Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Принципы и организационно-методическое обеспечение качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

ПРИНЦИПЫ И ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ

ИНФЕКЦИЙ

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика Научный консультант: д.м.н., профессор Савичева A.M.

05201351906

На правах рукописи

Шипицына Елена Васильевна

Санкт-Петербург - 2013

$

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................16

1.1. Эпидемиология урогенитальных инфекций.............................................16

1.2. Патогенез и клинические проявления урогенитальных инфекций........22

1.2.1. Гонококковая инфекция.......................................................................22

1.2.2. Урогенитальная хламидийная инфекция............................................25

1.2.3. Трихомониаз..........................................................................................29

1.2.4. Инфекция, ассоциированная с Mycoplasma genitalium.....................32

1.2.5. Папилломавирусная инфекция............................................................36

1.3. Лабораторная диагностика урогенитальных инфекций..........................41

1.3.1. Гонококковая инфекция.......................................................................41

1.3.1.1. Микроскопический метод..............................................................41

1.3.1.2. Культуральный метод.....................................................................42

1.3.1.3. Иммунологические методы...........................................................44

1.3.1.4. Методы амплификации нуклеиновых кислот..............................45

1.3.2. Урогенитальная хламидийная инфекция............................................54

1.3.2.1. Культуральный метод.....................................................................54

1.3.2.2. Иммунологические методы...........................................................55

1.3.2.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот..............................57

1.3.3. Трихомониаз..........................................................................................60

1.3.3.1. Микроскопический метод..............................................................60

1.3.3.2. Культуральный метод.....................................................................61

1.3.3.3. Иммунологические методы...........................................................61

1.3.3.4. Методы амплификации нуклеиновых кислот..............................62

1.3.4. Инфекция, ассоциированная с Mycoplasma genitalium.....................63

1.3.4.1. Культуральный метод.....................................................................63

1.3.4.2. Иммунологические методы...........................................................64

1.3.4.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот..............................64

1.3.5. Папилломавирусная инфекция............................................................65

1.3.5.1. Тестирование на ВПЧ в скрининге рака шейки матки...............65

1.3.5.2. Тесты для выявления нуклеиновых кислот ВПЧ........................67

1.5. Актуальные проблемы диагностики урогенитальных инфекций..........77

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................89

2.1. Общая схема работы...................................................................................89

2.2. Оценка тестов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, для диагностики инфекций, передаваемых половым путем..........................91

2.2.1. Пациенты и клинические образцы......................................................91

2.2.2. Оцениваемые тесты...............................................................................93

2.2.3. Взятие, транспортировка и хранение клинических образцов..........99

2.2.4. Выделение нуклеиновых кислот.......................................................100

2.2.5. ПЦР.......................................................................................................101

2.2.6. NASBA.................................................................................................102

2.2.7. Референтное тестирование.................................................................102

2.2.7.1. Референтное тестирование на Neisseria gonorrhoeae................102

2.2.7.2. Референтное тестирование на Chlamydia trachomatis...............103

2.2.7.3. Референтное тестирование на Trichomonas vaginalis................103

2.2.7.4. Референтное тестирование на Mycoplasma genitalium..............103

2.2.8. Референтная панель микоплазм.........................................................104

2.2.9. Определение пределов детекции ПЦР-тестов..................................104

2.2.10. Анализ результатов...........................................................................105

2.3. Оценка распространенности нового (Шведского) варианта Chlamydia trachomatis в Санкт-Петербурге и оценка способности ПЦР тестов для диагностики хламидийной инфекции его выявлять.....................................107

2.3.1. Пациенты и клинические образцы....................................................107

2.3.2. Лабораторный штамм Sweden2.........................................................107

2.3.3. Тестирование клинических проб на новый (Шведский) вариант Chlamydia trachomatis...................................................................................107

2.3.4. Генотипирование Chlamydia trachomatis..........................................108

2.3.5. Оцениваемые ПЦР тесты...................................................................108

2.4. Оценка теста для выявления клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска................109

2.4.1. Пациенты и клинические образцы....................................................109

2.4.2. Цитологические и гистологические исследования..........................109

2.4.3. Оцениваемый тест...............................................................................110

2.4.4. Референтный тест НС2.......................................................................111

2.4.5. Секвенирование ДНК для определения генотипа ВПЧ..................112

2.4.6. Анализ результатов.............................................................................113

2.4. Сравнение методов диагностики гонококковой инфекции..................114

2.4.1. Пациенты и клинические образцы....................................................114

2.4.2. Микроскопическое исследование......................................................115

2.4.3. Культуральное исследование.............................................................115

2.4.4. ПЦР.......................................................................................................116

2.4.5. NASBA.................................................................................................116

2.4.6. Секвенирование ДНК для видовой идентификации Neisseria gonorrhoeae....................................................................................................117

2.4.7. Анализ результатов.............................................................................117

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ТЕСТОВ, ОСНОВАННЫХ НА АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ........................................................118

3.1 .Тесты для выявления Neisseria gonorrhoeae............................................118

3.2. Тесты для выявления Chlamydia trachomatis..........................................129

3.3. Тесты для выявления Trichomonas vaginalis...........................................139

3.4. Тесты для выявления Mycoplasma genitalium.........................................145

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСПРОСТРАНЕННОСТИ НОВОГО (ШВЕДСКОГО) ВАРИАНТА CHLAMYDIA TRACHOMATIS В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

И ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ ПЦР ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ ЕГО ВЫЯВЛЯТЬ........................................157

ГЛАВА 5. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМОГО КОЛИЧЕСТВА ВИЧ

ВЫСОКОГО ОНКОГЕННОГО РИСКА...........................................................159

ГЛАВА 6. СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ГОНОКОККОВОЙ

ИНФЕКЦИИ.........................................................................................................165

ГЛАВА 7. МОДЕЛЬ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА АНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ С ПРИМЕНЕНИЕМ

МАНК....................................................................................................................169

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................175

ВЫВОДЫ..............................................................................................................202

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.............................................................204

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.........................................206

ЛИТЕРАТУРА.....................................................................................................209

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Инфекции урогенитального тракта являются серьезной проблемой здравоохранения во всех странах мира [404]. Очень часто урогенитальные инфекции не имеют специфических проявлений или протекают бессимптомно, поэтому ключевая роль в установлении диагноза отводится лабораторной диагностике.

Внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в микробиологическую диагностику значительно повысило ее эффективность. К их числу относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР), амплификация со смещением нити ДНК (strand displacement amplification, SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (transcription mediated amplification, TMA), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA). Преимущества МАНК перед традиционными микробиологическими методами заключаются в том, что они сочетают высокую чувствительность с высокой специфичностью, быстры в исполнении, в высокой степени стандартизированы и автоматизированы, имеют высокую пропускную способность, не требуют сохранения жизнеспособности возбудителя. Кроме того, МАНК позволяют использовать материалы, полученные неинвазивным путем.

В последние годы МАНК находят все более широкое применение в диагностике урогенитальных инфекций, в том числе в нашей стране [23, 24]. К числу урогенитальных инфекций, в диагностике которых широко используются МАНК, относятся инфекции, передаваемые половым путем (ИППП) (гонорея, хламидийная инфекция, трихомониаз, инфекция, ассоциированная с Mycoplasma genitalium), а также этиологически связанная с раком шейки матки (РШМ) папилломавирусная инфекция. Культуральный метод до сих пор остается «золотым стандартом» диагностики гонококковой инфекции, несмотря на то, что гонококки - исключительно прихотливые бактерии и культуральный метод требует соблюдения очень строгих условий

транспортировки и культивирования. Связано это с тем, что метод позволяет определять антибиотикорезистентность гонококков, которая представляет собой серьезную проблему [361]. Микроскопический метод выявления гонококков имеет невысокую чувствительность и специфичность и по международным стандартам может использоваться только у мужчин с острым уретритом; тем не менее, метод очень широко используется в нашей стране [226]. Культуральный метод также широко используется для диагностики трихомониаза, он достаточно чувствителен, но очень длителен. Микроскопическое исследование нативного материала - распространенный метод диагностики трихомониаза у женщин, однако его чувствительность невысока [6]. Таким образом, недостатки существующих методов выявления Neisseria gonorrhoeae и Trichomonas vaginalis не позволяют сомневаться в неизбежности широкого внедрения МАНК в диагностику гонореи и трихомониаза. В диагностике хламидийной инфекции МАНК в последние годы практически полностью заменили культуральный метод, метод прямой иммунофлюоресценции и другие методы выявления Chlamydia trachomatis [167]. М. genitalium — труднокультивируемые бактерии, и их определение в настоящее время полностью основывается на МАНК [216].

С установлением этиологической роли вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии РШМ тест на онкогенные типы ВПЧ стали использовать в скрининге этого заболевания наряду с цитологическим тестом. Тестирование на онкогенные типы ВПЧ обладает очень высокой чувствительностью для выявления цервикальных интраэпителиальных поражений высокой степени (cervical intraepithelial neoplasia grade 2 и выше, CIN2+) [281], однако его специфичность недостаточно высока, что связано с широкой распространенностью транзиторной папилломавирусной инфекции. Кроме того, так как диагностика папилломавирусной инфекции основывается на высокочувствительных методах анализа его нуклеиновых кислот [299], очень часто выявляются клинически незначимые концентрации вируса. Для эффективного скрининга РШМ тест на ВПЧ должен выявлять только

клинически значимое количество вируса, и поэтому необходимость разработки и внедрения таких тестов не вызывает сомнения.

Несмотря на очевидные достоинства МАНК, их использование в диагностике урогенитальных инфекций сопряжено с рядом проблем, обусловленных как свойствами самих методов, так и свойствами определяемых аналитов. Известно, что высокая чувствительность МАНК связана с высоким риском получения ложноположительных результатов вследствие контаминации, а присутствие в реакции субстанций, ингибирующих энзиматическую амплификацию, может привести к получению ложноотрицательных результатов. Генетическая изменчивость микроорганизмов может быть источником как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Так, высокая степень гомологии нуклеотидных последовательностей и частый генетический обмен между гонококками и другими видами рода Neisseria, а также высокий уровень генетического полиморфизма разных штаммов N. gonorrhoeae являются серьезной проблемой молекулярной диагностики гонореи (Palmer Н.М. et al., 2003; Whiley D.M. et al., 2006; Tabrizi S.N. et al., 2011). В диагностике хламидийной инфекции исследователи недавно столкнулись с проблемой появления нового (Шведского) варианта С. trachomatis (нвСТ), имеющего мутацию в криптической плазмиде, которая применяется в качестве мишени в большинстве тестов на основе МАНК [327]. Таким образом, внедрение МАНК в рутинную диагностику урогенитальных инфекций существенно повышает ее эффективность, но вместе с тем требует оптимизации системы обеспечения качества исследований.

Степень разработанности темы. Эффективность молекулярной диагностики урогенитальных инфекций в нашей стране в значительной мере ограничивается недостаточной разработанностью нормативной базы по обеспечению качества исследований с использованием неколичественных методов, к числу которых относятся методы анализа нуклеиновых кислот возбудителей инфекций. В частности, не регламентируются процедуры

клинической оценки тестов и критерии приемлемости тестов. Применение тестов, не получивших объективную характеристику своих аналитических и функциональных свойств, сопряжено с высоким риском получения недостоверных лабораторных результатов [14, 15, 33]. Принципы

клинической оценки неколичественных тестов обобщены в ряде »

международных стандартов [175, 393], однако способы оценки тестов в разных областях лабораторной медицины различаются как в аспектах экспериментального дизайна, так и анализа данных, и должны разрабатываться с учетом специфики методов и аналитов. Для диагностики наиболее значимых урогенитальных инфекций предлагается ряд международных тестов на основе МАНК, аналитические и диагностические параметры которых определены в независимых клинических исследованиях и описаны в литературе. В нашей стране повсеместно используются тесты Российского производства, однако объективная информация об их аналитических и особенно диагностических характеристиках практически отсутствует. В этих условиях основным способом проверки точности результатов молекулярных микробиологических исследований является внешняя оценка качества, осуществляемая в нашей стране Федеральной системой внешней оценки качества (ФСВОК) [16], которая, однако, только дополняет, но не заменяет контроль качества диагностики [5, 12, 18]. Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена необходимостью оптимизации и стандартизации системы обеспечения качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, что будет способствовать как их своевременному выявлению и лечению, так и получению достоверных эпидемиологических данных и разработке профилактических программ.

Цель исследования:

Обоснование принципов и разработка организационно-методического обеспечения качества лабораторной диагностики урогенитальных инфекций с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.

Задачи исследования:

1. Оценить диагностические характеристики тестов Российского производства на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (JV gonorrhoeae, С. trachomatis, Т. vaginalis, М. genitalium), с использованием международных валидированных тестов в качестве референтных стандартов. Определить аналитическую чувствительность и специфичность тестов.

2. Выявить распространенность нового варианта С. trachomatis в популяции пациентов гинекологических и урологических клиник Санкт-Петербурга и оценить способность ПЦР-тестов, разработанных и используемых в России для диагностики хламидийной инфекции, выявлять новый вариант.

3. Определить диагностические характеристики теста Российского производства для выявления клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска и оценить его соответствие требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки.

4. Проанализировать возможность использования клинических образцов, полученных неинвазивным путем (отделяемое влагалища у женщин, первая порция мочи у женщин и мужчин), для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.

5. Провести оценку традиционных методов диагностики гонококковой инфекции (микроскопического и культурального) в сравнении с методами амплификации нуклеиновых кислот.

6. Разработать и обосновать структурно-функциональную модель обеспечения качества аналитического этапа молекулярной диагностики урогенитальных инфекций с методической детализацией ее ключевого компонента - клинической оценки тестов.

\ ь

I V

1

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Разработана структурно-функциональная модель системы аналитического качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, компоненты ко