Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оксидантно-антиоксидантная система и секреция гистамина при иммунологической и неиммунологической активации тучных клеток

, О ^ п Л''

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИМЛ1Унологии

На правах рукописи ЦЫНКАЛОВСКИИ Олег Ростиславович

ОКСИДАНТНАЯ-АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА И СЕКРЕЦИЯ ГИСТАМИНА ПРИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ И НЕИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК

14.00.36. — Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1990

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор И. С. Гущин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Л. Г. Коркина; доктор медицинских наук профессор А. А. Польнер.

Ведущая организация: Московский иаучно-иоследователь-

екмй институт вакцин и сыворотоь здм. И. И. Мечникова АМН СССР

Защита состоится «............»......................................................1990 г. г

........................ час. на заседании специализированного советг

Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корт. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти ту та иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан «............».......................................... 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

А. В. Колобо!

/ 1.

,4 I

"j ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Усиленное внимание к свободным радикалам (CP), не ослабевающее i течение последних трех десятилетий, обусловлено тем, что данные ;оединения вследствие своего строения (наличия одного или более не-¡паренных электронов на внешних орбиталях) обладают высокой реакци-)нной способностью. CP ыогут легко окислять (или восстанавливать) (ругие молекулы, инактивировать Ферменты, вызывать повреждения ДНК, ¡нициироровать перекисное окисление мембранных липидов, приводящее : изменению проницаемости мембраны и гибели клетки (Владимиров и юавт., 1975; Меерсон $.3. и соавт., 1979; Fridovich, 1976; Freeman, гаро, 1982; Birnbolm et al., 1985; Lunec et al., 1985; Esterbauer-, 986; Wolf et al., 1986; и др.). Во многих областях медицины и иологии процессы с участием CP исследованы достаточно подробно, но молекулярной аллергологии проделано небольшое число исследований, видетельствующих о вовлечении CP в аллергические реакции.

В частности, имеющиеся данные показывают, что процессы с уча-тием CP протекают в клетках-шшенях аллергии: эти клетки способны енерировать супероксидный радикал (Henderson, Kaliner, 1978; sleepan, Stechschulte, 1986); параллельно с высвобождением гиста-ша накапливают продукты пероксидации в присутствии систем, гене-Фующих активные производные кислорода (Januszkievicz et al., 386). В гранулах тучных клеток (ТК) присутствует антиоксидантный грмент супероксид дисмутаза - СОД (Henderson, Kaliner, 1978; ileepan, Stechschulte, 1986).

В ряде работ изучалась способность экзогенных CP активировать гетки-мишени. аллергии. Этими исследованиями продемонстрировано,

что СР, образуемые экзогенно на различных клеточных и бесклеточных системах, инициируют избирательное высвобождение гистамина из ТК, угнетаемое антиоксвдантными соединениями (Qhmori et al., 1979; Stendahl et al., 1983; Fantozzi et al., 1986; Masini et al., 1986; Manmioni et al., 1988).

Выявлена способность антиоксиданта дифенилбензохинона ингибиро-вать высвобождение гистамина из активированных ТК (Гущин И.С. и со-авт., 1987). Имеются сведения, что СР способствуют развитию повреждения при аллергическом процессе (Meitzer et al., 1986, Cluzel et al., 1987).

Перечисленные факты свидетельствуют о связи процессов перокси-дации и секреции медиаторов активированными клетками-мишеняш, однако не являются доказательством участия эндогенно образуемых в ТК СР в секреции гисташша этими клетками. Оксидантная-антиоксидантная система ТК до настоящего времени не изучалась ни в общих чертах, ни в связи с процессами активации клеток-мишеней аллергии и секреции ими медиаторов.

Универсальность процессов перекисного окисления, протекающих и в клетках-мишенях аллергии, наличие данных.о значении экзогенно генерируемых СР для активации ТК и высвобождения из них медиаторов, с одной стороны, и отсутствие каких-либо сведений о роли эндогенных СР в этих процессах, с другой, обосновывают необходимость проведения специальных исследований для получения знаний о реальных взаимоотношениях процессов пероксидацш в ТК.и высвобождения медиаторов из этих клеток. Полученные данные могут быть использованы при подборе Фармакологических препаратов, тормозящих процессы генерации СР и секреции гисташша ТК. ' •

Для полного отражения событий, протекающих в клерках при свободно-радикальном окислении, необходимо.учитывать обе, находящиеся

во взаимосвязи и сбалансированные в норке, стороны данного процесса - образование СР и их метаболизм, с одной стороны, и нейтрализацию появляющихся радикалов и продуктов их метаболизма, с другой. То есть, следует оценивать, как процесс пероксидации. Ферментативной и неферментативной, так и активность многокомпонентных антиоксидант-ных систем, защищающих клетки от последствий пероксидации. Кроме того, для получения адекватного представления о взаимоотношениях процессов пероксидации и секреции медиаторов ТК является необходимым проведение исследований кинетики показателей оксидантной-анти-оксидантной системы параллельно с определением кинетики процесс^ секреции гистаыина, вызванной различными избирательными высвободи-телями.

Цель исследования:

изучить взаимоотношения процессов свободно-радикального окисления и секреции гистамина при активации ТК для понимания механизмов аллергических реакций немедленного типа. Задачи:

1) разработать модель экспериментов для определения базального уровня показателей системы СР в очищенной взвеси 1К, а также кинетики этих показателей в процессе высвобождения гистамина при активации ГК;

2) определить кинетику показателей оксидантной-антиоксидантной си-зтемы параллельно с кинетикой секреции гистамина при действии на ТК яммунологического (специфического аллергена) и неиммунологических зецепторных (вещества 48/80, полимиксина В1) и нерецепторного

[А 2318?) избирательных активаторов;

5) выяснить значение изменений Ферментативной и неферментативной

пероксидации при активации ТК для процесса секреции ими гистамина;

4) установить значение изменений активности антиоксид антных Ферментов при активации ТК для секреции гистамина этими клетками;

5) определить действие серии известных соединений, стабилизирующих ТК, на реакцию оксидантной-антиоксидантной системы этих клеток;

6) изучить связь между выделением кислородных свободных радикалов и секрецией гистамина активированными ТК.

Научная новизна.

Впервые определен базальный уровень показателей оксидантной-антиоксидантной системы ТК.

Впервые проведена одновременная оценка кинетики этих показателей и секреции гистамина при активации ТК различными избирательными высвободителями.

Установлено, что реакция оксидантной-антиоксидантной системы ТК и процесс секреции гистамина, вероятно, не зависят друг от друга и непосредственно не связаны между собой.

Практическая значимость.

Впервые разработан и осуществлен методический подход для комплексной оценки базальяого уровня показателей оксидантной-антиоксидантной системы.и одновременного определения кинетики этих показателей в процессе секреции гистамина при. активации ТК; изучены взаимоотношения процессов перекисного окисления и высвобождения медиаторов при активации ТК различными избирательными высвободителями и при торможении активации клеток. '

Впервые выявлены антиаллергические свойства у известного ингибитора супероксид дисмутазы диэтопдитиокарбамата натрия.

Теоретически обоснована необходимость использования для купиро-

вания аллергических процессов полифункциональных стабилизаторов ТК, которые имеют точками приложения своего действия разные звенья процесса активации клеток-мишеней аллергии, включающие не только секрецию медиаторов аллергии, но и пероксидацгао в клетках.. Публикация результатов исследования и апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 4 работы, 1 статья принята в печать. Материалы работы докладывались на конференциях молодых ученых Института иммунологии Минздрава СССР (Москва, 1988 и 1989), га семинаре молодых ученых Института иммунологии Минздрава СССР, зуководимом проф. А.А.Ярилиным (Москва, 1989), на Первом всесоюзном зъезде иммунологов (Сочи, 1989), на 17-ой конференции Европейского )бщества исследователей гистамина (Нидерланды, Бреда, 1989). Основ-ше положения диссертации доложены и обсуждены на ыежлабораторной • сонФеренции Института иммунологии Минздрава СССР (август, 1990).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста; со-:тоит из "введения, обзора литературы (2 главы), материалов и. методе, собственных исследований (7 глав)заключения и выводов; со-ержит 5 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 122 исто-ника, из которых 99 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 530 крысах самцах Ы1згаг, массой 250-350 г, злученных из питомника "Столбовая" АМН СССР.

В отдельных опытах крыс самцов массой 100-150 г, сенси-

«шзировали аллергеном овальбумином - ОА (40 мкг/ыл) в смеси с

- 6. коклюшной вакциной (40 млрд. микробных тел/мл) однократным подкожным введением в область шеи в 0.5 мл Физиологического раствора (Mota, 1964; Jasanl, Stanvorth, 1979). ТК выделяли на 14-21 день после сенсибилизирующей.инъекции. В одном опыте использовали не менее 4 животных.

ТК выделяли на градиенте плотности фиколла из грудной и брюшной полостей крыс по методу, описанному ранее в работах Uvnas В., 1966.

Концентрированную клеточную взвесь клеток (4.5 - 6 млн кл./мл) инкубировали в тестируемых условиях, затем реакцию останавливали 5-кратным разведением клеточной взвеси охлажденной (+4"С) средой и перенесением пробирок на лед. Из одной и той же порции клеток использовали 20 мкл клеточной взвеси для определения высвобождения гистамина, а остальной объем для оценки других исследованных показателей. Все испытания проведены в дубликатах.

Содержание гистамина определяли раздельно в осадочных и над-осадочных порциях после конденсации с ортофталевьш альдегидом спек-трофлуориметрическим методом (Shore et al., 1959).

Супероксид дисмутазную активность исследовали методом, описанным Nishikimi et al., 1972, в модификации Fried, 1975.

Активность глутатион редуктазы (ГР) оценивали по методу Hosoda, Nakaaura, 1970.

Активность глутатион пероксидазы (ГП) определяли методом, описанным Pàglia, Valentine, 1967, в модификации Maral et al., 1977.

Неферментативную пероксидацию:оценивали по накоплению в'клетках малонового диальдегида - ВДА (Стальная И.Д., Гариивили Т.Г., 1977, модификация Tien; Aust, 1982).

Ферментативную пероксидацию определяли по изменению-липоксиге-назной активности - ЛО (Стальная И.Д., Í977, модификация Hagaishi, Shimizu, 1982). '

Высвобождение кислородных радикалов из ТК оценивали по реакции люминол-зависимой хемилшинесценции - ХЛ (Hastings et al., 1983), регистрируемой на люминометре LKB Wallac 1251, Швеция. Уровень ХЛ оценивался в мВ/10в кл.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятым методом с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первые опыты были посвящены разработке модели экспериментов, включающей определение базального уровня показателей оксидантной-антиоксидантной системы, а также кинетики всех исследованных показателей в активированных ТК. После выбора концентрации ТК (4-5 млн. слеток/мл), достаточной для оценки исследованных показателей, и оп-гимальных временных интервалов для изучения кинетики этих показателя, был определен базальный уровень пероксидации и активности ан-дгоксидантных Ферментов.

Для выяснения особенностей реакции системы CP при активации ТК гспользовали различные избирательные высвободители. Из рецелтор-мх иммунологических активаторов ТК использовали специфический ал-;ерген OA, активирующий сенсибилизированные ТК через высокоафинные сс-рецепторы (Kulezycki et al., 1979; Ishizaka et. al., 1984), из еиммунологических - вещество 48/80 и полишксин Б1, взаимодейству-щие с одинаковыми мембранными рецепторами ТК (Hino et.al., 1977; ead, Kiefer, 1983). В качестве нерецепторного активатора ТК приме-яли кальциевый ионофор А 23187.

Как свидетельствуют результаты проведенных экспериментов, любой ариант активации ТК вызывал значительную стимуляцию пероксидации рис.1). Совпадая или незначительно запаздывая по отношению к сек-

Рис.1, кинетика изменений ЛО (I), МДА (2), СОД (З), ГП (4)' и "ГР (5) в ходе секреций гистамина (6) ТК, вызванной ОА • (а).полиниксин Б1 _(б) и ионофором А 23187 (в). По оси абсиисс: время инкубации с высвободителем_ в сек. . По оси ординат: верхний ряд ,т изменение исследованных показателей в процентах по отношению к исходным;' нижний ряд - высвобождения гиста-мина (в %). -

ТК сенсибилизированных крыс инкубировали при 37,разное время с ОА (20 ыкг/ыл) - (а), ТК интактных крыс инкубировали при 17°С разное время с полимиксином Б1 (5 икЮ - (б) или с ионофором А 23187 (1мкМ) - (в).

Реакцию останавливали добавлением I ил среды и перенесением • пробирок на лед. -'

(а): исходный уровень активности ЛО - 0.09 Е2ззни/30мин/106кл.; МДА - 0.119 мкМ/Ю6юи; СОД - 0.37 ед/мг белка; ГР - 4.87 мкМ . . в^б/ит/ит белка; ГП - 32.3 мкМ Мй^/мин/иг/белка.

(б): исходный уровень• активности ЛО - 0.085' Е2ззнм/30мин/Ю®кл.; МДА - 0.97 ыкМ/К^кл.; СОД - 0.37 ед/ыг белка; ГР - 4.2 мкМ . ¿^¿Умин/мг белка; ГП - 34 мкМ МММ /ыин/нг белка. .

(в): исходный уровень активности ЛО - 0.096 ?2ззнм/30мин/10^кл.; МДА - 0.103 мкМ/Ю6кл.; СОД - 0.46 ед/мг белка;' ГР - 4.4 мкМ Л-С/ыин/мг/белка; ГП - 36.6 мкй.^/¡¿М'/цин/ыг/белка. '

На каждом графике приведены результаты Ь-из З --,5 экспериментов. '■

реции гистамина, интенсивно увеличивалась ЛО-активность (Ферментативная пероксидация), следом за ней менее интенсивно нарастало накопление МДА (неферментативная пероксидация). Изменения активности антиоксидантных Ферментов различались в зависимости от рецепторной или нерецепторной стимуляции ТК. Рецепторные, как иммунологические, так и неиммунологические, высвободители вызывали сходные изменения активности антиоксидантных ферментов в процессе секреции гистамина (рис.1 а и б). В первые секунды после воздействия активаторов этой группы происходило значительное снижение СОД-активности, а затем менее выраженное ГР- и ГП-активности. Восстановление активности СОД совпадало с нарастанием секреция гистамина. Вслед за увеличением Х»Д-активности восстанавливалась активность ГР и за ней ГП. Изменения активности антиоксидантных Ферментов преобретали другой характер при активации ТК ионоФором А 23187 (рис.1 в): СОД-активность ■ медленно повышалась, а активность. Ферментов глутатионового цикла юнотонно снижалась) *

Выявленные различия, в изменении активности антиоксидантных Фер-(ентов в зависимости от вида активатора позволили связать ранние вменения активности СОД, ГР и ГП, выявляемые при действии рецеп-юрных высвоводителей, с начальными этапами мембранной перестройки, :ак следствие взаимодействия лиганд-рецептор.

В первые секунды после воздействия любого из рецепторных высво-юдителей на ТК четко проявлялся этап резкого снижения активности ОД. Данный фермент отвечает за нейтрализацию супероксида, и паде-ие активности СОД должно привести к накоплению этого кислородного адикала. Эти соображения и выявленное в наших опытах снижение СОД-ктивности, предшествовавшее началу секреции гистамина, позволили показать предположение, что при действии на ТК рецепторных высво-одителей накопление супероксида может явиться инициирующим событи-

ем для высвобождения медиатора. Для проверки такого предположения необходимо было изучить влияние блокады СОД на изменение.других показателей пероксидации и секрецию гистамина.

Для блокады СОД (Cu-зависимого Фермента) использовали ингибитор Фермента диэтилдитиокарбамат натрия (ДЦК), являющийся хелатором металлов, в частности меди (Lengfelder, 1979; Непох, 1982; Lo, 1982; Yu, Wal, 1984; Weiss et al., 1985).

Уже в предварительных опытах обнаружилось, что ДЦК не только не усиливает, но, напротив, тормозит, в зависимости от концентрации, вызванную веществом 48/80 секрецию гистамина ТК.

После выбора концентраций, в которых ДЦК ингибировал высвобождение медиатора, и оптимального интервала времени инкубации ТК с препаратом, исследовали его влияние на показатели пероксидации и активность антиоксидантных Ферментов в процессе секреции гистамина, вызванной веществом 48/80 или OA (рис.2). ДЦК полностью тормозил СОД, препятствовал изменению- ее активности при действии на ТК вы-свободителей и, в то же время, значительно снижал секрецию гистамина. Поскольку препарат, блокирующий СОД,-не только не усиливал секреции гистамина, но значительно ее тормозил, можно было исключить предположение об инициирующей роли супероксида для высвобождения медиаторов (Gushchin et al., 1990).

Особый интерес, на наш взгляд, представляло влияние ДЦК на разные виды пероксидации: параллельно со снижением секреции гистамина происходило торможение нарастания ЛО-активности, в.то время как накопления в ТК ВДА, напротив, увеличивалось. Этот Факт представляется нам особенно важным, так как* указывает на то, что нарастание неФерментативной пероксидации не имеет отношения к усилению и поддер-жз-чпо секреции гистамина.

Механизм ингибирующего эффекта ДЦК на высвобождение медиаторов

Рис.2. Влияние ДДК на кинетику изменений Ж) (I), НДА (2), СОД (3)* ГП (4) и ГР (5) в ходе секреции гистамина (6) при активации ТК, вызванной специфическим ал-- лергенои (ОА). '»означения по о сяи-координат аналогичны обозначениям на рис.5. I сенсибилизированных"крыс преинкуСировали 15 мин при 37°С в-■сутствии (а) или в присутствии (О) Ю~4М диэтилдитиокарба-1та, затем активировали специфическим антигеном ОА (20 ыкг/ыл). ¡акиию останавливали, как описано в подписи к рис.5, ходный уровень активности ЛО - 0.083 Е2ззнм73°мчн/106кл.; А - 0.127 мкМ/'106кл.; СОД - 0.11 ед/мг белка;.ГП -25.3.мкМ ьщ/нин/мг белка; ГР - 3.87 мкМ ¿^¿г/мин/иг белка, иведены результаты -I из 5 экспериментов.

из активированных ТК может быть связан, с влиянием, препарата на пул пероксида водорода. ДДК ингибирует СОД и препятствует Ферментативному превращению супероксида в пероксид и накоплению пероксида, способного, по данным литературы, вызывать избирательное высвобождение гистамина из ТК (ОЪтог! ег а1., 1979). Обращает на себя внимание также гот Факт, что ДДК, помимо ингибиции секреции гистамина, вызываемого рецепторными высвободителями, полностью тормозит секрецию гистамина, вызванную ионофором А 23187. Это позволяет предположить, что ингибирующий эффект ДДК на высвобождение медиаторов, вызванное веществом 48/80 и ОА, не связан с действием препарата на рецепторные структуры.

Итак, было установлено, что активация ТК проявляется в усилении процессов перекисного окисления и изменении активности антиоксидан-тных Ферментов; рецепторные высвободители вызывают аналогичные по характеру изменения активности антиоксидантных Ферментов, но при этом вероятное накопление супероксида не играет инициирующую роль для секреции гистамина. Кроме того, удалось выяснить, что изменения неферментативной пероксидации, по-видимому, не связаны с высвобождением медиаторов. Однако, оставался нерешенным вопрос, имеют ли значение для секреции гистамина изменения антиоксидантной системы и связан ли процесс высвобождения гистамина с ферментативной перокси-дацией.

\ •

Для ответа на этот вопрос оценивали действие различных ингибиторов секреции гистамина на показатели оксидантной-антиоксидантной системы. Учитывая параллельность, с одной стороны, нарастания секреции гистамина и 310-активности при любом варианте активации ТК, а, с другой,. - торможения обоих показателей при обработке ТК ДДК, пгчдставляЛо интерес оценить влияние на все исследуемые показатели известных неспецифических ингибиторов липокеигеназ кверцетинов - КЦ

(Ретге11, СотреПБ, 1977; М1<Шеи>п вt а!., 1981). Выли использованы концентрации, в которых препарат тормозил высвобождение гиста-мина из активированных веществом 48/80 ТК. КЦ не оказывали заметного влияния на изменение активности антиоксидантных Ферментов, вызываемое рецепторными иммунологическим или неиммунологическим высво-бодителями, однако заметно снижали уровень пераксидаций в ТК и тор. мозили*нарастание пероксидации и секрецию гистамина при активации клеток.

Полностью тормозило пероксидацига и высвобождение гистамина при иммунологической или неиммунологической активации ТК и производное теофиллина вещество ОФ 4472, являющееся стабилизатором клеток-мше-

ней (Гущин И.С. и соавт., 1987). Как и КЦ, этот препарат не влиял

■ <

на изменение ферментов глутатионового цикла. ОФ 4472 вмешивался в определение активности СОД, поэтому на удалось изучить влияние препарата на изменение активности данного Фермента в активированных ТК.

Следовательно, оба использованные соединения, значительно тормозящие или полностью блокирующие секрецию гистамина из активированных ТК, не затрагивали изменения активности ГР и ГЛ. Это дало' основание сделать вывод о том, что колебания активности этих Ферментов не имеют значения для высвобождения гистамина из ТК.

Анализ действия на оксвдантную-антиоксидантнуи систему ТК различных избирательных высвободателей показал, что усиление ЛО-актив-ности совпадало или незначительно запаздывало по отношению к нарастанию секреции медиатора и достигало самых высоких уровней, когда высвобождение гистамина было, максимальным. В то же время, при действии на ТК любых ингибиторов секреции гистамина происходило также и торможение Ферментативной пероксидации. Оставалось неясным, зависит ли высвобождение медиатора от. изменения -пероксидации, или эти процессы параллельны и не связаны между собой. Необходимо .было вы-

яснить, макет ли произойти разобщение указанных процессов.

Учитывая, что снижение температуры замедляет скорость энергозависимого процесса секреции, в частности секреции гистамина из ТК (Johnson, Могап, 1970), представляло интерес изучить изменение показателей оксидантной-антиоксидантной системы параллельно с высвобождением гистамина в зависимости от температуры инкубации клеток с веществом 48/80.

При понижении температуры среды инкубации ТК с веществом 48/80 от 27еС до 16°С значительно снижалось высвобождение гистамина и изменялся характер нарастания секреции: если при 27°С кривая секреции гистамина уже к 15 с достигала "плато", го при 16е С она принимала линейный характер (рис.3). Вместе с тем, снижение температуры инкубации существенно не отражалось на характере изменений показателей оксидантной-антиоксидантной системы; можно отметить лишь' более интенсивное нарастание пероксидации при 2?°С по сравнении с увели- • чением этого показателя при 16°С. То, что снижение секреции гистамина при уменьшении температуры инкубационной среды не сопровождалось изменением показателей активности антиоксвдангных систем, под-' твердило предположение об отсутствии взаимосвязи между изменением активности антиоксидантных ферментов и высвобождением медиаторов из ТК. В то же время, выявление меньией зависимости от температуры Ферментативной пероксидации, чем секреции медиатора, позволило предположить, что эти процессы не связаны между собой..

Учитывая сведения литературы о высвобождении супероксидного радикала из активированных клеток-мишеней аллергии (Henderson, Kaliner, 1978; Deleepan, Stechschulte, 1986), представляло интерес . выяснить, происходит ли данный процесс в нашей системе, и связан ли он с секрецией гистамина. С этой целью оценивалась лшинол-зависи-мая ХЛ параллельно с высвобождением гистамина при активации ТК веществом 48/80 или латексом (широко используемым стимулятором люми-

О 5 .13

Рис.3« Кинетика изменений-Л0С1)„ ВДА (2), СОД (3), ГП.(4) и ГР (5)- в .ходе секреции гистамина при активации ТК веществом 48/80 при разных температурных режимах. . Обозначения по осям аналогичны представленным на рис.5. . ?К инкубировали при 16°С (а) ит при 27°С Сб) разные интервалы времени с веществом 48/80 (I мкг/мл). Реакцию.останавливали, как • описано в подписи к рис.5. Исходный уровень активности: .

(а): ЛО - 0.049 Е233нм /30мин/106кл.; ВДА,- 0.078-шШ/106кл.; -СОД - 0.69 ед/мг "белка; ГР - 8.4 мкМ"<Г5^/мин/мг белка; ГП - 71.7, мкМ ^АУ/мш/мг. бэлка.

(б): ЛО •-. 0.058 Е2ззнм/30мин/106кл.; МДА - 0.08Ь мкМ/Юькл.; СОД - 0.71 ед/мг белка; ГР - 7.5 мкМ <?Л"<Г/мин/мг белка; ГП -70;7 мкМ ЛЯл^/мин/мг белка.

Приведены результаты I из 4 экспериментов-.

несценции).

Стимуляция ТК веществом 48/80 проявлялась более чем двукратным приростом ХП, соответствовавним достаточно высокому высвобождению гистамина. Предварительная инкубация ТК с СОД значительно снижала прирост ХЛ, вызываемый веществом 48/80, не уменьшая при этом высвобождения медиатора (рис.4). При добавлении к ТК латекса также выявлялся высокий прирост ХЛ, однако секреции гистамина при этом не наблюдалось (рис.5). Полученные результаты свидертельствуга о том, что активация ТК веществом 48/80 вызывает параллельно с секрецией гистамина образование и выделение активных производных кислорода. Однако, как показали опыты с латексом и СОД, генерация кислородных радикалов ТК не всегда сопровождается высвобождением медиатора, а торможение прироста ХЛ может не отражаться на секреции гистамина.

Указанные исследования позволили сделать заключение о том, что выделение активных Форм кислорода стимулированными ТК не связано с ■ инициацией высвобождения из них гистамина. Однако, учитывая данные литературы (Henderson, Kaliner, 1978; Deleepan, Stechschulte, 1986), а также полученные нами данные о высвобождении кислородных радикалов при активации ТК, необходимо было проверить, не могут ли эти радикалы усиливать секрецию медиатора. С этой целью в серии экспериментов исследовали влияние известных ловушек CP (ферментов СОД и каталазы, D-маннитола) на иымунологически и неиммунологически индуцируемую секрецию гистамина ТК. Ловушки использовались в концентрациях, в которых проявлялось их антиоксидантное действие и в которых,- по данным литературы, эти соединения тормозили секрецию гистамина ТК, вызванную экзогенно генерируемыми на различных системах СР.

В наших опытах при иммунологической или неиммунологической активации ТК использованные ловушки ни в одной из концентраций статистически достоверного торможения секреции гистамина не вызывали.

З.в

I $ 2,0

1

2

1 1'6

I К 1,2

о - г • -2 о -3 ♦ -4

/

,0-0-0

/

2—

I /и--"-

. I__I. ..-,1

I, I_!___!_I-

_1_I

3

12

мин.

аб 62

т 70

60

50 I

ио й В

30 |

! 20 "8

СО у

■о 10 00

Рис.4- Влияние СОД на хемилюмйнесиениию и секрецию гистами-^ на ТК, вызванную веществом 48/80. .'

, По оси абсцисс - время'записи хемилюминесиениии в мин. По оси ординат: хемилюминесиениия в ыВ (слева),, высвобождение гистамина в процентах (справа). Стрелкой обозначен момент добавления вещества 48/80.

ТК преинкубировали в отсутствие (I и 3; а и в) или присутствии (2 и 4; о и г) СОД (25 мкг/мл). Через 6 мин после начала записи хемилюминесиениии добавлено вещество 48/80 в. концентрации I мкг/ мл (3 и 4; в-и г).

Показатели высвобождения гистамина (а, б, в, г) определялись' на . 14-ой нин от начала регистрации хемилюминесиениии. • Приведены результаты-I из 4 экспериментов.

ZB

со

5 2.4

§

£ 1 te

|

1 1,2

5

3 48

о -т • -2

■9

/

I •

i-1—i—i_i_i_i_i_1.1,1_i, ...i.

0 3 6 9 12

■ i.....i_i

15 мин.

ш

аб

60 ^ 50 I

I

40 В

50 1 I 20 3

У

• Рис..5. Показатели хемилюминесиениии и секреции гистамина при действии на ТК латекса. По оси абсцесс - время записи хемилюминесиениии в мин. По оси ординат: хемилюминесиениия в мВ (слева), высвоболдение гистамина в процентах (справа). Стрелкой обозначен момент добавления латекса.

К ТК (2, б) через 6 мин после начала записи хемилюминесиениии добавлен латекс (0.1%).

Показатели высвобоадения гистаиина (а, б, в, г) определялись на 14-ой мин от начала регистрации хемилюминесиениии. Приведены результаты I из 4 экспериментов.

Можно предположить, что при таком варианте активации ТК либо образуемых радикалов недостаточно для поддержания секреции гистамина, либо они быстро обезвреживаются антиоксвдантныш системами. Однако, в любом случае, можно сделать заключение, что при активации ТК избирательными высвободителями CP не усиливают высвобождение медиатора.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что активация ТК сопровождается реакцией оксидантной-йнтиоксвдантной системы, ie связанной с процессом секреции гистамина. Полученные результаты необходимо учитывать при выборе Фармакологического контроля аллергического процесса. То, что CP участвуют в патогенезе аллергических эеакций {(Johnson et.al., 1981; Weiss» Mulllck, 1985; Cluzel et.al., L987) и могут выделяться активированными клетками-мишенями аллергии .Henderson, Kaliner, 1978), а также то, что процессы свободно-ради-гального окисления и высвобождения гистамина на связаны друг с дру-•ом, обусловливает необходимость употребления, помимо" средств, тор-юзящих секрецию медиаторов, специальных препаратов, ингибирувдих роцесс пероксидации в клетках. Таким требованиям отвечают полифун-циональные стабилизаторы ТК, имеющие точками приложения своего ;ействия разные звенья процесса активации клеток-мишеней аллергии • Гущин И.С. и соавт.., 1987; Gushchin et al., 1989).

ВЫВОДЫ

: Разработана модель для одновременной оценки кинетики показате-ей Ферментатигной и неферментативной пероксидации, активности ан-доксидантных ферментов и секреции гистамина при иммунологической . неиммунологической активации тучных, клеток. . Активация тучных клеток различными избирательными высвободите-

лями, вызывающая секрецию гистамина, сопровождается реакцией окси-дантной-антиоксидантной систеш клеток, которая выражается в нарастании пероксидации и изменении активности антиоксидантных Ферментов.

3. Характер изменений антиоксидантной систеш тучных клеток зависит от вида активации клеток (рецепторной или нерецепторной). Начальные изменения активности антиоксидантных ферментов выявляются при действии на тучные клетки рецепторных высвободителей (специфического аллергена, полишксина Б1 и вещества 48/80) и отсутствуют при стимуляции клеток нерецепторным активатором (ионофором

А 23187). Это мсжет быть связано с начальными этапами мембранной перестройки, как следствие взаимодействия лиганд-рецептор.

4. Наблюдается параллельность усиления ферментативной пероксидации и нарастания секреции гистамина при активации тучных клегок и торможения обоих процессов в присутствии стабилизаторов тучных клеток. Однако выявление меньшей чувствительности к изменению температуры Ферментативной пероксидации, чем секреции медиатора, позволяет предположить, что эти процессы, по-видимому, не связаны между собой.

5. Нарастание неферментативной пероксидации при активации тучных клеток, вероятно, не имеет значения для усиления и поддержания секреции гистамина, поскольку диэтилдитиокарбамат, тормозящий высвобождение гистаыина, не только не снижает увеличение неферментативной пероксидации, но, напротив, усиливает его.

6. Секреция гистамина, по-ввдимсму, не связана с изменениями активности антиоксидантных Ферментов, гак как препараты, тормозящие процесс секреции, или понижение температуры при инкубации тучных клеток с активатором, отражающееся на характере высвобождения медиатора, не влияют на'изменения этих ферментов.

7. Возникающее начальное увеличение образования супероксида при

действии на тучные клетки рецепторных высвободителей не играет инициирующей роли в секреции гистамина, поскольку диэтилдитиокарбаыат, блокирующий супероксид дисмутазу, значительно тормозит высвобождение медиатора.

8. Выделение активных Форм кислорода стимулированными тучными клетками не связано с инициацией высвобождения из них гистамина, так как супероксид дисмутаза, значительно тормозящая хемилюминес-ценцию, не оказывает ингибирующего эффекта на высвобождение медиатора, а латекс, вызывающий значительное ваделение кислородных радикалов из тучных клеток, не вызывает секрецию гистамина.

9. Высвобождающиеся из стимулированных тучных клеток активные метаболиты кислорода не усиливают секрецию гистамина, поскольку известные ловушки свободных радикалов (супероксид дисмутаза, катала-за и D-маннитол) не тормозят далный процесс.

10. Ингибитор супероксид дисмутазы диэтилдитиокарбамат может обладать противоаллергической активностью, так как значительно тормозит

\

in vitro секрецию гистмина из иммунологически и неиммунологически активированных тучных клеток.

Список работ, опубликованных по. теме диссертации

1. Gushchin I.S., Petyaev I.M., Tsinkalovsky O.R. Kinetics of oxigen metabolism indices in the course of histamine secretion from mast cells..17-th Meeting of the European Histamine Research Society. Abstr., p.46., Breda, Neatherlahd, May, 17-20, 1989.

2. .Гущин И.С., Войтенко В.Г., Петяев Й.М., Цынкаловский О.Р. Ак-

t

тивация кислоррдного метаболизма в процессе высвобождения гистамина из тучных клеток крыс, вызванного специфическим аллергеном,

веществом 48/80 и ионофором А 2318*7. Иммунология, 1989, 5, с.33-36.

3. Гущин И.С., Цынкалояский О.Р., Войгенко В.Г. Изменение показателей кислородного метаболизма в ходе секреции гистамина при активации тучных клеток. Тез. Первого всесоюзного иммунологического съезда, т.2, с.326, г.Сочи, 15-17 ноября 1989 г.

4. Gushchin I.S., Petyaev I.M., Tsinkalovsky O.R. Kinetics of oxigen metabolism indices in the course of histamine secretion from mast cells. Agents Actions, 1990, v.1/2, p.85-88.

5. Гущин И.С., Цынкаловский О.Р. Система свободных радикалов и активация клеток-мишеней аллергии. Патол.физиол.эксперим.терап., принята в печать.