. Иммунология, 1998, №4, с.60-67.
34. Пинегин Б.В., Ильина Н.И., Латышева Т.В., Лусс Л.В., Сетдикова Н.Х., Шульженко А.Е., Феденко Е.С., Варфоломеева М.И. Клинические аспекты применения имуномодулятора полиоксидония. Методическое пособие для врачей. М., ФГУП "Медсервис", 2002.
35. Пинегин Б.В., Сараф А.С. Механизм действия и клиническое применение отечественного иммуномодулятора полиоксидония. М., "ИММАФАРМА", 2001.
36. Пинегин Б.В., Сараф А.С. Отечественный иммуномодулятор «Полиоксидоний»: механизм действия и клиническое применение. М., "ИММАФАРМА", 2000.
37. Пучкова Н.Г., Некрасов А.В., Разводовский Е.Ф., Эльцефон Б.С. Синтез и свойства полимерных алифатических N-окисей. Высокомолек. соед., 1980, т. 17А, №6, с. 1281-1285.
38. Разводовский Е.Ф., Берлин Ал.Ал., Некрасов А.В., Пущаева Л.М., Пономаренко А.Н., Пучкова Н.Г., Ениколопян Н.С. Механизм полимеризации азотсодержащих циклов. Высокомолек. соед., 1973, т. 15А, №10, с.2219-2232.
39. Резник И.Б. Современное состояние вопроса о первичных иммунодефицитах. Педиатрия, 1996, №2, с.4-14.
40. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., "Мир", 2000.
41. Романова А.В., Латышева Т.В., Применение полиоксидония в комплексной терапии больных с тяжелой формой бронхиальной астмы. Иммунология, 2002, № 6, с.372-376.
42. Сибиряк С.В, Строкин Ю.В., Садыков Р.Ф., Дианов В.М. Иммунотропная активность производных азолов и их конденсированных гетероциклических систем (обзор). Хим.-фарм. журнал, 1990, №11, с.11-24.
43. Сибиряк С.В. Иммуностимуляторы и аутоиимунитет. Фармакология и токсикология, 1990, № 3, с.67-72.
44. Сибиряк С.В., Садыков Р.Ф., Магазов Р.Ш., Сергеева С.А. Иммуномодуляторы. Справочник для практических врачей. Уфа, 1999.
45. Хаитов Р.М., Некрасов А.В. Синтез искусственных иммуногенов. Иммунология, 1987, № 5, с.99-106.
46. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунодефициты: диагностика и иммунотерапия. Лечащий врач, 1999, № 2-3, с.63-69.
47. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Вторичные иммунодефициты: клиника, диагностика, лечение. Иммунология, 1999, N1, с. 14-17.
48. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные принципы иммуномодулирующей терапии Аллергия, астма и клин, иммунол., 2000, N1, с.9-16.
49. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения. Иммунология, 2000, N5, с.4-8.
50. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекции. Иммунология, 2000, №1, с.7-13.
51. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов К.А. Экологическая иммунология. М., ВНИРО, 1995.
52. Хоменко А.Г. Туберкулез вчера, сегодня, завтра. Проблемы туберкулеза, 1997, №2, с.9-11.
53. Шанурин С.Ю., Белевская Р.Г., Фонина Л.А., Михайлова А.А. Сравнительное изучение иммунорегуляторной активности миелопептида-1 имиелопептида-2, входящих в состав препарата "Миелопид". Иммунология, 1996, №4, с.21-23.
54. Шульженко А.Е. Клиническая эффективность и безопасность применения полиоксидония в лечении хронической неспецифической вирусной инфекции, вызванной вирусами простого герпеса. Иммунология, 2002, №6, с.349-353.
55. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. М., " Медицина ", 1999.
56. August A., Dupont B. Association between mitogen-activated protein kinase and the zeta chain of the T cell receptor (TcR) with the SH2,3 domain of p561ck. J. Biol. Chem., 1996, v.271, N17, p.10054-10059.
57. Bass D.A., Parce J.W., Dechaitelet L.R., Szejda P., Seeds M.C., Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neurtophils: a graded response to membrane stimulation. J. Immunol., 1983, v.130, N4, p.1910-1917.
58. Belardeli F. Role of interferons and others cytokines in regulation of the immune respons. APMIS, 1995, v.103, N 3, p.161-179.
59. Berninghausen O., Leippe M. Necrosis versus apoptosis as the mechanism of target cell death induced by Entamoeba histolytica. Infect. Immun., 1997, v.65, p.3615-3621.
60. Berridge M.J., Irvine R.F. Inositol triphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction. Nature, 1984, v. 312, p.315.
61. Borregaard N., Kjeldsen L., Lollike K., Sengelov H. Granules and secretory vesicles of the human neutrophil. J.Clin. Exp.Immunol., 1995, v.101, p.6-9.
62. Boyum A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 1968, v.97, p.31-50.
63. Burchiel S.W., Edwards B.S., Kuckuck F.W., Lauer F.T., Prossnitz E.R., Ransom J.T., Sclar L.A. Analysis of free intracellular calcium by flow cytometry:multiparameter and pharmacological applications. Methods, 2000, N21, p.221-230.
64. Choo M., Hunt Т., Hussain M. Hydrogen peroxide stimulates macrophage vascular endothelial growth factor release. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol,2001, v.280, p.H2357-H2363.
65. Collins J.M., Klecker R.W., Katki A.G. Clin. Cancer Res., 1999, v.5, p.1976-1981.
66. Cornelissen M., Philippe J., De Sitter S., De Ridder L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: an electron microscopic evaluation. Apoptosis, 2002, v.7, N1, p.41-7.
67. Dabrowski M.P., Stankiewicz W., Plusa Т., Chcialowski A., Szmigielski S. Competition of IL-1 and IL-lra determines lymphocyte response to delayed stimulation with PHA. Mediators Inflamm., 2001, v.10, N3, p. 101-7.
68. Darley-Usmar V., Wiseman H. Nitric oxide and oxygen radical: a question of balance. FEBS Letters, 1995, v.369, p.131-135.
69. Davey P.C., Zuzel M., Kamiguti A.S., Hunt J.A., Aziz K.A. Activation-dependent proteolytic degradation of polymorphonuclear CD lib. Br. J. Haematol., 2000, v.lll, N3, p.934-42.
70. Diasio R., LuBuglio A. Immunomodulators: Immunosupressive Agents and Immunostimulants. In. Goodman & Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9-th Ed., McGraw-Hill, 1996, p.1289-1309.
71. Eeden S.F., Klut M.E., Walker B.A.M., Hogg J.C. The use of flow cytometry to measure neutrophil function. J. of Immun. Meth., 1999, v.232, p.23-43.
72. Erlandsen S.L., Magney J.E. Color atlas of histology. USA, M osby-Year В ook, 1999.
73. Evans T.J., Buttery L.D.K., Carpenter A., Springall D.R., Polak J.M., Cohen J. Cytokine-treated human neutrophils contain inducible nitric oxide synthase that produces nitration of ingested bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, p.9553-9558.
74. Feofanov A., Charonov S., Kudelina I., Fleury F., and Nabiev I. Localization and Molecular I nteractions of Mitoxantrone Within Living K562 Cells as probed by Confocal Spectral Imaging Analysis. Biophys. J., 1997, v. 73, p.3317-3327.
75. Galanina О., Feofanov A., Tuzikov А. В., Rapoport E., Crocker P. R., Grichine L., Egret-Charlier M., Vigny, Pendu J. Le and Bovin N. V. Fluorescent Carbohydrate Probes for Cell Lectins. Spectrochimica Acta, 2001, v.57, p.2285-2296.
76. Gauthier M., Girard D. Activation of human neutrophils by chlordane: induction of superoxide production and phagocytosis but not chemotaxis or apoptosis. Hum. Exp. Toxicol., 2001, v.20, N.5, p.229-35.
77. Gibson S., August A., Branch D., Dupont В., Mills G.M. Functional LCK is required for optimal CD28-mediated activation of the TEC family tyrosine kinase EMT/ITK. J. Biol. Chem., 1996, v.271, N14, p.7079-7083.
78. Goasduff Т., Darcissac E.C., Vidal V., Capron A., Bahr G.M. The transcriptional response of human macrophages to murabutide reflects a spectrum of biological effects for the synthetic immunomodulator. Clin. Exp. Immunol., 2002, v. 128, N3, p.474-82.
79. Goding J.W. Conjugation of antibodies with fluorochromes: modification to the standard methods. J. Immunol. Methods., 1976, v. 13, N3-4, p.215-26.
80. Hadden J. Immunostimulants. Immunol. Today, 1993, v. 14, p.275-280.
81. Hamada M., Honda J., Yoshimuta Т., Fumimori Т., Okamoto M., Aizawa H. Fosfomycin inhibits neutrophil function via a protein kinase C-dependent signaling pathway. Int. Immunopharmacol., 2002, v.2, N4, p.511-8.
82. Hensley K., Robinson K.A., Gabbita S.P., Salsman S., Floyd R.A., Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury. Free Radical Biology & Medicine, 2000, v.28, N10, p. 1456-1462.
83. Jagannath С., Actor J.L., Hunter R.L. Induction of nitric oxide in human monocytes and monocyte cell lines by Mycobacterium tuberculosis. Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 1998, v.2, N3, p.174-186.
84. Janssen-Heininger Y.M., Poynter M.E., Baeuerle P.A. Recent advances towards understanding redox mechanisms in the activation of nuclear factor кВ. Free Radical Biology & Medicine, 2000, v.28, N9, p. 1317-1327.
85. Jensen K.D., Nori A., Tijerina M., Kopeckova P., Kopecek J.Cytoplasmic delivery and nuclear targeting of synthetic macromolecules. J. Control Release, 2003, v.87, N1-3, p.89-105.
86. Johnston R.B. Clinical aspects of chronic granulomatous disease. Curr. Opin. Hematol., 2001, v.8, N1, p. 17-22.
87. Kamata H., Manabe Т., Oka S., Kamata K., Hirata H. Hydrogen peroxide activates IkappaB kinases through phosphorilation of serine residues in the activation loops. FEBS Lett., 2002, v.519, N1-3, p.231-237.
88. Karaulov A.V. Immunotherapy and Immunorehabilitation in Clinic of Internal Diseases. Russ. J. Immunol., 1999, v.4, N4, p.315-318.
89. Kelso A. Cytokines: principles and prospects. Immunol. Cell Biol., 1998, v.76, p.300-317.
90. Kim D., Cho E., Seong J., Um H.-D. Adaptive concentration of hydrogen peroxide suppress cell death by blocking the activation of SAPK/JNK pathway. J. of Cell Science, 2001, v.l 14, p.4329-4334.
91. Kobayashi Т., Yoshizaki G., Takeuchi Y., Takeuchi T. Isolation of highly pure and viable primordial germ cells from rainbow trout by GFP-dependent flow cytometry. Mol. Reprod. Dev., 2004, v.67, N1, p. 91-100.
92. Kolanus W., Nagel W., Schiller В., Zeitlmann L., Godar S., Stockinger H., Seed B. alphaLbeta2 integrin/LFA-1 binding to ICAM-1 induced by cytohesin-1 a cytoplasmic regulatory molecule. Cell, 1996, v.86, N2, p.233-242.
93. Kotanides H., Reich N.C. Interleukin-4-induced STAT6 recognizes and activates a target site in the promoter of the interleukin-4 receptor gene. J. Biol. Chem., 1996, v.271, N41, p.25555-25561.
94. Lammas S., Marsden P.A., Li G.K., Tempst P., Michel T. Endotelial nitric oxide synthase: molecular cloning and characterisation of a distinct constitutive enzyme isoform. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1992, v.89, p.6348-6352.
95. Lara L.L., Rivera H., Perez-P C., Blanca I., Bianco N.E., De Sanctis J.B. Low density lipoprotein receptor expression and function in human polymorphonuclear leucocytes. Clin. Exp. Immunol., 1997, v. 107, N1, p.205-12.
96. Model M.A, KuKuruga M.A. et al. A sensitive flow cytometryc method for measuring the oxidative burst. J. of Immunol. Meth., 1997, v.202, p. 105-111.
97. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and human promotion. Nature, 1984, v.308, p.693.
98. Noti J.D., Reinemann B.C., Johnson A.K. The leukocyte integrins are regulated by transcriptional and post-transcriptional mechanisms in a leukemic cell that overexpresses protein kinase C-zeta. Int. J. Oncol., 2001, v.19, N6, p.1311-8.
99. Ormerod M.G. Flow cytometry. Oxford, University press, 2000.
100. Petrov R.V., Khaitov R.M., Ataullachanov R.I. Artificial antigens and vaccines based on non-natural polyelectrolytes. In: Immunology reviews. Harwood Acad. Publ., 1987, N1, p.241-443.
101. Petrov R.V., Khaitov R.M., Nekrasov A.V., et al. Influenza virus antigens conjugated with a synthetic polyelectrolytes: a novel model of vaccines. Vaccine, 1985, v.3, N5, p.392.
102. Ponton A., Clement M.V., Stamenkovic I. The CD95 (APO-l/Fas) receptor activates NF-kappaB independently of its cytotoxic function. J. Biol. Chem., 1996, v.271, N15, p.8991-8995.
103. Rippe В., Rosengren B.I., Carlsson O., Venturoli D. Transendothelial transport: the vesicle controversy. J Vase. Res., 2002, v.39, N5, p.375-90.
104. Roos D., Van Bruggen R. Genetic analysis of patients with chronic granulomatous disease: insights in a clinical situation. Centr. Eur. J. Immunol., 2000, v.25, N3, p.106-112.
105. Saresella M., Roda K., Speciale L., Taramelli D., Mendozzi E., Guerini F., Ferrante P. A flow cytometric method for the analysis of phagocytosis and killing by polymorphnuclear leukocytes. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1997, v.832, p.53-61.
106. Siedlar M., Mytar В., Krzeszowiak A., Baran J., Hyszko J., Ruggiero I., Wieckiewicz J., Stachura J., Zembala M. Demonstration of iNOS-mRNA andiNOS in human monocytes stimulated with cancer cells in vitro. J. Leukoc. Biol., 1999, v.65, N5, p.597-604.
107. Springer T.A. Adgesion receptors of the immune system. Nature, 1990, v.346, N6283, p.425-34.
108. Stivens A., Lowe J. Histology. England, Mosby-Year Book Europe, 1993.
109. Tamir S., Tannenbaum H. The role of nitric oxide in cancerogenic process. Biochem. and Biophysical Acta., 1996, v.1288, p.31-36.
110. Tarnok A. Improved kinetic analysis of cytosolic free calcium in pressure-sensitive neuronal cells by fixed-time flow cytometry. Cytometry, 1996, v.23, N1, p.82-9.
111. Treska V., Kocova J., Boudova L., Neprasova P., Topolcan O., Pecen L., Tonar Z. Inflammation in the wall of abdominal aortic aneurysm and its role in the symptomatology of aneurysm. Cytokines Cell. Mol. Ther., 2002, v.7, N3, p. 91-7.
112. TsukaharaY., Morisaki Т., Kojima M., Uchijama A., Tanaka M. iNOS expression by activated neutrophils from patients with sepsis. Aust. N. Z. J. Surg., 2000, v.71, N1, p.15-20.
113. Vazquez-Torres A., Jones-Carson J., Balish E. Peroxynitrite contributes to the candidacidal activity of nitric oxide-producing macrophages. Infect. Immun, 1996, v.64, N8, p.3127-3133.
114. Wang X.-T., McCullough K., Wang X.-J., Carpenter G., Holbrook N. Oxidative stress-induced phospholipase C-yl activation enchances cell survival. J. of Biol. Chem., 2001, v.276, N30, p.28364-28371.
115. Weinberg J., Misukonis M. Human mononuclear phagocyte inducible nitric oxide synthase (iNOS): analysis of iNOS, mRNA, iNOS protein, biopterin, and nitric oxide production by blood monocyte. Blood, 1995, v.86, N3, p. 1184-1195.
116. Wichmann G., Herbarth ОLehmann I. The mycotoxins сitrinin, gliotoxin, and patulin affect interferon-gamma rather than interleukin-4 production in human blood cells. Environ. Toxicol., 2002, v. 17, N3, p.211-8.
117. Zeman K., Banasik M., Scopczynska H., Pokoca L., Bernatowska E. Contemporary diagnostics of chronic granulomatous disease. Centr. Eur. J. Immunol., 2000, v.25, N3, p.113-118.