Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Принципы и организационно-методическое обеспечение качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций

На правах рукописи

Шипицына Елена Васильевна

ПРИНЦИПЫ И ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ

ИНФЕКЦИЙ

14.03.10 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

"8 АВГ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005531949

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга» СЗО РАМН

Научный Савичева Алевтина Михайловна

консультант: доктор медицинских наук профессор

Официальные Зыбина Наталья Николаевна

оппоненты: доктор биологических наук профессор

ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России, отдел лабораторной диагностики, заведующий

Иванов Андрей Михайлович доктор медицинских наук профессор ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО Российской Федерации, кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики, начальник

Карпищенко Анатолий Иванович доктор медицинских наук профессор СПбГУЗ «Медицинский информационно-аналитический центр», организационно-методический отдел мониторинга качества медицинской деятельности, сектор клинической лабораторной диагностики и метрологии, руководитель

Ведущее ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный

учреждение: медицинский университет имени академика

И.П. Павлова» МЗ Российской Федерации

Защита состоится «/¿7» 2013 года в S3 часов на

заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 197374, Санкт-Петербург, ул. Оптиков, д. 54.

Автореферат разослан «'25~» CCf~Q/?SL_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инфекции урогенитального тракта являются серьезной проблемой здравоохранения во всех странах мира (WHO, 2011). Очень часто урогенитальные инфекции не имеют специфических проявлений или протекают бессимптомно, поэтому ключевая роль в установлении диагноза отводится лабораторной диагностике.

Внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в микробиологическую диагностику значительно повысило ее эффективность. К их числу относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР), амплификация со смещением нити ДНК (strand displacement amplification, SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (transcription mediated amplification, TMA), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA). Преимущества МАНК перед традиционными микробиологическими методами заключаются в том, что они сочетают высокую чувствительность с высокой специфичностью, быстры в исполнении, в высокой степени стандартизированы и автоматизированы, имеют высокую пропускную способность, не требуют сохранения жизнеспособности возбудителя. Кроме того, МАНК позволяют использовать материалы, полученные неинвазивным путем.

В последние годы МАНК находят все более широкое применение в диагностике урогенитальных инфекций, в том числе в нашей стране (Савичева A.M., 2009; Кубанова A.A., 2011). К числу урогенитальных инфекций, в диагностике которых широко используются МАНК, относятся инфекции, передаваемые половым путем (ИППП) (гонорея, хламидийная инфекция, трихомониаз, инфекция, ассоциированная с Mycoplasma genitalium), а также этиологически связанная с раком шейки матки (РШМ) папилломавирусная инфекция. Культуральный метод до сих пор остается «золотым стандартом» диагностики гонококковой инфекции, несмотря на то, что гонококки -исключительно прихотливые бактерии и культуральный метод требует соблюдения очень строгих условий транспортировки и культивирования. Связано это с тем, что метод позволяет определять антибиотикорезистентность гонококков, которая представляет собой серьезную проблему (Tapsall J., 2001). Микроскопический метод выявления гонококков имеет невысокую чувствительность и специфичность и по международным стандартам может использоваться только у мужчин с острым уретритом; тем не менее, метод очень широко используется в нашей стране (Unemo M. et al., 2006). Культуральный метод также широко используется для диагностики трихомониаза, он достаточно чувствителен, но очень длителен. Микроскопическое исследование нативного материала - распространенный метод диагностики трихомониаза у женщин, однако его чувствительность невысока (Гущин А.Е., Рыжих П.Г., 2012). Таким образом, недостатки существующих методов выявления Neisseria gonorrhoeae и Trichomonas vaginalis не позволяют сомневаться в неизбежности широкого внедрения МАНК в диагностику гонореи и трихомониаза. В диагностике хламидийной инфекции МАНК в последние годы практически полностью заменили культуральный метод, метод прямой иммунофлюоресценции и другие методы

выявления Chlamydia trachomatis (Gaydos С., 2005). M. genitalium -труднокультивируемые бактерии, и их определение в настоящее время полностью основывается на МАНК (Jensen J.S., 2006).

С установлением этиологической роли вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии РШМ тест на онкогенные типы ВПЧ стали использовать в скрининге этого заболевания наряду с цитологическим тестом. Тестирование на онкогенные типы ВПЧ обладает очень высокой чувствительностью для выявления цервикальных интраэпителиальных поражений высокой степени (cervical intraepithelial neoplasia grade 2 и выше, CIN2+) (Cuzick J. et al., 2008), однако его специфичность недостаточно высока, что связано с широкой распространенностью транзиторной папилломавирусной инфекции. Кроме того, так как диагностика папилломавирусной инфекции основывается на высокочувствительных методах анализа его нуклеиновых кислот (Poljak М., Kocjan В., 2010), очень часто выявляются клинически незначимые концентрации вируса. Для эффективного скрининга РШМ тест на ВПЧ должен выявлять только клинически значимое количество вируса, и поэтому необходимость разработки и внедрения таких тестов не вызывает сомнения.

Несмотря на очевидные достоинства МАНК, их использование в диагностике урогенитальных инфекций сопряжено с рядом проблем, обусловленных как свойствами самих методов, так и свойствами определяемых аналитов. Известно, что высокая чувствительность МАНК связана с высоким риском получения ложноположительных результатов вследствие контаминации, а присутствие в реакции субстанций, ингибирующих энзиматическую амплификацию, может привести к получению ложноотрицательных результатов. Генетическая изменчивость микроорганизмов может быть источником как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Так, высокая степень гомологии нуклеотидных последовательностей и частый генетический обмен между гонококками и другими видами рода Neisseria, а также высокий уровень генетического полиморфизма разных штаммов N. gonorrhoeae являются серьезной проблемой молекулярной диагностики гонореи (Palmer Н.М. et al., 2003; Whiley D.M. et al., 2006; Tabrizi S.N. et al., 2011). В диагностике хламидийной инфекции исследователи недавно столкнулись с проблемой появления нового (Шведского) варианта С. trachomatis (нвСТ), имеющего мутацию в критической плазмиде, которая применяется в качестве мишени в большинстве тестов на основе МАНК (Ripa Т. A., Nilsson Р.А., 2006). Таким образом, внедрение МАНК в рутинную диагностику урогенитальных инфекций существенно повышает ее эффективность, но вместе с тем требует оптимизации системы обеспечения качества исследований.

Степень разработанности темы. Эффективность молекулярной диагностики урогенитальных инфекций в нашей стране в значительной мере ограничивается недостаточной разработанностью нормативной базы по обеспечению качества исследований с использованием неколичественных методов, к числу которых относятся методы анализа нуклеиновых кислот возбудителей инфекций. В частности, не регламентируются процедуры клинической оценки тестов и критерии приемлемости тестов. Применение

тестов, не получивших объективную характеристику своих аналитических и функциональных свойств, сопряжено с высоким риском получения недостоверных лабораторных результатов (Эмануэль B.JL, Домейка М., 2008; Меньшиков В.В., 2011, 2012). Принципы клинической оценки неколичественных тестов обобщены в ряде международных стандартов (European Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990; Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008), однако способы оценки тестов в разных областях лабораторной медицины различаются как в аспектах экспериментального дизайна, так и анализа данных, и должны разрабатываться с учетом специфики методов и аналитов. Для диагностики наиболее значимых урогенитальных инфекций предлагается ряд международных тестов на основе МАНК, аналитические и диагностические параметры которых определены в независимых клинических исследованиях и описаны в литературе. В нашей стране повсеместно используются тесты Российского производства, однако объективная информация об их аналитических и особенно диагностических характеристиках практически отсутствует. В этих условиях основным способом проверки точности результатов молекулярных микробиологических исследований является внешняя оценка качества, осуществляемая в нашей стране Федеральной системой внешней оценки качества (ФСВОК) (Малахов В.Н. и соавт., 2002), которая, однако, только дополняет, но не заменяет контроль качества диагностики (Мошкин А.В., Долгов В.В., 2004; Арефьева И.А. и соавт., 2005; Кишкун А.А., Миколаускас, 2006). Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена необходимостью оптимизации и стандартизации системы обеспечения качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, что будет способствовать как их своевременному выявлению и лечению, так и получению достоверных эпидемиологических данных и разработке профилактических программ.

Цель исследования:

Обоснование принципов и разработка организационно-методического обеспечения качества лабораторной диагностики урогенитальных инфекций с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.

Задачи исследования:

1. Оценить диагностические характеристики тестов Российского производства на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N.. gonorrhoeae, С. trachomatis, Т. vaginalis, M. genitalium), с использованием международных валидированных тестов в качестве референтных стандартов. Определить аналитическую чувствительность и специфичность тестов.

2. Выявить распространенность нового варианта С. trachomatis в популяции пациентов гинекологических и урологических клиник Санкт-Петербурга и оценить способность ПЦР-тестов, разработанных и используемых в России для диагностики хламидийной инфекции, выявлять новый вариант.

3. Определить диагностические характеристики теста Российского производства для выявления клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска и оценить его соответствие требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки.

4. Проанализировать возможность использования клинических образцов, полученных неинвазивным путем (отделяемое влагалища у женщин, первая порция мочи у женщин и мужчин), для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.

5. Провести оценку традиционных методов диагностики гонококковой инфекции (микроскопического и культурального) в сравнении с методами амплификации нуклеиновых кислот,

6. Разработать и обосновать структурно-функциональную модель обеспечения качества аналитического этапа молекулярной диагностики урогенитальных инфекций с методической детализацией ее ключевого компонента — клинической оценки тестов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Разработана структурно-функциональная модель системы аналитического качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, компоненты которой, функционируя комплементарно друг другу, обеспечивают точность результатов лабораторных исследований.

Впервые получены данные, объективно характеризующие аналитические и диагностические параметры тестов Российских производителей на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики наиболее значимых инфекций, передаваемых половым путем.

Впервые получены данные о распространенности нового варианта С. trachomatis в России. Теоретически обоснована возможность его дальнейшего распространения, определяющая перспективность изучения путей и динамики его трансмиссии.

Впервые охарактеризован тест Российского производства для выявления клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска и показано его соответствие требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки.

Валидация молекулярных тестов отечественного производства для диагностики урогенитальных инфекций в сравнении с международными тестами открывает возможности получения достоверных эпидемиологических данных в различных популяциях Российской Федерации и их сопоставления с соответствующими показателями в других странах.

Разработана доказательная база для использования клинических образцов, полученных неинвазивным путем, при молекулярной диагностике инфекций, передаваемых половым путем.

Установлена неприемлемо низкая чувствительность микроскопического и культурального методов выявления гонококков по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот при тестировании клинических материалов от женщин, определяющая высокий процент (до 70%) ложноотрицательных результатов у женщин с гонореей.

Практическая значимость работы. Проведена клиническая валидация целого ряда молекулярных тестов, применяющихся в нашей стране для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и скрининга рака шейки матки. Полученные данные позволили определить отечественные тесты с оптимальными аналитическими и диагностическими параметрами, как для

применения в лабораторной диагностике данных заболеваний, так и для использования в качестве референтных стандартов при клинической оценке новых отечественных тестов.

Обоснована возможность дальнейшего распространения нового варианта С. trachomatis в Российской Федерации, что определяет необходимость использования тестов, способных его идентифицировать, а также перспективность включения данного варианта С. trachomatis в контрольные панели Федеральной системы внешней оценки качества.

Показано, что при молекулярной диагностике инфекций, передаваемых половым путем, могут использоваться клинические пробы, полученные неинвазивным путем. Неинвазивный способ является предпочтительным, так как позволяет пациентам получать материал самостоятельно, что благоприятствует большему вовлечению населения в обследование на урогенитальные инфекции и способствует их своевременному выявлению и лечению.

Данные, полученные при сравнении методов диагностики гонореи, свидетельствуют о необходимости ограничения использования микроскопического метода, оптимизации культурального метода и внедрения молекулярных методов в рутинную диагностику этого заболевания.

Предложена модель обеспечения аналитического качества молекулярной диагностики инфекций, которая может быть использована при создании внутрилабораторной системы качества.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основополагающим принципом обеспечения качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, определяющим точность результатов исследований и сопоставимость результатов, полученных в разных лабораториях, является установление соответствия аналитических и диагностических параметров применяемых тестов клиническим задачам.

2. Возможность дальнейшего распространения нового варианта С. trachomatis в Российской Федерации определяет необходимость использования тестов, способных его идентифицировать, и перспективность его включения в контрольные панели Федеральной системы внешней оценки качества для выявления С. trachomatis.

3. Применение клинических материалов, полученных неинвазивным путем, для молекулярной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, не уступает в информативности использованию материалов, полученных стандартным методом.

4. Микроскопический и культуральный методы, являющиеся регламентированными методами диагностики гонореи в нашей стране, обладают низкой чувствительностью по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот. Внедрение валидированных молекулярных тестов в диагностику этого заболевания существенно повысит ее качество.

Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы теоретический анализ литературы, лабораторные методы и методы статистической обработки данных.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Достоверность полученных результатов обеспечена теоретическим анализом проблемы, репрезентативным объёмом выборок обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных.

Основные положения работы, а также содержание её отдельных этапов были представлены на 6-ом международном конгрессе Еврогин (Париж, Франция, 2006); 22-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Версаль, Франция, 2006); международной конференции «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики» (Санкт-Петербург, 2006); международной конференции «Охрана репродуктивного здоровья в рамках реализации национального проекта «Здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); 10-ом Всемирном конгрессе IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Сиэтл, США, 2007); 23-ей конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Дубровник, Хорватия, 2007); международном конгрессе «Новые технологии в акушерстве и гинекологии» (Санкт-Петербург, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2007» (Москва, 2007); 6-ой конференции Европейского общества по хламидийным инфекциям (Орхус, Дания, 2008); 24-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Милан, Италия, 2008); 25-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Тбилиси, Грузия, 2010); 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Вена, Австрия, 2010); 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2010» (Москва, 2010); 17-ой конференции Скандинавского общества урогенитальной медицины (Осло, Норвегия, 2010); 12-ом международном симпозиуме по хламидийным инфекциям человека (Зальцбург, Австрия, 2010); 26-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Рига, Латвия, 2011); 22-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Лондон, Великобритания, 2012).

Результаты исследования внедрены в диагностическую работу лаборатории микробиологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН и клинико-диагностической лаборатории Городского консультативно-диагностического молодежного центра «Ювента», а также отражены в методических рекомендациях по лабораторной диагностике урогенитальных инфекций, утвержденных Комитетами по здравоохранению Санкт-Петербурга и Ленинградской области: «Лабораторная диагностика инфекции, вызванной Neisseria gonorrhoeae» (2009), «Лабораторная диагностика урогенитальной хламидийной инфекции» (2009), «Лабораторная диагностика инфекции, вызванной Mycoplasma genitalium» (2010), «Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза» (2011).

По теме диссертации опубликовано 52 работы, в их числе 27 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях и 6 методических руководств.

Личное участие автора. Диссертант лично участвовала в планировании и организации работы, проведении большей части лабораторных исследований, обработке, анализе, обобщении и представлении полученных данных.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 254 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 43 таблицами. Список литературы включает 406 публикаций, из них 34 - отечественных авторов и 372 - зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Обследованные популяции

Для оценки аналитических и диагностических параметров молекулярных тестов Российского производства для диагностики урогенитальных инфекций было проведено несколько исследований (табл. 1). Общее число обследованных пациентов составило 10981 человек, общее количество исследованных клинических образцов - 12851, общее количество проведенных тестов - 37406.

Таблица 1

Популяции и клинические материалы__

Исследование Популяция Количество исследованных образцов Количество проведенных тестов

Оценка тестов на основе МАНК для диагностики ИППП Пациенты молодежных центров (п=497) и КВД (п=33) 1311 22270

Оценка распространенности нового варианта С. trachomatis Пациенты гинекологических и урологических клиник (п=9294) 9294 9567

Оценка теста для выявления клинически значимого количества ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска Женщины старше 30 лет, обратившиеся к гинекологу для планового обследования (п=823) 1646 2469

Сравнение методов диагностики гонококковой инфекции Пациенты КВД (п=334) 620 3100

1.2. Оценка тестов на основе МАНК для диагностики ИППП

1.2.1. Пациенты и клинические образцы Всего в исследование было включено 447 пациентов (319 женщин и 128 мужчин) трех молодежных центров Санкт-Петербурга, обратившихся к врачу с целью обследования на ИППП и не принимавших антибиотики в течение 4 недель до участия в исследовании. Клиническим материалом служили цервикальные и вагинальные образцы у женщин и уретральные образцы у мужчин, а также первая порция мочи у женщин и мужчин (табл. 2). Для оценки аналитической специфичности тестов на гонорею были получены экстрагенитальные пробы от 50 женщин. Кроме того, ввиду низкой распространенности трихомониаза в молодежной популяции, были получены клинические материалы от 33 пациентов городского КВД (30 женщин и трех мужчин) с диагнозом трихомониаза.

Таблица 2

Клинические пробы, использованные для оценки тестов Российского _производства на основе МАНК для диагностики ИППП_

Клинические пробы Оценка МАНК для выявления N. gonorrhoeae Оценка МАНК для выявления С. trachomatis Оценка МАНК для выявления Т. vaginalis Оценка МАНК для выявления М. genitalium

Цервикальные образцы 319 319 - -

Вагинальные образцы - 298 317 281

Образцы мочи от женщин 317 - - 281

Фарингеальные образцы 50 - - -

Ректальные образцы 50 - - -

Уретральные образцы 127 127 131 125

Образцы мочи от мужчин 127 127 - 125

Общее количество клинических проб 990 871 448 812

1.2.2. Оцениваемые тесты Всего оценивалось 22 теста (20 тестов на основе ПЦР и 2 теста на основе ЫАБВА) (табл. 3).

Таблица 3

_Оцениваемые тесты на основе МАНК для диагностики ИППП_

Производители Методы Оцениваемые тесты (приведено условное обозначение теста)

Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Trichomonas vaginalis Mycoplasma genitalium

ДНК- Технология (Москва) ПЦР с детекцией электрофорезом ПЦР-эф-ДТ-NG ПЦР-эф-ДТ-СТ ПЦР-эф-ДТ-ТУ ПЦР-эф-ДТ-MG

ПЦР в реальном времени ПЦР-рв-ДТ-NG ПЦР-рв-ДТ-СТ ПЦР-рв-ДТ-ТУ ПЦР-рв-ДТ-MG

Литех (Москва) ПЦР с детекцией электрофорезом ПЦР-эф-JI-NG ПЦР-эф-Л-СТ ПЦР-эф-Л-TV ПЦР-эф-Л-MG

ЦНИИ Эпидемиологии (Москва) ПЦР с детекцией электрофорезом ПЦР-эф-ИЭ-NG ПЦР-эф-ИЭ-СТ ПЦР-эф-ИЭ-TV ПЦР-эф-ИЭ-MG

ПЦР в реальном времени ПЦР-рв-ИЭ-NG ПЦР-рв-ИЭ-СТ ПЦР-рв-ИЭ-TV ПЦР-рв-ИЭ-MG

КАЭВА в реальном времени NASBA-NG NASBA-CT

1.2.3. Взятие, транспортировка и хранение клинических проб Цервикальные, вагинальные и уретральные образцы собирали в пробирки с реагентом ДНК-экспресс (Литех) (для анализа с использованием тестов производства ДНК-Технология и Литех) и в пробирки, содержащие 1 мл сахарозо-фосфатного буфера (для анализа с использованием тестов производства ЦНИИ Эпидемиологии и для референтного тестирования).

Очередность взятия материалов в ДНК-экспресс и сахарозо-фосфатный буфер меняли каждый день с целью рандомизации. Образцы мочи собирали в контейнеры объемом 25 мл. Все клинические пробы транспортировали в лабораторию микробиологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, где их анализировали с применением оцениваемых тестов в течение 1-2 дней. Перед тестированием пробы вортексировали и отбирали аликвоты для референтного тестирования, которые хранили при -70°С и транспортировали в замороженном виде в референтные лаборатории.

1.2.4. Анализ клинических проб с применением оцениваемых тестов

Выделение нуклеиновых кислот, реакции амплификации, анализ и интерпретацию результатов проводили в соответствии с рекомендациями производителей тестов.

1.2.5. Референтное тестирование

Референтное тестирование выполняли вслепую, с целью исключения фактора субъективности, с использованием международных валидированных тестов. Референтные тесты и лаборатории, в которых осуществлялось референтное тестирование, представлены в таблице 4.

Таблица 4

Референтные тесты для оценки отечественных тестов на ИППП_

N. gonorrhoeae С. trachomatis Т. vaginalis М. genitalium

Тесты ПЦР в реальном времени для выявления псевдогена N. gonorrhoeae рогА (Hjelmevoll S.O. et al., 2006) COBAS AMPLICOR CT/NG Test (Roche Molecular Systems, США), LightMix 480HT (TIB MOLBIOL, Германия) ПЦР в реальном времени для выявления фрагмента повторяющейс я ДНК Т. vaginalis (Pillay А. et al., 2007) ПЦР в реальном времени для выявления гена MgPa М. genitalium (Jensen J. et al., 2004), ПЦР для выявления гена 16S рРНК М. genitalium (Jensen J. et al., 2003), ПЦР для выявления гена MgPa М. genitalium (Jensen J. et al., 1991)

Учреждения Отделение микробиологии и инфекционного контроля университетского госпиталя г. Тромсё, Норвегия Отделение клинической микробиологии университетско го госпиталя г. Оребро, Швеция Отделение ИППП центра контроля над заболеваниями (CDC), Атланта, США Лаборатория микоплазм Государственного института сывороток, Копенгаген

1.2.6. Референтная панель микоплазм

Для определения аналитической чувствительности и специфичности ПЦР-тестов для выявления М. genitalium использовали контрольную зашифрованную панель, любезно предоставленную доктором Jensen J. S. (лаборатория микоплазм, Государственный институт сывороток, Копенгаген, Дания), которая включала 58 проб ДНК, выделенной из 6 штаммов М. genitalium (G37, МЗО, М2288, М2300, М2321 и М2341) и 18 проб ДНК, выделенной из 14 других видов микоплазм: М. pneumoniae (n=5), М. hominis (n=l), М. fermentans (n=l), М. penetrans (n=l), М. alvi (n=l), М. arginini (п=1),

M. pirum (n=l), M. primatum (n=l), M. lipophilum (n=l), M. amphoriforme (n=l), M.faecium (n=l), M. buccale (n=l), M. orale (n=l) и M. gallisepticum (n=l).

1.2.7. Определение пределов детекции ПЦР-тестов

Пределы детекции ПЦР-тестов для выявления N. gonorrhoeae, С. trachomatis и Т. vaginalis определяли с использованием серийных разведений коммерческих количественных стандартов Neisseria gonorrhoeae Quantitated Bacterial DNA Control (Advanced Biotechnologies, США), Chlamydia trachomatis (VIRCELL, Испания) и Trichomonas vaginalis ATCC® 3000ID (АТСС, США), соответственно. Для определения пределов детекции ПЦР-тестов для выявления М. genitalium использовали пробы ДНК штаммов М. genitalium в различных концентрациях из референтной панели.

1.2.8. Анализ результатов

Диагностические характеристики тестов (чувствительность, специфичность, прогностическую значимость положительных и отрицательных результатов (ПЗПР и ПЗОР)) с доверительными интервалами с уровнем значимости 95% (95% ДИ) рассчитывали по отношению к результатам референтных тестов. Данные представляли в виде диапазона показателей для разных тестов и/или клинических образцов. При сравнении разных клинических материалов применяли тест Мак-Немара; различия в частоте выявления возбудителей в разных материалах считали статистически значимыми при /)<0,05. Статистический анализ проводили с использованием пакета StatsDirect (StatsDirect, Великобритания).

1.3. Оценка распространенности нового варианта С. trachomatis и оценка способности ПЦР-тестов его выявлять

1.3.1. Пациенты и клинические образцы

В работе были использованы клинические образцы от 9294 пациентов, поступившие в лабораторию микробиологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН из гинекологических и урологических клиник Санкт-Петербурга для рутинного тестирования на С. trachomatis.

1.3.2. Тестирование клинических проб на нвСТ

Анализ клинических проб, в которых в ходе рутинного тестирования была выявлена ДНК С. trachomatis, на нвСТ проводили с применением метода мультиплексной ПЦР в реальном времени, использующей в качестве мишеней два фрагмента криптической плазмиды С. trachomatis (Ripa Т. А., Nilsson P.A., 2007). Один фрагмент расположен в пределах делеции, другой фрагмент - за пределами делеции, что позволяет выявлять как штаммы дикого типа С. trachomatis (два ПЦР-сигнала), так и нвСТ (один ПЦР-сигнал).

1.3.3. Генотипирование С. trachomatis

Для установления идентичности штамма нвСТ, выявленного в Санкт-Петербурге, штаммам нвСТ, выявленным ранее в Швеции и других Североевропейских странах, было проведено высокоразрешающее генотипирование методом вариабельного числа тандемных повторов (variable number of tandem repeats, VNTR) (Pedersen L.N. et al., 2008).

1.3.4. Оцениваемые ПЦР-тесты Шесть ПЦР-тестов, выпускаемых 4 Российскими компаниями, были проанализированы на способность выявлять нвСТ: 1) Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis: формат Форез (ДНК-Технология, Москва); 2) Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis: формат Rt (ДНК-Технология); 3) Полимик-Хл (Литех); 4) АмплиСенс Chlamydia trachomatis EPh (ЦНИИ Эпидемиологии); 5) АмплиСенс Chlamydia trachomatis FL (ЦНИИ Эпидемиологии); 6) РеалБест ДНК Chlamydia trachomatis (Вектор-Бест, Новосибирск). Для анализа использовали образец ДНК, выделенной из лабораторного штамма нвСТ Sweden2, любезно предоставленный доктором Unemo М. (отделение клинической микробиологии университетского госпиталя г. Оребро, Швеция).

1.4. Оценка теста для выявления клинически значимого количества ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска

1.4.1. Пациенты и клинические образцы Оценка теста основывалась на рекомендациях международной группы экспертов (Meijer C.J. et al., 2009), согласно которым ВПЧ-тест должен оцениваться в сравнении с тестом Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test (HC2) (Qiagen, США) на выборке женщин старше 30 лет из скрининговой популяции. В нашей стране скрининг РШМ осуществляется на оппортунистической основе, поэтому в качестве обследуемой популяции были выбраны женщины, обратившиеся к гинекологу для планового обследования. В исследование были включены 823 женщины в возрасте от 30 до 65 лет, не беременные и не имевшие CIN2+ в анамнезе. С помощью цитощетки DNAPAP Cervical Sampler (Qiagen, США) получали материал из цервикального канала, который наносили на предметное стекло для цитологического исследования, после чего цитощетку опускали в пробирку, содержащую 1 мл транспортной среды Specimen Transport Medium (Qiagen, США). Перед тестированием материал вортексировали и делили на две равные части по 0,5 мл. Одну аликвоту анализировали с использованием теста НС2. Вторую аликвоту тестировали с применением оцениваемого теста.

1.4.2. Цитологические и гистологические исследования Цитологические исследования проводили по методу Папаниколау. При выявлении плоскоклеточных интраэпителиальных поражений любой степени (при любом результате теста НС2), а также при положительном результате теста НС2 было рекомендовано проведение кольпоскопии и, в случае необходимости, гистологического исследования биопсии шейки матки.

1.4.3. Оцениваемый тест Из ряда отечественных тестов на ВПЧ для оценки был выбран только один тест, который по выявляемому спектру типов ВПЧ и по наличию порога клинической значимости вирусной нагрузки соответствовал требованиям, предъявляемым к скрининговым ВПЧ-тестам (Stoler М.Н. et al, 2007). Тест АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр FL (ЦНИИ Эпидемиологии) основан на мультиплексной ПЦР-амплификации и количественной детекции (без

дифференциации) в режиме реального времени фрагментов ДНК 12 онкогенных типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59). Тест включает количественную оценку ДНК человека, что позволяет контролировать адекватность взятия материала и этапы анализа, а также нивелировать эффект вариации при взятии материала. Анализ проводили в соответствии с инструкцией производителя. Результат считали положительным, если количество ДНК ВПЧ равнялось или превышало 103 копий на 105 клеток человека.

1.4.4. Референтный тест Тест НС2 основан на гибридизации ДНК ВПЧ с РНК-зондами и последующей хемилюминесцентной детекции образующихся гибридов и предназначен для выявления 13 онкогенных типов ВПЧ (без дифференциации), а именно, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68. Анализ проводили в соответствии с инструкцией производителя с небольшой модификацией, заключающейся в уменьшении объема денатурирующего реагента, пропорциональном уменьшению объема тестируемой пробы (вдвое).

1.4.5. Секвенирование ДНК для определения генотипа ВПЧ

Для подтверждения наличия ДНК ВПЧ и определения типа вируса в дискордантных образцах проводили реакцию ПЦР с праймерами MY11/ MY09 и GP5+/GP6+ к гену капсидного белка ВПЧ L1 с последующим секвенированием продуктов амплификации (Lee S.H. et al., 2007).

1.4.6. Анализ результатов Расчет чувствительности и специфичности оцениваемого теста с определением 95% ДИ производили после разрешения дискордантных результатов по отношению к результатам теста НС2 с использованием статистического пакета StatsDirect (StatsDirect, Великобритания).

1.5. Сравнение методов диагностики гонококковой инфекции

1.5.1. Пациенты и клинические образцы В исследовании участвовали 334 пациента (286 женщин и 48 мужчин) двух КВД Санкт-Петербурга, обратившихся с симптомами урогенитальной инфекции. Клиническим материалом служили цервикальные и уретральные образцы от женщин и уретральные образцы от мужчин. Каждую пробу наносили на предметное стекло для микроскопического исследования, затем делали посев на питательные среды Комплегон (Институт вакцин и сывороток, Санкт-Петербург) и VCA3 (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Франция). После этого получали еще один образец для анализа с применением МАНК, который помещали в пробирку, содержащую 1 мл сахарозно-фосфатного буфера.

1.5.2. Микроскопические и культуральные исследования Микроскопические и культуральные исследования проводили в лабораториях КВД в соответствии со стандартными протоколами. В обоих КВД проводилась лишь предварительная идентификация N. gonorrhoeae, то есть обнаружение в культуре типичных грамотрицательных оксидазаположительных диплококков. Для окончательной видовой

идентификации образцы культур собирали в сахарозо-фосфатный буфер для последующего секвенирования фрагмента гена 16SpPHK.

1.5.3. Выявление N. gonorrhoeae методами ПЦР и NASBA

Анализ клинических проб методами ПЦР и NASBA проводили с использованием тестов АмплиСенс Neisseria gonorrhoeae EPh и АмплиСенс Neisseria gonorrhoeae Риботест (ЦНИИ Эпидемиологии), соответственно, согласно инструкциям производителя.

1.5.4. Секвенирование фрагмента гена 16SрРНКN. gonorrhoeae

Для видовой идентификации образцов культур и верификации всех положительных клинических образцов использовали метод определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК.

1.5.5. Анализ результатов

При расчете диагностических характеристик методов за истинно положительные принимали образцы, положительные любым методом, если наличие в этих образцах ДНК гонококков было подтверждено секвенированием. Характеристики методов с определением 95% ДИ рассчитывали по отношению к числу инфицированных пациентов с использованием пакета StatsDirect (StatsDirect, Великобритания).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Оценка тестов на основе МАНК для диагностики ИППП

2.1.1. Характеристики тестов для выявления N. gonorrhoeae

При референтном тестировании ДНК N. gonorrhoeae была обнаружена у 7 женщин (2,2%) и 5 мужчин (3,9%). Все оцениваемые тесты показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референтным тестом - 99,4— 100%. Дискордантные результаты были получены для трех проб (табл. 5).

Таблица 5

Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления N. gonorrhoeae

Клинические материалы Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов Количество образцов с несовпадающими результатами тестов Уровень совпадения результатов, %

+ -

Цервикальные образцы (п=319) 5 313 1 99,7

Образцы мочи от женщин (п=317) 4 311 2 99,4

Уретральные образцы от мужчин (п=127) 4 123 0 100

Образцы мочи от мужчин (п=127) 5 122 0 100

При исследовании проб, полученных от женщин, чувствительность оцененных тестов варьировала от 67 до 100%. При исследовании проб от мужчин все тесты имели 100% чувствительность. Специфичность и ПЗПР всех тестов равнялись 100%, ПЗОР - 99-100% (табл. 6).

Таблица 6

Диагностические характеристики тестов на основе МАНК

для выявления N. gonorrhoeae

Клинические материалы Тест Чувствительность, % [95% ДИ1 Специфичность, % [95% ДИ1 ПЗПР, % [95% ДИ] ПЗОР, % [95% ДИ]

Цервикаль-ные образцы (п=319) ПЦР-эф-ДТ-NG 100 [61-1001 100 [99-1001 100 [61-1001 100 [99-1001

ПЦР-рв-ДТ-NG 100 [61-100] 100[99-1001 100 [61-1001 100 [99-1001

ПЦР-эф-JI-NG 83 [36-1001 100[99-100] 100 [55-1001 100 [98-1001

ПЦР-эф-ИЭ-NG 100 [61-1001 100[99-1001 100 [61-1001 100 [99-1001

ПЦР-рв-ИЭ-NG 100 [61-1001 100[99-1001 100 [61-100] 100 [99-1001

NASBA-NG 100[61-1001 100[99-1001 100(61-1001 100 [99-1001

Образцы мочи от женщин (п=317) ПЦР-эф-ДТ-NG 83 [36-1001 100 [99-1001 100 [55-1001 100 [98-100]

ПЦР-рв-ДТ-NG 83 Г36-1001 100[99-1001 100 [55-1001 100 [98-1001

ПЦР-эф-JI-NG 67 [22-96] 100 [99-1001 100 [47-1001 99 [98-1001

ПЦР-эф-ИЭ-NG 100 Г61-1001 100 [99-1001 100 Г61-1001 100 [99-1001

ПЦР-рв-ИЭ-NG 100 [61-1001 100 [99-1001 100 [61-1001 100 [99-1001

NASBA-NG 100 [61-1001 100 [99-1001 100 [61-1001 100 [99-1001

Уретральные образцы от мужчин (п=127) ПЦР-эф-ДТ-NG 100 [47-1001 100[98-1001 100 [47-1001 100 [98-1001

ПЦР-рв-ДТ-NG 100 [47-1001 100[98-1001 100 [47-1001 100 [98-1001

ПЦР-эф-JI-NG 100 [47-1001 100[98-1001 100 [47-1001 100 [98-1001

ПЦР-эф-ИЭ-NG 100 [47-1001 100[98-1001 100 [47-1001 100 [98-1001

ПЦР-рв-ИЭ-NG 100 [47-1001 100 [98-1001 100 Г47-1001 100 Г98-1001

NASBA-NG 100 [47-1001 100 [98-1001 100 [47-1001 100 [98-1001

Образцы мочи от мужчин (п=127) ПЦР-эф-ДТ-NG 100 [55-1001 100 [98-1001 100 [55-1001 100 [98-1001

ПЦР-рв-ДТ-NG 100 [55-1001 100 [98-1001 100 [55-1001 100 [98-1001

ПЦР-эф-JI-NG 100 [55-1001 100 [98-1001 100 [55-1001 100 [98-1001

ПЦР-эф-ИЭ-NG 100 [55-1001 100 [98-1001 100 [55-1001 100 [98-100]

ПЦР-рв-ИЭ-NG 100 [55-100] 100 [98-1001 100 [55-1001 100 [98-1001

NASBA-NG 100 [55-1001 100[98-100] 100 Г55-1001 100 Г98-1001

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДТ-NG, ПЦР-рв-ДТ-NG, ПЦР-эф-JI-NG, ПЦР-эф-ИЭ-NG и ПЦР-рв-ИЭ-NG составили 1-3, 1-3, 3-6, 1-3 и 1 копий ДНК на реакцию, соответственно.

Для оценки аналитической специфичности тестов были исследованы образцы со слизистой глотки и из прямой кишки, которые являются типичными локализациями нейссерий-комменсалов. Ни для одного из экстрагенитальных образцов не было зарегистрировано неспецифических реакций.

2.1.2. Характеристики тестов для выявления С. trachomatis

По результатам референтного тестирования, 40 женщин (12,5%) и 16 мужчин (12,6%) были инфицированы С. trachomatis. Уровень совпадения результатов тестов составил 98,1-99,2%. Дискордантные результаты были получены для 15 образцов, большинство из которых - от женщин (табл. 7).

Таблица 7

Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления С. trachomatis

Клинические материалы Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов Количество образцов с несовпадающими результатами тестов Уровень совпадения результатов, %

+ -

Цервикальные образцы (п=319) 34 279 6 98,1

Продолжение таблицы 7

Вагинальные образцы (п=298) 31 261 6 97,9

Уре1ральные образцы от мужчин (п=127) 13 113 1 99,2

Образцы мочи от мужчин (п=127) 12 ИЗ 2 98,4

При исследовании клинических проб от женщин чувствительность оцениваемых тестов составила 86-92%. При тестировании проб от мужчин чувствительность была несколько выше - 92—100%. Специфичность тестов составила 99-100%. ПЗПР оцениваемых тестов варьировала от 92 до 100%, ПЗОР - от 98 до 100% (табл. 8).

Таблица 8

Диагностические характеристики тестов на основе МАНК _для выявления С. trachomatis_

Клинические материалы Тест Чувствительность, % [95% ДИ1 Специфичность, % [95% ДИ1 ПЗПР, % [95% ДИ] ПЗОР, % [95% ДИ]

Цервикаль-ные образцы (п=319) ПЦР-эф-ДТ-СТ 92 [79-98] 100 [98-100] 97 [86-100] 99[97-100]

ПЦР-рв-ДТ-СТ 92 [79-98] 100 [98-100] 97 [86-100] 99 [97-100]

ПЦР-эф-Л-СТ 87 [73-96] 100 [98-100] 97 [85-100] 98 [96-99]

ПЦР-эф-ИЭ-СТ 87 [73-96] 100 [99-100] 100 [92-100] 98 [96-99]

ПЦР-рв-ИЭ-СТ 87 [73-96] 100 [99-100] 100 [92-100] 98 [96-99]

NASBA-CT 90 [76-97] 100 [99-100] 100 [92-100] 99 [96-100]

Вагинальные образцы (п=298) ПЦР-эф-ДТ-СТ 92 [78-98] 100[98-100] 97 [85-100] 99 [96-100]

ПЦР-рв-ДТ-СТ 92 [78-98] 100 [98-100] 97[85-100] 99 [96-100]

ПЦР-эф-Л-СТ 86 [71-95] 100 [98-100] 97 [84-100] 98 [96-99]

ПЦР-эф-ИЭ-СТ 86 [71-95] 100 [99-100] 100 [91-100] 98 [96-99]

ПЦР-рв-ИЭ-СТ 86 [71-95] 100 [99-100] 100 [91-100] 98 [96-99]

NASBA-CT 92 [78-98] 100 [99-100] 100 [91-100] 99 [97-100]

Уретральные образцы от мужчин (п=127) ПЦР-эф-ДТ-СТ 93 [66-100] 100 [97-100] 100 [79-100] 99[95-100]

ПЦР-рв-ДТ-СТ 93 [66-100] 100 [97-100] 100 [79-100] 99[95-100]

ПЦР-эф-Л-СТ 100 [81-100] 100 [97-100] 100 [81-100] 100 [97-100]

ПЦР-эф-ИЭ-СТ 100 [81-100] 100 [97-100] 100 [81-100] 100[97-100]

ПЦР-рв-ИЭ-СТ 100 [81-100] 100 [97-100] 100 [81-100] 100 [97-100]

NASBA-CT 100 [81-100] 100 [97-100] 100 [81-100] 100 [97-100]

Пробы мочи от мужчин (п-127) ПЦР-эф-ДТ-СТ 92 [64-100] 99 [95-100] 92 [64-100] 99 [95-100]

ПЦР-рв-ДТ-СТ 92 [64-100] 99 [95-100] 92 [64-100] 99[95-100]

ПЦР-эф-Л-СТ 92 [64-100] 100 [97-100] 100 [78-100] 99[95-100]

ПЦР-эф-ИЭ-СТ 92 [64-100] 100[97-100] 100 [78-100] 99 [95-100]

ПЦР-рв-ИЭ-СТ 92 [64-100] 100 [97-100] 100 [78-100] 99 [95-100]

NASBA-CT 100 [79-100] 100 [97-100] 100 [79-100] 100[97-100]

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДТ-СТ, ПЦР-рв-ДТ-СТ, ПДР-эф-Л-СТ, ПЦР-эф-ИЭ-СТ и ПЦР-рв-ИЭ-СТ составили 2-4,4-6,4-6,2-4 и 2-4 копий ДНК на реакцию, соответственно.

2.1.3. Характеристики тестов для выявления Т. vaginalis

Среди посетителей молодежных центров ДНК Т. vaginalis была выявлена у 5 из 287 женщин (1,7%) и ни у одного мужчины. Все образцы, полученные от пациентов городского КВД (п=33) с диагнозом трихомониаза, были подтверждены как истинно положительные. Результаты оцениваемых тестов и референтного теста совпали для 315 из 317 (99,4%) вагинальных образцов и для 130 из 131 (99,2%) уретральных образцов от мужчин (табл. 9).

Таблица 9

Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления Т. vaginalis

Клинические материалы Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов Количество образцов с несовпадающими результатами тестов Уровень совпадения результатов, %

+ -

Вагинальные образцы (п=317) 33 282 2 99,4

Уретральные образцы от мужчин (11=131) 2 128 1 99,2

Для трех истинно положительных образов, от двух женщин и одного мужчины, ложноотрицательные результаты были получены при анализе с использованием теста ПЦР-эф-Л-ТУ. Таким образом, чувствительность данного теста составила 94% для вагинальных образцов и 67% для уретральных образцов от мужчин. Чувствительность остальных тестов равнялась 100%. Специфичность всех тестов равнялась 100% (табл. 10).

Таблица 10

Диагностические характеристики тестов на основе МАНК _для выявления Т. vaginalis _

Клинические материалы Тест Чувствительность, % Г95% ДИ1 Специфичность, % [95% ДИ1

Вагинальные образцы (п=317) ПЦР-эф-ДТ-ТУ 100 [92-100] 100 [99-100]

ПЦР-рв-ДТ-ТУ 100 [92-100] 100 [99-100]

ПЦР-эф-Л-TV 94 [81-99] 100(99-100]

ПЦР-эф-ИЭ-TV 100 [92-100] 100 [99-100]

ПЦР-рв-ИЭ-TV 100 [92-100] 100 [99-100]

Уретральные образцы от мужчин (п=131) ПЦР-эф-ДТ-ТУ 100 [37-100] 100 [98-100]

ПЦР-рв-ДТ-TV 100 [37-100] 100 [98-100]

ПЦР-эф-Л-TV 67 [9-99] 100 [98-100]

ПЦР-эф-ИЭ-TV 100 [37-100] 100 [98-100]

ПЦР-рв-ИЭ-TV 100 [37-100] 100 [98-100]

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДТ-ТУ, ПЦР-рв-ДТ-ТУ, ПЦР-эф-Л-TV, ПЦР-эф-ИЭ-TV и ПЦР-рв-ИЭ-TV составили 1, 1, 5, 1 и 1 копий ДНК на реакцию, соответственно.

2.1.4. Характеристики тестов для выявления М. genitalium

Частота выявления М. genitalium составила 2,5% (7 из 281) среди женщин и 9,6% (12 из 125) среди мужчин. Уровень совпадения результатов оцениваемых и референтных тестов составил 99,3%, 97,5%, 97,6%, 95,1% для вагинальных проб и проб мочи от женщин и уретральных проб и проб мочи от

мужчин, соответственно. Дискордантные результаты были получены для 18 проб (табл. 11).

Таблица 11

Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления М. genitalium

Клинические материалы Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов Количество образцов с несовпадающими результатами тестов Уровень совпадения результатов, %

+ -

Вагинальные образцы (п=281) 2 277 2 99,3

Образцы мочи от женщин (п=281) 0 274 7 97,5

Уретральные образцы от мужчин (п=125) 6 116 3 97,6

Образцы мочи от мужчин (п=125) 3 - 116 6 95,2

Чувствительность оцениваемых тестов варьировала в широких пределах - от 0 до 100%. Самую высокую чувствительность (от 71 до 100% в различных клинических материалах) показал тест ПЦР-рв-ИЭ-МО, за ним следовали ПЦР-эф-ИЭ-МО (57-100%) и ПЦР-рв-ДТ-МС (43-100%) (табл. 12).

Таблица 12

Диагностические характеристики тестов на основе МАНК _для выявления М. genitalium__

Клинические материалы Тесты Чувствительность, % [95% ДИ1 Специфичность, % [95% ДИ1 ПЗПР, % [95% ДИ] ПЗОР, % [95% ДИ]

Вагинальные образцы (п=281) ПЦР-эф-ДТ-MG 75 [19-99] 100[99-100] 100 [37-100] 100 [98-100]

ПЦР-рв-ДТ-MG 100 [47-100] 100 [99-100] 100 [47-100] 100 [99-100]

ПЦР-эф-Л-МО 50 [7-93] 100 [99-100] 100 [22-100] 99 [97-100]

ПЦР-эф-ИЭ-MG 100 [47-100] 100 [99-100] 100[47-100] 100 [99-100]

ПЦР-рв-ИЭ-MG 100 [47-100] 100 [99-100] 100 [47-100] 100 [99-100]

Образцы мочи от женщин (п=281) ПЦР-эф-ДТ-MG 0[0-35] 100 [99-100] - 98 [95-99]

ПЦР-рв-ДТ-MG 43 [10-82] 100 [99-100] 100 [37-100] 99[96-100]

ПЦР-эф-JI-MG 0 [0-35] 100 [99-100] - 98[95-99]

ПЦР-эф-ИЭ-MG 57 [18-90] 100 [99-100] 100 [47-100] 99 [97-100]

ПЦР-рв-ИЭ-MG 71 [29-96] 100 [99-100] 100 [55-100] 99 [97-100]

Уретральные образцы от мужчин (п=125) ПЦР-эф-ДТ-MG 67 [30-93] 100 [98-100] 100 [61-100] 98 [93-100]

ПЦР-рв-ДТ-MG 78 [40-97] 100 [98-100] 100 [65-100] 98 [94-100]

ПЦР-эф-Л-MG 67 [30-93] 100 [98-100] 100 [61-100] 98 [93-100]

ПЦР-эф-ИЭ-MG 67 [30-93] 100 [98-100] 100[61-100] 98[93-100]

ПЦР-рв-ИЭ-MG 78 [40-97] 100 [98-100] 100 [65-100] 98[94-100]

Образцы мочи от мужчин (п=125) ПЦР-эф-ДТ-MG 40 [12-74] 100[98-100] 100 [47-100] 95[90-98]

ПЦР-рв-ДТ-MG 60 [26-88] 100 [98-100] 100 [61-100] 97 [92-99]

ПЦР-эф-Л-MG 40 [12-74] 100 [98-100] 100 [47-100] 95 [90-98]

ПЦР-эф-ИЭ-MG 60 [26-88] 100 [98-100] 100 [61-100] 97 [92-99]

ПЦР-рв-ИЭ-MG 80 [44-98] 100 [98-100] 100 [69-100] 98 [94-100]

Чувствительность тестов ПЦР-эф-ДТ-MG и ПЦР-эф-JI-MG была низкой (0-75% и 0-67%, соответственно), особенно для проб мочи. С использованием этих двух тестов M. genitalium были выявлены только в 4 из 10 положительных проб мочи от мужчин и ни в одной из 7 положительных проб мочи от женщин. Специфичность и ПЗПР тестов равнялись 100%. ПЗОР варьировала от 95 до 100%. Ранее с использованием количественной ПЦР в реальном времени было показано, что М. genitalium часто содержится в урогенитальных образцах в низких концентрациях (Jensen J.S. et al., 2004). Это подчеркивает необходимость применения как высокочувствительных тестов, так и оптимальных способов пробоподготовки.

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДТ-MG, ПЦР-рв-ДТ-MG, ПЦР-эф-JI-MG, ПЦР-эф-ИЭ-MG и ПЦР-рв-ИЭ-MG составили 5-50, 5, 15-300, 5 и 5 копий ДНК на реакцию, соответственно.

При оценке аналитической специфичности один из оцениваемых тестов (ПЦР-рв-ДТ-MG) перекрестно реагировал с ДНК М. pneumoniae в концентрации >100 копий/мкл. В литературе описаны случаи выявления М. pneumoniae в пробах из урогенитального тракта (Goulet M. et al., 1995; Sharma S. et al., 1998), и, хотя роль данного возбудителя в урогенитальной патологии не ясна, очевидно, что при применении данного теста может потребоваться подтверждение положительных результатов другим тестом. Для остальных тестов перекрестных реакций не наблюдалось.

2.1.5. Использование различных клинических материалов для выявления возбудителей IIIIIIII

Для оценки информативности использования различных клинических материалов для диагностики ИППП было проведено сравнение частоты обнаружения возбудителей ИППП в различных материалах (табл. 13).

Таблица 13

Использование различных клинических материалов для выявления _возбудителей ИППП__

Возбудитель Клинические материалы Частота выявления Значение р

N. gonorrhoeae Женщины Цервикальные образцы 1,9% (6/317) 1,000

Образцы мочи 1,9% (6/317)

Мужчины Уретральные образцы 3,1% (4/127) 1,000

Образцы мочи 3,9% (5/127)

С. trachomatis Женщины Цервикальные образцы 13,1% (39/298) 0,375

Вагинальные образцы 12,1% (36/298)

Мужчины Уретральные образцы 11,0% (14/127) 1,000

Образцы мочи 10,2% (13/127)

M. genitalium Женщины Вагинальные образцы 1,4% (4/281) 0,250

Образцы мочи 2,5% (7/281)

Мужчины Уретральные образцы 7,2% (9/125) 1,000

Образцы мочи 8,0% (10/125)

Статистически значимых различий между частотой выявления возбудителей ИППП при использовании различных клинических материалов не выявлено. Неинвазивный способ взятия материала предпочитается пациентами

и позволяет самостоятельно получать урогенитальные образцы, что благоприятствует большему вовлечению населения в обследование на ИППП, способствуя, таким образом, их своевременному выявлению и лечению. Применение данного подхода также облегчает проведение эпидемиологических и скрининговых исследований.

2.2. Распространенность нового варианта С. trachomatis и способность ПЦР-тестов для диагностики хламидийной инфекции его выявлять

Впервые нвСТ был обнаружен в Швеции в 2006 году (Ripa T. A., Nilsson P.A., 2006). Быстрому распространению нвСТ способствовало то, что примерно две трети диагностических лабораторий в Швеции использовали тесты производства Roche и Abbott, не способные выявлять мутантный тип. У тысяч пациентов, инфицированных хламидиями, они оставались не выявленными, что серьезным образом повлияло на эпидемиологию этого заболевания в стране. Только в 2010 году показатель заболеваемости начал снижаться (Unemo M., Clarke I.N., 2011). Сейчас нвСТ широко распространен в Швеции и встречается в других странах Западной Европы (Unemo M., Clarke I.N., 2011). Данных по Восточной Европе до настоящего времени не было опубликовано. Для того чтобы определить, насколько нвСТ распространен в нашей стране, мы протестировали на нвСТ 273 пробы, в которых были выявлены хламидии при рутинном тестировании клинических материалов от 9294 пациентов. НвСТ был выявлен в одном образце, который был получен от 23-летней женщины. С использованием высокоразрешающего VNTR-генотипирования была подтверждена его идентичность штаммам, обнаруженным ранее в Швеции и других Североевропейских странах (VNTR генотип 8.7.1). Только один из 6 тестов, проанализированных на способность выявлять нвСТ, а именно, Полимик-Хл (Литех), не мог его идентифицировать. Таким образом, распространенность нвСТ составила 0,01%, а доля нвСТ по отношению к дикому типу С. trachomatis - 0,4%.

Показано, что нвСТ по своим биологическим свойствам не отличается от дикого типа (Unemo M. et al., 2010), поэтому полагают, что через некоторое время нвСТ достигнет равновесия с диким типом и постепенно распространится в другие страны. Так как нвСТ находится сейчас в стадии ранней трансмиссии, и так как его штаммы являются стабильными клонами, нвСТ предоставляет уникальную возможность для изучения динамики распространения микроорганизма в популяции. Возможность широкого распространения нвСТ в нашей стране обосновывает необходимость использования тестов, способных его выявлять, а также перспективность включения нвСТ в контрольные панели ФСВОК.

2.3. Диагностические характеристики теста для выявления

клинически значимого количества ВПЧ высокого онкогенного риска

Практически все ключевые исследования, доказавшие диагностическую ценность теста на онкогенные типы ВПЧ в скрининге РШМ были проведены с использованием теста НС2 (Cuzick J. et al., 2008), поэтому группой международных экспертов было предложено, что все новые скрининговые ВПЧ-тесты должны иметь диагностические характеристики, сравнимые с

характеристиками этого теста (Меуег СЛ. е1 а1., 2009). Чувствительность ВПЧ-теста для выявления СШ2+ должна быть не ниже 90%, специфичность - не ниже 98% по сравнению с тестом НС2.

С помощью теста НС2 ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска была обнаружена у 13% (107 из 823) пациентов. СШ2+ были выявлены у 6 женщин.

Уровень совпадения результатов оцениваемого и референтного тестов был высоким: одинаковые результаты были получены для 769 образцов (94,3%), из них 86 положительных и 683 отрицательных (табл. 14).

Таблица 14

Результаты исследования цервикальных образцов на ВПЧ высокого

онкогенного риска

АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр РЬ НС2 ПЦР с праймерами МУ11/ МУ09 и ОР5+ЛЗР6+ и последующим секвенированием продуктов амплификации Количество образцов

+ + Не проводили 86

- - Не проводили 683

Невалидный - Не проводили 21

+ - + 12

- + + 19

- + - 2

Оцениваемый тест АмплиСенс, в отличие от референтного теста НС2, обладает внутренним контролем, позволяющим оценивать качество взятия и хранения клинического материала. В 21 пробе при использовании теста АмплиСенс не определялся внутренний контроль; данные пробы были исключены из анализа.

Для 12 проб были получены положительные результаты с применением теста АмплиСенс и отрицательные - с применением теста НС2. Анализ методом ПЦР с праймерами МУ11/ МУ09 и ОР5+/ОР6+ подтвердил наличие ДНК ВПЧ в данных образцах. Концентрация вируса в данных образцах варьировала от 1x103 до 2x104 (средняя концентрация 5х 103) копий на 105 клеток, т.е. была несущественно выше порога клинической значимости.

В 19 образцах, отрицательных при анализе тестом АмплиСенс и положительных при анализе тестом НС2, ПЦР с праймерами МУ11/ МУ09 и ОР5+ЛЗР6+ подтвердила наличие ДНК ВПЧ. С помощью секвенирования в 5 пробах была обнаружена ДНК ВПЧ 68 типа (данный тип не выявляется тестом АмплиСенс). Еще 6 проб содержали 16 тип (п=2), 33 тип (п=1), 51 тип (п=1), 58 тип (п=1) и смесь типов (п=1). Следует отметить, что в 4 из этих 6 проб при использовании теста АмплиСенс регистрировался ПЦР-сигнал, однако бирусная нагрузка была ниже порога клинической значимости, и поэтому результат был интерпретирован как отрицательный. В 8 пробах были обнаружены типы неопределенного онкогенного риска, а именно, 32, 66 и 70 типы (1, 3 и 4 пробы, соответственно); эти 8 проб были исключены из анализа.

В двух пробах, которые были отрицательными при использовании теста АмплиСенс и положительными при использовании теста НС2, ПЦР с

праймерами MY11/MY09 и GP5+/GP6+ не подтвердила наличие ДНК ВПЧ. Эти две пробы также были исключены из анализа.

В итоге в анализ были включены 792 пробы - 97 положительных и 695 отрицательных. С помощью теста АмплиСенс было правильно идентифицировано 86 из 97 положительных проб (чувствительность 89%; 95% ДИ [81-94]). Оба ВПЧ-теста показали положительные результаты во всех 6 случаях CIN2+ (чувствительность 100%; 95% ДИ [54-100]). Из 695 отрицательных проб с применением теста АмплиСенс было правильно идентифицировано 683, и специфичность теста составила 98% (95% ДИ [97— 99]). Таким образом, оцененный тест по критериям чувствительности и специфичности соответствует требованиям, предъявляемым к скрининговым ВПЧ-тестам.

2.4. Сравнение методов диагностики гонококковой инфекции

Данное исследование должно было оценить качество традиционной микробиологической диагностики гонореи в учреждениях Санкт-Петербурга и продемонстрировать диагностические возможности молекулярных методов выявления N. gonorrhoeae. В соответствии с этой задачей, микроскопическая и культуральная диагностика осуществлялась в КВД на рутинной основе. ДНК N. gonorrhoeae была обнаружена в образцах от 13 женщин и 4 мужчин. Чувствительность культурального метода выявления N. gonorrhoeae была равна 31% и 50% у женщин и мужчин, соответственно. Чувствительность микроскопического метода составила 31% и 75% у женщин и мужчин, соответственно. Чувствительность метода NASBA была равна 91% и 100% у женщин и мужчин, соответственно. Специфичность всех методов составила 100% (табл. 15). ПЗПР всех методов также равнялись 100%. ПЗОР варьировала от 96 до 100%.

Таблица 15

Пациенты Метод Чувствительность, % [95% ДИ] Специфичность, % [95% ДИ] ПЗПР, % [95% ДИ] ПЗОР, % [95% ДИ]

Женщины Культуральный 31 [14-55] 100 [99-100] 100 [65-00] 97 [96- 100]

Микроскопический 31 [14-55] 100 [99- 100] 100[65-100] 97 [96-100]

ПЦР 100[87-100] 100 [99-100] 100 [87-100] 100 [99-100]

NASBA 91 [71-99] 100 [99-100] 100 [86-100] 100 [99-100]

Мужчины Культуральный 50 [7-93] 100 [93-100] 100 [22-100] 96 [85-99]

Микроскопический 75 [19-99] 100 [93- 100] 100 [37-100] 98[88-100]

ПЦР 100 [47-100] 100 [93-100] 100 [47-100] 100 [93-100]

NASBA 100 [47-100] 100 [93-100] 100 [47-100] 100 [93-100]

Таким образом, микроскопический и культуральный методы, являющиеся регламентированными методами диагностики гонореи в нашей стране, обладают очень низкой чувствительностью, особенно у женщин. Использование микроскопического метода в случаях иных, чем установление предварительного диагноза гонореи у мужчин с уретритом, может быть оправдано только отсутствием доступа к другим диагностическим методам.

Необходима оптимизация культуральиого метода, незаменимого при мониторинге антибиотикорезистентности циркулирующих штаммов N. gonorrhoeae. В то же время, повышение качества культуральных исследований не решает полностью проблему диагностики гонококковой инфекции. Даже при соблюдении всех необходимых условий культивирования в ряде случаев не удается выделить N. gonorrhoeae из клинического материала (Luijt D.S. et al., 2005). В этой связи необходимость внедрения валидированных молекулярных методов в диагностику гонококковой инфекции не вызывает сомнений.

2.5. Модель обеспечения качества аналитического этапа микробиологической диагностики с применением методов амплификации нуклеиновых кислот

Результаты проведенных нами исследований, в совокупности с анализом международного и отечественного опыта в области качества лабораторных исследований, позволили нам разработать и обосновать модель обеспечения аналитического качества молекулярной диагностики инфекционных заболеваний, компоненты которой, действуя комплементарно друг другу, призваны нивелировать и контролировать риски возникновения лабораторных ошибок, связанных как со свойствами МАНК, так и со свойствами аналитов -нуклеиновых кислот инфекционных агентов (рис. 1). Основными компонентами системы обеспечения аналитического качества диагностики инфекционных заболеваний являются контроль качества и оценка качества. Контроль качества включает процедуры внутреннего контроля качества и контроля качества аналитических систем. Применительно к молекулярной диагностике, к процедурам внутреннего контроля относятся контроль взятия материала, контроль выделения ДНК/РНК, контроль амплификации, контроль ингибирования амплификации, контроль контаминации. Процедуры внутреннего контроля качества должны быть включены в стандартный протокол лабораторного исследования.

К мере контроля качества аналитических систем относится, в первую очередь, клиническая оценка тестов. Любой тест, коммерческий или некоммерческий, перед внедрением в рутинную диагностику должен пройти надлежащую клиническую оценку. Если предполагается внедрить тест, аналитические и диагностические параметры которого описаны в литературе и соответствуют задачам лаборатории, достаточно провести валидацию теста, например, с использованием панели охарактеризованных образцов биологического материала, как положительных (содержащих разные концентрации возбудителя), так и отрицательных. Если планируется использовать тест, информация об аналитических и диагностических параметрах которого недоступна или была получена для популяций, существенно отличающихся от той, в которой предполагается использовать тест, необходимо провести его клиническую оценку. Основные этапы оценки тестов для молекулярной диагностики урогенитальных инфекций представлены ниже.

Обеспечение качества молекулярной микробиологической диагностики

V +

Контроль качества Оценка качества

4 4 4

Внутренний контроль качества Контроль качества аналитических систем Внешняя оценка качества Внутренняя оценка качества

43- ХЗ-

• Контроль взятия материала • Контроль выделения нуклеиновых кислот • Контроль амплификации • Контроль инги бирования • Контроль контаминации Клиническая оценка тестов перед внедрением в рутинную диагностику; валидация тестов после любой модификации Тестирование контрольных панелей, выпускаемых национальными (ФСВОК) и международными (С} СМ О, ЬаЬдиаИ1у) референтными организациями Периодическое повторное тестирование зашифрованных клинических проб

Основные этапы клинической оценки тестов:

• Выбор обследуемой популяции

• Выбор референтного стандарта

• Определение размера выборки

• Тестирование клинических материалов

• Анализ дискордантных результатов

• Определение аналитической чувствительности (предела детекции)

• Определение аналитической специфичности

• Определение диагностических характеристик (диагностической чувствительности, диагностической специфичности, прогностической значимости положительного и отрицательного результатов)

Рис. 1. Модель обеспечения качества молекулярной диагностики инфекционных заболеваний

Выбор обследуемой популяции. Оценка теста должна установить соответствие его характеристик клиническим задачам. Клинические задачи определяют выбор обследуемой популяции - для оценки теста следует выбирать популяцию, в которой предполагается использовать данный тест. В зависимости от предназначения теста — для скрининга, подтверждения, установления диагноза, контроля излеченности - требования к характеристикам теста будут различаться. Так, скрининговые тесты должны обладать высокой чувствительностью и высокой ПЗОР. Приоритетом при выборе подтверждающего теста должна быть высокая специфичность и высокая ПЗПР. Тесты, предназначенные для установления диагноза, должны обладать как высокой чувствительностью, так и высокой специфичностью. Требования к характеристикам теста также различаются в зависимости от характера

инфекции. Тесты для выявления облигатных патогенов должны обладать максимально высокой аналитической чувствительностью и специфичностью, чтобы обеспечить адекватную клиническую чувствительность и специфичность, тогда как тесты для выявления условно-патогенных микроорганизмов должны выявлять только клинически значимое количество микроорганизма.

Выбор референтного стандарта. Выбор референтного стандарта, по отношению к которому определяются диагностические характеристики оцениваемого теста, имеет критическое значение для валидности результатов оценки. Ввиду высокой чувствительности МАНК адекватным выбором для оценки внедряемых молекулярных тестов могут считаться клинически валидированные молекулярные тесты. Предпочтение следует отдавать коммерческим тестам, которые в высокой степени стандартизированы.

Определение размера выборки. Для расчета необходимого размера выборки нужно знать распространенность возбудителя в обследуемой популяции. Показатель распространенности можно определить в пилотном исследовании или по данным литературы.

Получение и тестирование клинических проб. Клинические пробы следует собирать в транспортную среду, поставляемую/рекомендуемую производителем теста. Для оценки теста следует использовать типы клинического материала, используемые в рутинной практике и указанные в инструкции производителя теста. Порядок взятия проб для тестирования с помощью референтного и оцениваемого тестов необходимо рандомизировать. Для оценки теста допускается использовать архивные образцы, что обеспечивает определенную быстроту и экономичность. Основным недостатком такого подхода является вероятность деградации нуклеиновых кислот при хранении, особенно в пробах с их низкой концентрацией. Для объективной оценки тестирование клинических проб с помощью оцениваемого теста следует проводить вслепую относительно результатов референтного теста.

Анализ дискордантных результатов. Учитывая, что чувствительность и специфичность референтного теста в реальной ситуации не равны 100%, в случае получения дискордантных результатов проводят их анализ. Чаще всего для разрешения дискордантных результатов используют третий тест, который по чувствительности и специфичности сопоставим с референтным тестом.

Определение аналитической чувствительности (предела детекции) теста. Аналитическую чувствительность (предел детекции) тестов на основе МАНК определяют путем тестирования серийных разведений количественных стандартов ДНК, коммерческих или приготовленных из чистой культуры возбудителя. Для более точной оценки рекомендуется тестирование как минимум 20 проб каждого разведения, близкого к пределу детекции. Пределом детекции считают минимальную концентрацию возбудителя, давшую не менее 95% положительных результатов (как минимум 19 из 20 образцов данного разведения).

Определение аналитической специфичности теста. Аналитическую специфичность теста определяют путем тестирования панелей

микроорганизмов, которые могут встречаться в данном биотопе. Определение аналитической специфичности тестов особенно актуально в тех случаях, когда в клинических материалах, применяемых для тестирования, могут содержаться близкородственные виды микроорганизмов.

Определение диагностических характеристик оцениваемого теста. Диагностические характеристики тестов (диагностическую чувствительность, специфичность) определяют с помощью таблицы сопряженности 2x2:

Референтный тест +

Оцениваемый тест + а Ь а+Ь

- с <1 С+(1

а+с Ь+с!

Чувствительность оцениваемого теста представляет собой долю истинно положительных результатов в группе инфицированных пациентов (а/(а+с)). Специфичность - это доля истинно отрицательных результатов в группе неинфицированных пациентов (с!/(Ь+с1)). ПЗПР - это доля истинно положительных результатов среди всех положительных результатов (а/(а+Ь)). ПЗОР — это доля истинно отрицательных результатов среди всех отрицательных результатов (с1/(Ь+с1)). ПЗПР и ПЗОР зависят не только от чувствительности и специфичности теста, но также от распространенности инфекции в данной популяции.

Оценка качества диагностики служит для установления точности результатов исследований, а также меж- и внутрилабораторной воспроизводимости, и включает меры внешней и внутренней оценки качества. Лаборатория должна на регулярной основе участвовать в межлабораторных сравнениях, организуемых системами внешней оценки качества, как национальными, так и международными. К процедурам внешней оценки качества относится тестирование зашифрованных контрольных панелей микроорганизмов. Для адекватной оценки чувствительности используемых тестов для выявления облигатных патогенов в состав панели должны быть включены образцы с предельно низким содержанием возбудителя. При создании контрольных панелей необходимо учитывать генетический полиморфизм циркулирующих штаммов анализируемого инфекционного агента, а также степень гомологии нуклеотидных последовательностей тестируемого и близкородственных ему микроорганизмов. В качестве меры внутренней оценки качества может служить периодическое повторное тестирование зашифрованных клинических проб.

Таким образом, качество молекулярной диагностики урогенитальных инфекций обеспечивается комплексом мер, важнейшей из которых является надлежащая клиническая оценка тестов. Точность результатов исследований, а также сопоставимость результатов, полученных в разных лабораториях, можно обеспечить только при использовании тестов, диагностическая эффективность которых обоснована с позиций доказательной медицины.

26

ВЫВОДЫ

1. Для оцененных отечественных тестов, предназначенных для диагностики гонореи, хламидийной инфекции и трихомониаза, установлена удовлетворительная диагностическая чувствительность в сравнении с референтными тестами (67-100%, 86-100%, 67-100%, соответственно). Чувствительность оцененных тестов для выявления М. genitalium существенно варьирует (0-100%) и уступает чувствительности референтных тестов.

2. Точность оценки диагностической чувствительности тестов подтверждена показателями аналитической чувствительности, определенной с использованием контрольных материалов (1—6, 2-6, 1-5, 5-300 копий на реакцию для N. gonorrhoeae, С. trachomatis, Т. vaginalis, М. genitalium, соответственно).

3. Для всех оцененных отечественных тестов для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, установлена высокая диагностическая специфичность в сравнении с референтными тестами (99-100%).

4. Высокая специфичность тестов для выявления N. gonorrhoeae подтверждена отсутствием ложноположительных результатов при тестировании экстрагенитальных образцов. При оценке аналитической специфичности тестов для выявления М. genitalium для одного теста зарегистрирована перекрестная реактивность с ДНК М. pneumoniae в концентрации >100 копий/мкл.

5. Диагностические параметры оцененного Российского теста для определения клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска соответствуют требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки (чувствительность для выявления цервикальных интраэпителиальных неоплазий высокой степени тяжести — 100%, чувствительность и специфичность по отношению к результатам референтного теста - 89% и 98%, соответственно).

6. Частота выявления нового варианта С. trachomatis в популяции пациентов гинекологических и урологических клиник составляет 0,01%, доля нового варианта по отношению к дикому типу С. trachomatis - 0,4%. Не все отечественные тесты для диагностики хламидийной инфекции могут выявлять новый вариант. В связи с возможностью дальнейшего распространения данного варианта С. trachomatis необходимо использовать тесты, способные его идентифицировать.

7. Тестирование клинических материалов, полученных неинвазивным путем (отделяемое влагалища у женщин, первая порция мочи у женщин и мужчин), при диагностике инфекций, передаваемых половым путем, с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот не уступает в информативности тестированию материалов, полученных инвазивным методом (соскобы эпителиальных клеток цервикального канала у женщин и уретры у мужчин).

8. Микроскопический и культуральный методы диагностики гонореи, являющиеся регламентированными методами диагностики этого заболевания в нашей стране, обладают низкой чувствительностью, особенно при

тестировании клинических материалов от женщин (31% для обоих методов). Микроскопический метод следует использовать только в случаях уретрита у мужчин. Культуральный метод, необходимый для мониторинга антибиотикорезистентности гонококков, требует оптимизации. Необходимо внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот в протоколы диагностики гонореи.

9. Разработана и обоснована структурно-функциональная модель обеспечения аналитического качества молекулярной диагностики инфекционных заболеваний, компоненты которой, действуя совместно, призваны минимизировать риски возникновения лабораторных ошибок на аналитическом этапе диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Клиническим диагностическим лабораториям, применяющим методы амплификации нуклеиновых кислот для диагностики инфекционных заболеваний, рекомендуется использовать разработанную в данном исследовании модель обеспечения аналитического качества при планировании лабораторной системы качества.

2. Все тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики урогенитальных инфекций перед внедрением в рутинную диагностику должны проходить оценку соответствия их характеристик клиническим задачам. В качестве референтных стандартов рекомендуется использовать международные или Российские валидированные тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот.

3. В диагностике гонококковой, хламидийной, трихомонадной инфекций и инфекции, ассоциированной с М. gertitalium, рекомендуется использовать охарактеризованные в данном исследовании тесты с оптимальными диагностическими параметрами.

4. Оцененный тест для выявления клинически значимого количества вируса папилломы человека высокого онкогенного риска отвечает требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки.

5. При диагностике инфекций, передаваемых половым путем, с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот наряду с материалами, полученными инвазивным методом, рекомендуется использовать клинические материалы, полученные неинвазивным путем.

6. В связи с возможностью широкого распространения нового варианта С. trachomatis рекомендуется использовать тесты, способные его выявлять.

7. В связи с низкой чувствительностью микроскопического метода диагностики гонореи его рекомендуется использовать только для установления предварительного диагноза гонореи у мужчин с уретритом. Культуральный метод необходим для определения чувствительности гонококков к антибиотикам, поэтому его следует оптимизировать. Необходимо внедрить валидированные тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот в протоколы диагностики гонореи.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы разработки темы исследования заключаются в дальнейшей стандартизации лабораторной диагностики инфекционных заболеваний: разработке нормативной базы по обеспечению качества лабораторных исследований с применением неколичественных тестов, включая разработку процедур клинической оценки тестов и требований к их аналитическим и диагностическим характеристикам, а также создании референтной системы (референтной лаборатории, референтных методов) для клинико-лабораторных микробиологических исследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах и изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий

1. Шипицына, Е.В. Папилломавирусная инфекция: факторы риска цервикальной неопластической прогрессии / Е.В. Шипицына, К.А. Бабкина, Е.А. Оржесковская, A.M. Савичева // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2004. - Т. LIII, № 3. - С. 38-45.

2. Шипицына, Е.В. Определение вирусной нагрузки и статуса ДНК вируса папилломы человека 16 типа методом ПЦР в реальном времени / Е.В. Шипицына, Е.А. Оржесковская, К.А. Бабкина, A.M. Савичева, Н.А. Микая, О.О. Орлова, И.К. Юркова // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2004. - Т. LIII, № 4. - С. 26-32.

3. Ширшова, Н.Ю. Особенности микрофлоры гениталий у женщин с эндоцервицитом / Н.Ю. Ширшова, Е.В. Шипицына, A.M. Савичева, А.А. Полянин // Ж. акуш. и жен. болезн.

- 2004. - Т. LIII, № 4. - С. 47-52.

4. Шипицына, Е.В. Метод амплификации нуклеиновых кислот NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) и возможности его применения в акушерско-гинекологической практике / Е.В. Шипицына, О.В. Будиловская, A.M. Савичева // Ж. акуш. и жен. болезн. -2005. - T.LIV, № 2. - С. 83-89.

5. Шипицына, Е.В. Применение метода Nucleic Acid Sequence-Based Amplification в реальном времени (NASBA-REAL-TIME) для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции / Е.В. Шипицына, К.А. Бабкина, Е.А. Оржесковская, A.M. Савичева // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2005. - T.LVI, № 4. - С. 17-21.

6. Шипицына, Е.В. Тестирование на вирус папилломы человека в скрининге рака шейки матки / Е.В. Шипицына, Е.А. Золотоверхая, Е.С. Юшманова, A.M. Савичева // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2006. - Т. LV, № 4. - С. 80-86.

7. Шипицына, Е.В. Mycoplasma genitalium как возбудитель инфекций урогенитального тракта: патогенез, клиника, диагностика и лечение / Е.В. Шипицына, A.M. Савичева, А.С. Бенькович, Е.В. Соколовский // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2008. - Т. LVII, № 2. - С. 111-120.

8. Золотоверхая, Е.А. Маркеры папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки / Е.А. Золотоверхая, Е.В. Шипицына, Е.С. Юшманова, A.M. Савичева // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2008. - Т. LVII, № 4. - С. 31-39.

9. Савичева, A.M. Генитальные микоплазмы / А.М. Савичева, Е.В. Шипицына // Врач.

- 2009. - № 1,-С. 9-12.

10. Шипицына, Е.В. Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики трихомониаза / Е.В. Шипицына, Е.А. Золотоверхая, А.Н. Григорьев, О.С. Рыжкова, К.В. Шалепо, О.А. Ломакина, Е.П. Протасова, С.Ю. Романцева, Е.М. Тангатарова, И.В. Литвиненко, Т.С. Смирнова, A.M. Савичева // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2011. - Т. LX, № 3. - С. 73-79.

11. Shalepo, К. Diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia - in-house PCR assays may be effective but overall optimization and quality assurance are urgently needed / K. Shalepo,

A. Savitcheva, E. Shipitsyna, M. Unemo, M. Domeika // APMIS. - 2006. - Vol. 114, № 7-8. -P. 500-507.

12. Shipitsyna, E. Pooling samples: the key to sensitive, specific and cost-effective genetic diagnosis of Chlamydia trachomatis in low-resource countries / E. Shipitsyna, K. Shalepo, A. Savicheva, M. Unemo, M. Domeika // Acta Derm. Venereol. - 2007. - Vol. 87. - P. 140-143.

13. Shipitsyna, E. Comparison of microscopy, culture and in-house PCR and NASBA assays for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia / E. Shipitsyna, A. Guschin, A. Maximova, M. Tseslyuk, A. Savicheva, E. Sokolovsky, G. Shipulin, M. Domeika, M. Unemo // APMIS. -2008.-Vol. 116; №2.-P. 133-138.

14. Shipitsyna, E. Evaluation of six nucleic acid amplification tests (NAATs) used for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia to an international strictly validated real-time porA pseudogene PCR / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, S.O. Hjelmevoll, A. Maximova, A. Savicheva, E. Sokolovsky, V. Skogen, M. Domeika, M. Unemo // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2009. - Vol. 23, № 11. - P. 1246-1253.

15. Shipitsyna, E. First evaluation of polymerase chain reaction (PCR) assays used for diagnosis of Mycoplasma genitalium in Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, B. Dohn, A. Benkovich, A. Savicheva, E. Sokolovsky, J.S. Jensen, M. Domeika, M. Unemo // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2009. - Vol. 23, № 10. - P. 1164-1172.

16. Shipitsyna, E. First evaluation of six nucleic acid amplification tests (NAATs) widely used in the diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, I. Agne-Stadling, A. Krysanova, A. Savicheva, E. Sokolovsky, M. Domeika, M. Unemo // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2009. - Vol. 23, № 3. - P. 268-276.

17. Smelov, V. Chlamydia trachomatis serovar distributions in Russian men and women: a comparison with Dutch serovar distributions / V. Smelov, K.D. Quint, J. Pleijster, P.H. Savelkoul, K. Shalepo, E. Shipitsyna, M. Domeika, A. Gorelov, A. Savicheva, W.G. Quint, H.J. de Vries, S. Ouburg, S.A. Morre // Drugs Today (Bare). - 2009. - Vol. 45, Suppl. B. - P. 33-38.

18. Domeika, M. Guidelines for the laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections in East European countries / M. Domeika, A. Savicheva, E. Sokolovsky, N. Frigo, T. Brilene, A. Hallen, A. Unemo M, R. Ballard, M. Ward, K. Babayan, R. Ismailov, I. Shimanskaya, O. Pankratov, L. Zhurauskaya, O. Kudina, K. Chudomirova, G. Galdava, O. Kvlividze, G. Askarova, A. Karibajeva, D. Yusupova, N. Danilenko, A. Rubins, I. Jacobsone, J. Pirsko, V. Kucinskiene, E. Shipitsyna, A. Ignatovsky, A. Guschin, S. Sidorenko, A. Kasimov, O. Kasimov, G. Mavrov, N. Kochetova, S. Ibragimov, O. Izvekova // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2009. - Vol. 23, № 12. - P. 1353-1356.

19. Shipitsyna, E. Guidelines for the laboratory diagnosis of Mycoplasma genitalium infections in East European countries / E. Shipitsyna, A. Savicheva, E. Solokovskiy, R.C. Ballard, M. Domeika, M. Unemo, J.O. Jensen // Acta Derm. Venereol. - 2010. - Vol. 90, № 5. - P. 461^167.

20. Domeika, M. Guidelines for the laboratory diagnosis of trichomoniasis in East European countries // M. Domeika, L. Zhurauskaya, A. Savicheva, N. Frigo, E. Sokolovsky, A. Hallen, M. Unemo, R. Ballard, K. Babayan, E. Manukian, R. Ismailov, I. Shimanskaya, O. Pankratov, N. Kolomiec, O. Kudina, K. Chudomirova, T. Brilene, G. Galdava, O. Kvivlidze, J. Deak, G. Askarova, A. Utegenova, D. Usupova, E. Al-Kilani, A. Rubins, V. Kucinskiene, E. Shipitsyna, T. Krasnoselskich, A. Guschin, A. Kasimov, O. Kasimov, G. Mavrov, N. Kochetova, G. Bondarenko, S. Ibragimov, O. Izvekova, T. Nabiev // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2010. - Vol. 24, № 10. - P. 1125-1134.

21. Shipitsyna, E. Prevalence of high-risk human papillomavirus types and cervical squamous intraepithelial lesions in women over 30 years of age in St. Petersburg, Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, D. Kuevda, V. Nasonova, T. Romanyuk, A. Khachaturyan, O. Orlova, E. Abashova, I. Kostyuchek, O. Shipulina, A. Anttila, A. Savicheva // Cancer Epidemiol. -2010.-Vol. 35, №2. -P. 160-164.

22. Unemo, M. Recommended antimicrobial treatment of uncomplicated gonorrhoea in 2009 in 11 East European countries: implementation of a Neisseria gonorrhoeae antimicrobial susceptibility programme in this region is crucial / M. Unemo, E. Shipitsyna, M. Domeika // Sex. Transm. Infect. - 2010. - Vol. 86, № 6. - P. 442-444.

23. Unemo, M. Gonorrhoea surveillance, laboratory diagnosis and antimicrobial susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae in 11 countries of the eastern part of the WHO European region / M. Unemo, E. Shipitsyna, M. Domeika // APMIS. - 2011. - Vol. 119, № 9. - P. 643-649.

24. Shipitsyna, E. Evaluation of polymerase chain reaction assays for diagnosis of Trichomonas vaginalis infection in Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, C.Y. Chen, K.H. Chi, A. Grigoryev, A. Savicheva, R. Ballard, M. Domeika, M. Unemo // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2012. - Vol. 27. - P. e217-e223.

25. Tjalma, W.A. Differences in human papillomavirus type distribution in high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer in Europe / W.A. Tjalma, A. Fiander, O. Reich, N. Powell, A.M. Nowakowski, B. Kirschner, R. Koiss, J. O'Leary, E.A. Joura, M. Rosenlund, B. Colau, D. Schledermann, K. Kukk, V. Damaskou, M. Repanti, R. Vladareanu, L. Kolomiets, A. Savicheva, E. Shipitsyna, J. Ordi, A. Molijn, W. Quint, A. Raillard, D. Rosillon, S.C. De Souza, D. Jenkins, K. Holl // Int. J. Cancer. - 2012. - Vol. 132, № 4. - P. 854-867.

26. Shipitsyna, E. First reported case of the Swedish new variant of Chlamydia trachomatis (nvCT) in Eastern Europe (Russia), and evaluation of Russian nucleic acid amplification tests regarding their ability to detect nvCT // E. Shipitsyna, R. Hadad, O. Ryzhkova, A. Savicheva, M. Domeika, M. Unemo // Acta Derm. Venereol. - 2012. -Vol. 92, № 3. - P. 330-331.

27. Shipitsyna, E. Sexual behaviours, knowledge and attitudes regarding safe sex, and prevalence of non-viral sexually transmitted infections among attendees of youth clinics in St. Petersburg, Russia / E. Shipitsyna, T. Krasnoselskikh, E. Zolotoverkhaya, A. Savicheva, P. Krotin, M. Domeika, M. Unemo // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2012. - Vol. 27. - P. e75-e84.

Научные издания, методические руководства

28. Шипицына, Е.В. Факторы риска развития рака шейки матки: интеграция ДНК вируса папилломы человека / Е.В. Шипицына, Е.А. Оржесковская, Н.А. Микая, И.К. Юркова, О.О. Орлова, М.Г. Чхартишвили, Н.К. Селимян, Н.Ю. Ширшова, К.А. Бабкина, A.M. Савичева // Патология шейки матки. Генитальные инфекции. - 2005. - №1. — С. 54—59.

29. Ширшова, Н.Ю. Роль возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, в возникновении цервицита / Н.Ю. Ширшова, Е.В. Шипицына, A.M. Савичева, А.А. Полянин // Патология шейки матки. Генитальные инфекции. - 2005. - №1. - С. 60-64.

30. Шипицына, Е.В. Диагностика папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки / Е.В. Шипицына, Е.А. Золотоверхая, Е.С. Юшманова, A.M. Савичева // Материалы конференции «Охрана репродуктивного здоровья в рамках реализации национального проекта «Здоровье». - Санкт-Петербург, 2007. - Ж. акуш. и жен. болезн. - Т. LVI, спецвыпуск. - С.72—75.

31. Шипицына, Е.В. Научные исследования по оптимизации методов лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем / Е.В. Шипицына, К.В. Шалепо, A.M. Савичева, М. Домейка // Материалы конференции «Охрана репродуктивного здоровья в рамках реализации национального проекта «Здоровье». - Санкт-Петербург, 2007. - Ж. акуш. и жен. болезн. - Т. LVI, спецвыпуск. - С. 32—35.

32. Савичева, А.М. Оптимизация методов диагностики и терапии репродуктивно значимых инфекций / A.M. Савичева, Е.В. Шипицына Н.Е. Воробьева // Материалы конгресса «Новые технологии в акушерстве и гинекологии», посвященного 210-летию НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга РАМН. - Санкт-Петербург, 2007. - Ж. акуш. и жен. болезн. - Т. LVII, спецвыпуск. - С. 87—88.

33. Шипицына, Е.В. Сравнение методов амплификации нуклеиновых кислот, применяемых в России для выявления Neisseria gonorrhoeae / Е.В. Шипицына, Е.А.

Золотоверхая, С. Хьелмеволл, А. Бенькович, А. Крысанова, А. Савичева, Е. Соколовский, В. Скоген, М. Домейка, М. Унемо // Материалы 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2007». - Москва, 2007. - Т. II. - С. 199—201.

34. Гущин, А.Е. Совершенствование диагностики уретрита, вызванного Mycoplasma genitalium, при исследовании первой порции мочи / А.Е. Гущин, Е.В. Шипицына, A.M. Савичева, М. Домейка, Г.А. Шипулин // Материалы 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2007». - Москва, 2007. - Т. II. - С. 289-290.

35. Савичева, A.M. Лабораторная диагностика инфекции, вызванной Neisseria gonorrhoeae. Методические рекомендации / A.M. Савичева, З.М. Мартикайнен, О.В. Будиловская, Е.В. Шипицына, Е.В. Соколовский, Т.С. Смирнова, И.В. Литвиненко, Г.В. Гриненко, Т. Брилене, Д. Дэак, Р. Баллард, К. Айсон, А. Халлен, М. Домейка. - Санкт-Петербург: Н-Л, 2009. - 80 с.

36. Савичева, A.M. Лабораторная диагностика урогенитальной хламидийной инфекции. Методические рекомендации / A.M. Савичева, Е.В. Шипицына, Е.В. Соколовский, М.А. Башмакова, Т.С. Смирнова, А.А. Крысанова, В.В. Назарова, Г.В. Гриненко, А.В. Игнатовский, Т.В. Красносельских, И.В. Литвиненко, Н.В. Фриго, С.В. Сидоренко, Т. Брилене, Р. Баллард, А. Халлен, М. Унемо, М. Ворд, Домейка М. - Санкт-Петербург: Н-Л, 2009. - 56 с.

37. Савичева, A.M. Лабораторная диагностика инфекции, вызванной Mycoplasma genitalium. Методические рекомендации. // A.M. Савичева, Е.В. Шипицына, Е.А. Золотоверхая, М.А. Башмакова, Е.В. Соколовский, В.И. Кисина, Т.С. Смирнова, Г.В. Гриненко, Т.В. Красносельских, А.В. Игнатовский, И.В. Литвиненко, Р. Баллард, А. Халлен, М. Унемо, М. Домейка. - Санкт-Петербург: Н-Л, 2010. - 35 с.

38. Шипицына, Е.В. Эпидемиология инфекций, передаваемых половым путем, среди пациентов молодежных клиник Санкт-Петербурга / Е.В. Шипицына, Т.В. Красносельских, Е.А. Золотоверхая, A.M. Савичева, М. Домейка, М. Унемо // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2010». - Москва, 2010. - Т. III.-Р. 283-287.

39. Куевда, Д.А. Сравнение тестов АмплиСенс ВОТ ВКР скрин титр FL и Hybrid Capture 2 для выявления вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, Е.В. Шипицына, A.M. Савичева, Г.А. Шипулин // Материалы 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2010». -2010. - Москва, 2010. - Т. III. - С. 376-379.

40. Савичева, A.M. Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза. Методические рекомендации / A.M. Савичева, Т.В. Красносельских, Е.В. Соколовский, В.И. Кисина, Т.С. Смирнова, М.А. Башмакова, З.М. Мартикайнен, А.Н. Григорьев, Е.В. Рыбина, Е.В. Шипицына, С.Л. Зациорская, Л. Журавская, Г.В. Гриненко, А.В. Игнатовский, И.В. Литвиненко, Р. Баллард, А. Халлен, М. Унемо, М. Домейка. - Санкт-Петербург: Н-Л, 2011. — 36 с.

41. Сухих, Г.Т. Профилактика рака шейки матки. Руководство для врачей / Г.Т. Сухих, В.Н. Прилепская, Т.Н. Бебнева, М.Г. Галицкая, Н.В. Зароченцева, В.П. Козаченко, Л.А. Коломиец, М.Н. Костава, В.И. Краснопольский, Д.А. Куевда, Р.Я. Мешкова, Г.Н. Минкина, Л.С. Намазова-Баранова, Н.М. Подзолкова, С.И. Роговская, A.M. Савичева, В.К. Таточенко, А.Ф. Урманчеева, С.М. Харит, И.П. Шабалова, И.Л. Шаханина, Е.В. Шипицына, О.Ю. Шипулина. - Москва: МЕДпресс-информ, 2012.-192 с.

42. Домейка, М. Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта / М. Домейка, A.M. Савичева, Е.В. Соколовский, Р. Баллард, М. Унемо, М. Ворд, К. Айсон, Й. Сков-Иенсен, Е.В. Шипицына, Т. Брилене, Т. Красносельских. - Санкт-Петербург: Н-Л, 2012.-288 с.

43. Shipitsyna, Е. Comparison of microscopy, culture and polymerase chain reaction used for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in St. Petersburg, Russia / E. Shipitsyna, Z. Martikainen, A. Kirpicheva, M. Unemo, A. Savicheva, S. Sahartseva, I. Afonona, E. Sokolovsky,

M. Domeika // Proceedings of the 22nd IUSTI-Europe Conference on STI's. - Versailles, France, 2006. - Int. J. STD/AIDS. - Vol. 17, Suppl. 1. - P. 35.

44. Shipitsyna, E. Type-specific persistence of high-risk human papillomavirus DNA as a factor of cervical neoplastic progression I E. Shipitsyna, E. Orzheskovskaya, E. Yushmanova, A. Savicheva // Proceedings of the 6th International Multidisciplinaiy Congress Eurogen. - Paris, France, 2006. - P. 137.

45. Shipitsyna, E. Evaluation of nucleic acid amplification tests (NAATS) for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia / E. Shipitsyna, M.Unemo, A. Guschin, A. Maximova, P. Ryzhikh, A. Savicheva, E. Sokolovsky, M. Domeika // Proceedings of the 17th ISSTDR and 10lb IUSTI World congress. - Seattle, USA, 2007. - P. 184-185.

46. Shipitsyna, E. Evaluation of PCR assays for diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, I. Agne-Stadling, A. Krysanova, A. Benkovich, A. Savicheva, E. Sokolovsky, M. Unemo, M. Domeika // Proceedings of the 23rd IUSTI-EUROPE Conference on STI's and HIV/AIDS. - Cavtat/Dubrovnik, Croatia, 2007. - P. 98.

47. Guschin, A. Development and clinical evaluation of a new real-time NASBA assay for the diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infection / A. Guschin, E. Shipitsyna, P. Ryzhikh, A. Krysanova, G. Shipulin, N. Vorobyova, A. Savicheva, M. Domeika // Proceedings of the 6th meeting of Europe Society for Chlamydia research. - Arhus, Denmark, 2008. - P. 213—214.

48. Shipitsyna, E. Evaluation of five PCR assays used for diagnosis of Mycoplasma genitalium in Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, A. Krysanova, A. Benkovich, B. Dohn, A. Savicheva, E. Sokolovsky, J. Jensen, M. Domeika, M. Unemo // Proceedings of the 24th IUSTI-Europe Conference on STI and HIV/AIDs. - Milan, Italy, 2008. - P. 70.

49. Shipitsyna, E. Evaluation of six nucleic acid amplification tests (NAATs) used for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia to an internationally validated real-time pork. pseudogene PCR / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya, S.O. Hjelmevoll, A. Benkovich, A. Krysanova, A. Savicheva, E. Sokolovsky, V. Skogen, M. Domeika, M. Unemo // Proceedings of the 24 IUSTI-Europe Conference on STI and HIV/AIDs. - Milan, Italy, 2008. - P. 69.

50. Zolotoverkhaya, E. Epidemiology of high-risk human papillomavirus infections and associated cervical lesions in women over 30 years of age in St. Petersburg, Russia / E. Zolotoverkhaya, E. Shipitsyna, D. Kuevda, O. Shipulina, I. Kostyuchek, A. Savicheva // Proceedings of the 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. -Vienna, Austria, 2010. - Clin. Microbiol. Infect. - Vol. 16, Suppl. 2. - P. S327.

51. Savicheva, A. First quality validation of diagnostic system for STIs produced in Eastern Europe using internationally acknowledged standards / A. Savicheva, E. Shipitsyna, M. Domeika, M. Unemo // Proceedings of the 25th IUSTI-Europe conference. - Tbilisi, Georgia, 2010. -P. 28.

52. Shipitsyna, E. Prevalence and predictors of genital Chlamydia trachomatis infection among attenders of youth centres in St. Petersburg, Russia / E. Shipitsyna T. Krasnoselskikh, E. Zolotoverkhaya, A. Savicheva, E. Sokolovsky, M. Domeika, M. Unemo. // Proceedings of the 12th International Symposium on Human Chlamydial Infections. - Salzburg, Austria, 2010. - P. 421— 424.

Подписано в печать 27.06.13 Формат 60х84,Л6 Цифровая Печ. л. 1.5 Тираж 100 Заказ 02/07 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)