Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Оптимизация лекарственной терапии на основании молекулярных признаков гетерогенности злокачественных опухолей

9 15-14/657

На правах рукописи

МОИСЕЕНКО ФЕДОР ВЛАДИМИРОВИЧ

ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ НА ОСНОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРИЗНАКОВ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

14.01.12- онкология 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет Российской академии наук» (ректор - академик Ж.И. Алферов)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, чл.-корр. РАН

Официальные оппоненты:

Болотина Лариса Владимировна

Тюляндин Сергей Алексеевич Дубина Михаил Владимирович

Ганцев Шамиль Ханафиевич

доктор медицинских наук, руководитель отделения химиотерапии Московский научно-

исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства

здравоохранения Российской Федерации член-корреспондент АН РБ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой онкологии с курсами онкологии и патологической анатомии Института последипломного образования, директор Научно-исследовательского института онкологии Башкирского государственного медицинского университета, директор Клиники онкологии Республиканского клинического онкологического диспансера Министерства здравоохранения Республики Башкортостан

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией количественной онкологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский научно-исследовательский институт онкологии».

24. /О. ¿LOtf ■

Защита состоится «_»_20_года в у f часов на заседании диссертационного

совета Д001.017.01 на базе ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» (115478, г. Москва, Каширское шоссе д.23).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» (115478, г. Москва, Каширское шоссе д.23) и на сайте и http://www.ronc.ru.

Автореферат разослан « €>£. 0& ,2015 ]

Корман Давид Борисович

| года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Шишкин Ю.В.

РОСС ГОСУДА1 БИБ Г

АКТУАЛЬНОСТЬ И РАЗРАБОТАННОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИИ-

Основными элементами лечения злокачественных опухолей являются: хирургический, лучевой и лекарственный методы (Давыдов и соавт., 2013; Каприн и соавт., 2015; DeVita et al., 2014). При этом только операции и, в редких случаях, лучевая и лекарственная терапии позволяют полностью излечить пациентов (Chabner, 2010). В силу биологических особенностей опухолевого роста даже при, так называемом, радикальном лечении далеко не всегда удается добиться излечения заболевания. Кроме того, достаточно часто новообразования выявляются на стадии, когда хирургическое удаление опухоли технически невыполнимо или нецелесообразно из-за распространения болезни (Давыдов и соавт., 2013; Каприн и соавт., 2015; Siegel et al., 2014). По этой причине особое значение приобретают системные методы воздействия и, в первую очередь, различные виды лекарственной терапии (DeVita & Chu, 2008).

История развития системных подходов к лечению солидных опухолей началась с гормоно- и биотерапии в XIX веке, а с середины XX века развивалась преимущественно за счет щггостатической терапии (Chabner & Roberts, 2005). Нисколько не преуменьшая роль системной цитотоксический терапии, которая до настоящего времени, увеличивая общую выживаемость и улучшая качество жизни, остается основным методом лечения для большинства пациентов с местно-распространенным или диссеминированным опухолевым процессом, можно утверждать, что ее эффективность достигла своего предела, появление новых значительно более эффективных универсальных цигостатических препаратов маловероятно, а случаи излечения или регрессы, продолжающиеся годами, являются исключением из общей массы клинических наблюдений (Galmarini et al., 2012). В чем причина? Почему не удается перевести процесс в хроническое состояние с возможностью длительного контроля заболевания? Одной из возможных причин является отсутствие высокоинформативньгх предиктивных маркеров, которые бы с высокой вероятностью позволяли прогнозировать эффект высокотоксичных цитостатиков у каждого конкретного больного на каждом из этапов его лечения (Luo et al., 2009). В результате подавляющее большинство пациентов получают в настоящее время химиотерапию эмпирически с низкой ожидаемой эффективностью.

Большие надежды возлагались на таргетную терапию, появившуюся в более или менее окончательном виде в конце XX века (Pierotti et al., 2010). Между тем, как показали многочисленные работы, в общей популяции эти средства, направленно блокирующие те или иные механизмы сигнальной трансдукции, оказались менее эффективны, чем стандартные химиотерапевтические препараты (Giaccone Sc Soria, 2013).

Выходом из этой ситуации до настоящего времени считается отбор пациентов, в первую очередь, на основании наличия того или иного молекулярного нарушения, которое в случае истинно таргетной терапии является одновременно и мишенью для препарата (как правило речь идет о драйверных мутациях) (Weinstein & Joe, 2008). В течение последних 20 лет появилось много примеров успешности этого подхода: иматиниб при хроническом миелоидном лейкозе с транслокацией BCR-ABL, гефитиниб, эрлотиниб и афатиниб при EGFR-мутированном немелкоклеточном раке легкого (HMPJI), кризотиниб при транслокациях ALK и другие (Pierotti et al., 2010). Данный подход получил название геномной стратификации и определяется принципом "одна мишень -один препарат". Также, в редких случаях ключевое нарушение, определяющее неполноценность одного из метаболических механизмов, которое и лежало в основе возникновения опухолевого процесса, может быть мишенью для противоопухолевого воздействия (DeVita et al., 2014). Примером такой ситуации являются наследственные опухоли молочной железы и яичников, для которых в нескольких предклинических и отдельных клинических работах показана более высокая чувствительность к алкилирующим агентам (Byrski et al., 2014; Osher et al., 2011). В связи с тем, что на настоящий момент число исследований активности алкилирующих агентов у больных эпителиальными опухолями яичников (ЭОЯ) и раком молочной железы (РМЖ) с наследственными мутациями BR.CA1 крайне невелико, вопрос об использовании этого маркера для определения тактики лечения пациентов остается открытым. Возможность сохранения чувствительности к алкилирующим агентам после прогрессирования на фоне нескольких линий лекарственной терапии также остается дискутабельной. Другим вопросом, ответ на который должен быть еще получен, является, возможно, более высокая токсичность этих препаратов у носителей мутаций BRCA1 в связи с неполноценностью систем репарации, в том числе, и в здоровых клетках организма.

Можно признать, что на последующем этапе изучения молекулярных мишеней было показано, что их наличие позволяет выделить лишь крайне узкую группу среди общей массы солидных опухолей, патогенез которых связан с многочисленными генетическими нарушениями (TCGA, 2012; TCGA, 2014). К сожалению, и наследственные нарушения, и активирующие мутации встречаются крайне редко, что, несмотря на перспективность их использования, оставляет открытым вопрос об индивидуализации лечения подавляющего большинства больных. Кроме того, далеко не все факторы стратификации позволяют достичь одинаково выраженных результатов. Так, несмотря на однозначную роль в лечении больных с HER2 позитивными опухолями молочной железы, анти-НЕЛ2 препараты не обладают таким же эффектом в монотерапии, как ингибиторы тирозинхиназы (ИТК) EGFR,

что, возможно, связано с гетерогенностью HER2 гиперэкспрессирующих опухолей и сложностью внутриклеточной активности этого сигнального каскада (Gonzalez-Angulo et al., 2007; Tolaney & Кгор, 2009; Vu & Claret, 2012).

С учетом того, что патогенез опухоли чаще всего определяется множественными нарушениями, затрагивающими различные сигнальные каскады и метаболические пути, оценка отдельных звеньев у больных без активирующих мутаций вероятнее всего не приведет к идентификации оптимальной группы для лечения тем или иным препаратом, выбора оптимальной тактики лечения. В качестве примера можно привести терапию колоректального рака антиЕСРЯ-моноклональными антителами, для которых показано несколько мутационных изменений, обладающих негативной предиктивной силой, или эндокринотерапию РЭ-позитивных опухолей молочной железы, где, несмотря на высокую экспрессию РЭ, её эффективность не превышает 60%. В подобной ситуации, когда нет единственного молекулярного нарушения, определяющего патогенез опухоли, возможным потенциальным направлением для улучшения отдаленных результатов является комплексная оценка молекулярной картины опухоли и микроокружения с целью выделения более узких подгрупп со сходным профилем и, как следствие, возможно сходной чувствительностью к терапии. В последние годы появились постгеномные технологии, которые теоретически могут помочь в решении этого вопроса. Данный подход основан на рассмотрении всего спектра молекулярных нарушений в ткани опухоли за счет высокопродуктивных методик полногеномного профилирования. Нам представляется, что именно выделение отдельных групп пациентов за счет использования подобных методов может помочь оптимизировать терапию и улучшить отдаленные результаты лечения больных без активирующих мутаций и идентифицированных факторов чувствительности и резистентности к существующим методам лечения.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение подходов повышения эффективности системной терапии путем идентификации и использования генетических признаков молекулярной гетерогенности злокачественных опухолей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Провести полногеномный анализ с целью идентификации молекулярных признаков гетерогенности РЭ/РП+ HER2+ РМЖ, аденокарциномы легкого, рака тела матки.

2. Исследовать патогенетические, клинические и молекулярно-генетические признаки подтипов РЭ/РП+ HER2+ РМЖ, аденокарциномы легкого, рака тела матки.

3. Исследовать возможности геномной стратификации на основании идентифицированных признаков гетерогенности для более эффективного использования лекарственного лечения злокачественных опухолей.

4. Оценить возможности геномной стратификации на основании наличия драйверных мутаций на примере монотерапии гефитинибом больных НМРЛ с наиболее частыми мутациями БвРЯ в условиях проспективного исследования.

5. Исследовать возможности увеличения эффективности цисгостатической терапии больных за счет применения геномной стратификации на основании наследственных мутаций ВЯСА1, на примере проспективного исследования монотерапии цисплатином в неоадъювантном режиме у больных РМЖ, а также митомицином С у больных распространенными ЭОЯ, получавших стандартную терапию.

6. Определить возможности для геномной стратификации на основании отсутствия негативных предиктивных факторов для анти-ЕОРЯ терапии за счет описания характера и частоты молекулярных нарушений генов КЛАЭ, ЫЮЧЭ и ЕЖАТ у больных неоперабельным РТК Северо-Западного региона РФ.

7. Исследовать взаимосвязь между геномной стратификацией больных неоперабельным РТК на основании отсутствия мутаций генов КАБЖАР и эффективностью монотерапии цетуксимабом в первой лечебной линии в рамках проспективного исследования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые определены патогенетические подтипы и молекулярная гетерогенность РЭ/РП+ ШЖ2+ опухолей молочной железы, легкого и эндометрия методами полногеномного анализа.

2. Впервые идентифицированы новые генетические признаки, характеризующие гетерогенность РЭ/РП+ НЕИ2+ опухолей молочной железы, легкого и эндометрия.

3. Показаны возможности повышения эффективности существующих методов системного лечения при оптимизации их применения за счет геномной стратификации.

4. Впервые показана более высокая эффективность цисгостатической терапии при использовании геномной стратификации больных злокачественными опухолями на основании наследственного компонента патогенеза. Определена эффективность и токсичность неоадъювантной терапии цисплатином у больных РМЖ с наследственными мутациями В11СА1, а также терапии митомицином С у больных ЭОЯ носителей мутаций ВЯСА1, получавших стандартное лечение.

5. Показана возможность геномной стратификации больных РТК в популяции больных Северо-Западного региона Российской Федерации на основании отсутствия мутаций генов RAS/RAF.

6. Впервые оценено значение геномной стратификации на основании мутаций RAS/RAF для терапии цетуксимабом у больных РТК, не получавших ранее системной терапии.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1. Эффективность поиска индивидуальных молекулярно-генетических признаков гетерогенности опухолей может быть повышена методом полногеномного экспрессионного анализа.

2. Применение полногеномных методов анализа позволяет выделить биологически детерминированные молекулярные подтипы, обладающие различными показателями выживаемости в рамках опухолей молочной железы, экспрессирующих РЭ и/или РП и гиперэкспрессирующих HER2, аденокарциномы легкого, опухолей тела матки.

3. Использование таких генетических маркеров как мутации EGFR, BRCA1, KRAS, NRAS, BRAF позволяет повысить эффективность индивидуализации лечения у больных злокачественными опухолями.

4. Применение алкилирующих агентов у больных с наследственными мутациями BRCA1, в частности, цисплатина у больных РМЖ и митомицина С у больных ЭОЯ позволяет улучшить результаты лечения относительно стандартной терапии.

5. Отсрочка высокотоксичной химиотерапии у пациентов с распространенным РТК возможна при использовании цетуксимаба у больных, стратифицированных на основании отсутствия мутаций в генах RAS/RAF.

МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В рамках настоящей работы были рассмотрены концептуальные подходы к улучшению результатов лечения больных солидными опухолями на основании использования выявленных ранее и поиска новых молекулярных признаков гетерогенности. Для достижения поставленной цели было проведено несколько этапов исследований.

На первом этапе были изучены возможности использования комплексных полногеномных методов молекулярно-генетического анализа для идентификации новых признаков молекулярной гетерогенности в рамках гомогенных групп злокачественных опухолей. С этой целью были изучены 1178 клинических записей больных РМЖ, которым

7

за период с 2005 года, когда ИГХ определение РЭ, РП и HER2 было введено в рутинную практику, по 2012 год было проведено лечение. На первом этапе из 1178 случаев было отобрано 235 пациентов (19.9%) на основании наличия гиперэкспрессии HER2. На втором этапе отбор пациентов выполнялся на основании максимальной экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона. Так, в первую очередь отбирались пациенты с уровнем экспрессии рецептора эстрогенов 8 баллов и рецептора прогестерона 8 баллов, затем -рецептора эстрогенов 8 баллов и рецептора прогестерона 7 баллов и так далее. Согласно принятым критериям было отобрано 76 образцов (32.3% от HER2 позитивных и 6.5% от всех больных), из них гистологический материал был доступен для 46 образцов, которые и были подвергнуты полногеномному экспрессионному профилированию. Каждый случай был описан с точки зрения основных клинических и морфологических прогностических характеристик: возраста, менопаузального статуса, стадии по TNM, метастатического поражения лимфатических узлов, размеров первичной опухоли, степени злокачественности опухоли, уровню экспрессии РЭ, РП, KÍ67, характеру послеоперационного лечения. Для большинства больных (п=40) были оценены показатели общей и безрецидивной выживаемости.

Полногеномный экспрессионный анализ был проведен в лаборатории Stanford Genome Technology Center (http://med.stanford.edu/sgtc/ CA, USA) при поддержке гранта Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 8294 от 10 августа 2012 г.). В ходе полногеномного транскриптомного анализа, проведенного с помощью чипа Aflymetrix Glue Grant human transcriptome, были получены данные экспрессии 6.9 миллионов олигонуклеотидов. Все процедуры анализа проводились согласно рекомендациям производителя в лаборатории Stanford Genome Technology Center (США).

С целью проверки полученных результатов и увеличения выборки больных «внутренний» набор экспрессионных профилей был расширен за счет публично доступных экспрессионных профилей. Основу для валидационного набора составили образцы, полученные из базы GEO, доступной по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, а также пакетов Bioconductor Experiment Data

(http://www.bioconductor.org/packages/release/data/experiment/). Отбор баз данных для включения в работу производился на основании сравнимости использованного метода полногеномного экспрессионного анализа с методом, использованным в нашей работе. Всего для валидации генетического профиля кластеризации из более 4000 образцов было отобрано 264. У 164 из 264 была доступна информация о безрецидивой выживаемости, оцененной как время от первичного хирургического лечения до регистрации прогрессирования заболевания.

Аналитический этап работы был проведен совместно с кафедрой информационных технологий ФГАОУВО Санкт-Петербургского национального исследовательского университета информационных технологий, механики и оптики. Для работы был использован следующий план, который включал в себя как общепринятые подходы к анализу данных полногеномного экспрессионного профилирования, так и собственные разработки. На первом этапе после получения результатов экспрессионного анализа была проведена иерархическая кластеризация экспрессионных данных 46 образцов («внутренний» набор образцов). Проводилось определение оптимального числа кластеров. Затем на основании степени различий между уровнем экспрессии генов была отобрана группа наиболее дифференциально экспрессированных генов, которая определяла разделение на кластеры. Параллельно был проведен анализ публично доступных баз данных экспрессионных профилей, полученных в различных исследованиях, на предмет получения данных профилирования для образцов с одновременной позитивной экспрессией РЭ и/или РП и гиперэкспрессией HER2. После преданалитической обработки данных была проведена кластеризация полученных из публичных баз данных профилей на основании собственного набора генов, определенного на первом этапе работы. Кроме того, полученные данные были подвергнуты независимому кластеризационному анализу.

Кроме того, возможности полногеномных методов молекулярного анализа для выявления подтипов опухолей были рассмотрены на примере изучения профиля экспрессии, мутаций генов 230 образцов аденокарциномы легкого и 248 пар образцов опухолей эндометрия. Для этих образцов было проведено полноэкзомное секвенирование на платформе Illumina HiSeq, а также полногеномный анализ копийности генов на чипе Affymetrix SNP 6.0. Также в образцах аденокарциномы легкого был оценен уровень трансверзии. При аналитической обработке полученных результатов была получена классификация опухолей в зависимости от выявленных молекулярных различий.

На втором этапе были изучены возможности применения геномной стратификации больных на основании драйверных мутаций, молекулярных предикторов чувствительности к цитостатическим препаратам, а также негативных предиктивных факторов для таргетной терапии.

Оптимизация таргетной терапии была изучена на примере геномной стратификации НМРЛ на основании наличия наиболее частых мутаций EGFR. С этой целью 552 больных неоперабельным НМРЛ были скринированы для включения в исследование эффективности гефитиниба. 70 больных с мутациями EGFR были включены в исследование и получали терапию гефитинибом. Всем больным проводился контроль безопасности и эффективности лечения. Включенные в исследование пациенты получали

гефитиниб 250 мг/сут внутрь постоянно. Больные продолжали прием препарата до прогрессирования заболевания, непереносимой токсичности, решения врача о прекращении приема препарата или до отказа больного от дальнейшего приема. У всех больных были оценены ЧОО, ВДП и OB, а также проведен корреляционный анализ этих показателей и особенностей клинической картины заболевания и его течения.

Молекулярный анализ проводился на базе лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава РФ. Исследование мутационного статуса производилось на генетическом материале, полученном из опухолевой ткани парафиновых блоков. В рамках работы производился поиск наиболее частых молекулярных нарушений EGFR: делеций 19 экзона (exl9del) и точковых замен в 21 экзоне (L858R).

Возможность повышения эффективности цитостатической терапии была рассмотрена на примере алкилирующих агентов при опухолях молочной железы и яичников у носителей наследственных мутаций BRCA1. На этом этапе на наличие наследственных нарушений гена BRCA1 было скринировано около 150 больных без экспрессии РЭ, РП и HER2 или наличием опухолей у близких родственников. Определение мутационного статуса BRCA1 производилось на базе лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава РФ согласно методике, используемой рутинно. Так, определялись наиболее частые в российской популяции мутации BRCA1 5382insC, 4153delA и 185delAG (Krylova et al., 2006). В ходе скрининга были идентифицированы 6 женщин, которым была проведена неоадьювантная терапия цисплатином 80-100 мг/м2. Кроме того, был проведен скрининг более 100 больных ЭОЯ, получавших стандартную терапию. Скрининг позволил идентифицировать 12 больных с наличием наследственных мутаций BRCA1, которые были включены в исследование и получали терапию митомицином С. Все больные, включенные на этом этапе, были охарактеризованы с точки зрения основных клинических характеристик. В рамках проведенных исследований была оценена токсичность лечения согласно критериям токсичности СТС АЕ v.4.0, а также эффективность терапии, в том числе, ЧОО по критериям RECIST v. 1.1., а также ВДП.

Также в рамках работы была рассмотрена возможность геномной стратификации на основании исключения негативных предикгивных факторов. С этой целью с 2013 по 2014 гг. было проведено проспективное одноцентровое однорукавное исследование 2-й фазы по оценке эффективности цетуксимаба у селектированных на основании молекулярного статуса генов KRAS, NRAS и BRAF больных неоперабельным и метастатическим РТК. В исследовании приняли участие больные, наблюдавшиеся в ГБУЗ «Санкт-Петербургский

клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)». Первичной целью исследования было: определить ВДП на фоне терапии цетуксимабом в первой линии лечебной терапии у больных неоперабельным и метастатическим РТК с «диким типом» генов KRAS, NRAS и BRAF. Статистическая гипотеза для определения числа пациентов в исследовании была основана на двухстадийном дизайне Флеминга (Fleming's two stage design) (O'Brien et al, 1979). Гипотезой, принятой в исследовании, было отсутствие прогрессирования у 30% больных в течение 6-ти месяцев (Р0), альтернативной гипотезой - 50% без прогрессирования в течение 6-ти месяцев (Р1). Альфа- и бета-ошибки были определены на уровне 5% и 20%, соответственно. Запланированный размер выборки составил 36 пациентов, при этом, на первом этапе необходимо было включить 19 пациентов. При отсутствии прогрессирования в течение 6-ти месяцев, как минимум у 11 пациентов на первом этапе альтернативная гипотеза подтверждалась, и исследование заканчивалось досрочно.

На первом этапе скрининга был проведен анализ клинических данных 250 пациентов с неоперабельным РТК. Для проведения молекулярного тестирования на основании клинических критериев были отобраны 76 пациентов. Определение всех мутаций производилось методом полимеразной цепной реакции. Для определения мутаций KRAS, NRAS и BRAF были использованы протоколы, опубликованные ранее и используемые в рутинной работе лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава РФ (Yanus et al., 2013). Отсутствие в опухоли молекулярных нарушений KRAS, NRAS и BRAF было показано для 33 пациентов. Из них 21 больной был включен в исследование и получал монотерапию цетуксимабом.

Таким образом, при проведении исследований, направленных на определение возможностей молекулярно-генетической диагностики в оптимизации лечения больных солидными опухолями, было проведен анализ более 2000 пациентов, на основании которого 417 были включены в клиническую часть данной работы.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Относительно невысокая эффективность стандартной лекарственной терапии определяется наличием генетической гетерогенности среди злокачественных опухолей солидного происхождения.

2. Стандартные подходы к назначению лекарственной терапии не учитывают существование патогенетически значимых молекулярных подтипов в каждой из форм злокачественных опухолей.

3. Применение постгеномных методов молекулярного анализа позволяет детально идентифицировать признаки молекулярных подтипов в гомогенных опухолевых группах.

4. Геномная стратификация больных по драйверных мутаций, маркеров чувствительности для цитостатической терапии, а также при отсутствии негативных признаков чувствительности позволяет повысить эффективность существующих методов лекарственной терапии.

СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ И АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Репрезентативная выборка, адекватная для анализа выживаемости длительность наблюдения за больными, включенными в работу, детальное исследование исходов лечения пациентов, а также последующий анализ с использованием современных методов статистического анализа свидетельствует о достоверной научной значимости полученных результатов. Разработанные подходы оптимизации лечения на основании идентификации гетерогенности опухолей за счет определения активирующих мутаций EGFR у больных НМРЛ, наследственных мутаций BRCA1 у больных РМЖ и ЭОЯ внедрены в клиническую практику и активно используются в специализированных учреждениях Санкт-Петербурга (ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России, ГБУЗ «Санкт-петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)»)

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе - 13 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, библиографического указателя и приложения. Список использованной литературы включает 4 отечественных и 378 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 36 таблицами и 28 рисунками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на I Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины -возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), XIV Российском онкологическом

конгрессе (Москва, 2010), VI Международном конгрессе «Региональная фармакотерапии -2011» (Санкт-Петербург, 2011), Отечественной школе онкологов «Важнейшие события в онкологии 2010 года» (Санкт-Петербург, 2011), Отечественной школе онкологов «Важнейшие события в онкологии в 2011 году» (Санкт-Петербург, 2012), выездной сессии отечественной школы онкологов «Таргетная терапия злокачественных опухолей» (Ростов, 2013), Республиканской конференции «Таргетная терапия злокачественных опухолей» (Сыктывкар, 2013), Всероссийский конференции «Лучшее по материалам международных симпозиумов и конгрессов 2013» (Сочи, 2013), Республиканской конференции «Таргетная терапия злокачественных опухолей - 2013» (Екатеринбург, 2013), Республиканской конференции «Таргетная терапия злокачественных опухолей - 2013» (Оренбург, 2014), международной конференции «Возможности персонализации лечения в онкологии» (Хабаровск, 2014), Республиканской конференции (Санкт-Петербург, 2014), Отечественной школе онкологов (Санкт-Петербург, 2014), Всероссийский конференции «Лучшее по материалам международных конференций и симпозиумов 2014: Запад-Восток» (Сочи, 2014), Международном конгрессе «Региональная фармакотерапия - 2014» (Санкт-Петербург, 2014), XVIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2014), сессии «Лечение немелкоклсточного рака легкого» республиканской конференции (Архангельск, 2014), сессии «Лечение рака молочной железы» республиканской конференции (Челябинск, 2014), региональной конференции Таргетная терапия НМРЛ» (Саранск, 2015), Международной междисциплинарной конференции «Немелкоклсточный рак легкого» (Москва, 2015).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Автор самостоятельно провел аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы, касающейся проблем индивидуализации лекарственной терапии солидных опухолей на основании идентификации молекулярных признаков гетерогенности. Разработаны дизайны исследований, а также проведен подбор и анализ клинического материала для проведения аналитических процедур. С участием автора проведены молекулярно-генетические исследования биологического материала больных солидными опухолями. Организованы и проведены проспективные исследования противоопухолевых препаратов. Статистическая обработка данных, интерпретация результатов исследований, а также оформления текста диссертационной работы проведены автором самостоятельно.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - «онкология», конкретно - пункту 6 и специальности 03.02.07 - «генетика», конкретно -пункту 17.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ПОЛНОГЕНОМНЫХ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА

Исследование полногеномного экспрессионного профиля дважды-позитивного рака

молочной железы

С цепью определения молекулярно-генетических особенностей гомогенной, с точки зрения клинических характеристик, группы опухолей было проведено комплексное исследование их фенотипа при помощи наиболее современного метода полногеномного экспрессионного профилирования. В рамках этой задачи было запланировано проведение двух этапов исследования. На первом этапе был проведен отбор 46 образцов операбельного РМЖ на основании критериев, описанных ранее. Они составили набор для проведения экспрессионного профилирования и формирования генетического профиля («сигнатуры») для последующего этапа, названного, условно, «внутренним». Проверка полученной сигнатуры проводилась на данных экспрессионных профилей, полученных из публично доступных баз данных. Выработанный на основании отбора больных по критериям, описанным ранее, из публичных баз данных набор был условно назван «публичным».

На первом - поисковом - этапе работы нами был проведен полногеномный экспрессионный анализ 46 образцов РЭ/РП-позитивного НЕК2-гиперэкспрессирующего РМЖ. Анализ был проведен по методике Glue Grant human transcriptome array (GG-H) (Stanford Genome Technology Center, CA, USA) в лаборатории Stanford Genome Technology Center (США) при поддержке гранта Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 8294 от 10 августа 2012 г. (Xu et al., 2011).

Иерархическая самокластеризация полученных экспрессионных данных выявила распределение экспрессионных профилей на два кластера. В полученной дендрограмме, представленной на рис. 1, по вертикальной оси представлены 1257 генов, организовавшихся по степени экспрессии в исследуемых образцах. По горизонтальной оси представлены отдельные исследованные случаи опухолей молочной железы. При этом на перекресте линий, соответствующих отдельным генам и образцам, можно видеть уровень экспрессии данного гена в конкретном образце. С целью графической презентации данных уровень экспрессии был закодирован: черному цвету соответствовало отсутствие экспрессии, а затем изменение цвета от зеленого до красного соответствовало повышению уровня экспрессии конкретного гена. Таким образом, на полученной дендрограмме визуально представлены закономерности профиля экспрессии, определившие кластеризацию образцов на выявленные группы.

а. ; в з * г 5 я я я е » г, й, ^ а, а ^ с, я а, г ь а. г = г. ; а, я.а 9 вз, в а, г г, з а, г, з, а а,

шшшшшшшчшшшшчиишн

Рисунок 1 - Обзорная дендрограмма 46 образцов дважды-позитивного РМЖ «внутреннего» набора. По вертикальной оси представлена дендрограмма генов, по вертикальной - отдельных образцов. Горизонтальной цветной полосой под дендрограммой образцов выделена принадлежность образцов к одному из двух идентифицированных кластеров

В ходе корреляционного анализа не было выявлено статистически значимых связей между кластером и любым из проанализированных клинических характеристик, что говорит о невозможности дифференцировать кластеры на основании клинических различий.

Для образцов, распределенных на кластеры, был проведен анализ безрецидивной выживаемости. Данные о показателях выживаемости были доступны для 40 из 46 больных. Медиана времени наблюдения составила 45.3 мес. (11.5-113.5). Медианы безрецидивной и общей выживаемости в исследуемой группе больных достигнуты не

были. Регрессионннный анализ безрецидивной и общей выживаемости, в зависимости от кластера по методу Каплана-Мейера, представлен на рис. 2 и 3, соответственно.

Несмотря на то, что статистически значимых различий в безрецидивной выживаемости больных, относящихся к разным кластерам, выявлено не было (р = 0.123), на рис. 2 видна тенденция к большему безрецидивному интервалу у больных, отнесенных в результате анализа к черному кластеру.

Рисунок 2 - Кривые безрецидивной выживаемости у больных, включенных в полногеномный экспрессионный анализ (п = 40). Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера. Черная линия соответствует первому кластеру, красная - второму. Медианы не достигнуты (р = 0.123)

Рисунок 3 - Кривые общей выживаемости у больных, включенных в полногеномный экспрессионный анализ (п = 40). Черная линия соответствует первому кластеру, красная - второму. Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера. Медианы не достигнуты (р = 0.955)

С целью определения биологической природы выявленных кластеров среди больных дважды-позитивным РМЖ было проведено дополнительное исследование экспрессионной активности сигнальных каскадов, описанных ранее в работе Ни н соавт. как патогенетически значимых (Ни et al., 2006). При этом было выявлено, что первый кластер характеризовался более сильной экспрессией генного кластера интерферон-связанных генов (медиана экспрессии для интерферон-связанных генов составила для первого кластера 7.09, а для второго - 6.91). Аналогичные показатели для уровня экспрессии HER2 составили 7.44 и 7.34 соответственно. В то же время, второй кластер характеризовался более сильной экспрессией люминальных/РЭ+ генов: 7.16 против 7.00.

Для проведения последующей кластеризации образцов «публичного» набора дважды-позитивного РМЖ на основании дифференциальной экспрессии генов между двумя кластерами был получен генетический профиль из 50 генов.

Для исключения случайного характера выявленного нами распределения образцов в молекулярно-генетические кластеры проведен дополнительный анализ полученной «сигнатуры» генов на независимой группе пациентов. С этой целью в работу были включены экспрессионные профили из «публичных» наборов, полученных из опубликованных ранее исследований. На основании процедуры, описанной для образцов «внутреннего» набора, были получены экспрессионные профили 264 образцов, характеризовавшихся одновременной экспрессией РЭ/РП и гиперэкспрессией HER2.

Полученные экспрессионные профили были кластеризованы на основании «сигнатуры» наиболее различно эспрессированных между группами генов. В ходе анализа были также получены два кластера. Важно отметить, что полученная из публичных наборов экспрессионных профилей группа больных была сопоставима по основным прогностическим факторам с «внутренней». Это позволило нам допустить возможность сопоставления полученных данных во «внутренней» и «публичной» группах.

Корреляционный анализ клинических характеристик и результатов кластеризации образцов значимых закономерностей не выявил.

Для части больных были доступны показатели выживаемости. Так, безрецидивная выживаемость была оценена у 164/264 (62.1%), а общая выживаемость - у 86/264 (32.5%). Медиана безрецидивной выживаемости была достигнута только для пациентов, вошедших во второй кластер, и составила 2441 день (81.4 месяца или 6.7 года). Медианы общей и безрецидивной выживаемости для первого кластера и общей популяции больных, включенных в анализ, достигнуты не были. Медиана времени наблюдения за больными составила 44.4 месяца. При регрессионном анализе общей выживаемости статистически значимых различий выявлено не было (р = 0.677). Анализ безрецидивной выживаемости

выявил статистически значимую разницу между выявленными кластерами (р = 0.01). При этом кривые распределились так же, как в нашей группе. Кривые Каплана-Мейера представлены на рис. 4. Оценка ОВ выявила отсутствие статических различий между группами (рис. 5).

время (месяцы)

Рисунок 4 - Кривые безрецидивной выживаемости больных (п = 164). Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера безрецидивной выживаемости у больных, отобранных из публично доступных баз данных. Черная линия соответствует первому кластеру, красная - второму (р = 0.01)

время (месяцы)

Рисунок 5 - Кривые общей выживаемости больных (п = 86). Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера безрецидивной выживаемости у больных, отобранных из публично доступных баз данных. Черная линия соответствует первому кластеру, красная - второму (р = 0.677)

Интересно, что при проведении кластеризации с использованием 50-тигенного профиля, разработанного на основании дифференциальной экспрессии образцов

«внутреннего» набора, вновь полученные кластеры (первый - черный и второй - красный) соответствовали противоположным кластерам в кластеризации «внутренних» данных. Это наблюдение подтверждается тем, что интерферон- и HER2-reHbi были более интенсивно экспрессированы в красном кластере (медиана экспрессии 5.55 против 5.45 для интерферон-связанных генов; 5.32 и 5.11 для HER2, связанных соответственно). Кроме того, в красном кластере было представлено значительно больше образцов HER2 молекулярного подтипа.

Описанный ранее набор экспрессионных профилей, полученный из публичных баз данных, был также подвергнут независимому от образцов «внутреннего» набора анализу. С этой целью был проведен анализ закономерностей экспрессии «публичного» набора независимо от полученных ранее генетических наборов - независимая иерархическая кластеризация. В ходе нее были выделены четыре кластера. С целью облегчения анализа визуализации и сравнения с результатами разделения группы образцов «внутреннего» набора, общий набор генов был редуцирован до набора, описанного ранее и представленного в работе Ни Z. и соавт. (Ни et al., 2006). Распределение клинических особенностей образцов по кластерам представлено в табл. 1. Нельзя не обратить внимания на крайнее сходство в распределении изученных клинических характеристик между кластерами.

Несмотря на то, что медиана безрецидивной выживаемости была достигнута только для одного кластера, обращает на себя внимание, что черный кластер характеризовался лучшими показателями выживаемости, в то время как красный и зеленый - худшими. Интересно, что при регрессионном анализе были выявлены значительные различия в безрецидивной выживаемости между кластерами (р = 0.0047). Кривые Каплана-Мейера для безрецидивной выживаемости в зависимости от кластера представлены на рис. 6.

В связи с выявлением значимых различий в выживаемости был проведен анализ биологических особенностей полученных кластеров за счет анализа экспрессионной активности патогенетически важных биологических каскадов. Так, для кластера с самым длительным временем безрецидивной выживаемости был выявлен самый высокий уровень экспрессии интерферон-связанных генов. При анализе составляющих этот кластер молекулярных подтипов было показано, что он состоит в большой степени из образцов, охарактеризованных как НЕЛ2-подтип (19/39 - 48.7%). При этом второй по уровню безрецидивной выживаемости кластер - синий - характеризовался высокой активностью генов, принадлежащих к кластеру люминальных/РЭ+ согласно Ни Z. и соавт. (Ни et al., 2006).

Таблица 1 - Клинические характеристики больных «публичного» набора образцов дважды-позитивного РМЖ, распределенные при независимой

кластеризации

Характеристика Всего Кластер 1 Кластер 2 Кластер 3 Кластер 4 Р

п (%) п (%) п (%) п (%) п (%)

Число больных 264 (100%) 39 (14.7%) 79 (29.9%) 83 (31.4%) 62 (23.4%)

Возраст, годы 223 (84.4%) 33 (84.6%) 62 (78.5%) 75 (90.4%) 52 (83.9%) 0.724

Средний 53 55 52 53 52

Мин - макс 24-88 33-76 24-84 29-85 32-88

<50 102 (45.7%) 15 (45.5%) 29 (46.7%) 29 (38.7%) 28 (53.8%)

>50 121 (54.3%) 18 (54.5%) 33 (53.2%) 46 (61.3%) 24 (46.2%)

Размеры опухоли, мм 118 (44.7%) 23 (59.0%) 30 (38.0%) 36 (43.4%) 29 (46.8%) 0.129

<20 41 (34.7%) 8 (34.8%) 14 (46.7%) И (30.6%) 8 (27.6%)

>20 77 (65.3%) 15 (65.2%) 16 (53.3%) 25 (69.4%) 21 (72.1%)

Средний 33.8 28.7 39.2 25.9 42

БО 31.7 24.5 46.1 9.1 35

Поражение лимфатических узлов 127 (48.1%) 21 (53.8%) 35 (44.3%) 45 (54.2%) 25 (40.3%) 0.106

Нет 78 (61.4%) 15 (71.4%) 21 (60.0%) 22 (48.9%) 19 (76.0%)

Да 49 (38.6%) 6 (28.6%) 14 (40.0%) 23 (51.1%) 6 (24.0%)

Безрецидивная выживаемость, дни 164 (62.1%) 28 (71.8%) 46 (58.2%) 46 (55.4%) 43 (69.4%) 0.004

Медиана не достигнута не достигнута 2441 не достигнута не достигнута

Число рецидивов 50 (30.5%) 2 (7.1%) 18 (39.1%) 20 (43.5%) 10 (23.3%)

Общая выживаемость, дни 86 (32.5%) 6 (15.4%) 34 (43.0%) 17 (20.5%) 28 (45.2%) 0.688

Медиана не достигнута не достигнута не достигнута не достигнута 2372

Число смертей 17 (19.8%) 0 (0%) 8 (23.5%) 4 (23.5%) 5 (17.9%)

Молекулярный подтип Базапьный 13 (4.9%) 4 (10.2%) 1 (1.3%) 8 (9.6%) 0 (0%) < 0.001

НЕЯ2 88 (33.3%) 19 (48.7%) 14 (17.7%) 48 (57.8%) 7 (11.3%)

Люминальный А 39 (14.8%) 2(5.1%) 29 (36.7%) 1 (1.2%) 7 (11.3%)

Люминапьный В 66 (25.0%) 5 (12.8%) 8 (10.1%) 12 (14.5%) 40 (64.5%)

Нормальный или неклассифицируемый 58 (22.0%) 9 (23.0%) 27 (34.1%) 14 (16.9%) 8 (12.9%)

Рисунок 6 - Безрецидивная выживаемость больных, отобранных из публично доступных баз данных (п = 164). Регресионный анализ по методу Каплана-Мейера. Черная кривая соответствует первому кластеру, красная - второму, зеленая - третьему, а синяя - четвертому (р = 0.004)

Таким образом, полногеномное экспрессионное профилирование позволило показать гетерогеннность с точки зрения фенотипических свойств опухолей, характеризующихся позитивной экспрессией РЭ/РП и гиперэкспрессией HER2.

Комплексный анализ профиля молекулярных нарушений аденокарциномы легкого и рака тела матки

Проведение современных полногеномных молекулярно-генетических исследований является дорогостоящим и трудоемким процессом, предъявляющим крайне высокие требования к качеству изучаемого биологического материала. С целью получения максимально полной картины генетических нарушений в опухолях различной локализации при участии Национального противоракового института (National Cancer Institute, USA) была предпринята попытка объединить наиболее активные онкологические центры по всему миру для проведения наиболее современного и всестороннего анализа генетических особенностей различных опухолей.

В рамках проекта The Cancer Genome Atlas Research Network (TCGA) на базе нескольких крупных университетов США был проведен комплексный анализ молекулярных нарушений опухолей легкого железистой природы и опухолей тела матки. С целью определения профиля молекулярных нарушений было использовано несколько методов генетического анализа, среди которых полноэкзомное секвенирование, анализ экспрессии мРНК. В программе приняли участие многие научные центры США, при этом, отдельные этапы работы были проведены в различных учреждения.

Полноэкзомное секвенирование опухолей легкого железистого происхождения выявило высокую частоту молекулярных нарушений в данном виде злокачественных опухолей. Средняя частота мутаций составила 8.87 мутаций на мегабаз (megabase) (Мб) ДНК (0.5-48, среднее 5.78). Частота не синонимичных нарушений составила 6,86 мутаций на Мб. На первом этапе из анализа были исключены мутации, не определяющие патогенетические нарушения в опухолевых клетках. В итоге было выявлено 18 генов, несущих мутации наиболее часто. Первым по частоте молекулярных нарушений был ген ТР53, в котором мутации были выявлены в 56% случаев. Высокая частота мутаций была также в генах KRAS (33%) и EGFR (14%). При этом нарушения в одном из генов практически всегда исключали мутации во втором. Также высокая частота мутаций была показана для генов BRAF (10%), PI3K (7%), МЕТ (7%) и RIT1 (2%). Структурным нарушениям были подвержены и многие гены-опухолевые суппрессоры, среди которых: STK11 (17%), КЕАР1 (17%), NF1 (11%), RB1 (4%) и CDKN2A (4%).

Интересно, что на молекулярном профиле в значительной степени отражалось курение, что, по-видимому, отражает ключевой механизм канцерогенеза для каждой конкретной опухоли. При этом опухоли, ассоциированные с курением, характеризовались высокой частотой замен цитозина на аденин (С > А). На основании частоты С > А все опухоли были классифицированы на опухоли с высоким (ТН, п = 269) и низким (TL, п = 144) уровнем трансверзии нуклеотидов. Опухоли, относящиеся к разным группам, в значительной степени различались по профилю мутационных изменений. Так, мутации KRAS значительно чаще встречались в группе ТН (р = 2.1 х Ю-13), а мутации EGFR (р = 3.3 х Ю-6), PI3K и RB1 (р < 0.05) - в TL. Все транслокации ALK (3/230), ROSI (4/230) и RET (2/230) были выявлены в группе с низким уровнем трансверзии нуклеотидов (р = 1.85 х 10"4). Кроме того, в результате анализа копийности генов была выявлена значимая по частоте амплификация генов NKX2-1, TERT, MDM2, KRAS, EGFR, МЕТ, CCNE1, CCND1, TERC и МЕСОМ.

Большинство выявленных молекулярных нарушений проявляются, в том числе, на уровне экспрессии соответствующих мРНК. Совместный анализ мутационных изменений ДНК и транскриптомного анализа РНК позволяет выявить механизмы фенотипических изменений в опухоли. Проведенный в рамках этой работы анализ показал, что 75% мутаций, выявленных на этапе полноэкзомного секвенирования, выявляются также на уровне соответствующих транскриптов РНК.

Поиск активирующих мутаций и, в частности, мутаций в генах тирозинкиназ (PTK/RAS/RAF) в связи с высокой эффективностью низкомолекулярных ингибиторов являлся одним из приоритетных направлений проекта. Данный вид молекулярных

нарушений довольно часто выявлялся в опухолях легкого железистого происхождения. Так, драйверные нарушения были выявлены в 62% опухолей (143/230). Наиболее частыми среди них были мутации KRAS (32%, п = 74), EGFR (11%, п = 26) и BRAF (7%, п = 16). Кроме того, было показано наличие активирующих инсерций и других мутаций ERBB2 (п = 5), МАР2К1 (п = 2), NRAS (n = 1) и HRAS (n = 1). Секвенирование мРНК выявило наличие драйверных нарушений - транслокации МЕТ (п = 10), ROS1 (п = 4), ALK (п=4) и RET (п = 2). Кроме того, другие мутационные изменения, которые предположительно могут играть роль драйверных, были выявлены в 38% случаев.

Среди интересных наблюдений, выявленных в рамках данной работы, можно отметить высокую частоту мутаций ТР53, КЕАР1, NF1 и RIT1 в опухолях без активирующих мутационных изменений (р < 0.01).

Таким образом, проведенный анализ неплоскоклеточных опухолей легкого с помощью методов мутационного анализа, оценки экспрессии мРНК, копийности генов показал, во-первых, выраженную гетерогенность карцином в пределах одной гистологической формы, во-вторых, очевидную ограниченность молекулярно-генетического анализа отдельных драйверных мутаций, которые выявляются только у небольшой группы пациентов, в-третьих, необходимость полногеномного анализа с помощью технологий Next-generation sequencing для поиска потенциальных предиктивных маркеров в опухоли у конкретного больного.

Другим видом злокачественных опухолей, при которых был проведен комплексный анализ молекулярных нарушений, был рак эндометрия. Молекулярно-генетический анализ опухолей эндометрия включал в себя несколько этапов: определение копийности генов, полноэкзомное секвенирование, экспрессионный анализ микроРНК, мРНК, белков и ДНК метилирования, цитогенетические исследования аберраций генов, а также анализ системных нарушений сигнальных каскадов.

На первом этапе был проведен анализ копийности генов на опухолевом материале, полученном от 373 пациентов. У 307 больных опухоль была представлена эндомеггриоидным вариантом, а у 66 - серозным. При иерархической кластеризации полученных данных было получено 4 кластера. Первые три кластера состояли практически исключительно из опухолей эндометриоидной природы (97%). Отнесенные к первому кластеру опухоли характеризовались низким числом молекулярных нарушений -мутации встречались менее, чем в 0.5% генома. Анализ копийности в образцах, отнесенных ко 2-му и 3-му кластерам, состоявших преимущественно из опухолей эндометриоидной природы, выявил, что амплификация lq чаще встречались в опухолях третьего кластера, который характеризовался более низким ВДП опухоли (р = 0.003).

Опухоли четвертого кластера были преимущественно серозного происхождения и обладали наихудшим ВДП среди всей группы, включенной в исследование (р = 0.003).

Таким образом, по совокупности генетических нарушений опухоли эндометрия кластеризовались в четыре группы, обладавшие различными показателями ВДП (р = 0.0004).

На втором этапе было проведено полноэкзомное секвенирование 248 пар опухолевых и нормальных образцов. В рамках этой части работы было проведено определение мутационных изменений и микросателлитной нестабильности. Так же, как и на первом этапе, по совокупности нарушений опухоли разделились на 4 кластера. К первому кластеру были отнесены образцы с крайне высоким числом молекулярных нарушений (ультрамутабельные) - 232 х 10"6 мутаций на Мб, ко второму -гипермутабельные - с высоким числом изменений - 18 х 10"6 мутаций на Мб.

Среди всего спектра изученных генов были выделены 48 генов с дифференциальной экспрессией для четырех выделенных подтипов. Так, ген АШ5В, который входит в состав домена ARID, был значительно чаще мутирован при микросателлитной нестабильности (23.1%), чем при MSS (5.6%) или SCNA опухолях серозного происхождения (0%). Мутации ТР53 выявлялись практически исключительно при опухолях серозного происхождения.

Во всех опухолях эндометрия был проведен экспрессионный анализ мРНК (п = 333), экспрессии белков (п = 293), микроРНК (п = 367) и метилирования ДНК (п = 373). Кластеризация результатов экспрессионного профилирования мРНК выявила наличие трех кластеров, названных «митотический», «гормональный» и «иммунореактивный».

Таким образом, интегративный геномный и протеомный анализ 373 эндометриальной карциномы позволил получить более глубокое понимание биологии этого вида опухолей, а также дополнил существующую классификацию опухолей с непосредственным влиянием на тактику терапии. Ультравысокая частота мутационных нарушений, стабильность микросателлитов были определены как основные характеристики нового подтипа POLE. Кроме того, на описываемом материале была впервые проведена оценка копийносги генов в соматических клетках, которая выявила низкую частоту этих нарушений в опухолях эндомегриодной природы и высокую частоту в серозных опухолях. При этом, повышенное число копий коррелировало с низким временем до прогрессирования опухоли.

Кроме того, при опухолях тела матки была выявлена крайне высокая частота мутаций PI3K. Данный вид опухоли имел целый ряд сходных характеристик с опухолями толстой кишки. Так, была показана относительно высокая частота микросателлитной нестабильности (40% при опухолях эндометрия и 11% при опухолях толстой кишки), мутации POLE присутствовали в обоих видах опухолей (7% против 3%) и приводили к ультравысокой общей частоте мутаций.

Обобщая все вышесказанное, можно однозначно сказать, что проведенный анализ позволил идентифицировать в пределах одной нозологической формы опухолей тела матки несколько молекулярных подтипов, характеризовавшихся различным профилем молекулярных нарушений, что может иметь непосредственное применение с точки зрения клинического использования. Так, около 25% опухолей, трактуемых на основании морфологического исследования как высокодифференцированные эндометриодные опухоли, при молекулярном анализе имеют высокую частоту мутаций ТР53 и копийность генов, что делает их, в большей степени, сходными с опухолями тела манси серозной природы и определяет более агрессивное лечение даже на ранних стадиях.

СТРАТИФИКАЦИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛЕЙ ЛЕГКОГО

К ТАРГЕТНЫМ ИНГИБИТОРАМ EGFR НА ОСНОВАНИИ НАЛИЧИЯ МУТАЦИЙ EGFR

Возможность геномной стратификации пациентов на основании драйверных молекулярных нарушений было изучена на примере проспективного исследования эффективности гефитиниба у больных НМРЛ с наиболее частыми активирующими мутациями EGFR.

В исследование было включено 70 пациентов. Частота выявления различных типов мутаций (делеция в экзоне 19 или точковая замена в экзоне 21) не зависела от пола (р = 0.686), возраста (р = 0.510), курения (р = 0.936).

В проведенном нами исследовании общая ЧОО составила 32.7% (23/70 больных). Частичные регрессы заболевания были выявлены у 20/70 пациентов (28.5%), а полные регрессы - у 3/70 (4.2%). Кроме того, стабилизация заболевания была достигнута у 47/70 больных, что составило 67.3%. Таким образом, контроль заболевания (ПР + ЧР + стабилизация) в рамках исследования составил 100%. Суммированные результаты оценки частоты объективных ответов на фоне исследуемой терапии представлены в табл. 2.

Таблица 2 - Эффективность терапии гефитинибом у больных немелкоклеточным

раком легкого с наиболее частыми активирующими мутациями ЕвРЯ

Ответ на лечение Число больных (п = 70) Когорта 2008-2011 гг. (п = 25) Когорта 2013-2015 гг. (п = 45)

Полный регресс (ПР) 3 (4.2%) 2 (4.0%) 1 (2.2%)

Частичный регресс (ЧР) 20 (28.5%) И (44.0%) 9 (20.0%)

Стабилизация (Стаб) 47 (67.3%) 12 (48.0%) 35 (77.8%)

Прогрессирование (П) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Контроль заболевания (ПР + ЧР + Стаб) 70 (100%) 25 (100%) 45 (100%)

У всех больных в рамках исследования были оценены показатели выживаемости на фоне терапии гефитинибом. Так, медиана ВДП опухоли составила 15.8 мес. (95% доверительный интервал (ДИ): минимально - 11.9 мес., максимально - 19.7 мес.). При этом 34/70 больных (48.5%) продолжают прием препарата (от 100 до > 600 дней). Интересно, что у двух больных с верифицированным диссеминированным раком легкого лечение гефитинибом продолжается до настоящего момента более 76 и 71 месяца без признаков прогрессирования, что составляет 6.3 года в первом случае и 5.8 лет во втором). Результаты регрессированного анализа ВДП опухоли с помощью метода Каплана-Мейера представлены на рис. 7. Кроме того, у этих больных была оценена также общая выживаемость (рис. 8). Медиана ОВ в рамках исследования составила 20.0 мес. (95% ДИ: минимально - 14.0 мес., максимально - 26.0 мес.).

У больных с мутацией ЕвРЯ не было выявлено значимых корреляций между ответом опухоли на проводимое лечение и полом (р = 0.084), возрастом (р = 0.066), курением (р = 0.748), числом зон метастазирования (р = 0.840) и линией использования гефитиниба (р = 0.188). При этом, более выраженный ответ наблюдался у больных в более хорошем состоянии на момент начала лечения (р = 0.036), а также у больных с делецией экзона 21 (р = 0.025). Длительность ВДП также не коррелировала с клиническими характеристиками заболевания, в частности, полом (р = 0.641), возрастом (р = 0.469), курением (р = 0.737), общим состоянием (ЕССЮ) (р = 0.445), типом мутации (р = 0.607), числом зон метастазирования (р = 0.186), линией использования гефитиниба (р = 0.051), а также наличием локального лечения в течение терапии гефитинибом (р = 0.764).

3 6 17 « I* М 16 4! <1 Й СО

Время (месяцы)

Рисунок 7 - Кривая времени до прогрессировали опухоли у больных с наличием одной из наиболее частых активирующих мутаций ЕОБЯ, получавших гефитиниб в месяцах (п = 70). Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера. Медиана времени до прогрессирования - 15.8 мес.

Рисунок 8 - Кривая общей выживаемости больных с наличием одной из наиболее частых активирующих мутаций ЕСРЯ, получавших гефитиниб в месяцах (п = 70).

Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера.

Медиана общей выживаемости - 20.0 мес.

Сходные результаты были получены и для общей продолжительности жизни больных, получавших терапию гефитинибом. Так, пол (р = 0.138), возраст (р = 0.466), курение (р = 0.094), тип мутации (р = 0.461), число зон метастазирования (р = 0.758), линия использования гефитиниба (р = 0.984), а также наличие локального лечения (р = 0.764) не были связаны с общей продолжительностью жизни больных. Тем не менее, была показана достоверная связь между более высокой выживаемостью больных и состоянием на момент начала лечения (ЕССЮ) (р = 0.023).

Кроме того, был проведен внутригрупповой анализ, в рамках которого были сравнены отдаленные показатели выживаемости между когортами больных, включенных на первом и втором этапах. В ходе анализа были выявлены статистически достоверные различия как во ВДП опухоли (р < 0.0001), представленные на рис. 9, так и в OB (р = 0.001) - рис. 10. С целью выявления причин, определяющих столь выраженные различия в показателях выживаемости между группами, было проведено сравнение основных клинических показателей между группами методом хн-квадрат. Так, в первой когорте было достоверно больше больных с бронхиолоальвеолярной формой рака легкого (2/25 против 2/45, р = 0.045). Во второй когорте больных было больше пациентов с поражением костей (р = 0.042), головного мозга на момент начала лечения (р = 0.003). Кроме того, состояние больных на момент начала терапии было несколько лучше в первой когорте пациентов (р = 0027). С учетом критериев для проведения лечения, часть больных во второй когорте получала терапию гефитинибом во второй линии (8/45). Кроме того, в первой когорте на фоне терапии отмечалась более высокая частота и выраженность кожной токсичности (р = 0.005), диареи (р = 0.002), а также паранихиев (р = 0.013).

Рисунок 9 - Кривая времени до прогрессирования опухоли у больных с наличием активирующих мутаций БвРЯ, получавших гефитиниб в месяцах (п = 70). Зеленая линия (когорта 1) - больные, получавшие лечение в рамках рутинной практики (медиана не достигнута); синяя линия (когорта 2) - больные, получавшие лечение в рамках проспективного исследования (медиана 8.5 мес.) (р < 0.0001)

Время (месяцы)

Рисунок 10 - Кривая общей выживаемости больных с наличием мутаций EGFR, получавших гефитиниб в месяцах (п = 70). Зеленая линия (когорта 1) - больные, получавшие лечение в рамках рутинной практики (медиана 30.0 мес.); синяя линия (когорта 2) - больные, получавшие лечение в рамках проспективного исследования (медиана 14.0 мес.) (р < 0.0001)

Важно отметить, что между группами не было различий в частоте проведения цитотоксической терапии после прогрессирования на фоне гефитиниба (р = 0.455), общего числа линий лечения (р = 0.898), а также использовании локального лечения на фоне терапии гефитинибом (р = 0.366), что могло бы в первую очередь отразиться на показателях выживаемости.

С целью, выявления факторов, влияющих на показатели ВДП в группах был проведен монофакторный анализ методом log-rank для следующих клинических показателей: пол (р = 0.579), ECOG (р = 0.443), вид мутации (р = 0.696), проведение лечения после окончания гефитиниба (р = 0.073), локального лечения на фоне ИТК (р = 0.266), который не позволил выявить влияние одного из показателей.

Таким образом, в рамках проведенного нами исследования было показано, что геномная стратификация больных железистыми формами неоперабельного и метастатического HMPJI на основании наличия наиболее частых мутаций EGFR позволяет повысить эффективность лечения за счет использования таргетного ИТК EGFR. При этом, для небольшой, с точки зрения частоты выявления, группы пациентов удалось в значительной степени повысить частоту объективных ответов, увеличить ВДП и ОВ относительно исторического контроля в виде цитостатической терапии (8-12 месяцев), приведенного в обзоре литературы. При этом, важным фактором, влияющим на показатели выживаемости, по-видимому, является тактический подход к лечению таких пациентов.

ГЕНОМНАЯ СТРАТИФИКАЦИЯ НА ОСНОВАНИИ МАРКЕРОВ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

С целью подтверждения возможности использования наследственных мутаций BRCA1, как маркера геномной стратификации опухолей, нами было проведено два проспективных исследования цитостатических препаратов с алкилирующим механизмом действия у больных РМЖ и ЭОЯ, ассоциированным с наследственными мутациями BRCA1.

/

На первом этапе в результате скрининга более 100 больных РМЖ с подозрением на наследственный характер опухоли в исследование было включено б пациентов (б%). У всех больных опухоли были локализованными (ранними или местно-распространенными) и отсутствовала экспрессия РЭ, РП и HER2 (трипл-негативные).

Все больные в качестве неоадьювантной терапии получали цисплатин в монорежиме с целью уменьшения размеров первичной опухоли. Большинство больных получили 5 циклов терапии (5/6), при этом, у одной больной полное исчезновение опухоли по данным маммографии было выявлено после 4-х циклов терапии, в связи с чем проведение неоадьювантной терапии было прервано после 4-го цикла. Одной больной лечение было продолжено до 6-ти циклов в связи с отказом пациентки от предложенного хирургического лечения. Схема лечения состояла из монотерапии цисплатином в дозе 80100 мг/м2 1 раз в 3-4 недели. В случае выраженных нежелательных явлений (3-4 степень по критериям СТСАЕ v.4.0) интервал увеличивался до 4-х недель.

У всех больных на фоне терапии отмечались те или иные нежелательные явления. Наиболее частым видом токсичности была астения, которая наблюдалась у 6/6 (100%) пациентов. Несмотря на общее умеренное проявление этого вида токсичности (1 степень -1/6; 2 степень - 4/6), у одной больной степень токсичности была выраженной - 3 степень, что потребовало редукции дозы цисплатина на 20% после 2-х циклов лечения. Другим частым видом токсичности, который является ожидаемым на фоне этого вида терапии, являются гематологические осложнения. Так, у 5/6 больных наблюдалась нешропения, у 2/6 - анемия и у 1/6 - тромбоцитопения. Здесь важно отметить, что миелотоксичность была относительно умеренной в исследуемой когорте больных: у 3/6 больных -максимальная степень выраженности была 2-ая и лишь у одной больной - 3-я; поражение красного ростка кроветворения, выявленное у 2-х больных соответствовало 3 степени. Возможно, одним из объяснений относительно умеренной выраженности миелотоксичности является то, что 2/6 пациентам после 1-го эпизода нейтропении проводилась профилактическая терапия колониестимулирующими факторами.

Практически у всех больных (5/6) на фоне проводимого лечения отмечались проявления эмегогенной активности цисплатина. Так, несмотря на полноценную премедикацию с использованием трех препаратов (апрепитант + ондансетрон + дексаметазон) тошнота наблюдалась у 5/6 пациентов, при этом, у 1 больной тошнота была выражена сильно (3 степень) и сопровождалась рвотой 1 степени.

Интересно, что относительно ожидаемая токсичность, связанная с наследственным характером мутаций и неполноценностью репаративных механизмов во всех клетках организма, не была выявлена в ходе работы. Так, ни периферическая полинейропатия, ни ототоксичностъ не наблюдались ни у одной больной.

Перед проведением хирургического лечения всем больным была проведена оценка регресса опухоли по критериям RECIST 1.1. При этом, у 1 больной был выявлен полный регресс опухоли, а у 5/6 больных - частичный регресс. Заметим, что у всех больных с частичным регрессом опухоли наблюдалось уменьшение размеров образований более чем на 40% (от 42% до 60%).

Первичной целью работы была оценка частоты полных патоморфологических регрессов опухоли по данным исследования операционного материала согласно критериям Miller-Payne. Патоморфологический ответ расценивался как полный в случае отсутствия признаков остаточной инвазивной карциномы в операционных образцах первичной опухоли и лимфатических узлов. Оценка степени патоморфологического регресса была проведена у 5/6 больных, которым было проведено хирургическое удаление опухоли по окончанию системного этапа лечения. Одна больная отказалась от выполнения хирургического лечения по личным мотивам. Полный патоморфологический регресс был выявлен у 3/5 больных (60%), у 2/5 больных лечебный патоморфоз согласно критериям Miller-Payne составил менее 50%.

На втором этапе, возможность геномной стратификации на основании мутационного статуса BRCA1 была изучена у больных ЭОЯ на примере митомицина С. Учитывая отсутствие митомицина С в отечественных и международных рекомендациях по лечению ЭОЯ, для включения в исследования были отобраны больные, для которых были исчерпаны все стандартные опции терапии (в том числе, невозможность проведения терапии препаратами платины в связи с токсичностью предыдущих линий терапии в случае наличия платиночувствительного рецидива) и которые подлежали симптоматическому лечению. Таким образом, в рамках данного исследования терапия митомицином С была проведена 12 пациентам, носителям мутаций BRCA1 с ЭОЯ, резистентным к стандартной терапии. Среди включенных больных у 6/12 (50%) была выявлена мутация 5382insC, у 4/12 (33.4%) - 4153delA, и у 2/12 (16.6%) - 185del AG.

Медиана числа проведенных циклов терапии митомицином С составила 5 (1-6). Монотерапия митомицином С сопровождалась выраженными нежелательными явлениями (осложнения 3-4 ст. у 5/12 больных, что составило 41,7%). Это несмотря на то, что доза препарата была уменьшена в 2 раза по сравнению с рекомендациями производителя (10 мг/м2 вместо 20 мг/м2). Среди клинически выраженных осложнений (3-4 степень) наиболее частой была гематологическая токсичность у 3/5 пациентов: нейтропения 3-4 степени у 2/3 и анемия 3 степени у 1/3.

На фоне проводимой терапии у 1-й больной был выявлен полный регресс заболевания, также у 1-й больной - частичный регресс болезни и у 6-ти - стабилизация. Таким образом, частота объективных ответов составила 16,6% (2/12), а частота контроля заболевания - 9/12 (75%). Чаще всего клинический ответ на лечение сопровождался снижением уровня СА125. Медиана уменьшения уровня опухолевого маркера составила 69%. Медиана времени до прогрессирования на фоне лечения составила 5,5 месяцев (от 2 месяцев до 12 месяцев). При этом, только у одной пациентки клинический ответ сохранялся в течение 7 месяцев после окончания введения цитостатика, а у 11/12 окончание лечения было связано с прогрессированием болезни.

Таблица 3- Оценка эффективности терапии митомицином С у интенсивно леченных больных ЭОЯ носителей мутаций ВЯСА1

Ответ на терапию Число больных (п = 12) Доля больных (%) Медиана длительности ответа (месяцы)

Полный регресс (ПР) 1/12 8.0% 9

Частичный регресс (ЧР) 2/12 16.6% 10,5 (9,12)

Частота объективных ответов 3/12 25.0% -

Стабилизация (Стаб) 6/12 50.0% 5,5 (3-6)

Контроль заболевания (ПР + ЧР + Стаб) 9/12 75.0% 6(3-12)

Таким образом, с помощью монотерапии митомицином С у носителей мутаций ВЯСА1 больных ЭОЯ, резистентных к стандартной терапии, удалось достичь значимого увеличения времени до прогрессирования опухоли на фоне умеренной токсичности лечения.

Описанные выше результаты неоадъювантного лечения цисплатином больных РМЖ и паллиативной терапии митомицином С больных диссеминированными ЭОЯ подтверждают целесообразность геномной стратификации на основании мутационного статуса ВЯСА1. Проведение подобного разделения позволяет выделить группу больных с повышенной чувствительностью к алкилирующим агентам.

ГЕНОМНАЯ СТРАТИФИКАЦИЯ БОЛЬНЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АНТИ-EGFR МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ НА ОСНОВАНИИ НЕГАТИВНЫХ ПРЕДИКТИВНЫХ ФАКТОРОВ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

С целью изучения возможности использования монотерапии анти-EGFR моноклонапьными антителами вместо стандартной цитостатической терапии в первой линии после геномной стратификации больных на основании отсутствия мутаций RAS/RAF было проведено проспективное исследование. С учетом необходимости проспективного отбора пациентов для включения в исследование скрининг пациентов был разделен на два этапа: сначала клинический подбор больных на основании наличия признаков индолентного течения заболевания и затем молекулярно-генетический анализ. На первом этапе скрининга для участия в исследовании были включены 73 пациента.

Средний возраст включенных больных составил 68,9 лет (54-85). В исследование было включено несколько больше мужчин - 39 (53.4%), чем женщин - 34 (46.6%). У большинства больных - 51 (69.8%) - первичная опухоль локализовалась в левом фланге, у 22 (30.2%) - в правом.

Всем больным было проведено молекулярно-генетическое исследование мутационного статуса гена KRAS, NRAS, BRAF в опухоли. В результате проведенного молекулярно-генетического анализа отсутствие KRAS, NRAS и BRAF было установлено у 33 больных (45.2%). При этом, у 40 (54.8%) пациентов были выявлены те или иные мутации в генах KRAS, NRAS или BRAF.

Среди мутаций наиболее частыми были «классические» мутации гена KRAS, которые были выявлены у 46.6% (34/73 случаев) больных общей группы и 85% (34/40) - у больных с мутациями RAS/RAF. Большинство мутаций были в 12 кодоне (G12V, G12S, G12D, G12C и p.All_G12insGA), их частота составила 36.9% (27/73 случая). Значительно реже встречались мутации в кодоне 13 (G13S) - 2/73 больных (2.7%). Кроме того, анализ показал наличие мутаций, затрагивающих другие участки гена KRAS, а именно -p.All_G12insGA в 1/73 случаев, Y71_M72insRDQY - 1/73 случаев, кодон 146 А146Т -3/73 случаев. У одного больного была выявлена мутация NRAS - G13S (1.3%). В свою очередь, мутации BRAF были выявлены у 6/73 больных, таким образом, их частота составила 8.2%.

Корреляционный анализ не выявир статистически значимого преобладания какой-либо из клинических групп среди больных без мутаций в генах RAS/RAF.

В рамках проспективного исследования была проведена оценка эффективности монотерапии цетуксимабом в первой линии у больных неоперабельным и метастатическим РТК без мутации в генах RAS/RAF. Из 33 отобранных на основании

молекулярно-генетического анализа пациентов 12 не получали цетуксимаб. Схема включения больных в исследование представлена на рис. 11.

2 больных закончили лечения до первой оценки эффекта:

1 - появление паренхиматозной желтухи 2 - отказ от режима введения

Рисунок 11 - Схема включения пациентов в проспективное моноцентровое однорукавное исследование эффективности цетуксимаба в первой лечебной линии у больных неоперабельным РТК без мутаций в генах RAS/RAF

Медиана длительности терапии цегуксимабом составила 3.5 мес. (2-8.3 мес.). За время наблюдения прогрессирование заболевания было выявлено у 17/19 больных. Прогрессирование было зарегистрировано у 8/19 больных на фоне терапии цетуксимабом и у 9/19 больных после окончания терапии. Медиана ВДП в исследовании составила 7.4 месяца (95% ДИ: минимально - 5.1 мес., максимально - 9.8 мес.). Регрессионный анализ ВДП опухоли на фоне монотерапии цетуксимабом у больных неоперабельным РТК без мутаций в генах RAS/RAF представлен на рис. 12. В связи с тем, что длительность ВДП у 11 из 19 больных, включенных в исследование на первом этапе, составила > 6 месяцев исследование было окончено досрочно, а альтернативная гипотеза, согласно дизайну исследования, была подтверждена. Результаты оценки эффективности терапии цетуксимабом представлены в табл. 4.

Рисунок 12 - Кривая времени до прогрессирования опухоли на фоне монотерапии цетуксимабом у больных неопераюельным раком толстой кишки (п = 19). Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера. Медиана времени до прогрессирования - 7.4 мес.

На фоне монотерапии цетуксимабом нежелательные явления наблюдались у всех пациентов (100%). Ни одно из наблюдавшихся побочных явлений не привело к смерти пациента. Все побочные явления были обратимы и полностью купировались в течение 3-х недель после окончания лечения. Самой выраженной степенью токсичности была 3 степень, которая осложнила лечение у 31.5% больных (6/19 пациентов). Так, у четырех больных на фоне введений цетуксимаба наблюдались аллергические реакции 3 степени, угревидная/пустулезная сыпь 3 степени наблюдалась у 1-го пациента и у 1-го больного -паронихии 3 степени.

Кожная токсичность проявлялась сухостью и сыпью. У 89% больных (17/19) степень выраженности данного вида нежелательных явлений носила легкий или умеренный характер, соответствующий 1 и 2-й степеням по критериям СТС АЕ v.4.03. Вторым по частоте и выраженности среди побочных реакций был зуд (10/19). У 5/19 пациентов зуд достигал 2-й степени выраженности.

Кроме описанных выше, наблюдались и другие нежелательные явления, носившие умеренный характер и не требовавшие прекращения терапии или редукции дозы. Таким образом, несмотря на небольшое число объективных ответов на фоне терапии цетуксимабом достаточно высокая частота контроля заболевания, а также сравнимое с другими вариантами монотерапии ВДП (24 недели или 6 месяцев) позволяют говорить о значимости использования этого безцитостатического режима у высокоселектированных больных РТК без мутаций RAS/RAF.

Для всех пациентов включенных в исследование была проведена оценка ОВ. На момент анализа данных медиана ОВ не была достигнута. Медиана времени наблюдения

составила 13.4 мес., при этом в живых оставались 11/19 больных (61%). Моделирование ОВ по методу Каплана-Мейера больных РТК без мутаций RAS/RAF, получавших цетуксимаб в первой линии, представлено на рис. 13. Медиана составила 18.9 мес. (95% ДИ: минимально - 12.7 мес., максимально - 25.1 мес.).

Рисунок 13 - Кривая общей выживаемости больных неоперабельным раком толстой кишки без мутаций RAS/RAF, получавших цетуксимаб в первой линии в месяцах (п = 19). Регрессионный анализ по методу Каплана-Мейера.

Медиана времени до прогрессирования - 18.9 мес.

С целью выявления факторов, влияющих на ОВ пациентов, был предпринят статистический анализ по методу log-rank. В результате было показано, что такие показатели как пол (р = 0.449), фланг толстой кишки (р = 0.281), локализация первичной опухоли в отделе толстой кишки (р = 0.096), число зон метастазирования (р = 0.792), общее число линий лечения (р = 0.553), максимальный эффект терапии цетуксимабом (р = 0.213), агрессивность терапии второй линии (полихимиотерапия против монотерапии фторпиримидинами) (р = 0.418), а также хирургическое лечение первичной опухоли (р = 0.87) не связаны с ОВ пациентов.

Несмотря на то, что заболевание характеризовалось как индолентное на момент включения больных в исследование, в зависимости от характера прогрессирования (появление новых метастатических очагов, появление симптомов, связанных с заболеванием или увеличение предсуществовавших очагов и отсутствие симптомов, связанных с течением заболевания) и состояния на момент прогрессирования часть больных в качестве второй линии лечения получала поликомпонентные схемы лечения (9/19 - 47.4%: FOLFOX 6 - 7/9; FOLFIRI - 2/9), а часть монотерапию фторпиримидинами (8/19 - 42.1%: капецитабин - 6/8, DeGramont - 2/8). У двоих пациентов прогрессирования

I

"I I 10 12 U li U 20 S 24*

Время (месяцы)

заболевания на момент анализа не выявлено и они продолжают терапию цетуксимабом. Анализ ВДП в зависимости от характера проведенного лечения представлен на рис. 14. Так, медиана ВДП на фоне второй линии составила 4.1 мес. (95% ДИ: минимально -2.1 мес., максимально - 6.0 мес.) в группе агрессивного подхода и 2.0 мес. (95% ДИ: минимально - 0 мес., максимально - 4.0 мес.) в группе монотерапии. При этом, была выявлена статистически достоверная разница между этими показателями (р = 0.036).

Рисунок 14 - Кривая времени до прогрессирования на фоне второй линии терапии у больных неоперабельным раком толстой кишки без мутаций RAS/RAF, получавших

цетуксимаб в первой линии (n = 19). Синяя линия - группа монотерапии (п = 8; медиана 2.0 мес.), зеленая кривая - группа полихимиотерапии (п = 9; медиана 4.1 мес.)

Данная закономерность получала дальнейшее подтверждение при анализе совокупного ВДП на фоне обеих линий (от первого введения цетуксимаба до прогрессирования на фоне второй линии лечения). Так, медиана ВДП на фоне второй линии составила 10.6 мес. (95% ДИ: максимально - 13.5 мес., минимально - 7.3 мес.) в группе агрессивного подхода и 8.0 мес. (95% ДИ: максимально - 9.4 мес., минимально -6.7 мес.) в группе монотерапии. При этом также была выявлена статистически достоверная разница между этими показателями (р = 0.025). Данные эффективности второй линии терапии представлены в табл. 4. При этом у 1/9 больных в группе агрессивной терапии на момент анализа данных обследования получено не было.

Общие данные о лечении больных, включенных в исследование визуализированы на рис. 15. При этом, эффект второй линии терапии не коррелировал с длительностью времени до прогрессирования опухоли на фоне терапии цетуксимабом (р = 0.817) или эффектом на ее фоне (р = 0.189).

время (месяцы)

(р = 0.036)

Таблица 4 - Показатели эффективности второй линии терапии у больных неоперабельным раком толстой кишки без мутаций RAS/RAF, получавших цетуксимаб в первой линии

Для всех больных (п = 17) Группа полихимиотерапии (п = 9) Группа монотерапии (п = 8) Р

ов 18.9 мес. (12.7- 25.1) Медиана не достигнута 13.9 мес. (10.4-17.3) 0.418

ВДП 1 6.4 мес. (4-8.7) 7.7 мес. (6.7- 8.7) 2.8 мес. (1.3-4.2) 0.106

ВДП 2 10.5 мес. (10.3- 10.7) 10.6 мес. (7.3-13.5) 8.0 мес. (6.7-9.4) 0.025

Эффективность 2-й линии терапии

Частичный регресс 2/17(11.8%) 2/9 (22%) 0/8 (0%)

Стабилизация 6/17(35%) 4/9 (44%) 2/8 (25%)

Прогрессирование 8/17(47%) 2/9 (22%) 6/8 (75%)

Примечания: ВДП 1 - время до прогрессирования на фоне монотерапии цетуксимабом в первой линии, ВДП 2 - время до прогрессирования на фоне 2-й линии терапии от начала терапии цетуксимабом.

h

Монотерапия после цетуксимаба

Полихимиотерапия после цетуксимаба

О 200 400 600 800

Время наблюления (дни)

Рисунок 15 - Диаграмма времени до прогрессирования больных неоперабельным раком толстой кишки без мутаций RAS/RAF на фоне цетуксимаба (столбцы синего цвета), первой линии терапии (столбцы зеленого цвета, второй линии терапии (столбцы оранжевого цвета), третьей линии терапии (столбцы красного цвета). Символом <овездочка» рядом со столбцом отмечены погибшие пациенты

ФОРМИРОВАНИЕ АЛГОРИТМА ИНДИВИДУАЛИЗАЦИИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ СОЛИДНЫМИ ОПУХОЛЯМИ НА ОСНОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ

В результате проведенных исследований молекулярных особенностей солидных опухолей нами был разработан алгоритм выделения отдельных групп пациентов с целью повышения эффективности лекарственной терапии (рис. 16).

Рисунок 16. Алгоритм индивидуализации лечения больных солидными опухолями на основании молекулярно-генетических особенностей

На настоящий момент на первом этапе персонализации лечения наиболее целесообразным является выделение группы больных с возможными теми или иными драйверными нарушениями. Селекция пациентов на основании наличия активирующих мутаций позволяет в значительной степени повысить эффективность использования дорогостоящих таргетных препаратов. В качестве примера можно привести использование ингибиторов EGFR у больных НМРЛ. Подобные случаи представлены, в том числе, в нашей работе. В неселектированной группе пациентов эффективность этих препаратов не превышает 13,3%, а медиана времени до прогрессирования опухоли - 6,7 месяцев, в то время как у больных с активирующими мутациями, которые составляют около 7% от общего числа пациентов, эффективность достигает 45% при медиане 12,8 месяцев (Moiseyenko et al., 2010; Perez-Soler, 2004; Shepherd et al., 2005).

Активирующие мутации являются отдельным, и, к сожалению, довольно редким примером предиктивных маркеров чувствительности к лекарственным препаратам. На втором этапе персонализации лечения представляется целесообразным выделение больных с наличием патогенетически значимых нарушений, которые, не являясь мишенями, тем не менее определяют чувствительность опухоли к действию тех или иных лекарственных препаратов. Данный вопрос был, в рамках нашей работы, изучен на примере носителей наследственных мутаций ВЯСА1 больных опухолями молочной железы и яичников, которым проводилась терапия цисплатином и митомицином С соответственно. Идентификация отдельной группы на основании молекулярных маркеров может способствовать увеличению ожидаемой эффективности лечения (частота полных патоморфологических регрессов 60% против 7-45% по литературным данным), что косвенно может свидетельствовать о возможном увеличении общей выживаемости, и достижению значимого времени до прогрессирования у больных, резистентных к стандартной терапии (медиана времени до прогрессирования у пациентов резистентным ЭОЯ составила 5,5 месяцев).

На следующем этапе после исключения больных с активирующими мутациями и молекулярными нарушениями, определяющими чувствительность к отдельным препаратам, представляется целесообразным выделить отдельную группу больных без негативных предиктивных факторов к таргетным или цитостатическим препаратам. Примером подобной группы могут служить больные раком толстой кишки без мутаций КЛАЭ, №1А8 и ВЯАР. Использование в данной группе пациентов монотерапии цетуксимабом позволяет достичь 6 месяцев медианы времени до прогрессирования опухоли и отсрочить потенциально чрезвычайно токсичную химиотерапию.

И наконец, всем оставшимся больным солидными опухолями целесообразно проводить комплексные методы оценки молекулярно-генетического профиля (полногеномный экспрессионный анализ) с цепью выделения отдельных групп пациентов, которые могут быть потенциально более чувствительными к тем или иным видам лекарственной терапии, независимо от локализации первичной опухоли.

выводы

1. Молекулярная гетерогенность является неизбежным следствием патогенетических процессов, лежащих в основе развития злокачественных солидных опухолей. Комплексное использование полногеномных методов молекулярного анализа и геномной стратификации пациентов для выделения патогенетических подтипов является перспективным направлением повышения эффективности терапии больных злокачественными опухолями.

2. Подтверждением молекулярной гетерогенности солидных опухолей является выявление двух и четырех подтипов среди P3/Pn+HER2+ опухолей молочной железы, трех и шести подтипов среди аденокарцином легкого, четырех подтипов среди опухолей тела матки, идентифицированных на основании результатов полногеномных методов молекулярного анализа.

3. Биологическое значение выявленных подтипов подтверждается статистически значимыми различиями в показателях отдаленной выживаемости между ними: безрецидивная выживаемость для двух подтипов P3/Pn+HER2+ рака молочной железы (р = 0.01), безрецидивная выживаемость для четырех подтипов РЭ/РП+НЕК2+ рака молочной железы (р = 0.004), безрецидивная выживаемость для четырех подтипов рака тела матки (р = 0.0004).

4. Определение изолированных предиктивных генетических маркеров является в настоящее время оптимальным подходом к лечению отдельных групп пациентов.

5. Использование наиболее частых мутаций EGFR в качестве фактора геномной стратификации для терапии гефитинибом позволяет увеличить время до прогрессирования опухоли (медиана 15.8 мес.) и общую выживаемость (медиана 20.0 мес.) относительно исторического контроля в виде цитостатической терапии (4-8 мес. и 12 мес., соответственно).

6. Применение геномной стратификации на основании мутационного статуса BRCA1 позволяет повысить частоту полных патоморфологических регрессов у больных раком молочной железы при использовании цисплатина (60%), а также достичь более длительного контроля за заболеванием у больных раком яичников при применении митомицина С (частота контроля за заболеванием 75%, медиана времени до прогрессирования - 5.5 мес.).

7. Опухоли толстой кишки с «диким типом» RAS/RAF составляют 45.2%, что является значимой частью больных с этой нозологией.

8. Монотерапия цетуксимабом сопровождается разной степенью токсичности у всех пациентов, при этом выраженная токсичность (ПНУ степень) наблюдается у 31.5% больных. Среди больных, стратифицированных на основании отсутствия мутаций RAS/RAF, частота объективного эффекта на фоне монотерапии цетуксимабом составила 10.5% и контроля за заболеванием - 68%, что сравнимо со стандартной терапией капецитабином. Медиана длительности контроля за заболеванием составила 7.4 мес., что соответствует результатам первой линии терапии фторпиримидинами.

9. На первом этапе наиболее клинически целесообразно проводить поиск активирующих мутаций (EGFR) и предиктивных маркеров чувствительности (мутации BRCA1) с последующим использованием полногеномных методов молекулярного анализа для комплексной оценки гетерогенности опухолей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В силу биологических особенностей развития все солидные опухоли гетерогенны по многочисленным молекулярно-генетическим параметрам, что является причиной различий в клиническом течении и чувствительности к стандартной терапии.

2. Выбор лекарственной терапии у больных солидными опухолями должен основываться на молекулярно-генетических предиктивных (позитивных и негативных) маркерах, что позволяет избежать стандартного эмпирического подхода и на основе индивидуализации достоверно повысить эффективность лечения.

3. У больных распространенным неплоскоклеточным немелкоклеточным раком легкого обязательно проведение молекулярного анализа с целью выявления мутации EGFR. В случае наличия одной из активирующих мутаций целесообразно использовать монотерапию ингибиторами тирозинкиназы EGFR (гефитиниб, эрлотиниб), при отсутствие - стандартную химиотерапию.

4. Определение наследственных молекулярных нарушений, в частности BRCA1, должно входить в стандарты обследования больных раком яичников и раком молочной железы без экспрессии рецепторов эстрогенов и/или прогестерона и HER2.

5. Больные раком молочной железы, ассоциированным с наследственными мутациями BRCA1, характеризуются высокой чувствительностью к алкилирующему действию производных платины. По этой причине монотерапия цисплатином может проводиться этим больным в неоадьювантном режиме.

6. При диссеминированном раке яичников у носителей наследственных мутаций BRCA1 после прогрессирования на фоне стандартных методов лечения с включением таксанов

и препаратов платины целесообразно использование с паллиативной целью монотерапии митомицином С.

7. Применение монотерапии цетуксимабом у больных с индолентной формой рака толстой кишки и отсутствием мутаций RAS/RAF позволяет сохранить качество жизни и отсрочить начало потенциально токсичной стандартной химиотерапии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семиглазов, В.Ф. Механизмы резистентности рака молочной железы к цитостатической терапии / В.Ф. Семиглазов, В.М. Моисеенко, Ф.В. Моисеенко и соавт. // Вопр Онкол. - 2015. [принято в печать].

2. Моисеенко, В.М. Опыт использования гефитиниба у больных неоперабельным неплоскоклеточным раком легкого с активирующими мутациями EGFR / В.М. Моисеенко, В.А. Чубенко, Ф.В. Моисеенко и соавт. // Вопр Онкол. - 2015. -Т. 61, №2,- С. 259-265.

3. Moiseyenko, V. High efficacy of cisplatin neoadjuvant therapy in a prospective series of patients carrying BRCA1 germ-line mutation / V. Moiseyenko, A. Ivantsov, F. Moiseyenko, et al. // Medical Oncology. - 2015. - Vol. 32(4). - P. 514-519.

4. Cancer Genome Atlas Research Network Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma / Cancer Genome Atlas Research Network (including Fedor Moiseenko) // Nature. - 2014. - Vol. 511(7511). - P. 543-550.

5. Moiseyenko, V.M. Evidence for clinical efficacy of mitomycin С in heavily pretreated ovarian cancer patients carrying germ-line BRCA1 mutation / V.M. Moiseyenko, V.A. Chubenko, F.V. Moiseyenko, et al. // Med Oncol. - 2014. - Vol. 31(10). - P. 199-205.

6. Моисеенко, Ф. Новое в лечении немелкоклеточного рака легкого / Ф. Моисеенко // Официальная газета профессионального общества онкологов-химиотерапевтов. -2014.-Vol. 6.-Р. 7-9.

7. Kandoth, С. Integrated genomic characterization of endometrial carcinoma. / C. Kandoth, N. Schultz, F. Moiseenko, et al. // Nature. - 2013. - Vol. 497(7447). - P. 67-73.

8. Семиглазов, В. Экспрессионный анализ и его клиническое использование при опухолях молочной железы / В. Семиглазов, В. Семиглазов, Ф. Моисеенко и соавт. // Вопр Онкол. - 2013. - Т. 59, №1. - С. 23-27.

9. Моисеенко, Ф. Клинические особенности рака молочной железы с экспрессией рецепторов стероидных половых гормонов и амплификацией HER2 / Ф. Моисеенко, В. Семиглазов, Т. Семиглазова и соавт. // Креативная хирургия и онкология. — 2013. — Т.З.-С. 84-93.

10. Моисеенко, Ф. Принципы индивидуализации лечения рака легкого / Ф. Моисеенко // Практ онкол. - 2013. - Т. 14, №4. - С. 208-215.

11. Проценко, С.А. Фармакоэкономический анализ терапии гефитикибом больных немелкоклеточным раком легкого / С.А. Проценко, А.В. Рудакова, Ф.В. Моисеенко и соавт. // Вопр Онкол. - 2012. - Т. 58, №3. - С. 352-358.

12. Семиглазова, Т.Ю. Маркеры эффективности предоперационной таксансодержащей химиотерапии местнораспространенного рака молочной железы / Т.Ю. Семиглазова,

B.В. Клименко, Ф.В. Моисеенко и соавт. // Вопр Онкол. - 2013. - Т. 59, №3. - С. 363368.

13. Suspitsin, E.N. Rapid symptomatic improvement in gefitinib-treated patients with EGFR-mutated lung cancer: possible role of downregulation of inflammatory molecules? / E.N. Suspitsin, E.V. Levchenko, F.V. Moiseyenko, et al. // Onkologie. - 2011. -Vol. 34(10).- P. 559-560.

14. Моисеенко, Ф. Роль гефитиниба в лечении больных немелкоклеточным раком легкого с мутацией в гене рецептора эпидермального фактора роста / Ф. Моисеенко, Е. Имянитов, Д. Мацко и соавт. // Современная онкология. - 2011. - Т. 3, №13. -

C. 38-41.

15. Моисеенко Ф. Индолентный и агрессивный диссеминированный ртк: различия в клинических признаках, течении и лечебной тактике / Ф. Моисеенко // Практ. онкология. - 2012. - Т. 13, №4. - С. 229-234.

16. Моисеенко Ф. новое в лекарственном лечении опухолей легкого / Ф. Моисеенко // Практическая онкология.-2012.-Т.13, №1, С. 32-38.

17. Семиглазова, Т. Таргетная терапия после прогрессирования ШЖ2-позитивного рака молочной железы / Т. Семиглазова, В. Семиглазов, Ф. Моисеенко и соавт. // Фарматека. - 2011. - Т. 17.-С. 14-18.

18. Чубенко, В. Побочные токсические эффекты таргетных противоопухолевых препаратов и их лечение / В. Чубенко, Н. Брежнев, Ф. Моисеенко и соавт. // Медпайн-экспресс. - 2011. - Т. №2-3 (208). - С. 73-80.

19. Moiseyenko, V.M. High efficacy of first-line gefitinib in non-Asian patients with EGFR-mutated lung adenocarcinoma / V.M. Moiseyenko, S.A. Procenko, F.V. Moiseyenko et al. // Onkologie. - 2010. - Vol. 33(5). - P. 231-238.

20. Имянитов, E. Применение Ирессы (гефитиниба) в качестве терапии первой линии для лечения неоперабельных аденокарцином легкого, содержащих мутацию в гене EGFR / Е. Имянитов, А. Того, Ф. Моисеенко и соавт. // Современная онкология. - 2010. -Vol. 1.-Р. 60-66.

Подписано в печать 03.07.15. Формат 60x84/16. Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 485. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» Минздрава России 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24

2015673292

2015673292