Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Оптимизация лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза на основе методов амплификации нуклеиновых кислот

0050484.5/

На правах рукописи

РЫЖИХ Павел Геннадьевич

ОПТИМИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ЯНВ 2013

Санкт-Петербург - 2012

005048437

Работа выполнена в ФБУН Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Роспотребнадзора.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Гущин Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Козлов Антон Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Северо-западный государственный медицинский университет им. Мечникова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической лабораторной диагностики, заведующий

Липова Елена Валерьевна - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ учебно-научный медицинский центр управления делами Президента Российской Федерации, кафедра дерматовенерологии, микологии и косметологии.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 22 января 2013 г. в 13-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан « 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор МИТИН Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Урогенитальный трихомониаз (УТ) - широко распространенная инфекция, передаваемая половым путем, возбудителем которой является Trichomonas vaginalis - простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в органах мочеполовой системы человека. По данным официальной статистики, трихомониаз имеет наибольшую долю в структуре заболеваемости ИГТПП. В 2008 году его доля составила 38,9% из всех зарегистрированных случаев заболеваний инфекциями, передаваемыми половым путем (Иванова М.А., 2009). У женщин в воспалительный процесс могут вовлекаться вульва, влагалище, уретра, парауретральные протоки, шейка матки, матка и ее придатки, большие вестибулярные железы, мочевой пузырь, почечная лоханка; у мужчин — уретра, предстательная железа, семенные пузырьки, мочевой пузырь, почечные лоханки. Для трихомониаза, как и для других ИППП, в большинстве случаев характерно отсутствие специфических признаков заболевания, а у значительного числа пациентов инфекция протекает бессимптомно. Классический для трихомониаза "клубничный" симптом встречается только у 2% пациенток; пенистые выделения, которые можно связать с активным ростом трихомонад, наблюдаются только примерно у 12% инфицированных женщин (Fouts А.С., et al. 1980). Кроме того, часто трихомониаз сочетается с другими ИППП: гонореей, хламидиозом, микоплазмами, что объясняется общностью путей передачи инфекции (Щербакова Н.И., 1982; Делекторский В.В., 1985; Межевитинова, 1999).

В связи с неспецифическими клиническими проявлениями диагноз трихомонадной инфекции основывается на результатах лабораторных методов исследования, которые включают микроскопические, культуральные, серологические и молекулярно-биологические.

Согласно приказу Минздрава СССР № 1570 от 4 декабря 1986 г регламентированными методами диагностики трихомониаза считались микроскопия (нативного или окрашенного) препаратов и культуральное исследование. Несмотря на то, что приказом Минздрава РФ №398 от 23.12.2003 г приказ № 1570 от 4 декабря 1986 г. был признан не действующим, в нашей стране наиболее часто для диагностики трихомонадной инфекции используется метод микроскопии, что объясняется его относительно низкой стоимостью и быстротой исполнения (Фриго Н.В., с соавт., 2008). Тем не менее, данный метод недостаточно чувствителен и воспроизводим, субъективен и требует высокой квалификации исполнителя.

Культуральный метод долгое время рассматривался в качестве «золотого стандарта» диагностики трихомонадной инфекции. Но его эффективность в значительной степени зависит от качества используемых питательных сред. Ограничивают его применение также большие сроки получения результата анализа, вплоть до 11-17 суток после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от посевной дозы. Кроме того,

культуральный метод имеет высокие требования к транспортировке и хранению клинического материала.

В последние годы во всем мире в лабораторной диагностике различных инфекций, в том числе ИППП, все большее распространение стали получать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленные на выявление специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителей. Одним из наиболее распространенных МАНК является метод ПЦР. Преимуществами данного метода являются высокие аналитические и диагностические показатели чувствительности и специфичности, менее строгие требования к хранению и транспортировке клинического материала, короткие сроки исполнения, относительно невысокая стоимость анализа и его универсальность в отношении других урогенитальных инфекций.

Согласно рекомендациям Центра по контролю и профилактике заболеваемости (CDC — Centers for Disease Control and Prevention) в связи с более высокой аналитической чувствительностью амплификационных методов верификацию их результатов следует проводить на основе альтернативных амплификационных тестов (CDC, 2002). В своей работе A.J. McAdam предложил требования, которым должен соответствовать дополнительный метод для решения вопросов, связанных с дискордантными результатами: аналитическая чувствительность дополнительного метода должна быть сопоставима с исследуемым методом; должна использоваться отличная мишень для амплификации; должен использоваться другой принцип амплификации (McAdam A.J., 2000).

Одним из методов, соответствующих требованиям, предложенным McAdam, является метод определения рибосомальной РНК (рРНК) на основе реакции транскрипционной амплификации (Transcription-Mediated Amplification - ТМА). На основе данного метода за рубежом применяется серийно выпускаемый тест для диагностики инфекции, вызванной T.vaginalis — APTIMA Trichomonas vaginalis Assay (Gen-Probe Inc., San Diego, CA). Данный тест имеет высокие показатели диагностической чувствительности не только по сравнению с методами микроскопии и микробиологического посева, но и в сравнении с ПЦР (Hardick A., et al., 2006; Nye М.В., et al., 2009; Andrea S.B., et al., 2011). Аналогом ТМА является реакция транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleic acid sequence-based amplification - NASBA). В работе Morre S.A. и соавт. на примере С.trachomatis была показана возможность с помощью метода НАСБА оценивать наличие жизнеспособных микроорганизмов в образце в процессе и после терапии (Morre S.A., et al., 1996).

На сегодняшний день за рубежом предложено множество протоколов выявления ДНК T.vaginalis с помощью метода ПЦР (Riley D.E., et al., 1992; Kengne P., et al., 1994; Shaio M.F., et al., 1997; Madico G., et al., 1998; Mayta H., et al., 2000). Было показано, что диагностическая чувствительность ПЦР выше, чем у традиционных методов выявления T.vaginalis (микроскопия и культуральный посев), однако она варьировала в широких пределах (от 60 до 100%), а сами исследования проводили на различном биологическом материале (моча, вагинальное отделяемое, соскобы из уретры и цервикального канала),

среди различных групп населения, полученном от мужчин и женщин. При этом аналитическая чувствительность в предложенных протоколах не была установлена. В свою очередь аналитические характеристики (аналитическая чувствительность и специфичность) определяют диагностические чувствительность и специфичность метода. Для повышения аналитической чувствительности метода необходимо выбрать оптимальную мишень, размер амплифицируемого фрагмента, программу амплификации и метод его детекции. Одной из причин, ограничивающих использование ПЦР в клинической лабораторной практике, является отсутствие в методиках образцов, которые бы контролировали проведение всего процесса ПЦР-исследования (от экстракции нуклеиновых кислот, до детекции продуктов амплификации) предотвращающих выдачу лабораторией ложноотрицательных и ложноположительных результатов исследования.

На сегодняшний день отсутствуют нормативные документы, регламентирующие использование метода ПЦР при лабораторной диагностике конкретных нозологических форм, и нормативно-правовая база диагностики мочеполового трихомониаза, как таковая, отсутствует. Поэтому необходима разработка новых регламентирующих документов, которые, в свою очередь, должны базироваться на объективных данных об аналитических и диагностических характеристиках различных лабораторных методов.

Цель исследования

Разработка стандартизованных методик лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза на основе технологий ПЦР и НАСБА в реальном времени и обоснование необходимости их применения.

Задачи исследования

1. Разработать методику для выявления ДНК T.vaginalis на основе метода ПЦР в реальном времени;

2. Разработать методику для выявления РНК T.vaginalis на основе метода НАСБА в реальном времени;

3. Определить и сравнить аналитическую чувствительность микроскопии (нативного и окрашенного препаратов), культурального посева, ПЦР и НАСБА;

4. Оценить эффективность лабораторной диагностики трихомониаза на биологическом материале, полученном от пациентов, исходя из значений аналитической чувствительности методов выявления T.vaginalis.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования

Впервые проведено сравнение аналитической чувствительности методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) и рутинных методов диагностики трихомонадной инфекции (микроскопия нативного и окрашенного препаратов, микробиологический посев).

Впервые в отечественной лабораторной практике разработана методика для выделения РНК T.vaginalis на основе реакции транскрипционной амплификации ИАБВА в режиме реального времени.

Использование разработанной методики на основе ПЦР позволяет оптимизировать и повысить качество лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.

Практическая значимость исследования

Разработаны методики на основе высокочувствительных и специфичных методов амплификации нуклеиновых кислот, которые увеличивают эффективность диагностики трихомонадной инфекции. Методика НАСБА может быть использована как дополнительный высокочувствительный МАНК для решения вопросов, связанных с получением дискордантных результатов при совместном использовании метода ПЦР и традиционных методов выявления трихомонад (микроскопии и культурального посева).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана методика ПЦР для диагностики урогенитального трихомониаза с высокими показателями чувствительности и специфичности.

2. Разработана методика НАСБА для диагностики урогенитального трихомониаза с высокими показателями чувствительности и специфичности.

3. Аналитическая чувствительность разработанных методик на основе технологий ПЦР и НАСБА достоверно выше, чем у методов микроскопии и культурального посева.

Внедрения результатов исследования

На основе разработанных методик созданы наборы реагентов: «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL», «АмплиСенс Т. vaginal /л- Р И Б ОТ ЕСТ», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

Разработанные методики применяются для диагностики урогенитального трихомониаза в более чем 800 лабораториях различных регионов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья.

Материалы проведенных в ходе работы исследований входят в программу сертификационного цикла усовершенствования «ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний» на базе ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и НМАПО им. П.Л. Шупика МЗ Украины.

Апробация материалов диссертации

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, протокол №10 от 1 ноября 2012 г.

Основные положения диссертации были доложены на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, 7-10 июня 2005 (г. Москва); Международной конференции «Фундаментальные науки — биотехнологии и медицине», 3-7 сентября 2006 (г. Новосибирск); Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» 19-20 мая 2006 (г. Алматы, Казахстан); 23rd IUSTI-Europe Conference on Sexually Transmitted Infections and HIV/AIDS, 11-14 октября 2007 (г. Дубровники, Хорватия); VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» 28-30 ноября 2007 (г. Москва); llth IUSTI World Congress, 912 ноября, 2009 (г. Кейптаун, Южная Африка); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010», 24-26 ноября 2010 (г. Москва); 20th EADV Congress, 20-24

ноября 2011, (г. Лиссабон, Португалия); Всероссийской научной конференции «Фундаментальная медицина: от науки к технологиям», 15-16 декабря 2011 (г. Санкт-Петербург); XII Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, 26-26 июня 2012 (г. Москва)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация представлена на 154 страницах, включая 38 рисунков, 16 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов с выводами. Список использованной литературы включает 41 отечественных и 139 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы:

Оценку специфичности разработанных методик использовали штаммы и клинические изоляты из коллекции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии следующих микроорганизмов: Trichomonas tenax, Trichomonas foetus, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Gardnerella vaginalis, Atapobium vaginae, Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Dientamoeba fragilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Gardia intestinalis, Gardia lamblia, Haemophilus durcei, HSV 1,2, Pentatrichomonas hominis, Streptococcus agalactiae, Treponema pallidum.

Исследовано 13376 биологических образцов (84% женщин и 16% мужчин) полученных от пациентов Центра молекулярной диагностики при ФБУН ЦНИИ эпидемиологии. Для проведения исследования по определению диагностической эффективности методов микроскопии и культурального посева мы использовали биологический материал от 199 женщин и 11 мужчин, у которых была обнаружена ДНК T.vaginalis.

Молекулярно-биологическое исследование (ПЦР и НАСБА) биологического материала включает три последовательных технологически связанных между собой этапа: экстракцию и очистку нуклеиновых кислот, собственно постановку и проведение реакции амплификации и детекцию продуктов амплификации.

Для экстракции ДНК и РНК T.vaginalis из биологического материала и культуры клеток, использовали серийно выпускаемые наборы реагентов ДНК-Сорб-АМ (производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, Роспотребнадзора - № ФСР 2007/00183 от 13 июля 2009г) и NucliSens Isolation Reagents (Биомерье, Франция) соответственно. Наборы реагентов основаны на модифицированной методике аффинной сорбции на силикагелевом сорбенте по Boom R. (Boom R., et al., 1990). В результате процедуры экстракции получается высокоочищенный

препарат нуклеиновых кислот, свободный от ингибиторов реакции амплификации. Экстракцию проводили согласно инструкциям производителей.

Для проведения дизайна праймеров и зондов были выполнены множественные выравнивания и сравнительный анализ фрагментов генов у широкого спектра микроорганизмов, полученных из компьютерной базы данных Национального центра биотехнологической информации GenBank (NCBI - The National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ последовательностей и выбор области посадки праймеров проводили с помощью компонента AlignX программного пакета Vector NTI Advance 11.0. Выбор праймеров (оценку наличия или отсутствия праймеров димеров, образования петель, температуру плавления и т.д.) оценивали с помощью компонента Primer Select v.4.03 программного пакета DNAStar. Специфичность выбранных праймеров и зондов проверялась с использованием поисковой программы для нуклеотидных и белковых последовательностей BLAST Национального центра биотехнологической информации (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Олигонуклеотиды были синтезированы на автоматизированном олигонуклеотидном синтезаторе АСМ-1000 по амидофосфитной схеме согласно рекомендациям производителя. Очистку праймеров флуоресцентно-меченных зондов проводили методом гель-электрофореза и обращено-фазовой ВЭЖХ.

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием процедуры «горячего старта». Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза и гибридизационно-флуоресцентного анализа. Для проведения ПНР с электрофоретической детекцией использовали амплификатор Терцик («ДНК-технология», Россия). Для проведения ПЦР в реальном времени -RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия).

При разработке методики НАСБА для выявления T.vaginalis мы использовали «Базовый набор «NucliSens» («bioMerieux», Франция) включающий в себя комплект реагентов для экстракции РНК из клинического материала (лизирующий раствор, отмывочный раствор, сорбент Silica и элюирующий буфер) и комплект реагентов для проведения амплификации (солевые компоненты, дНТФ, комплекс ферментов в виде лиофилизированной гранулы с AMV- обратной транскриптазой, Т7 РНК-полимеразой, РНКазой H и необходимые для их растворения компоненты). Реакцию амплификации НАСБА проводили на анализаторе «NucliSens EasyQ» («bioMerieux», Франция) и на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия).

Для получения РНК-защищенных контролей (1ш2-фагов) проводили клонирование целевых фрагментов ДНК в экспрессирующие плазмидные вектора, содержащие регуляторные элементы бактериофага Т7 и необходимые структурно-функциональные элементы гш2-фага по сайтам рестрикции BamHI и KpnI. Экспрессия РНК, содержащей данные конструкты и упаковка в фаговые частицы в составе генома т$2-фага происходила после трансформации плазмидным вектором соответствующего штамма E.coli (Sambrook J., et al., 2001). Каждый из полученных рекомбинантных векторов с клонированным

участком содержал фрагмент гена gag ВИЧ, что позволило измерить концентрацию РНК с использованием количественного набора «Cobas Amplicor HIV-l Monitor» версии 1.5 фирмы Хоффманн-Ла Рош (Швейцария).

Для получения ДНК-защищенных контролен (лямбда фагов) проводили клонирование целевого фрагмента ДНК в вектор XgtlO по сайту рестрикции EcoRI. Копийность клонированного препарата ДНК оценивали методом лимитирующих разведений с использованием программы Quality (Rodrigo A.G., et al., 1997).

Микроскопическое исследование на T.vaginalis проводили двумя методами - микроскопией нативного препарата и микроскопией фиксированного препарата, окрашенного способом Романовского-Гимзе. Процедуры выполнялись согласно установленным в лабораторной практике протоколам, в соответствие с методическими рекомендациями (Соколовский Е.В., и соавт., 2010).

Для проведения культурапьного исследования использовали питательную среду СВТ (НИИЭМ имени Пастера, СПб), среду питательную для выделения трихомонад (ООО НПО Диагност-Мед, Омск), основу агара Трихомонас (Himedia, Индия). Все среды готовили и использовали в соответствии с инструкцией производителей. Так же в исследование была включена среда СВТ с добавлением суспензии клеточной культуры L-41, поддерживаемая постоянными пассажами на многокомпонентных питательных средах 199 и 2МЕМ в соотношении 1:1 (ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва).

Для подсчета клеток трихомонад использовали камеру Горяева (Слюсаренко Т.П., 1984).

Для проведения реакции циклического секвенирования были использованы наборы реагентов фирмы Applied Biosystems (США): Big Dye ® Terminator vl.l Sequencing Standard Kit. Разделение меченых фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора Applied Biosystems ABI Prism® 3100.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы SPSS 11.5 for Windows. Вычисляли следующие параметры: коэффициент корреляции Спирмена, коэффициент вариации, коэффициент регрессии. Количественные показатели представлены в виде среднего и ее стандартной ошибки, медианы. Для графического представления был использован программный пакет Microsoft Office Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка методики выявления ДНК T.vaginalis на основе метода ПЦР в

реальном времени

На сегодняшний день, за рубежом, существует большое количество так называемых «in house» ПЦР методик, направленных на выявление ДНК T.vaginalis, каждая из которых имеет свои недостатки, затрудняющие их использование в клинической лабораторной диагностике. Для одних методик характерна большая длина амплифицируемого фрагмента, для других -

недостаточное число циклов амплификации, для всех методик характерно отсутствие горячего старта и отсутствие ВКО для исключения ложноотрицательных результатов исследования. В главе 3 диссертации описана разработка методики с высокими показателями аналитической чувствительности и специфичности, в которой мы учли все недостатки перечисленные выше.

На первом этапе нами был выполнен поиск генов-мишеней для проведения амплификации, удовлетворяющих следующим условиям: присутствие в данном гене консервативных участков, не подверженных мутагенезу, а также уникальность структуры данной последовательности ДНК в отношении T.vaginalis, не встречающаяся в клетках других организмов. В результате проведенного анализа в качестве мишени нами были выбраны повторяющиеся генетические элементы ДНК в геноме T.vaginalis (Trichomonas vaginalis repeated DNA target for PCR identification, GenBank: L23861), использование которых в качестве мишени в методиках, предложенных за рубежом, позволило добиться высокой диагностической чувствительности. Кроме того, данная мишень высокоспецифична для влагалищной трихомонады, и не обнаружена в геномах других простейших, включая близкородственные виды трихомонад - T.tenax, T.gallinae и Pentatrichomonas hominis (Paces J., et al., 1992).

Проведя анализ последовательности были выбраны области гибридизации праймеров и специфического флуоресцентно-меченного зонда (ФМ-зонда). Выбранные праймеры (TvGl/TvG2) и специфический ФМ-зонд (Tv-12M) комплементарны геномной ДНК всех представителей вида T.vaginalis. Длина мишень-специфической области праймеров TvGl и TvG2 составила 27 и 26 оснований соответственно. GC состав праймеров TvGl и TvG2 составил 45% и 50% соответственно. Размер фрагмента, фланкированного парой праймеров TvGl и TvG2 составил 237 п.о.. При проведении оптимизации условий для повышения выхода ПЦР продукта число циклов программы амплификации было выбрано равным 45 при температуре отжига равной 60°С. Для предотвращения появления неспецифических продуктов реакции амплификации использовали методику «горячего старта».

Детекция продуктов амплификации в разрабатываемой методике происходила непосредственно в процессе реакции в режиме реального времени. Для ПЦР в реальном времени помимо праймеров в ПЦР-смесь добавляются ФМ-зонды, которые при появлении специфического продукта амплификации гибридизуются с ним, вызывая увеличение уровня флуоресцентного сигнала. Для эффективной и специфичной работы зонда его температура плавления должна быть на 5-10 градусов выше, чем температура плавления праймеров (Livak K.J, et al., 1995). Для разработанного нами ФМ-зонда Tv-12M характерна высокая температура плавления и наличие вторичной структуры при которой флуорофор находиться в непосредственной близости к гасителю, что позволяет увеличить специфичность методики, а также ее запас прочности (рисунок 1). Длина мишень-специфической области 26 оснований, GC состав — 58,6%, расчетная температура плавления зонда Tv-12M составляет 67°С и превышает температуру плавления праймеров TvGl и TvG2 на 9 и 7 градуса

соответственно. На 5'-конце присутствует флуорогенная молекула Fam, а 3'-конец ковалентно связан с гасителем BHQ1.

Для стандартизации всех этапов молекулярно-биологического исследования и для достижения высокого качества метода в условиях клинико-диагностической лаборатории необходимо использование контрольных образцов. Их разработка, подбор рабочих концентраций и условий испльзования является необходимой процедурой для корректной работы методики. В отличие от методик, предложенных за рубежом (Riley D.E., et al., 1992; Kengne P., et al., 1994; Shaio M.F., et al., 1997; Madico G„ et al., 1998; Mayta H., et al., 2000) и методики, представленной в работе Мустафиной Г.Р. (Мустафина Г.Р., 2010), в разработанной нами методике используются несколько контрольных образцов и реакций, таких как ВКО, ПКО, «К-» и «К+», позволяющих использовать ее в клинико-диагностических лабораториях. Данные образцы и реакции позволяют контролировать каждый из этапов ПЦР-исследования - от экстракции нуклеиновых кислот до анализа результатов, что способствует достижению максимальной достоверности анализа.

Для контроля реакции амплификации нами был разработан положительный контрольный образце (ПКО), который, после определения его концентрации, мы использовали для оценки аналитической чувствительности методики, которую проводили на двукратных разведениях полученного препарата в 10 повторах каждое (таблица 1). Аналитическая чувствительность методики на полученном препарате ПКО составила 5x102 коп/мл.

Проверку аналитической специфичности методики проводили на штаммах и клинических изолятах из коллекции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии. Перекрестных реакций с другими микроорганизмами, получено не было.

„9 9.

С' А

/ \ А А

9 Э

\ / Т А

С - д

т д

С д

1

А Т

1 I

С д

9 с

5' ,»С яп, д., э' Рис. 1 Структура ФМ-зонда Tv-12M

Таблица 1

Определение аналитической чувствительности ПЦР с использованием рекомбинантного препарата ДНК ПКО T.vaginalis

Двукратные разведения препарата ДНК ПКО с концентрацией 4x103 коп/мл Количество положительных результатов при 10-кратном тестировании Количество копий ДНК в разведении, коп/мл

1 10 2хЮ3

1/2 10 1x10'

1/4 10 5х102

1/8 8 2,5x102

1/16 6 1,25х 102

1/32 0 7x10'

Для контроля эффективности экстракции ДНК и возможного ингибирования реакции ПЦР в методике используется универсальный неконкурентный внутренний контрольный образец (ВКО) размером 230 п.о. (раствор фаговых частиц бактериофага лямбда GT67, содержащих клонированную генно-инженерную конструкцию с искусственной нуклеотидной последовательностью, негомологичной известным микроорганизмам и вирусам), который добавляется в каждый образец при экстракции нуклеиновых кислот, что позволяет контролировать все этапы ПЦР анализа.

Разработка методики выявления РНК T.vaginalis на основе метода НАСБА в реальном времени

В качестве альтернативного МАНК для диагностики T.vaginalis была выбрана реакция транскрипционной амплификации НАСБА, направленная на выявление РНК T.vaginalis. Для данной реакции показана большая аналитическая чувствительность в сравнении с ПЦР для выявления С.trachomatis в связи с выбором в качестве мишени 16S рРНК (Chan А.В., et al., 1999; Morré S.A., et al., 1999). Разработка методики проводилась на основе «Базового набора «NucliSens» («bioMerieux», Франция).

Первая задача, которую нам необходимо было решить — это выбор подходящей мишени для амплификации. Основным обстоятельством для выбора в качестве мишени именно 18S рРНК послужило то, что в клетке содержится не менее 10 тыс. молекул рРНК. В прокариотических клетках (например, E.colî) содержится порядка 20 тыс. молекул рРНК (Lewin В., 1997), в то время как в эукариотических клетках, к которым относиться T.vaginalis, их может быть значительно больше. Данная особенность выбранной мишени дает возможность добиться высокой аналитической чувствительности у разрабатываемой методики. Вторым обстоятельством является то, что РНК является менее стабильным материалом и быстрее разрушается. Это дает предпосылки для использования РНК в качестве маркера для контроля эффективности проведенной терапии (Morre S.A., et al., 1996; McKillip J.L., et al., 1998).

Для разработки специфических праймеров и ФМ-зонда был проведен сравнительный анализ генов 18S рРНК у широкого спектра микроорганизмов, включая представителей семейства Trichomonadidae, на основе информации GenBank и определен участок высокоспецифичный для T.vaginalis.

«Прямой» праймер для реакции НАСБА имел характерную особенность: 5'-концом праймера TvNSB-2-T7 являлась последовательность промотора в виде полимеразы Т7 РНК, которая состояла из 25 нуклеотидов, необходимых для работы РНКазы Н, участвующей в реакции НАСБА. За последовательностью промотора Т7 РНК следовала цепь нуклеотидов, которая комплементарна последовательности РНК-мишени, имела длину в 21 основание, содержала GC в объеме 47,6%. «Обратный» праймер TvNSB-2R идентичен последовательности РНК-мишени, имел длину 22 основания, содержал GC в объеме 50%. Длина последовательности амплифицируемой РНК-мишени, фланкированной выбранными нами праймерами TvNSB-2-T7 и TvNSB-2R, составила 174 п.о.

Детекция продуктов амплификации НАСБА, по аналогии с ПЦР, происходила в режиме реального времени. В реакции НАСБА используется формат ФМ-зондов «molecular beacons», так называемые «молекулярные маячки» (ММ), которые добавляются в амплификационную смесь вместе с праймерами. ММ состоит из последовательности зонда с двумя короткими фланкирующими последовательностями, комплементарными друг другу (arm-последовательности). На 5'-конце присутствует флуорогенная молекула, тогда как З'-конец ковалентно связан с гасителем (рис 2) (Tyagi S., et al., 1996).

В реакции NASBA обе комплементарные агт-последовательности гибридизируются и придают ММ форму, при которой гаситель находится в непосредственной близости к флуорофору и поглощает испускаемое флуорофором свечение. В присутствии мишени внутренняя последовательность ММ, образующая петлю, гибридизуется с ней, зонд «раскрывается», в результате чего флуорофор и гаситель удаляются друг от друга, а испускаемый флуорофором свет регистрируется прибором. Преимуществом ММ является то, что они способны дифференцировать отличия между мишенями отличающихся только одним нуклеотидом (Bonnet G., et al., 1999).

Одно из главных условий, которое должно соблюдаться при выборе ММ -это отсутствие любых дополнительных вторичных структур. Для исследования возможности появления вторичной структуры, определения свободной энергии (AG) и температуры плавления вновь образованного ММ мы использовали программу для работы со свернутыми ДНК Mfold (Zuker M., 2003). Свободная энергия (AG) должна быть в пределах от -2,5 до -4,5 и температура плавления шпильки должна быть равной 60-70°С.

Таким образом, в гетерологической области гена 18S рРНК нами была выбрана последовательность GGACTGCGAGCCTGAGAGG, которая может быть использована для конструирования ММ (рисунок 3):

Флуорофор

18-25 нуклеотидов последовательности РНК-мишени

Гаситель

CGATCG - XXX...........XXX - CGATCG

arm последовательность на конце 5'

КзЬ

arm последовательность на конце 3'

Рис 2. Схема последовательности «молекулярного маячка».

1557 1560 1570 1580 1590 1 ¡00

Trichomonas vaginalis entatrichomonas hominis Candida albicans Candida krusei Candida tropicalis Candida parapsillosis Homo sapiens Balantidium coli Toxoplasma gondii Aspergillus fumigatus Saccharomyces cerevisiae Thaumatomonadida Dientamoeba fragilis 1275 1257 1434 1409 1412 1450 1528 1339 1462 1387 1450 1484 1330 GCTACAATGTTAGGATCAAT-A GCTACAATGCTAAGATCAAT-A GCTACACTGACGGAGCCAGCG.fi GCTACACTGACGGAGCCAGCAA G С TAC ACTG ACGGAGC С AGCGi GCTACACTGACGGAGCCAGCGJ! GCTACACTGACTGGCТСAGCG1 GCTACACTGATGCATACAACAi G С TACACTG ATGC АТС СAAC Gi GCTACACTGACAGGGCCAGCGi GCTACACTGACGGAGCCAGCGJi G С TAC ACTG ATGC G АТС АТС Gi GCTACAATGTTATAATCAAAGi 3GACT--GCGAGCCTGAGAGC 3 G A A----GC TAGTCTG AT AG С 3TATA-AGCCTTGGCCGAGA0C ЗТССА—AC С TTGGTC GAGAG С 3TATA-AACCTTGGCCGAGAGC 3TATA—AACCTTGGCCGAGAGC ÎTGCCTACCCTACGCCGGCAGC JTGC---CTAGCCCGCCAGC 3TTTATAACCTTGGCCGATAGC 3TACATCACCTTGGCCGAGACC 3TCTA—ACCTTGGCCGAGAGC 3 С TTACAACС TTGACTGAGAG С JGTTT---GCTAAATCGATAGi JTGC Й.САТ tctg :ccg TCTG TCTG :gcg j TAT ГСТА TCTG ГСТТ TCTG ГТАТ

Рис. 3 Последовательность, находящаяся в гетерологической области

фрагмента гена 18S рРНК для конструирования ММ.

Для выбранной последовательности был сконструирован ММ TvNSB-Z3 (рисунок 4) не имеющий других вторичных структур кроме заданной, с AG -3,9 и Тт=66,8°С. На 5'-конце зонда присутствует флуорогенная молекула Fam, а на 3'-конец ковалентно связан с гасителем BHQ1.

Оценку эффективности работы методики и подбор условий амплификации проводили на рекомбинантном препарате РНК T.vaginalis, который включал в себя фрагмент гена 18S рРНК фланкированный праймерами TvNSB-2R/TVNSB-2-T7. Установленный согласно рекомендуемым протоколам порог положительного результата разработанной методики составил 1,2 у.е. флуоресценции. В нашем исследовании мы добились 3-5 кратного превышения порогового уровня флуоресцентного сигнала на низких концентрациях мишени (Таблица 2).

Для стандартизации условий лабораторного исследовании с использованием реакции транскрипционной амплификации НАСБА в разработанной нами методике, по аналогии с ПЦР, используются несколько контрольных образцов и реакций, таких как ВКО, ПКО, «К-» и «К+», позволяющих использовать ее в клинико-диагностических лабораториях.

l=19

G С

с a a т

G - С

С G 31 S С G Э1

s-tm=66.8°c

ûg=—3.9

Рис. 4. Схема ФМ зонда TvNSB-Z3

Таблица 2.

Проверка эффективности методики с выбранными праймерами и ММ на рекомбинантном препарате РНК фрагмента гена 18S рРНК T.vaginalis в различных концентрациях (в у.е. флуоресценции)

Концентрация ПКО, коп/мл TvNSB-2R / TVNSB-2-T7 / TvNSB-Z3

10" 5.787

106 5.934

105 4.077

103 6.085

104 3.848

ю4 6.121

к- 1.013

к- 1.009

В разрабатываемом наборе реагентов мы использовали экзогенный конкурентный ВКО, который представляет собой молекулу РНК, фланкированную сегментами, специфичными к 18S рРНК T.vaginalis и доступными для распознавания праймерами, применяемыми для амплификации РНК данного возбудителя. Т.е. ВКО амплифицируется с теми же праймерами, которые используются для амплификации РНК-мишени в одной реакции амплификации. В ходе детекции ампликоны ВКО отделяются от ампликонов РНК -мишени с помощью ММ, который гибридизуется на область, не являющуюся частью РНК-мишени.

Разработанный нами ВКО РНК T.vaginalis представляет собой генно-инженерный продукт. В качестве матрицы для наработки ампликона для клонирования использовали конструкт (рисунок 5) из олигонуклеотидов, два из которых содержали сайты рестрикции BamHl и KpnL, необходимые для последующего клонирования. Особенностью данного конструкта является то, что гибридизационная область ФМ-зонда ICNSBNG-Z уникальна, т.е. изменена нами таким образом, чтобы не быть комплементарной последовательности 18S

рРНК T.vagmalis, а также другим нуклеотидным последовательностям, опубликованным в СепВапк. Зонд ІСИЗВМС-г имеет длину 27 оснований, вС состав 45%, отсутствуют вторичные структуры, кроме заданной, расчетное значение свободной энергии Ав полученной структуры равно -2.8, и температура плавления шпильки 61°С. На 5'-конце зонда присутствует флуорогенная молекула Яох, а 3'-конец ковалентно связан с гасителем ВІ !()2 (рисунок 6).

Генно-инженерный конструкт РНК ВКО

Область праймера

\

Область зонда

Область праймера

5' < —> <-» < ---- >

сЛт Кргі ТУ1С-3.1 3 5' МЄІС-1.2

3'

Э ..... = ™с-4.1

Рис. 5 Схема генно-инженерного конструкта РНК ВКО. Б - флуорофор, <3 - гаситель.

1=27

С- Є -

С - (3

І і Т А

I

0 - э

1 і в - с

I

с.-.а ДС=-2.!

Рис. 6 Структура ФМ-зонда ICNSBNG-Z для детекции ВКО

Оценку аналитической чувствительности методики НАСБА проводили на двукратных разведениях рекомбинантного препарата РНК T.vaginalis, которая составила 50-100 копий для РНК ПКО (таблица 3). Далее, мы проводили оценку степени конкуренции в процессе ко-амплификации фрагментов ПКО и ВКО (моделирование положительного клинического образца с низким содержанием возбудителя). Было установлено, что при минимальном содержании РНК ПКО Т.vaginalis в образце, равном 100 копий в реакцию (1x105 коп/мл), конкуренция отсутствует при содержании РНК ВКО в количестве 100-300 копий в реакцию (1-3x105 коп/мл). Вследствие этого рабочую концентрацию ВКО, добавляемую при экстракции, мы определили равной 1хЮ5 коп/мл.

Проверку аналитической специфичности методики проводили на штаммах и клинических изолятах из коллекции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии. Перекрестных реакций с другими микроорганизмами, получено не было.

Таблица 3

Определение аналитической чувствительности реакции НАСБА с использованием рекомбинантного препарата РНК ПКО T.vaginalis

Разведения РНК ПКО (4х 104 коп/мл) Количество положительных результатов при 5-кратном тестировании Количество копий РЫК в разведении, коп/мл

1 5 2x104

1/2 5 1хЮ4

1/4 3 5x103

1/8 1 2,5х 103

1/16 0 1,25x10J

1/32 0 7x102

В разработанной методике в качестве положительного контроля мы использовали фрагмент гена I8S рРНК клонированный в >^-фаг и содержащий Т7 промотор. Т.е. данный ПКО представляет собой промежуточный продукт реакции НАСБА - кДНК с двуспиральной областью Т7-промотора, необходимой Т7 РНК-полимеразе для производства транскриптов РНК, которые выступают в качестве матрицы для дальнейшей амплификации.

Таким образом, нами была разработана методика, основанная на технологии НАСБА в реальном времени, содержащая одну пару праймеров и 2 ММ - для выявления РНК T.vaginalis и РНК ВКО. Зонд для детекции продукта амплификации T.vaginalis на 5'-копце содержит флуоресцентный краситель FAM, а для детекции ВКО использовали зонд, содержащий краситель ROX. Для контроля всех этапов проведения анализа помимо отрицательных контролей выделения и амплификации были разработаны рекомбинантные препараты ДНК ПКО, содержащий Т7-промотор, и РНК ВКО.

Определение аналитической чувствительности методик на основе ПЦР и НАСБА и их сравнение с микроскопией (нативного и окрашенного препаратов) и культуральным посевом.

Важнейшей характеристикой лабораторного метода является диагностическая чувствительность (ДЧ) - показатель, отражающий долю случаев выявленной инфекции среди обследованных инфицированных лиц. ДЧ в свою очередь в значительной степени определяется аналитической чувствительностью метода - минимальным количеством возбудителя, обнаруживаемым лабораторным тестом. Чем выше аналитическая чувствительность методики, тем выше его ДЧ. Для более полного и объективного представления о возможностях тех или иных лабораторных методов следует иметь их количественно охарактеризованные аналитические характеристики.

Модельный эксперимент по сравнению аналитической чувствительности

методов направленных на выявление Т. vaginalis В исследовании использовали эталонный штамм T.vaginalis В-7140 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Штамм поддерживался постоянными пассажами на свежей питательной среде СВТ. Для эксперимента использовали культуру клеток T.vaginalis, находящуюся в логарифмической фазе роста и при микроскопическом исследовании которой, в среде обнаруживались только подвижные клетки классической морфологии. Концентрацию трихомонад в культуре определяли методом прямого подсчета клеток в камере Горяева. Далее из полученной суспензии клеток готовили последовательные десятикратные разведения таким образом, чтобы расчетное количество простейших в последней пробирке было менее одной клетки на 1 мл физиологического раствора, а общий объем каждого разведения составил 2мл. Из каждого разведения брались аликвоты, которые параллельно исследовали с помощью микроскопии (нативного и окрашенного препарата), культурального посева и методиками на основе ПЦР и НАСБА согласно установленным для каждого из них протоколам (п=3). Схема эксперимента представлена на рисунке 7.

[ 1 »-датный шгведедая;

О 919|И9

Культура Tv

jf I ^Näfe,

Кул ьтуральиым посев Микроскопия Микроскопия окрашенного препарата пцр насба

препарата

Рис. 7 Схема модельного эксперимента по установлению аналитической чувствительности методов выявления T.vaginalis

При проведении микроскопического исследования на T.vaginalis исходные препараты клеточной суспензии и первое разведение просматривали в 10 полях зрения. Для последующих разведений, вследствие уменьшения количества трихомонад, проводили просмотр 100 полей зрения. При культуральном исследовании учет результатов проводили через 48 часов для малых разведений (1,45x10 и 1,4х105 кл/мл), через 96 ч для больших разведений (1,45х104 и 1,4x103 кл/мл) и через 168 ч — для сверх больших разведений (1,45x102 и меньше кл/мл). Определение ДНК и РНК T.vagmalis проводили методами ПЦР и НАСБА согласно разработанным методикам.

Оценивая результаты двух методик микроскопии, следует отметить, что при высокой (более 10" в 1 мл) концентрации клеток T.vaginalis в исходном образце обеими методиками было выявлено достаточное содержание клеток в каждом поле зрения микроскопа и для интерпретации результатов достаточно было анализа не более 10 полей зрения.

При микроскопическом исследовании аликвот из разведения с концентрацией 105 кл/мл приходилось просматривать гораздо больше полей зрения, и не в каждом из них обнаруживались клетки трихомонад. Разведение клеточной суспензии до 104 кл/мл привело к тому, что при анализе 100 полей зрения было обнаружено всего несколько клеток простейшего при микроскопии нативного препарата. Таким образом, установленной нами аналитической чувствительностью микроскопического метода в условиях чистой культуры T.vaginalis, следует считать значение более 105 кл/мл, а при исследовании биологического материала от пациентов эта величина может быть больше.

При проведении культурального исследования нами были получены следующие результаты: при высокой концентрации клеток простейших в разведении (более 105 кл/мл) после 2 суток инкубации на исследованных питательных средах во всех полях зрения микроскопа было зафиксировано более 200 клеток трихомонад. При уменьшении концентрации клеток простейших в разведении до 104 кл/мл через 4 суток культивирования на питательных средах были выявлены единичные подвижные клетки T.vaginalis не в каждом поле зрения микроскопа. При содержании простейших в исследуемом разведении 103 кл/мл, было зафиксировано не более 1 клетки не в каждом поле зрения микроскопа только для среды СВТ через 4 суток культивирования. Дальнейшая инкубация образцов не приводила к увеличению содержания клеток, и через 7 суток от начала культивирования.

При культивировании на питательной среде СВТ+Ь-41, даже если концентрация клеток простейших в разведении составляла 102 кл/мл, в каждом поле зрения микроскопа насчитывалось свыше 200 простейших. Минимальная концентрация простейших в разведении, при которой наблюдался рост на среде СВТ+Ь-41, составила 14 кл/мл.

Таким образом, установленная нами аналитическая чувствительность культурального метода с использованием серийно производимых сред составила более 104 кл/мл, а при культивировании T.vaginalis в питательной среде СВТ в присутствии клеточной линии 1,-41 аналитическая чувствительность составила не менее 14 кл/мл.

При исследовании с использованием методик на основе ПЦР и НАСБА в реальном времени были получены такие же значения аналитической чувствительности, что и для питательной среды СВТ в присутствии клеточной линии Ь-41 - воспроизводимое при троекратных тестированиях обнаружение ДНК и РНК T.vaginalis, которая составила не менее 14 кл/мл.

В результате проведенного исследования было установлено, что среди методов выявления T.vaginalis, наибольшей аналитической чувствительностью обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА, а наименьшей аналитической чувствительность — микроскопические методы. Аналитическая чувствительность культурального метода с использованием бесклеточных питательных сред была выше, чем у метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК. При использовании питательной среды с добавлением клеточной линии Ь-41 аналитическая чувствительность составила не менее 14 кл/мл, что соответствует чувствительности методов ПЦР и КАБВА.

Таблица 4

Результаты выявления T.vaginal¡s разными методами в разведениях культуры

Концентрация клеток Т.уа&паИй в разведении (кл/мл) Метод исследования

Микроскопия (среднее количество простейших в п/зр) Культуральный метод (среднее количество простейших в п/зр) МАНК Количество положительных результатов при 3-кратном тестировании

Нативный препарат Окрашен, препарат Учет результатов (к-во п/зр) Среда свт (СПб) Среда ООО НПО Диагност-Мед (Омск) НтесНа (Индия) СВТ+ Ь-41 Учет результат ов, (сутки) ПЦР НАСБА

(1.45±0.24)х106 5.36±0.92 12.96±3.02 10 >200 >200 >200 >200 2 3 3

1.45x103 1.53±0.51 2.7±0.45 100 >200 >200 >200 >200 2 3 3

1.45x104 0.06±0.01 0 100 0,66±0.35 0.10±0.11 0.10±0.11 >200 4 3 3

1.45x103 0 0 100 0-10tt0.ll Неподв. Неподв. >200 4 3 3

1.45x10" . - 0 0 0 >200 7 3 3

1.45x10 - - - 0 0 0 >50 7 3 3

1.45 ■ - 0 0 0 0 7 1 2

1.45x10"' - - - 0 0 0 0 7 0 0

Определение частоты выявления T.vaginalis в зависимости от аналитической чувствительности методов диагностики трихомонадной инфекции.

На сегодняшний день в РФ для выявления T.vaginalis в биологическом материале из урогенитального тракта отсутствуют нормативные документы, регламентирующие использование МАНК при лабораторной диагностике трихомониаза. По данным зарубежных исследователей диагностика трихомониаза с помощью ПЦР обладает высокой диагностической чувствительностью (93-98,7%) по сравнению и с микроскопией (50-64,9%), и с культуральным методом (73-89,2%) (Ryu J.S., et al., 1999; Nye M.B., et al., 2009; Shaio M.F., et al., 1997). Но в нашей стране метод ПЦР для установления диагноза трихомониаза применяется реже других методов лабораторной диагностики, и микроскопическое исследование является преобладающим методом при установлении диагноза трихомониаза (Фриго Н.В., и соавт., 2008). Вследствие этого, мы решили определить диагностическую эффективность методов микроскопии и культурального посева на основе установленных нами значений их аналитической чувствительности.

Для определения концентрации T.vaginalis в биологическом материале нами была разработана методика количественного определения возбудителя в образце методом ПЦР в реальном времени. Вследствие того, что для получения нуклеиновых кислот, необходимых для проведения ПЦР-исследования, мы используем сорбентный метод экстракции, все примеси, характерные для клинического материала, из раствора вымываются и не оказывают влияние на конечный результат (Boom R., et al., 1990). Поэтому данная методика может использоваться для определения концентрации T.vaginalis в биологическом материале, полученном от пациентов.

В качестве мишени для ПЦР амплификации нами был выбран ген Са2+ АТФазы (Meade J.C., et al., 1997), который представлен в геноме T.vaginalis в 1 копии. Благодаря однокопийности мишени становится возможным определение концентрации T.vaginalis в исследуемом материале с учетом 1 копия = 1 ГЭ = 1 клетка. Фрагмент, размером 186 п.о., фланкированный выбранными праймерами TVCA-1 и TVCA-2 и включающий в себя область ФМ-зонда TVCA-Z был клонирован в X фаг - X-gtl0 для последующего создания ДНК-стандартов. ДНК стандарты готовили путем разведения данного рекомбинантного препарата ДНК. В методике используются три количественно охарактеризованных ДНК стандарта, добавляемых в каждую реакцию амплификации, что позволяет построить по ним калибровочную прямую и определить концентрацию возбудителя в каждом исследуемом образце.

При сравнении на разведениях клеточной культуры методики количественного определения возбудителя в образце методом ПЦР в реальном времени (ГЭ/мл) с методикой прямого подсчета клеток в камере Горяева (кл/мл) было получено почти полное совпадение значений концентраций (рисунок 8). Полученные результаты позволяют нам соотносить значения

аналитической чувствительности выраженные в кл/мл со значениями, выраженными в ГЭ/мл.

7.0 -

6.0 -

5.0 -4.0 -3.0 -2.0 1,0 -

Рис. 8 Графическое представление сопоставления значений концентраций T.vaginalis полученных при использовании двух количественных методик

Для проведения исследования по определению диагностической эффективности методов микроскопии и культурального посева нами было исследовано 13376 биологических образцов, из которых у 210 (199 женщин и 11 мужчин) была обнаружена ДНК T.vaginalis с помощью разработанной нами методики ПЦР в качественном формате на повторяющиеся генетические элементы ДНК T.vaginalis. В каждом из образцов мы определяли концентрацию трихомонад с помощью разработанной нами методики количественного определения ДНК T.vaginalis с помощью ПЦР в реальном времени.

В проведенном ранее исследовании мы установили значения аналитической чувствительности лабораторных методов выявления T.vaginalis, которые составили: для микроскопии — 105 ГЭ/мл, для культурального посева с использованием бесклеточных питательных сред — 104 ГЭ/мл и для методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) с использованием разработанных нами методик - 14 ГЭ/мл. Результаты проведенного нами количественного исследования показали, что концентрация ДНК T.vaginalis в биологическом материале, полученном от пациентов, варьирует от 100 до 2,8x107 ГЭ/мл. Медиана концентрации составила 1,9x104 ГЭ/мл. При этом в 57,1% образцов концентрация ДНК T.vaginalis составила менее 105 ГЭ/мл (что соответствует значению аналитической чувствительности микроскопического метода, рис. 9А); в 39,5% — менее 104 ГЭ/мл (значение аналитической чувствительности культурального метода, рис. 9Б). Более низкая концентрация возбудителя у ряда пациентов при трихомониазе может быть причиной также более низкой диагностической чувствительности методов микроскопии и культурального посева.

С учетом значений аналитической чувствительности разных методов лабораторной диагностики трихомониаза установлено, что при использовании разработанных методик на основе МАНК T.vaginalis выявляется дополнительно в 57,1% и 39,5% биологических образцов, в которых концентрация возбудителя

достоверно ниже, чем аналитическая чувствительность микроскопического и культурапьного методов соответственно.

А)

^ ВО

4

. * ♦----------♦ «,.-----------------* _ V

.............V •

♦ ♦♦ % * * У./:» ♦ +

..........♦.$-4-♦**_

- «РОЭ» 42,9%

Аналитическая чувствительность МС

■ «ЫЕв» 57,1%

Б)

'V . .. г. - : ......

Г*-*-----' V.-—*-4

I . .. Л -. V Л у

I 3.0-------* ----*--♦ ,........*----^ ♦ ♦ *----

I . .**♦ »и „.♦«*

«РОБ» 60,5%

Аналитическая чувствительность КМ

«ЫЕв» 39,5%

♦ *

Рис. 9 Распределение значений концентраций ДНК T.vaginalis в биологических образцах (п=210) и оценка диагностической эффективности традиционных методов исходя из значений их аналитической чувствительности: А) Метода микроскопии (МС); Б) Культурапьного метода (КМ).

ВЫВОДЫ

1. Разработана стандартизованная методика выявления ДНК Т.уа§таИ$ (протокол экстракции нуклеиновых кислот с контролем его эффективности, олигонуклеотидные праймеры и зонды, условия амплификации, контрольные образцы) для диагностики трихомониаза, на основе метода ПЦР в реальном времени.

2. Разработана стандартизованная методика выявления РНК T.vaginalis (протокол экстракции нуклеиновых кислот с контролем его эффективности, олигонуклеотидные праймеры и зонды, условия амплификации, контрольные образцы) для диагностики трихомониаза, на основе метода НАСБА в реальном времени.

3. Установлено, что аналитическая чувствительность методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) достоверно выше (14 кл/мл), чем у метода микроскопии окрашенного и нативного препаратов (105 кл/мл) и у метода культивирования T.vaginalis (104 кл/мл).

4. Установлено, что при использовании разработанных методик на основе МАНК T.vaglnalis выявляется дополнительно в 57,1% и 39,5% биологических образцов, в которых концентрация возбудителя достоверно ниже, чем аналитическая чувствительность микроскопического и культурального методов соответственно.

Практические рекомендации

1. Для постановки диагноза урогенитального трихомониаза у мужчин и женщин рекомендуется использование метода ПЦР, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью независимо от локализации инфекционного процесса, его длительности, наличия или отсутствия клинических проявлений и их выраженности.

2. Разработанная методика на основе технологии НАСБА может использоваться как независимый метод диагностики урогенитального трихомониаза. Рекомендуется для решения вопросов, связанных с получением дискордантных результатов при совместном использовании метода ПЦР и традиционных методов выявления трихомонад (микроскопии и культурального посева) и оценки эффективности проведенной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шипицына, Е.В. Применение метода Nucleic Acid Sequence-Based Amplification в реальном времени (NASBA-Real-Time) для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции. / Е.В. Шипицына, Н.Е. Воробьева, А.М. Савичева, Е.В. Соколовский, А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // Журнал акушерства и женских болезней.—2005. - Т. LIV, №4.- С. 1721.

2. Гущин, А.Е. Разработка тест-системы на основе технологии NASBA-Real-time (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) для диагностики инфекции, вызванной С.trachomatis. / А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих, Г.А. Шипулин // Сборник тезисов научных работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов —М., 2005—Т2 —с. 52.

3. Гущин, А.Е. Молекулярно-биологические методы - Real-time-PCR и NASBA-REAL-TIME в диагностике и изучении инфекций. / А.Е. Гущин, Ю.А. Савочкина, П.Г. Рыжих и др. // Сборник трудов Международной конференции "Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине".— Новосибирск, 2006

4. Гущин, А.Е. Разработка и апробация тест-системы для диагностики Chlamydia trachomatis на основе технологии Nucleic Acid Sequence-Based Amplification в реальном времени (NASBA-Real-time). / А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // Материалы Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней»,- Новосибирская обл. - 2005 - с. 257-264.

5. Гущин, А.Е. Верификация результатов лабораторных исследований на наличие возбудителей ИППП с помощью тестов на основе технологии NASBA-

Real-Time. / A.E. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // Международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней»,- Минск, 2007 - с. 57

6. Гущин А.Е. Изучение специфичности тест-системы «Амплисенс N.gonorrhoeae -РИБОТЕСТ» для выявления РНК N.gonorrhoeae на основе реакции транскрипционной амплификации НАСБА при исследовании материала из ротоглотки. / А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // II Всероссийский Конгресс дерматовенерологов - Санкт-Петербург, 2007.

7. Гущин, А.Е. Количественное исследование Chlamydia trachomatis в клиническом материале методами культуры клеток и ПЦР. / А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней - М., 2007 - Т2 - с. 157-160

8. Шипицына, Е.В. Использование количественного анализа ДНК Chlamydia trachomatis с помощью ПЦР «в реальном времени» для мониторинга эффективности терапии хламидийной инфекции. / Е.В. Шипицына, A.M. Савичева, Н. Воробьева, А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней-М., 2007-Т2-с. 186-189

9. Рыжих, П.Г. Разработка тест-системы для диагностики Mycoplasma genitalium на основе технологии НАСБА в реальном времени. / П.Г. Рыжих [и др.] // Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней - М., 2007.- Т2.- с. 273-277

10. Guschin, A. Real-time PCR and NASBA Real-time in identification and monitoring of Mycoplasma genitalium during treatment of urethritis in males. / A. Guschin, O. Burtsev, M. Tseslyuk, P. Ryzhikh et al. // The 23rd - IUSTI-EUROPE conference on sexually transmitted infections and HIV/AIDS. Dubrovnik, Croatia. 11-14 November, 2007 - Abstract book - p.21-22

11. Savicheva, A. Quantitative analysis of Chlamydia trachomatis DNA: implication for monitoring of treatment efficiency. / A. Savicheva, E. Shipitsyna, N. Vorobyova, E. Sokolovskiy, A. Guschin, P. Rizhikh et al. // The 23rd - IUSTI-EUROPE conference on sexually transmitted infections and HIV/AIDS. Dubrovnik, Croatia. 11-14 November, 2007 - Abstract book - p.54

12. Гущнн, А.Е. Мониторинг лечения пациентов с инфекцией, вызванной Mycoplasma genitalium с помощью методов ПЦР и НАСБА в реальном времени. / А.Е. Гущин, О.А. Бурцев, П.Г. Рыжих и др. // Клиническая дерматология и венерология.-2009.-№ 4.- с.58-63.

13. Гущин, А.Е. Новый метод диагностики инфекций органов репродукции на основе реакции транскрипционной амплификации НАСБА. / А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих и др. // Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням - М., 2009 - с. 52

14. Гущин, А.Е. Молекулярно-генетическое исследование клинического материала с использованием праймеров к различным участкам генома Trichomonas vaginalis и различным видам царства protozoa. / А.Е. Гущин, П.Г.

Рыжих, JT.A. Березина и др. // Сборник трудов «Молекулярная диагностика -2010» VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием,- М., 2010,- Т.З.- с. 204-207.

15. Рыжих, П.Г. Определение и сравнительный анализ пределов детекции микроскопии нативного и окрашенного препаратов, ПЦР, НАСБА для выявления T.vaginalis. / П.Г. Рыжих [и др.] // Сборник трудов «Молекулярная диагностика -2010» VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием - М., 2010 - Т.З.- с. 241-244.

16. Рыжих, П.Г. Принципы разработки и использования наборов реагентов для количественного выявления микоплазм (M.hominis., U.urealyticum, U.parviim) на основе ПЦР в реальном времени. // П.Г. Рыжих [и др.] // Сборник трудов «Молекулярная диагностика -2010» VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием — М., 2010 — Т.З.- с. 245-246.

17. Рыжих, П.Г. Сравнительная оценка аналитической чувствительности методов микроскопии (нативного и окрашенного препаратов) и амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА в реальном времени) при обнаружении Trichomonas vaginalis. / П.Г. Рыжих, А.Е. Гущин, Ю.А. Савочкина // Клиническая дерматология и венерология - 2011.- № 2 - с. 28-34

18. Гущин, А.Е. Изучение распространенности возбудителей ИППП (С. trachomatis, N. gonorrhoeae, М. genitalium, Т. vaginalis) с помощью ПЦР в реальном времени в формате «МУЛЬТИПРАЙМ». / А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих, Ю.А. Савочкина и др. // Клиническая дерматология и венерология - 2011.- №4.- с. 90-93

19. Рыжих, П.Г. Зависимость частоты выявления Trichomonas vaginalis от аналитической чувствительности методов диагностики трихомонадной инфекции. // П.Г. Рыжих, А.Е. Гущин // Сборник тезисов XII Всероссийского съезда дерматовенерологов и косметологов - М., 2012 - с. 55

20. Гущин, А.Е. Сравнение пределов обнаружения микроскопии, культуральпого посева и методов амплификации нуклеиновых кислот, используемых в лабораторной практике для выявления Trichomonas vaginalis. II А.Е. Гущин, П.Г. Рыжих // Клиническая дерматология и венерология.- 2012.- №3 — с. 16-21

Подписано в печать «17» декабря 2012 г. Формат60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ № 49798 Отпечатано в цифровом копировальном центре «Восстания - 1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Урогенитальный трихомониаз (УТ) - широко распространенная инфекция, передаваемая половым путем, возбудителем которой является Trichomonas vaginalis - простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в органах мочеполовой системы человека. По данным официальной статистики, трихомониаз имеет наибольшую долю в структуре заболеваемости ИППП. В 2008 году его доля составила 38,9% из всех зарегистрированных случаев заболеваний инфекциями, передаваемыми половым путем (Иванова М.А, и соавт., 2009). У женщин в воспалительный процесс могут вовлекаться вульва, влагалище, уретра, парауретральные протоки, шейка матки, матка и ее придатки, большие вестибулярные железы, мочевой пузырь, почечная лоханка; у мужчин - уретра, предстательная железа, семенные пузырьки, мочевой пузырь, почечные лоханки. Доказана роль Т.vaginalis в развитии осложнений при беременности и в её неблагоприятном исходе (Hardy Р.Н., et al., 1984; Cotch M.F., et al., 1997), развитии бесплодия у женщин, в том числе вследствие сальпингитов, начавшихся в детском возрасте (Stefanovic J., 1990). Установлено значение влагалищных трихомонад в увеличении риска заболевания ВИЧ-инфекцией (Wasserheit J.N., 1992; Sorvillo F., et al., 2001). У мужчин трихомонады также могут быть одной из причин бесплодия, в основе которого, как правило, лежит поражение предстательной железы. По данным Дьяченко А.И. при хроническом простатите Т.vaginalis выявляются у 29% больных (Дьяченко А.И., и соавт., 2001). При этом трихомонады обнаруживаются во всех тканях простаты, образуя внутриэпителиальные вакуоли (Gardner W.A., et al., 1986). Для трихомониаза, как и для других ИППП, в большинстве случаев характерно отсутствие специфических признаков заболевания, а у значительного числа пациентов инфекция протекает бессимптомно. Классический для трихомониаза "клубничный" симптом встречается только у 2% пациенток; пенистые выделения, которые можно связать с активным ростом трихомонад, наблюдаются только примерно у 12% инфицированных женщин (Fouts А.С., et al.,

1980). Кроме того, часто трихомониаз сочетается с другими ИППП: гонореей, хламидиозом, микоплазмами, что объясняется общностью путей передачи инфекции (Щербакова Н.И., и соавт., 1982; Делекторский В.В., и соавт., 1985; Межевитинова Е.А., 1999).

В связи с неспецифическими клиническими проявлениями диагноз три-хомонадной инфекции основывается на результатах лабораторных методов исследования, которые включают микроскопические, культуральные, серологические и молекулярно-биологические.

Согласно приказу Минздрава СССР № 1570 от 4 декабря 1986 г регламентированными методами диагностики трихомониаза считались микроскопия (нативного или окрашенного) препаратов и культуральное исследование. Несмотря на то, что приказом Минздрава РФ №398 от 23.12.2003 г приказ № 1570 от 4 декабря 1986 г. был признан не действующим, в нашей стране наиболее часто для диагностики трихомонадной инфекции используется метод микроскопии, что объясняется его относительно низкой стоимостью и быстротой исполнения (Фриго Н.В., и соавт., 2008). Тем не менее, данный метод недостаточно чувствителен и воспроизводим, субъективен и требует высокой квалификации исполнителя.

Культуральный метод долгое время рассматривался в качестве «золотого стандарта» диагностики трихомонадной инфекции. Но его эффективность в значительной степени зависит от качества используемых питательных сред. Ограничивают его применение также большие сроки получения результата анализа, вплоть до 11-17 суток после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от посевной дозы (Приказ № 1570 от 04.12.86 г.). Кроме того, культуральный метод имеет высокие требования к транспортировке и хранению клинического материала.

В последние годы во всем мире в лабораторной диагностике различных инфекций, в том числе ШИШ, все большее распространение стали получать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленные на выявление специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителей. Одним из наиболее распространенных МАНК является метод ПЦР. Преимуществами данного метода являются высокие аналитические и диагностические показатели чувствительности и специфичности, менее строгие требования к хранению и транспортировке клинического материала, короткие сроки исполнения, относительно невысокая стоимость анализа и его универсальность в отношении других урогенитальных инфекций.

Согласно рекомендациям Центра по контролю и профилактике заболеваемости (CDC - Centers for Disease Control and Prevention) в связи с более высокой аналитической чувствительностью амплификационных методов верификацию их результатов следует проводить на основе альтернативных амплификационных тестов (CDC, 2002). В своей работе A.J. McAdam предложил требования, которым должен соответствовать дополнительный метод для решения вопросов, связанных с дискордантными результатами: аналитическая чувствительность дополнительного метода должна быть сопоставима с исследуемым методом; должна использоваться отличная мишень для амплификации; должен использоваться другой принцип амплификации (McAdam A .J., 2000).

Одним из методов, соответствующих требованиям, предложенным McAdam A.J., является метод определения рибосомальной РНК (рРНК) на основе реакции транскрипционной амплификации (Transcription-Mediated Amplification - ТМА). На основе данного метода за рубежом применяется серийно выпускаемый тест для диагностики инфекции, вызванной Т.vaginalis -APTIMA Trichomonas vaginalis Assay (Gen-Probe Inc., San Diego, CA). Данный тест имеет высокие показатели диагностической чувствительности не только по сравнению с методами микроскопии и микробиологического посева, но и в сравнении с ПЦР (Hardick A., et al., 2006; Nye М.В., et al., 2009; Andrea S.B., et al., 2011). Аналогом ТМА является реакция транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleic acid sequence-based amplification - NASBA).

В работе Morre S.A. и соавт. на примере C.trachomatis была показана возможность с помощью метода НАСБА оценивать наличие жизнеспособных микроорганизмов в образце в процессе и после терапии (Morre S.A., et al., 1996).

На сегодняшний день за рубежом предложено множество протоколов выявления ДНК T.vaginalis с помощью метода ПЦР (Riley D.E., et al., 1992; Kengne P., et al., 1994; Shaio M.F., et al., 1997; Madico G., et al., 1998; Mayta H., et al., 2000). Было показано, что диагностическая чувствительность ПЦР выше, чем у традиционных методов выявления T.vaginalis (микроскопия и куль-туральный посев), однако она варьировала в широких пределах (от 60 до 100%), а сами исследования проводили на различном биологическом материале (моча, вагинальное отделяемое, соскобы из уретры и цервикального канала), среди различных групп населения, полученном от мужчин и женщин. При этом аналитическая чувствительность в предложенных протоколах не была установлена. В свою очередь аналитические характеристики (аналитическая чувствительность и специфичность) определяют диагностические чувствительность и специфичность метода. Для повышения аналитической чувствительности метода необходимо выбрать оптимальную мишень, размер амплифицируемого фрагмента, программу амплификации и метод его детекции. Одной из причин, ограничивающих использование ПЦР в клинической лабораторной практике, является отсутствие в методиках образцов, которые бы контролировали проведение всего процесса ПЦР-исследования (от экстракции нуклеиновых кислот, до детекции продуктов амплификации) предотвращающих выдачу лабораторией ложноотрицательных и ложнопо-ложительных результатов исследования.

На сегодняшний день отсутствуют нормативные документы, регламентирующие использование метода ПЦР при лабораторной диагностике конкретных нозологических форм, и нормативно-правовая база диагностики мочеполового трихомониаза, как таковая, отсутствует. Поэтому необходима разработка новых регламентирующих документов, которые, в свою очередь, должны базироваться на объективных данных об аналитических и диагностических характеристиках различных лабораторных методов.

Цель работы

Разработка стандартизованных методик лабораторной диагностики уро-генитального трихомониаза на основе технологий ПЦР и НАСБА в реальном времени и обоснование необходимости их применения.

Задачи исследования

1. Разработать методику для выявления ДНК Т.vaginalis на основе метода ПЦР в реальном времени;

2. Разработать методику для выявления РНК Т.vaginalis на основе метода НАСБА в реальном времени;

3. Определить и сравнить аналитическую чувствительность микроскопии (нативного и окрашенного препаратов), культурального посева, ПЦР и НАСБА;

4. Оценить эффективность лабораторной диагностики трихомониаза на биологическом материале, полученном от пациентов, исходя из значений аналитической чувствительности методов выявления T.vaginalis.

Научная новизна

Впервые проведено сравнение аналитической чувствительности методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) и рутинных методов диагностики трихомонадной инфекции (микроскопия нативного и окрашенного препаратов, микробиологический посев).

Впервые в отечественной лабораторной практике разработана методика для выделения РНК T.vaginalis на основе реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме реального времени.

Использование разработанной методики на основе ПЦР позволяет оптимизировать и повысить качество лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.

Практическая значимость работы

Разработаны методики на основе высокочувствительных и специфичных методов амплификации нуклеиновых кислот, которые увеличивают эффективность диагностики трихомонадной инфекции. Методика НАСБА может быть использована для решения вопросов, связанных с получением дискор-дантных результатов получаемых при совместном использовании метода ПЦР и традиционных методов выявления трихомонад (микроскопии и куль-турального посева).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика ПЦР для диагностики урогенитального трихомониаза с высокими показателями чувствительности и специфичности.

2. Разработана методика НАСБА для диагностики урогенитального трихомониаза с высокими показателями чувствительности и специфичности.

3. Аналитическая чувствительность разработанных методик на основе технологий ПЦР и НАСБА достоверно выше, чем у методов микроскопии и культурального посева.

Реализация и внедрение результатов исследования.

На основе разработанных методик созданы наборы реагентов: «Ампли-Сенс Trichomonas vaginalis-FL», «АмплиСенс T.vaginalis-PHBOTECT», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

Материалы проведенных в ходе работы исследований входят в программу сертификационного цикла усовершенствования «ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний» на базе ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и НМАПО им. П.Л. Шупика МЗ Украины.

Апробация и публикация материалов исследования.

Основные положения диссертации обсуждены на:

• IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, 7-10 июня 2005 (г. Москва)

• Международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине», 3-7 сентября 2006 (г. Новосибирск)

• Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» 19-20 мая 2006 (г. Алматы, Казахстан)

• 23rd IUSTI-Europe Conference on Sexually Transmitted Infections and HIV/AIDS, 11-14 октября 2007 (г. Дубровники, Хорватия)

• VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» 2830 ноября 2007 (г. Москва)

• 11th IUSTI World Congress, 9-12 ноября, 2009 (г. Кейп-Таун, Южная Африка)

• Научно-практической конференции молодых учёных «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней», 24 ноября 2009 (г. Москва)

• Научно-практической конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», 26 мая 2010 (г. Москва)

• VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010», 24-26 ноября 2010 (г. Москва)

• 20th EADV Congress, 20-24 ноября 2011, (г. Лиссабон, Португалия)

• Всероссийской научной конференции «Фундаментальная медицина: от науки к технологиям», 15-16 декабря 2011 (г. Санкт-Петербург)

• XII Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, 26-26 июня 2012 (г. Москва)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем

Диссертация представлена на 154 страницах, включая 38 рисунков, 16 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 главы собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов с выводами. Список использованной литературы включает 41 отечественных и 139 зарубежных источников.

132 ВЫВОДЫ

1. Разработана стандартизованная методика выявления ДНК T.vaginalis (протокол экстракции нуклеиновых кислот с контролем его эффективности, олигонуклеотидные праймеры и зонды, условия амплификации, контрольные образцы) для диагностики трихомониаза, на основе метода ПЦР в реальном времени.

2. Разработана стандартизованная методика выявления РНК T.vaginalis (протокол экстракции нуклеиновых кислот с контролем его эффективности, олигонуклеотидные праймеры и зонды, условия амплификации, контрольные образцы) для диагностики трихомониаза, на основе метода НАСБА в реальном времени.

3. Установлено, что аналитическая чувствительность методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) достоверно выше (14 кл/мл), чем у метода микроскопии окрашенного и нативного препаратов (105 кл/мл) и у метода культивирования T.vaginalis (104 кл/мл).

4. Установлено, что при использовании разработанных методик на основе МАНК T.vaginalis выявляется дополнительно в 57,1% и 39,5% биологических образцов, в которых концентрация возбудителя достоверно ниже, чем аналитическая чувствительность микроскопического и культурального методов соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для постановки диагноза урогенитального трихомониаза у мужчин и женщин рекомендуется использование метода ПЦР, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью независимо от локализации инфекционного процесса, его длительности, наличия или отсутствия клинических проявлений и их выраженности.

2. Разработанная методика на основе технологии НАСБА может использоваться как независимый метод диагностики урогенитального трихомониаза. Рекомендуется для решения вопросов, связанных с получением дис-кордантных результатов при совместном использовании метода ПЦР и традиционных методов выявления трихомонад (микроскопии и культурального посева) и оценки эффективности проведенной терапии.

134