Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Новые подходы к оценке фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности

На правах рукописи

РГБ ОД

11 ФЕВ 2002

ДАМБАЕВА Светлана Владимировна

йовые подходы к оценке фагоцитоза

при Различных видах иммунологической

^ недостаточности

14.00.36- Аллергология и иммунология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

¿Р-

Москва 2001

Работа выполнена в Институте иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Б.В.Пинегин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин доктор медицинских наук, профессор ВЛ.Гергерт

Ведущая организация — Российский государственный медицинский университет

С - •- . г

Защита диссертации состоится ■ \ ^¿с^-с^ -С 200 \г. в 14 часов

на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в Институте

иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ по

адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ

Автореферат разослан__200_г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Л,С.Сославши

Общая характеристика работы

Актуальность темы диссертации.

Одной из главных задач клинической иммунологии является диагностика нарушенного звена иммунной системы, в том числе и фагоцитарной. Все основные системы иммунитета задействованы в защите организма против инфекционных агентов - Т-лимфоциты и NK-клетки, фагоциты, иммуноглобулины и комплемент. Элиминация возбудителя осуществляется общими «усилиями» и все-таки одно из центральных мест в конечном этапе противоинфекционной защиты - киллинге микробных агентов и их разрушении - занимает фагоцитоз.

Первичная иммунологическая недостаточность нередко характеризуется яркой клинической картиной, однако только комплексное исследование фагоцитарного звена иммунитета является основополагающим при диагностике таких врожденных иммунодефицитов, как хроническая гранулематозная болезнь, синдром Чедиака-Хигаси, LAD (Leukocyte Adhesion Deficient), дефицит миелопероксидазы (Ю.Е.Вельтищев, 1996, D. Roos, et al., 2000) и др.

Изучение фагоцитарного звена иммунитета при вторичной иммунологической недостаточности, доминирующей формой которой является спонтанная (P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1999), необходимо для выяснения степени его нарушения и причинно-следственной роли фагоцитарных факторов иммунной защиты в развитии иммунодефицита. Важно установить причины нарушения фагоцитоза, они могут быть как внутренними, обусловленными дефектом самих фагоцитов, так и внешними. К последним можно отнести факторы, активирующее действие которых является необходимым для полноценного функционирования фагоцитов, например, Т-лимфоциты и продуцируемые ими цитокины.

В клинической практике изучение фагоцитоза чаще всего сводится к анализу поглотительной активности клеток фагоцитов, причем особого внимания выбору мишени фагоцитоза не уделяется. Другими распространенными методами являются исследования кислородного «взрыва» с помощью НСТ-теста и хемилюминесценции. Ключевой функциональный тест фагоцитарных клеток - киллинг захваченных микробов - проводится микробиологическим методом, с подсчетом выживших после фагоцитоза микробов по числу колоний. Метод не имеет широкого распространения, так как является трудоемким и продолжительным по времени выхода результата.

В настоящее время прочные позиции во всех областях науки, где проводятся работы по исследованию структуры и функции клеточных популяций, завоевывает проточная цитофлюорометрия. Использование проточной цитофлтоорометрии в иммунологии дает возможность оценки практически всех параметров иммунного статуса, включая и фагоцитарное звено (S.F. van Eeden, 1999, D.A. Bass et al., 1983, M. Saresella et al., 1997).

Применение цитометрических методов исследования к оценке основных этапов фагоцитоза - это получение более объективной информации о состоянии фагоцитарных клеток. Среди неоспоримых преимуществ проточной цитометрии - возможность исследовать метаболизм ' отдельно взятой клетки, анализ очень большого числа клеток, наконец, высокая скорость, точность, простота постановки реакции и быстрое - получение результата. В этом направлении уже сделаны большие успехи по разработке и внедрению методов оценки поглощения стафилококка и

• бактерицидности - внутриклеточного киллинга стафилококка (Мазуров Д.В., 2000) - пиогенного (внеклеточного) микробного агента.

< В связи с этим, целью работы явилась разработка новых -•■ цитофлюорометрических методов к оценке фагоцитарного звена иммунитета и изучение фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности на новом методическом уровне с использованием

• проточной цитофлюорометрии.

Задачи исследования.

1. Разработать метод оценки уровня активных форм кислорода в фагоцитарных клетках крови человека во время респираторного «взрыва» с использованием проточной цитофлюорометрии.

2. Разработать метод оценки поглощения и киллинга фагоцитами крови человека грибкового микробного возбудителя на примере Candida albicans с использованием проточной цитофлюорометрии.

3. Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с первичными иммуподефицитными состояниями.

4. Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научная новизна.

Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов тесты оценки уровня внутриклеточной перекиси, водорода в гранулоцитах и моноцитах периферической крови, отражающие интенсивность кислородного «взрыва» в этих клетках, с применением специальных индикаторных красителей ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии. Отработаны варианты тестов как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии.

Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов

• методики оценки поглощения и киллинга ФИТЦ-меченой C.albicans нейтрофилами и моноцитами крови человека с помощью проточной цитофлюорометрии для цельной крови (киллинг) и для выделенной лейкоцитарной суспензии (поглощение и киллинг).

Впервые проведено комплексное исследование состояния фагоцитарной системы у детей с ХГЪ, в том числе с анализом бактерицидной и-фунгицидной активности фагоцитов и анализом уровня продукции активных форм кислорода в отдельно взятых фагоцитарных клетках. Показаны возможности цитометрического метода оценки продукции активных форм кислорода для выявления Х-сцеплениых вариантов наследования болезни.

При исследовании влияния полиоксидония на бактерицидную функцию фагоцитов in vitro впервые были получены данные о значительном стимулирующем свойстве этого иммуномодулятора - в присутствии полиоксидония внутрифагоцитарный киллинг бактерий возрастает на 50100%. Эффект полиоксидония, выявленный при исследовании фагоцитарных клеток здоровых людей, в полной мере проявляется и в отношении НАДФН-оксидаза дефектных фагоцитов крови больных ХГБ. При этом показатели бактерицидности у больных ХГБ достигают нормативных значений.

Проведено комплексное изучение фагоцитарного звена иммунитета ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси и выявлены значительные дефекты в продукции активных форм кислорода и бактерицидности фагоцитов. Впервые обнаружено, что поглотительная активность фагоцитов крови больного в отношении стафилококка сопровождается апоптозом самих нейтрофилов, а опсонизация бактерий значительно увеличивает процент апоптоза фагоцитов.

Впервые использован цитометрический подход к исследованию основных показателей фагоцитоза у больных с вторичными иммунодефицитами. Выявлено, что для больных хроническим рецидивирующим фурункулезом характерно снижение бактерицидных качеств фагоцитарных клеток крови, а фагоцитарные клетки больных туберкулезом легких отличаются сниженными фунгицидными качествами (способностью убивать грибковые микробные агенты).

Практическая значимость работы.

Метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода (ДХФ-ДА и ДГР 123 тесты) с помощью проточной цитофлюорометрии разработан в виде микрометодов как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии, и подтвержден хемилюминесцентным анализом. Метод высокочувствительный, позволяет выявлять все клетки с дефектом НАДФН-оксидазы, например, при ХГБ, а также гетерозиготное носительство при X-сцегшенном варианте наследования этой патологии. Набраны нормативные показатели. Тесты просты в исполнении и могут использоваться для поточных исследований.

Для поточных исследований подготовлены и методы оценки поглощения и киллинга C.albicans с помощью проточной цитофлюорометрии. Набраны нормативные показатели по анализам здоровых людей. Метод оценки поглощения C.albicans пригоден для

постановки как в цельной крови, так и с выделенной лейкоцитарной суспензией.

На примере различных патологий показана возможность исследования фагоцитоза с помощью проточной цитофлюорометрии и диагностики нарушенного звена фагоцитарной системы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование индикаторных красителей ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать уровень внутриклеточной перекиси водорода в отдельно взятой фагоцитарной клетке. Метод можно использовать для диагностики ХГБ и выявления гетерозиготного носительства при Х-сцепленном варианте ХГБ.

2. Использование живой и фиксированной ФИТЦ-меченой С.albicans и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать соответственно фунгицидную активность и поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов.

3. Применение цитофлюорометрических подходов к оценке функциональной активности фагоцитарных клеток позволяет провести комплексную оценку фагоцитарного звена при различных видах иммунологической недостаточности, в том числе первичных иммунодефицитах - ХГБ и синдроме Чедиака-Хигаси и вторичных иммунодефицитах - хроническом рецидивирующем фурункулезе и туберкулезе легких.

4. Под влиянием иммуномодулятора полиоксидония значительно повышается бактерицидная активность фагоцитарных клеток in vitro

Публикации по теме диссертации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и 1 работа принята к печати. Результаты доложены на 4-ом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» 29-31 мая 2001г., Москва.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 114 источников. Работа содержит 19 таблиц, 19 рисунков и 9 приложений в виде таблиц.

Содержание работы 1. Материалы и методы исследования

Характеристика обследованных групп населения. В процессе работы обследовано 139 человек. 85 человек относятся к группе доноров, 13 больных туберкулезом, 23 больных рецидивирующим фурункулезом, 10 детей, страдающих ХГБ, матери детей больных ХГБ - 7 человек, 1 ребенок с синдромом Чедиака- Хигаси.

В группу доноров включены лица в возрасте от 19 до 60 лет, не имеющие хронических заболеваний и добровольно согласившиеся на сдачу крови.

Группу больных рецидивирующим фурункулезом составили лица с течением болезни как в стадии ремиссии, так и в стадии обострения. Возраст больных от 19 до 56 лет, в среднем - 37 лет.

Из больных туберкулезом легких у одного фиброзно-кавернозная форма, у 12 - инфильтративная. Бацилловыделение наблюдалось у 4 больных. "У двух больных хроническая форма заболевания - длительность течения болезни 1,5 года и больше. У остальных больных туберкулезом легких продолжительность болезни составляет около трех месяцев. Средний возраст больных был 39 лет с разбросом от 18 до 63 лет. Все больные были одного пола - мужчины.

Среди больных хронической гранулематозной болезнью 8 детей -мальчики и 2 ребенка - девочки. Возраст больных - от 4,5 лет до 16 лет. Два ребенка - сибсы. У 8 детей было проведено обследование их матерей, которые в свою очередь не имели тяжелых хронических заболеваний.

Больной с синдромом Чедиак-Хигаси - мальчик 4-х лет. Диагноз больному был поставлен на основании клинической картины и гематологического обследования (гранулоцитарные клетки периферической крови ребенка содержат аномальные гигантские азурофильные гранулы).

Методика исследований. Вся работа проводилась на образцах венозной крови. Для постановки анализов использовали и цельную кровь, и лейкоцитарную суспензию, полученную после спонтанной седиментации эритроцитов в среде с 1% желатиной.

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью системы сбора и анализа статистических данных Statistica v5.5a. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Обработку данных, полученных в виде файлов программного обеспечения Mackintosh, осуществляли в операционной среде Wiiidows-98 с помощью прикладной программы Win MDI 2,0 Microsoft.

2. Результаты исследовании и их обсуждение.

2.1. Разработка метода оценки внутриклеточной перекиси водорода а фагоцитарных тетках периферической крови с использованием проточной цитофчюорометрии.

Цитофлюорометрический подход к оценке кислородного «взрыва» в фагоцитарных клетках имеет ряд неоспоримых преимуществ по сравнению с традиционными методами исследования, среди которых в первую очередь это возможность исследовать метаболический ответ отдельно взятой клетки. Другой предпосылкой разработки такого подхода явилось отсутствие в России соответствующих методов оценки «взрыва» наряду с быстро растущим интересом в нашей стране к проточной цитометрии.

Соединения флюоресцсина, родамина и различных других агентов с заблокированными флюоресцирующими свойствами используются в виде индикаторов активных форм (X Эти вещества обладают свойством пассивно проникать сквозь плазматическую мембрану лейкоцитов и после обработки внутриклеточными эстеразами переходят в полярные соединения, неспособные диффундировать обратно из клетки. А результатом взаимодействия индикатора с определенными СЬ-радикалами является «разблокировка» флюоресцентных качеств красителя.

Для отработки доступного метода оценки СЬ-«взрыва» с помощью проточного питометра FACSCalibur нами были отобраны дихлорофлюоресцсина диацетат (ДХФ-ДА) и дигидрородамин 123 (ДГР 123), характеризующиеся подходящим (для этого прибора) спектром возбуждения Есхси =488 им и сходными спектрами эмиссии для сравнения. Так как условием флюоресценции этих красителей является наличие внутри клетки ] ЬСЬ, то можно говорить о ДХФ-ДА и ДГР 123 как об индикаторах внутриклеточной Н2О2. В основу разработки доступных способов оценки 02-«взрыва» были взяты методы Bass DA. et al., 1983, для теста с ДХФ-ДА и Emmendorffer A. et al, 1990, для теста с ДГР 123. Мы адаптировали эти методы для проведения анализов в микрообъемах и с неразделенной фракцией лейкоцитов или цельной кровью.

Дм поточных исследований существенным является возможность постановки реакции в цельной крови. Однако в случае с ДГР 123 лизис эритроцитов, предшествующий непосредственно цитометрическому анализу был затруднен. В результате серии экспериментов нами был выявлен еще ряд преимуществ ДХФ-ДА: 1) очень экономичное расходование, 2) стабильность (хранится при +4°С более 3-х месяцев без изменения флюоресцирующих свойств) и 3) возможность применения в цельной крови, поэтому вся основная работа проводилась с ДХФ-ДА красителем.

Приводим окончательный вариант протокола теста с ДХФ-ДА для лейкоцитарной суспензии. Постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных планшетах в объеме 200 мкл. Клетки (0,2-106) инкубировали с 5 мкМ ДХФ-ДА в присутствии 5 мМ азида натрия в течение 20 мин. при

37°С. Затем в опытную пробу (стимулированную) вносили ФМА (конечная концентрация 10 нг/мл) и 0,02мг/мл ЭДТЛ, в контрольную (спонтанную) пробу только ЭДТА. После 30 мин. инкубации при 37°С клетки осаждали, выдерживали 5 мин. в лизирующем эритроциты растворе, лейкоциты отмывали и ресуснендировали в ФСБ для анализа на проточном цитометре.

А. Б.

Моноциты

ФМА

Лимфоциты ФШ

10" 10* 1СГ 10> 10* FL1-H

в. г.

Рис.1. Цитофлюорограммы ДХФ-ДА теста. А - Dot Plot FSC/SSC, где R1 -нейтрофилы, R2 - моноциты, R3 - лимфоциты. Б, В, Г - гистограммы свечения ДХФ-ДА-меченых лейкоцитов крови. По оси абсцисс -интенсивность флюоресценции клеток, по оси ординат - относительная частота встречаемости. ФМА применялся в дозе 10 нг.

Анализ образцов на проточном цитофлюориметре FACSCalibur. В окне Dot Plot по двум параметрам PI (FSC) и Р2 (SSC) выделяли облака нейтрофилов (R1), моноцитов (R2) и лимфоцитов (R3). На экран выводили гистограммы по FL1 для Rl, R2, R3, отражающие интенсивность свечения этих клеток в зеленой области спектра. Настройку усилителя по FL1 устанавливали таким образом, чтобы интенсивность свечения нефлюоресцирующих лимфоцитов была в интервале от 1 до 10 единиц. В результате анализа проб получали показатели спонтанной флюоресценции,

стимулированной флюоресценции и рассчитывали коэффициент стимуляции отдельно для нейтрофилов и моноцитов. В каждом образце анализировали не менее 2000 нейтрофилов. На рнс.1 представлена цитофлюорограмма ДХФ-ДА. теста, где спонтанное (изначальное) свечение меченых ДХФ-ДА клеток показано в виде заштрихованных пиков.

Дтя индукции респираторного «взрыва» мы применяли классический агент - ФМА. Известно, что его действие связано с непосредственной активацией протеинкиназы С, одного из ключевых ферментов различных метаболических звеньев клетки. Интенсивность свечения меченых ДХФ-ДА или ДГР 123 нейтрофилов после добавления ФМА резко возрастала (более чем в 10 раз). На рис. 1 можно видеть, как сдвигается пик флюооресценции в НАДФН-оксидаза позитивных клетках. Оптимальную дозу ФМА для стимуляции кислородного «взрыва» в фагоцитах для цельной крови (100 нг) и для лейкоцитарной суспензии (10-100 нг) подбирали отдельно, чтобы получить достаточно сильный и менее вариабельный ответ. На рис.2 приведен график зависимости коэффициента стимуляции нейтрофилов от концентрации ФМА при постановке ДХФ-ДА теста в цельной крови.

ФМА

Рис.2. Влияние различных доз ФМА на уровень внутриклеточной Н2О2 при постановке ДХФ-ДА-ДА теста в цельной крови. Значение каждой точки представляет среднее нескольких экспериментов; п = 8, 5, 8, 11 и 5 соответственно для доз ФМА - 1, 10, 50, 100 и 200 нг.

По окончательному варианту ДХФ-ДА и ДГР 123 тестов для оценки внутриклеточных кислородных радикалов нами было обследовано 38 доноров, результаты этих анализов представлены в табл.1. Относительная вариабельность в захвате и гидролизе ацетата с ДХФ-ДА может вносить изменения в окончательную флюоресценцию клеток. Подобная зависимость от эстеразной активности отмечается и при применении других красителей (Э.Тл'ап Еедеп eí а)., 1999, А.ЕттепдогГкг е( а!., 1990, М.АМоМ & а1., 1997). Тем не менее, при обработке полученных данных были установлены весьма конкретные пределы разброса значений спонтанной и стимулированной флюоресценции и коэффициента стимуляции (к) при

определенной дозе ФМЛ. В большинстве работ указывают именно среднюю интенсивность флюоресценции, хотя возможен и подсчет количества молей ДХФ на клетку, однако требующий дополнительной аппаратуры (спектрофлюориметра) и весьма громоздкий.

Важно, что описываемым метод позволяет оценивать уровень внутриклеточной Н-СЬ в моношпах. По причине относительно малого количества моноцитов в периферической крови стандартными методами (НСТ'-тест и ХЛ) невозможно уловить степень изменения этого показателя. Для оиенкн Ог«взрыоа» в моноцитах, продуцирующих Н;0; в меньшем количестве по сравнению с неГпрофилами, предпочтительно проведение реакции с выделенными лейкоцитами. При этом нами были получены более высокие показатели коэффициента стимуляции моноцитов — 5,6±2,5, в то время как в цельной крови - 1,7+0,8.

Табл.1. Спонтанная и стимулированная ФМА флюоресценция фагоцитарных клеток доноров, меченных ДГР 123 и ДХФ-ДА - индикаторами внутриклеточной перекиси водорода. ___

Краситель

JleinpCrtjnUbl________ j__Моноциты

спонг. I стимул. ! к | споит, [стимул.. | к

5,8 ± 0,8

5,6 + 2 S

_________ ______ _JJvwmiuinajviaH суспепз1!Я_ ___

Д1!' 123.....Г" 26,3 ±"J 864,3 ± [ 34,2 ± i 53 Д ± "] 265.5 +Г

п ~ 5 _!... 2.:?. -L 135,2 | 20,0 I _ 42,7 ! 202-2_ ДХФ-ДА-ДА Т00,0± I 1398,6 ± Т 18,1 ± Т 27,6 ± ! 141,4 +

и = 22_________]__58,6 j 463,9 [ 9.7______|___} 91.0 . _

___ _ _ _ Цельная кровь ___ _

Д.\Ф-ДА-ДА ' 17.5 -. 252.3.. 16.4 ' "FT^Ti T'll'l ±" ГТ? »11__) 8,4 { 96,9 j 5,9 I 12,7 i 19,6 j 0,8

При постановке хемидюминеецентного анализа лейкоцитов традиционно используют в качестве стимулятора знмозан, опсонизнрованный пудовой сывороткой (ОЗ). 0:-«взрыв» в ответ на 03, добавляемый к ДХФ-ДА меченым фагоцитам, также приводил к окислению ДХФ и соответственно флюоресцентному свечению этих клеток. Например, интенсивность меченых ДХФ-ДА нентрофилов в покое составляла 53,7±22,5 (п~3), после стимуляции 1 нг ФМА - 394±124, после стимуляции ОЗ -375+84. Мы пропели корреляционный анализ ДХФ-ДА теста (ФМА 10 ш) и стандартной ЛХЛ. Оба анализа проводились с выделенными лейкоцитами. Несмотря на различные активирующие агенты и противопосташгенис либо нентрофилов, либо моноцитов (ДХФ-ДА тест! всем лейкоцитам (ЛХЛ), наблюдается положительная достоверная корреляция между этими тестами с достоверными коэффициентами корреляции. На рнс.З приведены графики распределения значений ЛХЛ и ДХФ-ДА теста при стимуляции клеток (на примере нентрофилов) и в покое (на примере моноцитов).

Коэффициент корреляции г = ,90 (р<0.05)

Коэффициент корреляции г=,89 (р<0,05)

спонт. ДХФ-ДА тест (Мон)

стим. ДХФ-ДА тест (Нф)

Рис.3. Корреляционный анализ спонтанного и стимулированного (ФМА) ДХФ-ДА теста и спонтанной и стимулированной (03) люминол-зависимой ХЛ(п=13).

ТА Regression 95% «опМ

2.2. Разработка методов поглощения и киллинга Candida albicans фагоцитами периферической крови с использованием проточной цитофлюорометрии

В норме фагоциты периферической крови характеризуются высокой поглотительной активностью в отношении бактериальных мишеней, но не менее интенсивно они фагоцитируют и грибы (R.Bjerknes, et el., 1984, M.Saresella et a!., 1997). Эффективность фагоцитоза в конечном итоге зависит от способности фагоцитарных клеток убивать эти захваченные микроорганизмы. Известно, что бактерицидность служит основной характеристикой фагоцитов. А анализ поглощения и дальнейшего киллинга грибов фагоцитарными клетками имеет большое значение как минимум по двум причинам. Во-первых, необходим для выявления патологических дефектов самих фагоцитов; во-вторых, важен при оценке Т-клеточного звена иммунитета, которому отводится ключевая роль в антимикотической защите (АЛО.Сергеев, 1999, R.D.Diamond et al., 1980, L.Marodi et al., 1994).

2.2.1. Оценка поглощения C.albicans фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии

Имеются ссылки на использование проточной цитометрии доя оценки фагоцитоза дрожжей за рубежом, однако в России эта методика пока не имеет распространения. За основу нами была взята разработка M.Saresella et al., 1997. Мы адаптировали метод для проведения анализа в цельной крови с использованием малых объемов крови и всех реагентов, что важно для широкого практического применения, и использовали иной подход к анализу образцов на проточном цитофлюориметре.

Основной принцип метода достаточно прост: объект фагоцитоза метится флюоресцентным красителем, затем с помощью цитометрического

анализа идентифицируются поглотившие микробы клетки. Результат выдается в виде процента светящихся клеток среди анализируемых.

Выбор и мечение объекта фагоцитоза. В качестве мишени фагоцитоза нами был выбран дрожжевой грибок Candida albicans, один из главных возбудителей кан/ш додав (Ю.А.Сергеев, 1999). Для мсчения мы использовали бластоспоры Candida albicans, высеянные от больных с кожно-слизистыми кандидозами, отмытые ФСБ и ресуспендированные в концентрации 1-108/мл.

Среди ряда флюоресцентных красителей, применяемых для окраски микробов (ФИ'ГЦ, РЕ, PerCP, LY и др.), самыми выгодными качествами обладает ФИТЦ. Он годами интенсивно флюоресцирует в узком диапазоне видимого спектра (желто-зеленый); ковалентно связывается с аминогруппами белков в щелочной среде (рН8-9,5); не взаимодействует ни с какими биомолекулами в условиях физиологического рН. Мечение дрожжей мы проводили в карбонатно-бикарбонатном буфере с рН9,5. С.albicans, предназначенную для оценки процента фагоцитоза предварительно фиксировали 70% этиловым спиртом, что способствовало значительному снижению расхода флюорохрома (0,01 мг/мл - для фиксированных дрожжей, для живых - 0,1 мг/мл) и связыванию ФИТЦ с аминогруппами не только поверхностных белков, но и внутриклеточных. Продолжительность мечения и для фиксированных, и для живых С.albicans составила 1ч. при комнатной температуре в защищенном от света месте, после чего дрожжи отмывали ФСБ и хранили при +4°С.

Протокол метода поглощения C.albicans фагоцитами периферической кропи; в пробирки «Falcon» вносили по 100 мкл цельной -крови и ФИТЦ-мечеиой C.albicans (8-106/мл). Инкубировали 30 мин. при 37ГС, эритроциты лизнрооали, лейкоциты отмывали ФСБ. Перед цитометрическим анализом в пробу вносили 1мл раствора трипанового синего.

Основная трудность анализа поглощения дрожжей - это удаление из лейковзвеси свободных, нефагоцитированных бластоспор. Если при постановке поглощения с более мелкими микробами, например, с бактериями St.aureus эта проблема решается дифференцированным центрифугированием, то в случае дрожжей, размер которых сопоставим с размерами лейкоцитов, необходимы другие подходы. Можно дополнительно окрашивать фагоциты с помощью CD13 или СОМ специфичных МАТ, коныо) ированных с фикоэритрином, и выделять по двойному свечению клетки, поглотившие ФИТЦ-дрожжи. Упрощает и удешевляет метод использование гасящих агентов - трипанового синего (1 мг/мл, рН 7,4) (R.Bjerknes, 1984), этидиума бромида (10 мкг/мл) (M.Saresella et al., 1997). Однако на наш взгляд, наиболее четкую картину разделения «гашеных» и «негашеных» бластоспор дает кислый раствор трипанового синего (1,0 мг/мл, рН 4,4). Этот агент отвечает двум необходимым требованиям: полностью гасит поверхностную флюоресценцию и не проникает внутрь лейкоцитов.

Рис.4. Оценка поглощения ФИТЦ-меченой С.albicans с помощью проточной ци гометрии. А - распределение нейтрофилов по флюоресцентным качествам после гашения трипановым синим, где можно выделить R4 (свободные дрожжи); Б - гистограмма свечения нейтрофилов по FL1 до гашения; В -гистограмма FL1 после гашения, но с учетом R4 событий (R4 +•); Г -гистограмма FL1 после гашения и с удалением из анализа R4 событий (not R4) Анализ проб с помощью проточного цитометра. Картины цитометрического анализа поглощения C.albicans, поставленного в цельной крови показаны на рис.4. Выделенное в Dot Plot FSC/SSC облако фагоцитов, в данном случае нейтрофилов, проецируют на Dot Plot FL1/FL3. Если до гашения распределение смеси нейтрофилов поглотавших и непоглотивших бластоспоры и свободных бластоспор выглядит так же, как на рис.5А, то добавление трипанового синего с рН 4,4 существенно меняет флюоресцентную характеристику свободной ФИТЦ-меченой C.albicans (рис.4А). При этом уменьшается интенсивность свечения по FL1 параметру, но в такой степени, что дрожжи нельзя спутать с несветящейся частью нейтрофилов. Кроме того, наблюдается смещение дрожжей и по FL3, что также ведет к четкому выделению их в отдельное окно дискриминации (R4).

Возможное объяснение нестопроцентного гашения - в использовании убитых фиксированных дрожжей. Если использовать для поглощения живые C.albicans, после гашения они полностью сливаются с несветящимися нейтрофилами, что значительно занижает процент фагоцитоза.

В завершение в опциях FL1 -гистограммы необходимо исключить окно R4 (not R4), чтобы иепоглотившиеся дрожжи не учитывались при расчете процента фагоцитоза (Ml) (на рис.4В показана гистограмма «R4+», на

рис.41' - гистограмма «not R4»). Это позволяет получить истинные значения поглощения C.albicans нейтрофилами. Подобным образом оценивают и фагоцитоз моноцитов.

А.

Б.

Й" to' 10J 10s 10* FL1-H

10* 10' 10' 10' 10' П.1-Н

Рис.5. Цитофлюорограммы оценки поглощения C.albicans в бессывороточной среде. А. Без гашения; Б. гашение трипановым синим.

Известно, что только опсонизация микроба приводит к их активному захвату фагоцитами. В бессывороточной среде возможно незначительное поглощение C.albicans, обусловленное маннозными рецепторами. На рис.5 представлена цитофлюорограмма поглощения C.albicans в бессывороточной среде. Здесь наиболее ярко выражен эффект гашения флюоресценции, производимый трипановым синим.

Табл.2. Процент фагоцитоза C.albicans лейкоцитами периферической крови доноров. ** - р<0,05.

Цельная кровь Лейкоцитарная суспензия

п=19 11=5

Нейтрофшы 78,5 ± 7,5 89,0±4,7**

Моноциты 25,2 ± 6,7 35,3±9,1

Нами обследовано 25 доноров. В табл.2 представлены данные при постановке поглощения С.аИпсат в цельной крови и с суспензией лейкоцитов в присутствии пуловой сыворотки. Процесс выделения лейкоцитов влияет на функциональное состояние клегок и поглотительная способность фагоцитов при этом заметно возрастает. Для нейтрофилов огмсчено достоверное повышение фагоцитоза С.а1Ысап.5.

2.2.2. Оценка киллинга С.аШсат фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии.

При оценке фунгицидной функции фагоцитов клиническая иммунология до недавнего времени располагала методами, достаточно субъективными, 'фудосмкими и продолжительными (микробиологический и основанный на световой микроскопии). Методы не имели широкого пракшческого применения, а наиболее важный функциональный показатель фагоцитарных клеток отсутствовал при оценке иммунного статуса.

Применение проточной цитофлюорометрии в исследовании фунгицидной активности лейкоцитов значительно облегчает поставленную задачу. В основу разработки метода оценки киллинга грибов мы использовали цитометрический подход, разработанный ранее в нашей лаборатории к оценке внутриклеточного киллинга стафилококка (Д.В.Мазуров, 2000) и методику M.Saresella etal., 1997.

Принцип метода оценки киллинга C.albicans фагоцитами периферической крови и особенности мечения грибов. Метод основывается на дифференциальном окрашивании живых и убитых в процессе фагоцитоза бластоспор - живые выявляются по одинарной (зеленой), а мертвые - по двойной (зеленой + красной) флюоресцентной метке. В качестве мишени киллинга мы выбрали те же дрожжеподобные грибы рода Candida -C.albicans, относящиеся к условно-патогенным микроорганизмам. Во-первых, они бьши успешно использованы в качестве объекта фагоцитоза и, во-вторых, это обусловлено необходимостью получения полноценной информации об антикандидозной активности фагоцитов.

Изначально культура C.albicans метится ФИТЦ с максимальным сохранением жизнеспособности бластоспор. В процессе отработки методики были использованы следующие концентрации ФИТЦ: 0,1, 0,5 и 1,0 мг на 108 живых C.albicans. Оптимальное свечение (больше 100 канала) ФИТЦ давал уже в дозе 0,1 мг/108 бластоспор, при этом процент погибших клеток после окрашивания не превышал 1-2%.

Второй флюоресцентный краситель, PI, является ядерным красителем. Он легко проникает только в мергвые клетки и связывается с ДНК, живые клетки при этом остаются немечеными. Хотя PI флюоресцирует в довольно широком спекгре (можно анализировать и по FL2 и по FL3 параметрам), он хорошо отличается от ФИТЦ.

Отработка метода киллинга C.albicans лейкоцитами периферической крови. По причине сопоставимости размеров лейкоцитов и бластоспор устранение избытка C.albicans после определенного этапа поглощения, как это возможно сделать в случае киллинга стафилококка, в данном случае неосуществимо. Поэтому проводить киллинг следует, как минимум, при равном соотношении мишеней и фагоцитов, чтобы все дрожжи были поглощены. Остаток свободных дрожжей будет занижать значение киллинга. При подборе соотношения С.albicans лейкоциты мы ориентировались на следующие условия: 1) для достаточно быстрого анализа образцов на проточном цитометре концентрация бластоспор должна быть не менее 1Т06/мл; 2) необходима оптимальная концентрация лейкоцитов, не требующая большого объема крови; 3) значения киллинга должны быть достаточно высокими, что позволит четко дифференцировать случаи отклонения от нормальных показателей. Этим требования соответствовало соотношение С.а1Ысапз:лейкоциты - 1:5.

Чтобы оценить результат фунгицидной активности лейкоцитов необходимо по окончании совместной инкубации высвободить из них

бластоспоры, анализ жизнеспособности которых и выявит процент киллинга. На этом этапе для лизиса лейкоцитов в методах оценки и бактерицидное™, и фунгицидности часто применяется гипотонический шок дистиллированной водой или детергент дезоксихолат натрия. Первый вариант требует большого реакционного объема (Ш мл) и продолжителен по времени, во втором случае детергент оказывает влияние на жизнеспособность дрожжей и требует незамедлительного цитомстрического анализа. Для разрушения лейкоцитов мы применили оригинальный лизирующий раствор, предложенный Мазуровым Д.В., 2000, для метода оценки внутриклеточного киллинга St.aureus. Катионный детергент растительного происхождения -сапонин - в гипотоническом растворе с рН 9,5 в объеме 200 мкл быстро разрушает лейкоциты и не снижает при этом жизнеспособности C.albicans.

Перед - цитометрическим анализом пробы подвергаются обработке раствором ДНКазы I, что позволяет удалить высвободившуюся из лейкоцитов ДНК. Для последующего окрашивания C.albicans Pi в литературе предлагается концентрация в 100 мкг/мл. Мы успешно использовали PI в дозе 2,5 мкг/мл, предложенной для стафилококка, кроме того, оказалось возможным совместить этапы инкубации с ДНКазой и окрашивания PI. Это не отразилось на качестве проб, но при этом сократилось время реакции.

Рис.б. Цитофлюорограммы оценки киллинга C.albicans фагоцитами периферической крови. А. - Dot Plot с изображением ФИТЦ-меченой C.albicans; Б. - Dot Plot FL1/FL3, где облаком R2 выделена C.albicans; В. -гистограмма FL1 - отображающая распределение ФИТЦ-меченой C.albicans no FL3, курсор Ml выделяет ФИТЦ'РГ- C.albicans.

Окончательный протокол метода оценки киллинга C.albicans: в лунку 96-луночного круглодонного планшета внести по 90 мкл лейкоцитарной суспензии (5-106) и ФИТЦ-C.albicans (МО6), и 20 мкл пуловой сыворотки. После инкубации в течение 2,5 ч. при 37°С клетки осаждали, лейкоциты разрушали 200 мкл 0,2% сапонина. Пробы выдерживали 15-20 мин. при 37°С в растворе ДНКазы 1 (40kUnitzVn) с добавлением 2,5 мкг/мл PI.

Анализ проб при оценке киллинга C.albicans с помощью проточного цитофлюориметра. На рис.6 показаны цитофлюорограммы измерения киллинга C.albicans. На Dot Plot FSC/SSC (рис.бА.) изображены только

А.

Б.

В.

меченые ФИТЦ бластоспоры, которые легко выделить в отдельное окно (¡12) по интенсивному зеленому свечению с помощью ГМРк« РЫ/РЪЗ (рис.бБ). Для получения окончательного результата окно Я2 необходимо спроецировать на гистограмму ИЬЗ, где с помощью статистики вычисляется процент клеток, положительных по двойному окрашиванию - М1 (рис.бВ).

Корреляционный анализ цитометрического метода оценки киллинга С.а1Ысап5 и микроскопического метода с использованием красителя метиленовый синий. В работах Д.В.Мазурова, 2000, 11.В]сгкпез, 1984 доказана высокая степень корреляции цитометрического метода оценки киллинга бактерий и грибов с классическим микробиологическим вариантом постановки реакции микробицидности. Мы дополнительно провели серию экспериментов для сравнения цитометрического подхода к оценке киллинга с микроскопическим методом. При микроскопии используется метиленовый синий, который подобно Р1 при цитометрии, дифференцированно окрашивает мертвые дрожжи. Был получен положительный коэффициент корреляции (1=0,78) двух методов с достоверностью р<0,05 (рис.7).

коэффициент корреляции г О.78, (р<0,05) 42 38 34 30 26 22 18 14

Рис.7. Сравнение показателей киллинга C.albicans, полученных с помощью двух методов для каждого человека (n=7): А - метод оценки киллинга C.albicans с помощью проточной цитофлюорометрии; Б - метод, основанный на световой микроскопии и окраске метиленовым синим.

Оценка киллинга C.albicans с помощью проточной цитофлюорометрии у здоровых лиц. Ингибиторный анализ механизмов фунгициднос ги.

Было обследовано 22 практически здоровых человека в возрасте от 22 до 59 лет. Среднее значение показателя по выборке и стандартное отклонение составило 30,6±7,2 %.

С целью изучения механизмов киллинга грибов мы провели ряд экспериментов по ингибиторному анализу. Были использованы азид натрия и йодацетамид. Азид натрия - блокатор электронного переноса - иншбирует дыхательную цепь, в частности, работу конечного белка цшюхромоксидазы. Это препятствует генерации активных форм 02 в лейкоцитах. Йодацетамид связывает сульфгидрильные группировки ферментов лизосом и, в основном, ингибирует О^-независимые механизмы киллинга микробов.

А Б

28

22

16

щ

ГО

4

HZ Slit. Dev.

-2

Контроль Йоданетамил

Лзид натрия

CZ3 i-Std. Err.

о Mean

Рис.8. Влияние азида натрия (0,1%) и йодацетамида (100 мкг/мл) на киллинг C.albicans фагоцитами периферической крови, п=10. По оси Y - процент киллинга. Mean - среднее значение, Std.Deviation - стандартное отклонение, Std Error - ошибка среднего значения.

Были получены следующие результаты: в контроле (без ингибиторов) процент киллинга C.albicans составил 23,7±5,4, после обработки азидом натрия - 16,0+7,0, йодацетамидом - 6,4±4,7 (рис.8). Опытные значения отличаются от контроля с достоверностью р<0,01. Можно видеть, что роль СЬ-независимых факторов при киллинге C.albicans имеет большее значение. Инактивация йодацетамидом гранулярных ферментов сильнее всего сказалась на результатах киллинга. Из ферментов ведущую роль в киллинге дрожжей отводят миелопероксидазе (L.Christin et al., 1997, R.D.Diamond et al., 1980), хотя она «субстратно» зависима и от продукции активных форм 02. Очевидно, небольшого количества Н202 после блокады азидом натрия миелопероксидазе достаточно для синтеза более реакционных гипогалоидов, участвующих в киллинге мишени фагоцитоза.

2.3. Оценка фагоцитоза при первичной иммунологической недостаточности

2.3.1. Особенности функционирования фагоцитарной системы у больных хронической гранулематозной болезнью

Проведена комплексная оценка фагоцитарного звена иммунитета у 10 детей с ХГБ в возрасте от 4,5 до 16 лет.

Исследование поглотительной активности и продукции активных форм От. При оценке поглотительной активности фагоцитов все показатели фагоцитарного индекса как нейтрофилов, так и моноцитов больных детей были на уровне нормы. Нами показано, что это в равной мере относится к бактериальным (St.aureus) и к грибковым (C.albicans) мишеням (табл.3).

Однако остальные функциональные параметры фагоцитарных клеток у больных ХГБ очень сильно снижены (табл.3). У них практически полностью отсутствовала генерация активных форм 02, что выявлялось в люминол- и

лкзцигенинзависимом хемилгомимесцентном анализе, стандартных методах измерения генерируемых во внеклеточную среду IЬСЬ и 0{ соответственно.

Табл.3. Оценка фагоцитарного звена иммунитета у больных ХГБ в сравнении с донорскими значениями. * - р<0,05, ** - р<0,01 при сравнении с

донорскими значениями. _ ___ _________

Люминол- |~ДХФ-ДА тест |. Внутри-зависимая ХЛ, (внутриклет, ( клеточный тУ/мин

Поглощение нейтрофилы / моноциты,%

Б^аигсиБ С.а1Ысапя

Сионтан[ Стим

Н20;)

киллинг

Нф

Мои 1$1.аигеи5| С.а1Ь.

Хроническая гранулелштозная болезнь

1. 94/78 н.д. | 0,7 5,7 1,8 1,2 17 8

2. 90/54 Н.Д. 0,6 ^ 2 1,7 1,5 12 18

3. 93/83 73/29 7,2 24,6 1,3 1,9 13 31

4. 96/891 65/18 5,3 12,7 2 1,5 10 37

5. 95/74 Н.Д. 0,86 16,7 1,5 1,5 13 31

6. 89/84 Н.Д. 0,45 4,2 2,7 0,9 11 24

7. 77/63 Н.Д. 0,6 3,8 2,4 1,3 15 17

8. 84/65 86/23 Г 0,4 0,5 3,8 4 13 28

9. н.д. Н.Д. 0,5 3,5 1,4 н.д. 17 15

10 I и.д. н.д. 1,2 5,3 н.д. н.д. 7,5

89,8+6,5/ 73,8+12,1 Среднее значение 74'7±,°'6| 18+2 4* /23,3+5,5| ' ' ± средн.) 8,2+7,5 ** <еадр.опп 2,1 ±0,8 ** аоненис 1,7+1 * 12,9+3 ** 23,2+ 5,5*

Доноры. Среднее значение ± средн.квадр.отклонение

86,5+3,5 / 80,2±4,4 (п=12)

78,9+6,6 / 27,6±6,4 (п=12)

9,1+5,9 (н=8)

152,2+ 57,9 (п-8)

17,7± 5,9 (п=13)

6,0± 2,8 (п=13)

31,0± 4,3 (п=13)

Применение цитофлюорометрического подхода (ДХФ-ДА теста) к исследованию 02-«взрыва», позволяет исследовать метаболизм отдельно взятой клетки. Применение ФМА, как классического индуктора «взрыва» выявляет клетки с дефектом НАДФН-оксидазы, не продуцирующие Н20?. На рис.9А можно видеть, что в крови здорового человека такие клетки отсутствуют; у больного ХГБ к ним относится вся популяция нейтрофшюв (рис.9Б), интенсивность свечения которых осталась без изменения; а у его матери, являющейся гетерозиготным носителем дефектного гена, нейтрофилы представлены как нормальными, так и не продуцирующими Н202 клетками. Как видно из рис.9В к дефектным нейтрофилам у матери относится 30% клеток. Эго согласуется с данными других исследователей,

указывающими что только 60-75% нейтрофилов носителя реагирует 02-"взрывом" на стимуляцию. Однако мы наблюдали и обратную ситуацию, когда только 35% нейтрофилов матери больного ребенка было НАДФН-оксидаза-позитивными. Так как более 60% всех случаев ХГБ приходится на Х-сцепленный вариант болезни (мутация Х-хромосомы в области СУВВ гена, кодирующем основную энзиматическую субъединицу НАДФН-оксидазы - цр91рЬ'к), имеет значение скрининговое тестирование женщин на предмет носительства дефектного гена, а также пренатальная диагностика этого типа ХГБ. Результаты нашего обследования матерей больных детей представлены в табл.4, где в случае Х-ХГБ было зарегистрировано 2 четких пика при проведении ДХФ-ДА теста с ФМА. Аутосомно-рецессивная форма была поставлена на основании 100% ответа фагоцитов 02-«взрывом» на стимуляцию. Выявление gp91p'юx-дeфeктa у больного необходимо и с прогностической целью, так как именно Х-сцепленный вариант ХГБ характеризуется более тяжелой клинической картиной по сравнению с аутосомно-наследованными формами болезни.

ФМА

А.

Б.

ФМА

В.

Рис 9. Гистограммы флюоресценции меченых ДХФ-ДА нейтрофилов до и после стимуляции ФМА (Юнг) (по оси ординат - относительная частота встречаемости, по оси абсцисс - интенсивность флюоресценции в отн.единицах): А. донора, Б. больного с ХГБ, В. матери ребенка с ХГБ.

Табл.4. Тип наследования ХГБ, выявленный при помощи ДХФ-ДА теста, проведенного с лейкоцитами матери ребенка.

Номер 1. 2. 3. 4"Г] 5. 6. 7. 8. 9 10.

Пол муж. муж. жен. _муж. муж. муж. муж. муж. жен.

Тип наследования аутос. X- аутос. н.д. X- н.д. аутос. X- X- аутос.

-рецес сцепл рецес сцепл -рецес сцепл сцепл -рецес

Также, но менее интенсивно в тесте с ДХФ-ДА выглядит метаболический ответ моноцитов. Дефект НАДФН-оксидазы распространяется на все фагоциты, включая клетки моноцитарно-) макрофагальной системы и эозинофильные гранулоциты. Хотя встречаются

случаи болезни, когда патология не затрагивает эозинофилы или мутация приводит к образованию двух различных клонов нейтрофилов: экспрессируюших субъединицу gp91p,"x и не экспрессируюших вовсе (О.Кооз е1 а1., 2000). '>го еще раз говорит о гетерогенности XI Ь и необходимости анализа на уровне отдельной клетки.

Исследование микробоцидных свойств фагоцитов больных ХГБ. В табл.3 внесены результаты анализов бактерицидной активности фагоцитов детей с ХГБ. У всех больных значительно снижен внутриклеточный киллинг 8с.аигеиз. В среднем процент убитых бактерий за 1 час составляет 13%, что в 2-3 раза меньше, чем у доноров за такое же время. На рис.ЮА представлена цитофлюоримстрическая картина анализа бактерицидности ребенка с ХГБ. На данной гистограмме по 1-1.3 параметру показано распределение стафилококка по свечению в спекгре Р1, окрашивающего только мертвые клетки, у этого больного к ним относится только 9% бактерий.

24%

10' ю-* 10: FL3-H

Рис. 10. Цнтофлюорограмма внутриклеточного киллинга St.aureus фагоцитами периферической крови больного ХГБ: А. без полиокевдония, Б. в присутствии 250 мкг/мл полиоксидоння. По оси абсцисс интенсивность свечения ФМТ1 ^меченого стафилококка по Pi, по оси ординат -относительная частота встречаемости.

Способность убивать захваченные С.albicans пострадала в меньшей степени. Как видно из табл.3 фагоциты четырех детей с ХГБ уничтожаю! дрожжевые клетки не менее эффективно, чем нормальные фагоциты (2837%). "Голыш у одного ребенка процент киллинга С.albicans был очень низким и составил 8%. По данным литературы при ХГБ грибы не относятся к числу часто высеваемых возбудителей, исключение составляют грибы рода Aspergillus, которые по J.Liesc et al., 2000, в 14% случаев становятся причиной инфекции. Механизмы устойчивости организма к грибковой инвазии до конца не изучены. Основное место в противогрибковом иммунитете отводят макрофагам и Т-клеткам, мобилизующим первые на уничтожение грибов. При этом ключевое значение имеет продукция Т-клетками цитокмнов, особенно INF-y (L.Marodi et al., 1991, 1994).

Тем не менее, неГпрофилы принимают активное участие в ацтимикотической защите организма. Как уже упоминалось, нейтрофилы поглощают дрожжи так же активно, как и бактерии, причем процент фагоцитоза у донороп и у больных ХГБ не различается. Процесс киллинга C.albicans включает а себя разрушение клеточной стенки гриба и фрагментацию ДНК микроба. Christin L. et al., 1997 выявили, что повреждение клеточной стенки C.albicans вызывают нейтрофилы и доноров и больных ХГБ, но не цитоатасты (нейтрофилы, лишенные ядра и гранул, однако сохраняющие способность к продукции активных форм СЬ), т.е. начальный этап киллинга дрожжей обусловлен 02-независимыми факторами. Другие механизмы фунгицидности связывают с дефензимами, с цитозольными белками, оксидом азота (NO). NO - один из эффективных НАДФН-оксидаза-независимых токсинов, определяющий кандидацидную активность макрофагов (A.Vazquez-Torres et al., 2000). Есть сообщения об экспрессии мРНК iNOS нейтрофилами больных сепсисом и активированных донорских нейтрофилов (T.J.Evans et al., 1996, Y.Tsukahara et al., 2000, J.L.Webb et al., 2001), а также о синтезе NO нейтрофилами и мононуклеарами больных ХГБ (A.Condino-Neto et al., 1993).

Влияние иммуномодулятора полиоксидония на фагоциты больных ХГБ. Лечение и профилактика ХГБ определяются в первую очередь антибиотиками. Полное излечение может обеспечить только трансплантация костного мозга, возможность которой серьезно ограничена проблемами VlLA-идентичности, да и вопрос обращения к этому относительно агрессивному типу лечения вызывает серьезные дебаты. Разнообразие форм ХГБ, когда множество уникальных мутаций ведут к дисфункции одного ферменга (так, у 460 больных с Х-сцеплсннои ХГБ было обнаружено около 290 различных мутаций в этой хромосоме (D.Roos et al., 2000)), предполагает и различные подходы к терапии. Например, при определенном типе Х-ХГБ -в случаях мутации первого шпрота CYBB гена и образования абберраитиой мРНК - имеет успех лечение больных JNF-y (A.Condino-Neto et al., 2000, R.A.Ezekovvitzetal., 1990).

Иммупомодулируюшая активность с направленностью на фагоцитарное звено характеризует препарат полиоксидоний. При исследовании влияния полиоксидония на бактерицидную активность фагоцитов мы установили, что в присутствии полиоксидония эффективность киллинга микробов значительно повышается. '>го было выявлено как при исследовании донорских фагоцитарных клеток, так и в случае НАДФН-окендаза дефектных фагоцитов больных ХГБ. При ХГБ с учетом изначально очень низкого уровня бактерицидное™ показатели достигали даже нормативных значений в присутствии 250 и 500 мкг/мл полиоксидония. На гистограмме (рис. 1 ОБ) видно, как увеличился процент позитивных по PI бактерий - с 9% до 24%. Дозозависимый характер эффекта полиоксидония на киллинг St.aureus в группе доноров и больных хорошо прослеживается по данным табл.5.

Табл.5. Показатели киллинга (%) у больных ХГБ и у доноров в присутствии иммуномодулятора полиоксидония (мкг/мл). Достоверность различия при сравнении с контролем:** - р<0,01_ _________________

Контроль

100

Полиоксидоннй 250

500

2.

7,5

12

18

30

16

24

35

3.

4.

13

20

22

35

17

16

22

43

5.

9

12

24

41

М ±т

12,5+4,2

15,6±3,6

22,0±2,4**

Зб,8±5,2**

Доноры, М + m (n=l 1)

33,9±7,3

34,5±8,8

48,7±10,2**

59,3+6,8**

1.

2.3.2. Синдром Чедиака Хигаси

Было проведено обследование состояния фагоцитарного звена иммунитета у ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси - мальчика 4-х лет.

При оценке поглотительной активности фагоцитов (в качестве объекта фагоцитоза применялись и бактериальная, и грибковая мишени) у больного не было выявлено каких-либо отклонений.

Исследование внутриклеточного киллинга 81.аигеи5 выявило значительное снижение бактерицидной активности фагоцитарных клеток больного. Процент киллинга 8ишгеий был снижен более чем в два раза по сравнению с нормой (табл.6). Это подтверждает патогенетический дефект этого синдрома, связанный с нарушением образования фаголгоосомы и клинически проявляющийся в повышенной восприимчивости к инфекциям.

Табл.6. Некоторые показатели оценки фагоцитарного звена у больного с синдромом Чедиака-Хигаси___________

У больного В норме

ЛХЛ спонтанная 12,1 10-12

ЛХЛ стимулированная 24,6 100-300

ДХФ-ДА. тест (нейтрофилы) 2,8 10-32

Внутриклеточный киллинг St.aureus, % 11,5 25-37

Продукция активных форм кислорода. Был проведен целый ряд

исследований (люминол- и люцигенин-зависимая ХЛ, ДХФ-ДА тест оценки внутриклеточного уровня Н202), выявивший существенное снижение способности фагоцитов отвечать 02-«взрывом» в ответ на стимуляцию. Результаты анализов показаны в табл.6. Возможный патогенез синдрома окончательно еще не выяснен, но его связывают с поражением аппарата мембран лизосом. Можно полагать, что это распространяется на все

цитоплазмавгоеские гранулы. Так, для работы НАДФН-оксидазного комплекса необходима сборка всех субъединиц на цитоплазматической мембране. Основной ферментативный блок - флавоиитохром Ь<5» (gp9!ph("i4p22p,1"'!) п спокойной клегке локализуется в мембранах секреторных везикул, желатиназных и специфических гранул, а при активации происходит мобилизация этих гранул в направлении стимулирующего агента и в норме флавоцитохром оказывается в мембране фагосомы (N.Borregaard et al., 1995, D.Roos el al., 2000). Судя по всему, у больного наблюдается дефект сборки оксидазного комплекса, чем объясняются столь низкие показатели 02-«взрыва».

Табл.7. Процент апоптоза лейкоцитов после инкубации со St.aureus в течение

Нейтрофнлы (Annex V' + AnnexV'PJ') бессыворот. : 10% пудовая среда ; сыворотка Лимфоциты (AnnexV • Annex VW) бессыворот. ; 10% пудовая среда ' сыворотка

Синдром Чедиака-Хигаси 22 45,6 3 4

Доноры (п=7) 6,6 ±3,1 7,2 ± 4,4 2,1 ±0,9 2,5 ±1,5

п?1т

& - • ■ п

1 S^fF f % | 1 tf 13' Iii* М ■1

«¡л-/**-.'

Ä*-ä j

I

RUH imVntC

10' 10' RJ-Я «я*?-ГП

'äUv-пй

А.

Б.

В.

Рис.11. Индуцированный стафилококком апоптоз нейтрофилов больного с синдромом Чедиак-Хигаси. А. - после фагоцитоза в бессывороточной среде; Б. - после фагоцитоза в присутствии 10% пуловой сыворотки; В. - нейтрофнлы донора после фагоцитоза в присутствии 10% пуловой сыворотки.

Апоптоз лейкоцитов у больного с синдромом Чедиак-Хигаси. Мы провели анализ фагоцитарных клеток, участвующих в процессе фагоцитоза бактерий на предмет апоптоза. Оказалось, что в сравнении с донорами у больного значительный процент нейтрофилов после инкубации со стафилококком в течение 3-х с половиной часов подвергался апоптозу. Ото напрямую зависело от наличия в реакционной среде сыворотки, которая, являясь опсонизирующим фактором, обеспечивала поглощение бактерий. Но

даже в бессывороточной среде были получены высокие показатели апнексин-положителъных нейтрофшюв - 22%. На рис .11 приведены цитофлюорограммы оценки апоптоза у больного и у донора с помощью раннего маркера рекомбинантного аннексина V-ФИТЦ, связывающегося с фосфатидилсерином на поверхности апоптотировавших клеток. Из данных табл.7 видно, что в присутствии пуловой сыворотки эта цифра возросла до 45,6%, в то время когда у доноров процент апоптоза в среднем составлял 6,6% и 7,2%, соответственно. В качестве контроля и для сравнения был оценен апоптоз лимфоцитов, не обладающих фагоцитарной активностью. Донорские показатели и показатели больного идентично свидетельствуют об отсутствии апоптоза в этих клетках в ответ на стафилококк.

По данным литературы фагоцитоз золотистого стафилококка, а также ряда других микробов (Escherichia coly, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis) тормозит наступление программированной гибели фагоцитов (J.Baran et al., 1996, 2001). У больного с синдромом Чедиак-Хигаси, таким образом, нарушен естественный ход процесса при бактериальной инвазии -нейтрофилы при контакте с микробами начинают погибать сами.

2.4. Фагоцитоз при вторичной иммунологической недостаточности

Было проведено исследование некоторых показателей фагоцитоза при таких заболеваниях, как туберкулез легких и хронический рецидивирующий фурункулез с помощью новых цитофлюорометрических подходов, разработанных ранее и в данной работе.

нейтрофилы

А Б

I Min-Мах 1 I 25%-75% о Median valui

моноциты

1 Min-Max Па.25%-75% . О Mediah vaiue

В

А

Б

В

Рис.12. Распределение данных по поглотительной активности фагоцитов. А -доноры (п-12), Б - туберкулезом легких (п=13), В - хронический рецидивирующий фурункулез (n=23). Min/Max - минимальное и максимальное значение выборки; 25%-75% - попадает в выделенную область; Median value - среднее значение

Оценка поглотительной активности фагоцитов периферической крови. Мы протестировали показатели фагоцитарного звена иммунитета у 13 больных с туберкулезом легких и у 23 больных с хроническим

рецидивирующим фурункулезом. Анализ поглотительной активности фагоцитов при этих заболеваниях не выявил достоверных отличий с показателями здоровых лиц. Тем не менее, при дальнейшей обработке материала было отмечено, что способность поглощать Б^аигеиз у больных хроническим рецидивирующим фурункулезом варьируют в значительной степени. И это характерно как для иейтрофилов, так и для моноцитов (рис.12). Снижение поглотительной активности у части больных рецидивирующим фурункулезом "возможно связано с нарушением опсонизирующих качеств сыворотки.

Анализ внутриклеточного киллинга Бьаитеиэ и С.аЧжат фагоцитами периферической крови. Нарушение микробицидных качеств фагоцитарных клеток свойственно для обеих патологий (рис.13). Причем в зависимости от патологии заметно страдает либо бактерицидная, либо фунгицидная активность лейкоцитов.

киши/г St. aureus

киллхтг С. albicans

Т т - ! < 1 г-Ц 1 Ц Л

а б в

~Т~ ±Sld. Dev. Г~1 t£td. Err D Mean

а б в

Рис.13. Распределение показателей микробицидной активности фагоцитов. А - доноры (п=12), Б - туберкулез легких (п=13), В - хронический рецидивирующий фурункулез (n=23). Std.dev. - стандартное отклонение, Std.Err. - ошибка средней, Median value - среднее значение. *- р<0,05 при сравнении с группой доноров.

При хроническом рецидивирующем фурункулезе достоверно снижены показатели внутриклеточного киллинга St.aureus - микробного агента, наиболее часто высеваемого при бактериологическом исследовании отделяемого из фурункула. В целом для этой группы больных было получено достоверное отличие (р<0,05) при сравнении с группой здоровых людей (26,6±7,5% и 31,2±4,2% соответственно). Способность убивать C.albicans клетками этих больных сохранена в рамках нормы.

Туберкулез легких, в противоположность, сопровождается нормальными значениями бактерицидной активности и достоверным снижением фунгицидной активности фагоцитов периферической крови. Показатели киллинга C.albicans у больных туберкулезом легких составляют 26,3+8,0%, соответствующие показатели у доноров - 33,9+6,3% (р<0,05).

Если стафилококк и ряд других бактерий относятся к внеклеточным интерстициальным микробам, защита против которых в основном связана с нейтрофилами, иммуноглобулинами и комплементом, то грибы и туберкулезная палочка наряду с бруцеллами, микоплазмами и др. попадают в одну группу, которую «курируют» Т-лимфоциты и макрофаги. Очевидно, ослабление контролирующего звена выразилось в развитии туберкулезной инфекции и проявилось снижением киллинга C.albicans при тестировании фагоцитарных клеток in vitro.

Выводы

1. Адаптирован для практического применения цитометрический метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода в фагоцитах периферической крови, отражающий интенсивность кислородного «взрыва» в этих клетках и предложены варианты с различными индикаторными красителями - ДХФ-ДА тест и ДГР 123 тест.

2. Разработан метод оценки поглощения ФИТЦ-меченых бластоспор Candida albicans нейтрофилами и моноцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии.

3. Разработан метод оценки киллинга бластоспор Candida albicans фагоцитарными клетками периферической крови с использованием двойной флюоресцентной метки (ФИТИ/Р!) и проточной цитофлюорометрии.

4. С помощью цитофлюорометрических методов показано, что у детей с первичной иммунологической недостаточностью - хронической гранулематозной болезнью - дефицит по лейкоцитарной НАДФН-оксидазе в первую очередь отражается на бактерицидных качествах фагоцитов и менее - на способности убивать грибы.

5. Показано, что с помощью цитометрического метода оценки активных форм кислорода (ДХФ-ДА теста) можно выявлять Х-сцспленный вариант наследования болезни по исследованию лейкоцитов матери ребенка.

6. Выявлено in vitro значительное дозозависимое усиление бактерицидных качеств фагоцитарных клеток под влиянием иммуномодулятора полиоксидония как у здоровых лиц, так и у больных ХГБ.

7. С помощью цитофлюорометрических методов исследования выявлено значительное снижение продукции активных форм кислорода, внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитарными клетками и повышенный апоптоз нейтрофилов при синдроме Чедиак-Хигаси.

8. С помощью цитофлюорометрических методов оценки киллинга и поглощения микробов показано, что при туберкулезе легких и хроническом рецидивирующем фурункулезе происходит снижение способности фагоцитов убивать C.albicans и Staureus соответственно.

Список работ, опубликовапиых по теме диссертации

1. Мазуров Д.В., Хамидулина К.Ф., Дамбаева C.B., Пинегин Б.В. Измерение поглотительной и бактерицидной функций граиулоштов и моноцитов периферической крови// Russian Journal of Immunology - 1999. - V.4. -Suppl.l. P.40. • ■■•

2. Мазуров Д.В., Дамбаева C.B., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии// Иммунология - 2000. - Ж>. - С.57-59.

3. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Голубева Н.М., Пинегин Б.В. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность фагоцитарных клеток периферической крови доноров// Иммунология -2000.-.№6.-С. 15-20.

4. Дамбаева C.B., Каримова И.М., Мазуров Д.В., Голубева Н.М. Влияние полиоксидония на функциональную активность фагоцитов периферической крови человека// Аллергия, астма и клиническая иммунология - 2000.-№11.-С.6-9.

5. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Комогорова Е.Э., Сегдикова Н.Х. Оценка киллерных свойств фагоцитарных клеток периферической крови у двух групп больных: с фурункулезом и туберкулезом легких// Сборник трудов 4-го Национального конгресса Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии и иммунофармакологии» - Москва, 29-31 мая 2001 г. - Т.2., стр.57.

6. Мазуров Д.В., Дамбаева C.B., Пинегин Б.В. Разработка новых подходов к оценке функциональной активности фагоцитов с помощью проточной цитометрии// Сборник трудов 4-го Национального конгресса Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии и иммунофармакологии» - Москва, 29-31 мая 2001 г. -Т.2., стр.187.

7. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Кондратенко И.В. Влияние полиоксидония на бактерицидную функцию фагоцитов периферической крови доноров и детей с хронической гранулематозной болезнью// Сборник трудов 4-го Национального конгресса Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов «Современные проблемы аллергологии и иммунофармакологии» - Москва, 29-31 мая 2001 г. - Т.2., стр.275.

8. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Пинегин Б.В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека// Иммунология - 2001. - №6. - С.58-61.

9. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Пинегин Б.В. Некоторые особенности функционирования фагоцитарной системы у больных хронической гранулематозной болезнью// Иммунология - принята к печати

Список принятых сокращений

ДГР 123 - дигидрородамин 123 ДХФ-ДА - дихлорофлюоресцеина диацетат ИНФ-у - интерферон у

JTXJT - люминолзависимая хемилюминесценция

МАТ - моноклональные антитепя

Н202 - перекись водорода

НАДФ - никотинамиддинуклеотид фосфат

02" - супероксидный анион

02-««взрыв»» - кислородный ««взрыв»»

CD - кластер дифференцировки (cluster of differentiation)

ФИ'ГЦ - флюоресцеин-5-изотиоциапат

ФМА - форболмиристат ацетат

Ф1Ю - фактор некроза опухоли

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

Х1Б - хроническая гранулематозная болезнь

XJI - хемилюминесценция

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

С.albicans - Candida albicans

Dot Plot - точечный рисунок в системе координат х/у

FACS - флюоресцентно активированный клеточный сортировщик

FSC - малоугловое светорассеяние

gpphlK - гликопротеин фагоцитарной оксидазы

iNOS - индуцибельная N0 сишаза

N0 - окись азота

ОН - гидроксильный радикал

PI - пропидиума иодид

SSC - боковое светорассеяние

St.aureus - золотистый стафилококк

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 05.12.01 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,75. Печать авторефератов: 174-32-31

Актуальность темы диссертации

Одной из главных задач клинической иммунологии является диагностика нарушенного звена иммунной системы, в том числе и фагоцитарной. Все основные системы иммунитета задействованы в защите организма против инфекционных агентов - Т-лимфоциты и NK-клетки, фагоциты, иммуноглобулины и комплемент. Элиминация возбудителя осуществляется общими «усилиями» и все-таки центральное место в конечном этапе противоинфекционной защиты - киллинге микробных агентов и их разрушении -занимает фагоцитоз [33].

Известные врожденные дефекты фагоцитарных клеток характеризуются яркой клинической картиной, например, хроническая гранулематозная болезнь, синдром Чедиака-Хигаси, LAD (Leukocyte Adhesion Deficient) [3]. Однако постановка окончательного диагноза чаще всего запаздывает, т.к. основанием для этого могут служить только результаты комплексного исследования фагоцитарного звена. Соответственно может иметь место отсутствие необходимого соответствующего лечения и в период обострений, и профилактического.

Вторичная, приобретенная иммунологическая недостаточность, доминирующей формой которой является спонтанная, проявляется хроническими рецидивирующими инфекционно-воспалительными процессами самой различной локализации [32]. Изучение фагоцитарного звена иммунитета при вторичном иммунодефиците необходимо для выяснения степени его нарушения и причинно-следственной роли фагоцитарных факторов иммунной защиты в развитии иммунодефицита. Важно установить причины нарушения фагоцитоза, они могут быть как внутренними, так и внешними [33]. Вн> фенние причины обусловлены дефектом самих фагоцитов. К внешним причинам можно отнести факторы, активирующее действие которых является необходимым для полноценного функционирования фагоцитов, например, Т-лимфоциты и продуцируемые ими цитокины.

В клинической ii| дктике изучение фагоцитоза чаще всего сводится к анализу поглотительном активности клеток фагоцитов, причем особого внимания выбору мишени фагоцитоза не уделяется. Другими распространенными методами являются исследования кислородного «взрыва» с помощью НСТ-теста и хемилюминесценции. Ключевой функциональный тест фагоцитарных клеток -киллинг захваченных микробов - проводится микробиологическим методом, с подсчетом выживших после фагоцитоза микробов по числу колоний. Метод не имеет широкого распространения, так как является трудоемким и продолжительным по времени выхода результата.

В настоящее время прочные позиции во всех областях науки, где проводятся работы по исследованию структуры и функции клеточных популяций, завоевывает проточная цитофлюорометрия. Использование проточной цитофлюорометрии в иммунологии дает возможность оценки практически всех параметров иммунного статуса, включая и фагоцитарное звено [41, 60, 99].

Применение цитометрических методов исследования к оценке основных этапов фагоцитоза - это получение более объективной информации о состоянии фагоцитарных клеток. Среди неоспоримых преимуществ проточной цитометрии -возможность исследовать метаболизм отдельно взятой клетки, анализ очень большого числа клеток, наконец, высокая скорость, точность, простота постановки реакции и быстрое получение результата. В этом направлении уже сделаны большие успехи по разработке и внедрению методов оценки поглощения стафилококка и бактерицидности - внутриклеточного киллинга стафилококка [15| - пиогенного (внеклеточного) микробного агента.

В связи с этим, целью работы явилась дальнейшая разработка цитофлюорометрических методов к оценке фагоцитарного звена иммунитета и изучение фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности на новом методическом уровне с использованием проточной цитофлюорометрии.

Задачи исследования

1. Разработать метод оценки уровня активных форм кислорода в фагоцитарных клетках крови человека во время респираторного «взрыва» с использованием проточной цитофлюорометрии.

2. Разработать метод оценки поглощения и киллинга фагоцитами крови человека грибкового микробного возбудителя на примере Candida albicans с использованием проточной цитофлюорометрии.

3. Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с первичными иммунодефицитными состояниями.

4. Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научная новизна

Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов тесты оценки кислородного «взрыва» в нейтрофилах и моноцитах периферической крови человека с применением индикаторов внутриклеточной перекиси водорода ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии.

Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов методики оценки поглощения и киллинга ФИТЦ-меченой С.albicans нейгрофилами и моноцитами крови человека с помощью проточной цитофлюорометрии для цельной крови (киллинг) и для выделенной лейкоцитарной суспензии (поглощение и киллинг).

Впервые проведено комплексное исследование состояния фагоцитарной системы у детей с ХГБ, в том числе с анализом бактерицидной и фунгицидной активности фагоцитов и анализом уровня продукции активных форм кислорода в отдельно взятых фагоцитарных клетках. Показаны возможное i и цитометрического метода оценки продукции активных форм кислорода для выявления Х-сцепленных вариантов наследования болезни.

При исследовании влияния полиоксидония на бактерицидную функцию фагоцитов впервые были получены данные о значительном киллинг-стимулирующем свойстве этого иммуномодулятора повышение киллинга бактерий на 50-100%. Эффект полиоксидония, выявленный при исследовании фагоцитарных клеток здоровых людей, в полной мере проявляется и в отношении НАДФН-оксидаза дефектных фагоцитов крови больных ХГБ. При этом показатели бактерицидности у больных ХГБ достигают нормативных значений.

Проведено комплексное изучение фагоцитарного звена иммунитета ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси и выявлены значительные дефекты в продукции активных форм кислорода и бактерицидности фагоцитов. Впервые обнаружено, что поглотительная активность фагоцитов крови больного в отношении стафилококка сопровождается апоптозом самих нейтрофилов, а опсонизация бактерий значительно увеличивает процент апоптоза фагоцитов.

Впервые использован цитометрический подход к исследованию основных показателей фагоцитоза у больных с вторичными иммунодефицитами. Выявлено, что для больных хроническим рецидивирующим фурункулезом характерно снижение бактерицидных качеств фагоцитарных клеток крови, а фагоцитарные клетки больных туберкулезом легких отличаются сниженными фунгицидными качествами (способностью убивать грибковые микробные агенты).

Практическая значимость работы

Метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода (ДХФ-ДА и ДГР 123 тесты) с помощью проточной цитофлюорометрии разработан в виде микрометодов как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии, и подтвержден хемилюминесцентным анализом. Метод высокочувствительный, позволяет выявлять все клетки с дефектом НАДФН-оксидазы, например, при ХГБ, а также гетерозиготное носительство при X-сцепленном варианте наследования этой патологии. Разработаны нормативные показатели. Тесты просты в исполнении и могут использоваться для поточных исследований.

Для поточных исследований подготовлены и методы оценки поглощения и киллинга С.albicans с помощью проточной цитофлюорометрии. Набраны нормативные показатели по анализам здоровых людей. Метод оценки поглощения С.albicans пригоден для постановки как в цельной крови, так и с выделенной лейкоцитарной суспензией.

На примере различных патологий показана возможность исследования фагоцитоза с помощью проточной цитофлюорометрии и диагностики нарушенного звена фагоцитарной системы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование индикаторных красителей ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать уровень внутриклеточной перекиси водорода в отдельно взятой фагоцитарной клетке. Метод можно использовать для диагностики ХГБ и выявления гетерозиготного носительства при Х-сцепленном варианте ХГБ.

2. Использование живой и фиксированной ФИТЦ-меченой С.albicans и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать соответственно фунгицидную активность и поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов.

3. Применение цитофлюорометрических подходов к оценке функциональной активности фагоцитарных клеток позволяет провести комплексную оценку фагоцитарного звена при различных видах иммунологической недостаточности, в том числе первичных иммунодефицитах - ХГБ и синдроме Чедиака-Хигаси и вторичных иммунодефицитах - хроническом рецидивирующем фурункулезе и туберкулезе легких.

4. Под влиянием иммуномодулятора полиоксидония значительно повышается бактерицидная активность фагоцитарных клеток in vitro

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и одна работа принята к печати. Результаты доложены на 4-ом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» 29-31 мая 2001г., Москва.

Выводы

1. Адаптирован для практического применения цитометрический метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода в фагоцитах периферической крови, отражающий интенсивность кислородного «взрыва» в этих клетках и предложены варианты с различными индикаторными красителями - ДХФ-ДА тест и ДГР 123 тест.

2. Разработан метод оценки поглощения ФИТЦ-меченых бластоспор Candida albicans нейтрофилами и моноцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии.

3. Разработан метод оценки киллинга бластоспор Candida albicans фагоцитарными клетками периферической крови с использованием двойной флюоресцентной метки (ФИТЦ/PI) и проточной цитофлюорометрии.

4. С помощью цитофлюорометрических методов показано, что у детей с первичной иммунологической недостаточностью - хронической гранулематозной болезнью -дефицит по лейкоцитарной НАДФН-оксидазе в первую очередь отражается на бактерицидных качествах фагоцитов и менее - на способности убивать грибы.

5. Показано, что с помощью цитометрического метода оценки активных форм кислорода (ДХФ-ДА теста) можно выявлять Х-сцепленный вариант наследования болезни по исследованию лейкоцитов матери ребенка.

6. Выявлено in vitro значительное дозозависимое усиление бактерицидных качеств фагоцитарных клеток под влиянием иммуномодулятора полиоксидония как у здоровых лиц, так и у больных ХГБ.

7. С помощью цитофлюорометрических методов исследования выявлено значительное снижение продукции активных форм кислорода, внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитарными клетками и повышенный апоптоз нейтрофилов при синдроме Чедиак-Хигаси.

8. С помощью цитофлюорометрических методов оценки киллинга и поглощения микробов показано, что при туберкулезе легких и хроническом рецидивирующем фурункулезе происходит снижение способности фагоцитов убивать С.albicans и St.aureus соответственно.

3.3.3. Заключение

Исследование функциональной активности фагоцитарных клеток при вторичной иммунологической недостаточности было проведено больным с хроническим рецидивирующим фурункулезом и туберкулезом легких. Для оценки основных этапов фагоцитоза применялись методы, основанные на проточной цитофл юорометрии.

Было установлено, что при данных патологиях отклонения поглотительной активности не так существенны, хотя при сравнении с контрольной группой здоровых людей разброс намного выше. Это наблюдается и для нейтрофилов, и для моноцитов.

Нарушение микробоцидных качеств фагоцитарных клеток свойственно для обеих патологий. Причем в зависимости от патологии заметно страдает либо бактерицидная, либо фунгицидная активность лейкоцитов. При хроническом рецидивирующем фурункулезе достоверно снижены показатели внутриклеточного киллинга St.aureus - микробного агента, наиболее часто высеваемого из отделяемого фурункула. Способность убивать С.albicans клетками этих больных сохранена в рамках нормы.

Туберкулез легких в противоположность сопровождается нормальными значениями бактерицидной активности фагоцитов. Фунгицидные качества нейтрофилов и моноцитов достоверно снижены при сравнении с донорскими показателями. Это в какой-то степени и определило патологию, т.к. природа защитного иммунитета против туберкулезной палочки очень близка к антимикотической защите, связанной с Т-клеточным иммунитетом, цитокинами и макрофагами.