Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунофармакологические аспекты изучения тучных клеток

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукопне* ПОПЫВАНОВА Галина Андреевна

ИММУНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ТУЧНЫХ КЛЕТОК

14.00.25 — фармакология

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа — 1992

Работа выполнена в Пермском государственном медици ском институте.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, пр фессор А. С. Закс.

Научный консультант: доктор медицинских наук, доце1 А. А. Быкова.

Официальные оппоненты: засл. деят. науки БАССР, доктор медицинских наук, профе сор Д. Н. Лазарева,

доктор медицинских наук, профессор В. Ф. Давыдов.

Ведущее учреждение — Российский государственный м дицинский университет им. Н. И. ПИРОГОВА (г. Москва).

Защита диссертации состоится _» . 1992 г

да в_/^_часов на заседании специализированного учено1 совета К 084.09.02 при Башкирском государственном мед] цинском институте. Адрес: 450000, г. Уфа, центр, ул. Леш на, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инст] тута (450000, г. Уфа, центр, ул. Ленина, 3).

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор Е- Г. Давлетов

АКТУАЛЬНОСТЬ

Тучные клетки (цзстоцити) широко представлены во всех органах и тканях. Длительное время их значение ограничивали участием в трофических процессах (EiCicK >1989; Riíey ,196*0.

В последние годы накапливаются данные о лимфоидной природе тучных клеток, их способности к участию в регуляции иммунного ответе (Девойно Л.В.,1972 -1983; Бережная Н.М. с соэвт., 1983; Падегимэс Б.Ю с соэвт., 1983 ; Suxnei, 1975; König ,1986; Wevf Beet» 1986 ). Это во многом связано с уникальной способностью мзстоцигов к дегрануляции с выделение* в окружающую среду разнообразных биологически активных ведеств ( БАВ ), среди которых первостепенное место принадлежит гистзмину и серотонину.

Широко известно, что последние относятся к классически« инициаторам и участникам разнообразных аллергических и воспалительных процессов. Установлены , однако, их несомненные иммунокоду-лирующиа свойства ( Девойно Л.В., 1972-1983; Faídacb , 1977; Rocken, 1977, 1У79 ; Beex.RockEin , 1984 ). В частности,по-показзно, что серотонии значительно снижает титры внтител в пер«-вичном иммуяном ответе на эритроциты барана ( ЭБ), удлиняет ла -тентныЬ период антитеяообрззоватш со смещением пика не более поздние сроки ( на 32 сутки для М и на 40-е сутки для 3<jG ). йнгибирующее влияние серотонина ( в дозе 25 мг/кг) распространяется нз секрецию лимфонинов, хемотЧнРическую активность нейтрофи-лов и гммоцитов ( Левойно Л.В.и йлюченок Р.Ю.,1983 ) Близкое влияние на иммунокомпетвнтные клетки и развитие иммунных реакций оказывает гистаиин ( Beer., Ro^gin, ,1976 - 1986 ). Уже в физиологических концентрациях он тормозит через специфические рецепторы реакцию бласттрэнсформации лимфоцитов и выработку лимфокинов в ответ нз стимуляцию ФГА и Хои А ( Roiktin, , 1977,1983 ). Позже обнаружилось, что гистаиин индуцирует синтез в .Т-клетках факторов, ингибирующих созревание и функционирование хелпаров

( Weífon, , Rosertctans, 1979), угнетает Т-розеткообразование ( E-РОК), особенно у людей, больных аллергическими заболеваниями (De Cock ii ai, 1977 ; khan , 1986). Несомненно иммуномодули-рующая активность присуща простаглэндинаы и лейкотриенам, постоянно выделяемый при вовлечении тучнкх клеток в реакции нэ раздражитель С&атйа , Batiih, , 1980 ; íievis , 1983).-

Признавая дозозависимое депримирущее влияние аутокоидов тучных клеток на иммунные реакции, вызываемые различными антиген нами и гэлтеяаии, мы считаем необходимым подчеркнуть способность этих веществ к инициации специфичных им нейтрализующих аутознти-тел, которые, с одной стороны, ограничивают функциональные возможности зутокоидов и ускоряют их элиминацию, с другой - снижают возможность формирования иммунных реакций на другие антигены» Наряду с прочими,этот феномен положен в основу концепции иммунного механизма химического гомеостазз ( ИМХГ ), сформулированную А.С.Заксом и А.А.Быковой ( 1976 - 1991).

Вместе с тем,возможное участие тучных клеток в функции ИМХГ нуждается в дальнейшем изучении: необходимо выяснить временные параметры включения мастоцитов в реакцию нз рэьллчлые раздражители, в том числе лекарственные вещества;

изучить заинтересованность фармакологических и иммунологических рецепторов тучных клеток, зависимость их вовлеченности в реакции от путей введения веществ ( в/бр, в/м, через рот) и т.д.

Целью данного исследования является изучение роли тучных клеток в реакциях иммунитета, а именно миграции макрофагов (ЖФ) и фагоцитоза, изучение реценторнаго аппарата тучных ¡шеток, определение возможности '.¡уриикологическом регуляции феноменов дегрз-нуляции роаеткообразования их с лимфоцитами крови людей и эритроцитами барина, сенсибилизированными гистэкином, серотшшюм , калликреином , ирадикшгансм.

В задачи исследования входило:

1.В эксперименте но крысах изучить реакцию леритонеэльных тучных клеток из биологически эктивные и лекарственные вещества разных групп, вводимые внутримышечно (в/и), внутрибрюшинно (в/бр) и через рот ;

2,Охарактеризовать рецепторный аппарат тучных клеток, обеспечивающий их включение в ответ на БЛВ, в реакциях эритроцитарно-ызстоцитарного розеткообрззовзния и с использованием фармакологических Олокэторов и зятигдобулиновых сывороток ;

3.Исследовать ¡и у^хо модулирующее влияние тучных клеток на функции макрофагов и лимфоцитов в реакциях торможения миграции макрофагов (слленоцитов) и фагоцитоза;

Изучить сенсибилизацию лимфоцитов и мзстоцитов к гистоми-ну, серотонину, выделяемых при стрессе (центрифугирование) и адъювант- артрите;

5.Разработать способ первичной оценки аллергизации ор-

ганизма л апробировать его в условиях клиники.

НШШ НОВИЗНА :

1.Установлено модулирующее влияние тучных клеток на течение некоторых реакция иммунитета;

2.Впервые показано наличие на мембрана тучных клеток специфических фармакологических ^.иммунологических рецепторов;

3.Установлена возможность фармакологической регуляции феномена дегрануляции мзстоцитов;

4.Расширены представления о механизме действия ряда фармакологических веществ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ :

I.Создан способ первичной оценки аллергического статуса организма человека, имеющий диагностическое и профилактическое знз-

чение, и позволяющий проводить в условиях клиники целенаправленную антиаллергическую терапию ;

2.Представляют интерес рекоиендзции по использованию феномена мзстоэригродитарного розеткообрззования для оценки иммунного статуса человека.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.Тучные клетки отвечают дегранулядией на введение лекарственных веществ любым способом ;

2.Мзстоциты крыс имеют на своей поверхности рецепторы- иммунологические и фармакологические к эндогенный веществен - гистзми-иу, серотошшу, брадикинику и кашшкреину, через которые возможна регуляция феноменов дегрзнуляцш и розеткообрззования ;

3. Перитонеальные тучные клетки являются шшуяомодуляторзни, участвуя в реакциях иммунитета, в частности, реакции миграции макрофагов ( ЫИФ) и фагоцитоза ;

А.Резрзботан способ оценки первично» здлергкзацак организма, имеющий диагностическое, профилактическое значение и дающий возможность коррекции антизлларгической терапии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Основные положения диссертации долохены на итоговой научной конференции и Экспериментальная разработка и применение в клинике современных методов иммунологического исследования", г.Пермь, 1977 ; на 7-й Северо-Кавказской научной конференции: я Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии", Краснодар, 1977 ;,нэ 2-м Всесоюзном съезде врачей-лаборантов" "Лабораторная диагностика", г.Ыосква, 1979 ; на 8-й Уральской конференции фармакологов:" Фармакологические пути решения актуальных клинических проблем", Пермь, 1980 ; нз 5-й Всесоюзной научной конференции: " Физиология и патология соединительной ткани," Новосибирск, 1980 ; на заседании областного иедико-тех-

нического общества":" Естественные науки - здравоохранению"., Пермь, 1987 ; на 9-й нэучной конференции: "факторы гуморвльао-го и клеточного иииунитега при различных физиологических и патологических состояниях", Челябинск, 1988 г.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ : Диссертация изложена нз 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания яетодов исследования и их результатов, заключения, выводов и практических рекомендаций. Иллюстрирована 5 рисунками,23 таблицам, 3 фотографиями. Указатель литературы содержит 87 отечественных иГ79 зарубежных источников.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

По теме диссертации имеется 17 научных публикаций.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ :

Результаты диссертации внедрены в практику эллергологическо™ го отделения областной клинической больницы г. Перми, используются в учебном процессе кэфедры фармакологии и госпитальной терапии, а тзкде в лабораторной практике иммунологического отдела Центральной научно-исследовательской лаборатории при медицинском институте г. "Перми.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 468 крысах - сзмцвх весом 180-Н00г, беспородных л популяции1,Виствр11, нз 62 мышвх обоего пола весом 12-16 г, на 72 кроликах весом 2,5 кг породы" Шиншилла". Исследована кровь 230 людей.

Неритонеальнае тучные клетки крыс получали по методике, описанной М.Я.Студеникиными Т.С.Соколовой (1971). Крысе вводили внутрибрюшинно 5-7 мл подогретой до 37°С физиологической жидкости Тироде. Наркотизированную эфиром крысу переворачивали на спин-

ку и делали легкий массах брюшке для лучшего выделения аастоци-тов в перионеальную кидкость. Делали разрез ло средней линии живота 0,5 - 1,0 см, через который стекала ранее вводимая жидкость в пробирку с гепарином. Отделение чистой клеточной массы изстоцитов от прочих элементов перитонеэльного экссудата осуществляли методом седиментации в градиенте плотности(с£ =1,07 г/см^ ^ фиколл-верографинв или сахарозы. Учет реакции дегрзнуляции тучных клеток проводился в условиях "влажной камеры" путем ыикро-скопировзния при увеличении 90 х 7. Цодсчитывали сто изстоцитов и распределяли их по степеням дегрэнуляцин: I степень- набухание клеток с увеличением их размеров ; II степень- обесцвечивание клеток ("соты"), III степень- разрыв оболочки с гиперкинезом и высыпанием гранул в межклеточное пространство. В опытах использовали клеточную взвесь, содержащую не более 10 % спонтанно де-грзнулировзнных изстоцитов.

Для реиения поставленных задач кроме известных классических дегрзнуляторов -декстрзна и соединения 48/80 - использовали ги-стамин дигидрохлорид (СЯш^е,» Австрия),серотонин- крезти-нин сульфат Венгрия), брадикинин триацетат (£ап<1о1,

Швейцария),калликреин (VI'мЬхорз Англия), рэуседил (Чехослова кия), езлицилат натрия , эфедрин, циклофосфзн, букзрбзн, мефенз-ыинэт натрия (СССР).

Препараты вводили внутримышечно, внутрибрюшинно и через рот в дозах: декстран - 10 -20 иг/ кг ; 48/80 - 1,2 мг/ кг; рзусе -дил - 1,2 мг/кг ; гистзмин - I мг/кг ; серотонин - I мг/кг; калликреин - I мг/кг ; брадикинин - I мг/кг ; салицилат нэтрия-200-400 мг/кг ; циклофосфзн - 200-400 мг/кг ; эфедрин - 5 мг/кг; азэфен - 4 мг/кг ; Сукзрбзн - 6 мг/кг; мелипрамин -100 мг/кг; мефенаминзт натрия -18 мг/кг, В контрольных опытах тем же путем вводили изотонический раствор натрия хлорида, действие испы -

туемых веществ на дегрануляцию мастоцитов определяли через lb,iO, 60 минут после введения.

Для характеристики возможных путей влиялия веществ на масто-циты использовали фармакологические анализаторы, в качестве которых применялись Hj- ¡^-гистаминоблокаторы (димедрол,пипольфен, метиамид)и М-Д-Т-серотониноблок8торм( морфин, дезерид, типицдол).

Кроме того^использовэли антямедиаторные сыворотки животных, которые получали путем иммунизации кроликов гаптен-протаиновыми конъюгатаыи в полном здъюванте Фрейнда (0,5 ил). Для этого гиста-мин, серотояия, калликреин или брэдихинин конъюгировали с человеческим эльбумияом ( Rcanat » Венгрия) через ието-р-толуенсульфонэт-1-циклогексил-5-2иорфолинил-4-этилкзрбодиимйД . Конедгагы вводя-лй подкожно в несколько точек боковых поверхностей туловища животных один раз в 3 дня на протяжении 4-6 недель. На 10 день после окончания введения забирали кровь для получения знтисывороток общепринятый способом. Титр сывороток определяли методом ыикро-лреципитации по Уанье* i РПГЛ.

В качестве контроля применяли сыворотки животных, который вводили физиологический раствор по аналогичной схеме. Сыворотки лодей - доноров, а также больных аллергическими заболеваниями получали из облвстной стэнции переливания крови и областной клинической больницы.

Взаимодействие полученных знтисывороток с рецепторшт аппаратом тучных клеток определяли по степени дегрануляции последних. С этой целью полученную суспензию перитонезльных мастоцитов в объеме 0,05 va помещали на предварительно окрашенное нейтрзль-ротои предметное стекло с рэвным объемом исследуемой сыворотки. Ингредиенты смешивали, накрывали покровным стеклом (условия влажной камеры) и термостатировали в течение 15 минут, после чего препарат микроскопировали при увеличении 90 х 7, учитывая число

дегранулированаых иастоцктов среди ста клеток, встречавшихся в полях зрения.

Учитывали также способность иаотоцитов образовывать розетки (РОК) с эритроцитами барана(ЗБ) или лимфоцитами крови людей, сплеяоцитаии крыс. Реакция включает подготовку сенсибилизированных эритроцитов и иаотоцитов как основных ингредиентов. Сенсибилизация эритроцитов включает 2 этапа:

1 - этап - глютаризвция нативных эритроцитов барана: для этого свежие ЗБ трижды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида (РН = 7,2 ), центрифугируя взвесь 5 минут при 1500 об/мин. Затем готовили 5 % взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного раствора натрия хлорида. При глвтаризацик

взвесь эритроцитов соединяли с 0,25 % свежеприготовленным раствором альдегиде в соотношении 1:1 и выдерживали при 1°+37°С 15 минут, затем эритроциты тщательно отмывали раствором натрия хлорида и доводили им же до первоначального объема.

2 И этап - сенсибилизация глютаризированных.эритроцитов. Для этого готовили раствор химического вещества, растворяя I , мг его в 10 мл забуференного раствора натрия хлорида (РН = 6,4), Эритроциты отмывали этим же раствором, затем соединяли с раствором вещества в соотношении 1:1. Смесь оставляли при комнатной температуре не 25 - 30 минут, затем клетки отмывали дважды раствором нэтрия.хлорида (РН = 7,2 ). Для реакции использовали 0,5 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Обработка глютаровым альдегидом лишалэ эритроциты барана способности к спонтанному

р о г е тко обра а ова ни».

Взвесь перитонеальных тучных клеток, полученную описэнныи выше способом, доводили до концентрации I х 105 в мл среды 199. Эквиобъемные количества (0,05 мл ) меченных медиаторами ЗБ и мастоцитов выдерживали при температуре + в течение 18чзсов,

после чего центрифугировали при 800 об/иан в точение 5 miзуг. Осадок ресуспзндировзли в среде 199, готовили из взвеси прзлзрзх "живая капля" и кикроскопировалн при увеличении 90 х 1.Подсчет РОК вели среди ста иастоцитов, присоединивших но кенее 3-х эритроцитов. В случав образования настолик^оцктзрных розеток вйзсто сенсибилизированных ЭБ применяли очищенные через градиент íjnt-колл-вергрзфина лимфоциты крови людей или спленоцпты крыс (Нови» ков Д.К., Новикова В.Н., 1979 ).

С целью выявления обнаруженных рецепторов к гисташану, серо-тонину, кзлликреину, брэдининину использовали обработку тучных клеток соответствующими фармакологическими антагонистами, приае-няемыми в разведениях: димедрол (1:10"^); пипольфен (1:10"^), типиндол (1:10~5), метиэмид (1:ПГ3), кятзл (1:Ю~^),морфия (Isltr4).

В отдельной экспериментальной серки было изучено влияние иастоцитов нз фагоцитарную активность иэкрофзгов и их способность к выделению фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов (опленоци-тов). Для оценки данных феноменов использованы классические методики определения фагоцитированных макрофагов по отношению к нивой культуре В. соШ и тест гормоаения миграции спленоцитоз по Новикову Д.К. с соэвт.(1976).

Результаты опытов обработаны методом вариационной ствтнстикя по тесту Стъюдентз и считались достоверным при Р< 0,05(х ); Р< 0.001 (хх).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследований, проведенных нэ перитонеальных тучных клетках крыс, подтверждают, прежде всего, способность ызото-цитов реагировать на любой раадракитель дегрзцулвдкай с выделе-ни(Ш биологически активных веществ (БАВ). Типичная картина данного феномена наблюдается при использовании классических де-грануляторов-декстрана, соединения 48/80 (Увнес Б.с ооавт,1963).

В наших опытах (таблица I) дегрануляция закономерно рвзвивз-лэсь не только на действие указз-нных веществ,но и при" в" / бр введении сзлщидата натрия (19,0 - 2,: 9); букзрбзнэ(24,Г* 2,10)', азафена (20,3 - 4>8),мефензмннэ1а натрия (27,5 - 1,3),циклофос-фана (34,2 1 6,5 ), рауседила (11,3 - 0,9). Следует отметить неоднозначность реакции и ее зависимость от природы вводимого вецествэ. Тек,число дегрэнулировзнных клеток слабо, но достоверно возрастало в опытах с рауседилом и не изменялось под влиянием эфедрина. Существенное значение имеет временной фзгсаор, з тают способ введения препарате, Рауседил при в/м введении не вызывал резкой альтерации клеток. Его влияние ограничивалось... изменением цвета клеток и потерей ими округлости форм. Клетки приобретали угловатость, гранулы становились трудноразличимыми, С другой стороны, салицилат натрия или декстран независимо от дозы постоянно вызывали массовое высыпание, резко вырэхенный гиперкинез гранул.В части опытов наблюдалась зависимость эффекта от дозы(Таблица 2 ) Тек,салицилат натрия в дозе 200 мг/кг, вводимый через рот, увеличивал число дегрзнулированных клеток с 8,6 ± 1,29% до 19,1 ± О,Г. а в дозе 400 мг/кг - до 36,0 ± 2,46$ Ыенмэя разница наблюдалась при в/м введении, когда в первой из доз салицилзт натрия увеличил дегрэнуляцию до 1У,8 - Iа при втором случае до 24,6 - 0,1. % (Р ^ 0,05).При в/бр иншции декотрэна в дозе 10 мг/кг число дегранулированных клеток соста-

Зэблнцз I

Дегранулирующий эффект иссладузаых соединений (в % )

й наиненованне п/п препаратов

доза дагрэнулядия ыастоцнтов

иг/кг дн^ введения

через рот в/ н

в / бр

1. Раствор натрия хлорида (контроль)

2. Декстран

_ п _

3.Соединение 48/80

4.Аэз:Ьен

5.БукэрСан

6.Ерадикиния

7.Гйстзыин 8«Каляйкреня Э«йефгнзыин85 яатрия

Ю.Мелипраиия П.Рауседил

12.Салицилат натрия

13.Серотонин

14.Циклофосфэн 15.Эфедрин

0,85 6,5*

10,0 23,3*

20,0 -

1,2 21,5*

4,0 7,8*

6,0 -

1.0 -

1.0 -

1,0 -

18,0 -

100,0 9,4*

1,2 12,0*

200,0 19,1*

1.0 -

200,0

5,0 -

1,1 6,5* 0,9 8,5* 1,2 хх . х .хх

2.5 12,5* 2,5 30,О* 2,4

34,8* 1,6 хх . х хх

2.3 19,1*4,3 23,1* 4,1

.X .XX

2.4 16,9*3,2 20,3* 4,8

. XX

24,1* 2,1 XX . XX

20,6*3,6 30,2* 1,7

хх . хх 21,4*3,7 36,2* 1,г-

XX , УХ

24,1*1,6 32,5* 27,5*

2.6

0,1 7,5*0,6 п>3± 0>9Х 1,6х 17,4*1,2Х 19(0+

, XX , XX

21,8*3,1 34,2* 1,6

хя . хг 21,6*3,5 34,2* 6,5

12,0*1,6 6,0* 1,3

Примечание: - исследование не проводилось

х достоверность результатов по сравнению с контролем при Р«= 0,05 хх достоверность результатов по сравнению с контролен при Р«= 0,001

Таблица 2

Влияние салкцклатэ натрия на догрануляцию перитоневльных тучных клеток крыс при равных путях введения и в разные сроки

серия путь опытов введения доза мг/кг вроденч дегранулированных изстоцитов

ч/з 3 мин. I ч/з 15 инк. 1 1 ч/з 30 ш. 1

Раствор з/и 0,85 5,0 ± 0,96 6,1 ± 1,4 6.5 ± 0,96

натрия в/бр 1! 7,3 ± 1,1 8,8 ± 1,6 8,5 ± 1,29

хлорида ре.1 ог 11 - 6,5 ± 1,2 5,8 ± 0.96х

Салицилат в/и 200 12,1 ± 1,4 19,1 ± 1,6 19,8 ± 1,29х

натрия в/бр реч а л 11 15,1 -8,6 - 1,29 1,29 19,1 ± 0,1 19,0 ± 2,9 XX 24,6 ± 0,1 XX 36,2 ± 2,4

реч 05 400 - 29,0 ± 1,6

Примечание: х - достоверность различий по сравнению с хлоридом натрия при Рс 0,05 хх - достоверность различий по сравнению с хлоридом натрия в эти же сроки при Р-«с 0,001

Таблица 3

^озетиообразованив (РО) мэстоцитов интзктных крыс с ЭБ, меченными гистамином, серотонином, калликре-инса и брздикинином

количество РО мэстоцитов с ЭВ

Ш п/п , обра бота н-г •глютвровый 1 альдегидом, •(контроль). м гистамином о чен серотонином н ы м и калликреи-ноа брадикини-ном

I. 2,0 19,0 14,0 22,0 26,0

2. 4,0 32,0 23,0 29,0 23,0

3. 2,0 20,0 30,0 19,0 29,0

4. 4,0 27,0 26,0 26,0 21,0

5. 2,0 34,0 27,0 16,0 16,0

6. 3,0 31,0 21,0 22,0 20,0

X X X X

М 2,33 27,17 23,5 22,3 22,66

ГЦ 1 0,48 2,42 2,58 2,08 2,11

Правечание: х- достоверность различий с/контролем ( Р 0,05 ).

дало 30,0 ± 2,4 з в Д033 20 мг/кг - 34,8 * 1,6 ( Р^- 0.05)

В экспериментах о салицилзтон натрия с в/бр и в/u введением эффект дегрзнулпцяи наблюдался уке через 3 минуты, достигая наибольшей Еырзяэнности к 15 минуте и оставаясь на этой уровне спустя 30 минут. При введении через рог двгрануляция тзвхэ усилилась через 15 минут и продолжала нарастать через 30 минут.

В контрольной группе животных с введением натрия хлорида при разных способах не наблюдалось достоверных изменений.

Таким образом, установлен факт "отвеча-.моста" кастоцитов нэ введение любым способом веществ, не обладающих сродством к тучный клеткам. Наблюдаемая дегрзнулядия, как правило, не сопровох-двлзсь полной альтерацией клеток, но характеризовалась активацией внутриклеточных структур с выделением в окрукэюцую среду биологически активных веществ: гистамина, серотонина, кининов, лрос-тагландинов, троибоксэнов и пр. Согласно традиционным представлениям, выделившиеся ВДВ могут быть инициаторами воспалительных и аллергических реакций ( Адо A.A.,1970 ; Ишиковэ Л.Ц.,оеличен-ко Л.1/1., 1975; Jusfin , I972,Wasse-thiaMh, 1986). Следует отметить, что зз последние годы накапливаются данные об определенной морфологической и функциональной близости кастоцитов к. им-мунокомпетентныы клеткза, э продуцируемые ими вещества, в частности, гистамин л серотонин, обладают ицмуноыодулирующим действием ( Девойно Л.В., 1983; Beet, Rock С ¡ w , 1975-1985; JUai'mi , 1987). Влияние аутокоидов на иммунокомпетентныв клетки осуществляется через рецепторы (Hj- и Н2 )i предсучествующие не на лимфоцитах ( siich+en btei ц, 1У79 ). Тучные клетки, в свою очередь, также активируются через систему рецепторов, из которых наиболее изучен рецептор к Jg Е (jagueS • I979;Conxad < 1980 ; kiön'icj i 1986 ). Обнаружены на мембране мэстоцнтов рецеп-

торы к декстрвну ( Weit ,1978), соединению 48/80 (Jaj,«e£ ,1979), адреналину {btanсЛяа,1988),аденозиу (Mat^uati , 1979),ацетил-mtimj; (Вв-аисИпа » 1980 ).

Значительно менее изучен вопрос о механизмах действия на туч -кие клети БАБ. Следующая серия опытов была поставлена с целью определения наличия рзцепторзых структур к медиаторам и фериантак на мембране ператонеаньных тучных клеток. Для этого использовали ве-тодику иммунного розеткообрззования с ЭБ, сенсибилизированными аго-нистамн различных медиаторов воспаления и иммунитета. Внесение сенсибилизированных эритроцитов во взвесь иастоцгаов приводило к феномену розеткообразования. Б ряде случаев почти одновременно начиналась дегрвнуляциа различной степени вкракенности, в то время как другие розетЕообраэуюцив клетка не претерпевали каких-либо изменений. В контроле к розеткообразованию с глютаровыми эритроцитами были готовы всего 2,33 - 0,48 % тучных клеток, а к дегрануляции -5,3 - 1,29 f иг них.

При добавленаи к взвеон мзстоцитов ЭБ, сенсибилизированных гн-ст8юшом,серотонинон,калликреином и брздикиккнои,наблюдалась следующая картина образования "розеток": с "гист8миновыми"ЭБ - 27,17 te,42^; с"серотониновьши|,ЭБ-23,50 - 2,58 %', с "калликреиновымк,'ЭБ -22,3 * 2,08 с"брадикинивовыик" ЭБ - 22,6 ± 2,10 % (таблица 3 ).

Предварительная обработка мзстоцитов типиндолом, дезерклом, а особенно морфинов (соответственно Т-Д-54-серотониноблокаторы), а таете димедролом и метиамидом (Hj- Н2-гистаминоблокаторы) подавляла их. способность к иммунному розеткообразованию с "серотониновыми" и "гис18миновымии эритроцитами. Параллельным был эффект блокаторов в отношении сопутствующей дегрануляции.

^ Принципиально важно, что розеткообразование блокировалось тзк-se аатниммуноглобулиновыми сыворотками (таблица 4).Кроличья сыворотка против глобулинов крысы сникала,в частности,число РОЙ с ЭБ, меченными сероюнинок, с 22,3 * 5,1% до 7,; ~ 2,6 % (Р «с 0,001), а дегрануляции о 22,л ± . % до 15,0 * '■,п Ъ ( Р «= 0,01).

Таблица 4

Влияние крысиного энтиглобулина и альбумина на феномены дегрэнуляции (Д) и.розеткообра-зования (РО) тучных клеток крыс в реакции с ЭБ, меченными серотопинса

Число дегранулированных (Д) и розеткообрззуюпдах (РО)

мзстодктов в реакции о ЭБ. мечеиншм серотонпноц _

до обработки! альбумином и энтисыво-! рОТКОЙ К За- крысы ,

п/п

п о о я е обраб-откя альбумином антисызоротяой

РОК .контроль.

к крыс и

РОК Л(« РОК Д(»

19,0 2В-.0 6,0 12,0

33,0 21,0 7,0 12,0

27,0 24,0 10,0 14,0

21,0 20,0 4,0 16,0

13,0 26,0 8,0 12,0

24,0 20,0 11,0 24,0

23,9 23,2 X ;.,7 15,0"

2,3 1,3 1,9

I. 21,0

2. 29,0

3. 26,0

4. 19,0

5. ' 16,0

6. 23,0

И 22,3

«1 4 2,1

27,0 21,0 19,0 21,0 24,0 20,0

22,0 1,3

Примечание: х - достоверность различий результатов по сравнению с контрольной группой

Следует отметить, что перитонеэльные тучные клетки крыс способны к розеткообра зовзнив не только с ЭБ, иеченнына аутакоидзии и кининами.но и с лиыфоидными клеткаиа анвогных и людей о образованием мастолиафоцитарных "розеток". Так, в следующей сериаи опи-пен

тов было показано, что добавлении к суспензии мастоцитов спдено-цитов крыс , наблюдается образование азстолимфоцитарных розеток в количестве 2,33 - 0,5 %. В случае использования спленпцитов крыс, получавших серотонин или резерпин, число РО мастоцитов значительно возрастало.достигая соответственно 29,8-1,77 % и 24,8 * 3,54 % ( Р< 0,05 ).

- 16 -

По ходу решения вопроса о рецепторах тучных клеток были расширены представления о механизма действия интала, который, кзк известно ,обеспечивает стабилизацию мембран тучных клеток. Оказалось, что он предупрездэет такие розеткообразовэние изстоцитов с ЭБ, меченными гистамином и серотонином, т.е. способен блокировать соответствующие рецепторы. • Таблица 5

Влияние интала на дегргнуляцию мзстоцитов при воздействии серотонинои

число мзстоцитов,деграну- число мзстоцитов, деграиули-

лироЕзнйых раствором се- рованных раствором серотони-

ротонина, до блокады инта- на,после блокады инталои лом ( контроль) ( опыт )

п/п ! це-! лые ! ■ степени ! дегрануляции , ! ! 1 «е-. Д 'лые 1 степени дегрануляции I ( д

2 клет! ! ки I 2 3 |В % !клет-! I ки , I 2 3 ' ! в $

I. 54,0 24,0 2,0 ' 20,0 46,0 84,0 12,0 2,0 2,0 16, ,0

2. 59,0 20,0 1,0 23,0 41,0 88,0 12,0 0 0 12, 0

3. 44,0 23,0 0 23,0 54,0 90,0 6,0 4,0 0 10, ,0

51,0 27,0 2,0 20,0 49,0 89,0 6,0 3,0 2,0 и, .0

5. 53,0 31,0 7,0 9,0 47,0 86,С 10,0 2,0 2,0 0

6. 40,0 26,0 10,0 24,0 60,0 88,0 12,0 0 0 12, 0

М 50,1 25,1 3,6 19,8 49,5 X 87,5 9,66Х 1,83 X 1,0 12, X ,6

•п ± 3,06 1,7 . 1,45 2,42 3,06 1,46 1,46 0,32 - I, ,15

Примечание: Х- достоверность различен контроля и опыта( р<;0,05)

Таким образом, полученные нами данные позволяют утверждать, что перитонеальные тучные клетка способны к иммунологическим феноменам розеткообразования, с помощью которого удается обнаружить ряд субпопуляций мзстоцитов, несущих на мембране фармакологические рецепторы к гистамину, серотоиину калликреину и брадикинину, показать их специфичность путем применения соответствующих блокаторов.

Кроаз того, впервые показано, что стияуляция рецепторов кзото-цитоз, ведущая к дегрзнуляции, мохет осуществляться не только самими медиаторами, но и антителами к специфичных ии рацепторза. Данный феномен обнэрукаи в опытах с обработкой перитонезльаых на-стоцитов крис кроличьиаи антисывороткаып к гистаинну, саротоняну, кзлдикреину и брадикинину. Нэибольсая деграиуляция наблюдалась при применении антигисташшовой сыворотки - 70,0 далее антикал-ликреиновой - 65,055, знтибрздикининовой - 62,0 % и, наконец,онти-серотониновой - 59,0$. Как правило,дегрэнуляция характеризовалась появлением увеличенных з рззыерах ыастоцитов, изменением окраски до лгмого обесцвечивания, разрывом клеточной оболочки и высыпанием гра::ул. Элактронномикроскопичвский анализ подтвердил нвблвдэе-мые изйенс^ия гранулярных структур, выраженные в снижении элек -тронной плотности грвнул, обнзгением строкы в виде тонкой петлястой сети и выбросе содержимого гранул через дефекты цитоплззиоти-ческой мембрана, Наблюдаемый эффгкт, по сути, является эффектоа антми'дотипических антител и. моает расцениваться квк укззанзе на определенную близость природы фармакологических и шаукологичеехгезе рецепторов. Последнее дополнительно подтвердилось в экспериментах с применением обработки тучных клеток кроличьими знписывороткзни к глобулинзм крысы (таблица 4 ).

Интересно, что близкие результаты были получены при использовании сыворотки крови больных аллергическими заболеваниями. Установлено,что сыворотки здоровых доноров облвстной станции перелн-зэния крови были способны дегранулировзть лишь 10,1 % тучных клеток интактных крыс. Сыворотки больных незллергическиии заболеваниями - 12,1 5&, в то время как сыворотки страдающих рззншги формами аллергии в среднем - 35,0 %. Наибольший дегранулирувдий эффект (43,0 %) был присущ сывороткам больных поллиноззми, несколько меньший - бронхиальной астмой и лекарственной крапивницей (34,0 % и 30,2 % соответственно).

Дегрэнудируювуй эффект сывороток сохранялся после вх диализа или Тепловой инактивации при 56° С в течении 30 минут. Сыворотки диэли-зоеэли в целлофановых мешочках с диаметром пор 12000-15000 А0 против изотонического раствора хдоргдэ нвграя (РН = 7,2 ) в течение 18 часов при температуре + б.

Обнаруженное влияние антииедиаторных сывороток -на изстоциты позволило разработать способ диагностики . аллергизации организма и апробировать его в клинических условиях. С этой целью нз предвечном стекле, предварительно окрзиеннон 0,1 % спиртовым раствороы нейтрального красного и высушенном нэ воздухе, смешивзлись капля исследуемой сыворотки и кзпля взвеси пермонеальных тучных клеток белой крысы.

Смесь покрывали покровным стеклом, края которого смазывали вазелином ( влажная кэиера ) и после инкубации при температура + 37° С подсчитывали под иммерсионной системой, микроскопа (увеличение 90 х 7 ) сто тучных клеток, среди которых выделяли целые, частично дагранули-ровашше и полностью разрушенные клетки.

Обследованы сыворотки крови 73 больных различными аллергическими ззбояегаааяка, 33 сыворотки крови больных неаллергического профиля (сердечно-сосудистая патология) и 66 сывороток людей- доноров областной станции передивания крови.

Влияние тучных клеток моает затрагивать рззные этапы иммунного ответа. В частности, показано, что активированные декстрэнон мэсто-циты крыс - доноров тормозят реакцию нитрации сплевоцитов крыс, получавших тэюке 2,0 % раствор декстрэнэ в виде в/м инъекции. Индекс тор-иояенкя миграции возрастал в среднем более, чем на 38,0 %. Результаты представлены в таблице 6.

йимуноыодулируюадае свойства.тучных клеток обнаруаены и при изучении их влияния на фагоцитарную активность макрофагов селезенки крыс. Контакт макрофагов с сенсибилизированными БАВ тучными клетками приводил к сниггнию их фвгоцитарной активности нэ 25,2 % (таблице 7).

Таблица 6

Индекс торможения миграции сплзноцигов (ИИС) декстрановых крыс до и после контакта с мзсто-цитзыи сенсибилизированных декстрзнои животных

й йТМС до контакта I ИТИС после контакта

п/л с мэстоцитаии ! с' ЦЭСТОЦЙТЭИН

I. 58,3 66,9

2. 37,3 53,5

3. 47,6 60,1

4. 20,9 64,4

5. 57,8 58,1

б. 63,4

X

и 44,2 61,0

т ± 6,0 * 2,1

Примечание: х - достоверность различий ИШС до и после контакта ( Р -г 0,05 )

Таблица 7

Влияние иастоцитов крыс, сенсибилизированных декстраном, на фагоцитарную активность ин -тактных макрофагов

! Р1 число фагоцитирующих клеток (в % )

п/п ! ! до контакта с ! после контакта с

мэстоцитаии ! мэстоцитаии

I. 88,0 67,0

. 2. 90,0 72,0

3. 89,0 58,0

4. 100,0 86,0

5. 100,0 53,0

6. 85,0 77,0

М т 92,0 * 1.1 X 68,8 1 5,3

Примечание : х - достоверность различий фагоцитарной активности до и после контакта с мзстоцитэми ( Р< 0,05 ).

Продолжением исследования инмуноиодулируюпдах свойств мзстоцв-тов явились опыты на крысах с моделированием различных патологических состояний ( стресс и адъювант- артрит). Сопровождающие последние мобилизация и выброс зутококдов могут способствовать сенсибилизация самих тучных клеток, окруязющих ткани, вызывать воспалительные и иного роде изменения в них, всасываться и оказывать раглЕчный резорбтивный зффзкт, в том числе иммунного и на-икаунного характера.

Установлено, что в результате центрифугирования крыс ( 200 об/кин в течение одной минуты) почти в 3 раза возрастает число дегранулнрованных клеток ( таблица 8 ). Несколько слабее, но столь хе достоверно увеличивается розеткообразование мастоцитов о ЭБ, сенсибилизированными гистамином и серотониноа.

Таблице 8

Влияние центрифугирования крыс на дегрануляций " перитонеальных мастоцитов и на их способность к розеткообрэзованив с Э5,меченными гистамином и серотонинои

до центрифугирования

1

после центрифугирования

! число РО мастоцитов, дегра-- число РО мастоцитов, дегрз-. специфичных н?дя специфичных мля-

1 ! гистзиину ^серотоннну ция в, ! % ! гистзиину ^серотонину дия в ! %

I. 19,0 21,0 5,0 39,0 49,0 31,0

2. 32,0 29,0 13,0 43,0 45,0 24,0

3. 20,0 26,0 14,0 62,0 39,0 29,0

4. 14,0 19,0 11,0 54,0 42,0 27,0

5. 23,0 16,0 7,0 43,0 48,0 25,0

6. 30,0 23,0 12,0 40,0 43,0 29,0

X X

М 23,0 22,3 10,3 46,8 44,3х 27,5

Щ ± 2,9 2,9 1,45 3,7 1,6 1,12

Пркмечание :. х- достоверность различий до и после центрифугирования ( Р < 0,05 )

- 21 -

Принципиально такая же картина наблюдалась у животных с введением им полного адъюванта Фрейндэ в область брюшной полости» Отмечено, что на 10-е сутки после иммунизации число РО мастоцитов с ЭБ, меченными гистэмином и серотониноы, возрастало соответственно на 61,2 % и 42,6 %.

Тэким образом, результатом последних групп экспериментов может быть заключение об участии мастоцитов в иммунологических реакциях через фармакологические рецепторы и Уу Е -рецепторы, специфичные различным эутокоидам.

ВЫВОДЫ

1.Тучные клетки являются обязательным компонентом реакции организма на вводимые и высвобождаемые биологически активные вещества. Показано, в частности, развитие феномена дегрануля-ции мастоцитов при внутрибрюшинном, внутримышечном или пер -оральном применении не только соединения 48/80 и декстрэна, но и букарбзнэ, рэуседила, салицилата натрия, * ;" .. эззфена, мефенаминэта натрия, циклофосфана, гиствыина, серотонина, кал-ликреина, брздикинина.

2.Перитонеэльные тучные клетки дегранулируют в ответ на действие эндогенномобилизуемых биологически активных веществ: при введении декстрэна, при стрессовых (центрифугирование) и воспалительных (эдъюванг-8ртрит) реакциях.

3.Тучные клетки являются иммуномодуляторами, угнетая, в частности, миграцию макрофзгов и снижая их фагоцитарную активность.

4.Перитонеальные' тучные клетки интзктных крыс вступают в реакции иммунного мастоэритроцитэрного розеткообразования с глютэризировзнными эритроцитами барана, меченными гистэмином серотонином, кэлликреином и брэдиккнином.

- 22 -

5.Перитонеэльные тучные клетки крыс, сенсибилизированных указанными лекарственными соединениями или мобилизуемыми ими веществами, дают усиленную реакцию нзетоэритроцитзрного ро-зеткообрззования с эритроцитами барана, " меченными" как вводимым.', соединением (например, резерпином), так и эндогенно мобилизуемым им серотонином.

6.Перитонеальные мзетоциты образуют "лимфоцитарные розетки" с лимфоцитами крови людей здоровых и страдающих аллергическими заболеваниями, а также со спленоцитами интвктных крыс и сенсибилизированных лекарственными веществами и мобилизуемыми ими аутжоидами.

7.Показано, что дегрануляция тучных клеток, вызывэемэя гистэмином, серотонином, кзлликреином и брздикинином, тормозится применением т у/Ню специфических блокзторов рецепторов их мембраны: Н2-гистзмино-(диыедрол, пипольфен, метизиид) и М-Д-Т-серотокинолитиков (морфин,дезерил,типиндол). ¿ти антагонисты высокоэффективны также при дегрэнуляции тучных клеток,вызываемой антимедиэторными сыворотками, а также сыворотками крови больных аллергическими заболеваниями.

8.Способность тучных клеток к дегрэнуляции и розеткообрззо-взнию и ослабление этих феноменов под влиянием фармакологических антагонистов и кроличьей сыворотки против глобулинов крысы свидетельствует о наличии на их поверхности фармакологических и иммунологических рецепторов, специфичных медиаторам аллергии, воспаления , лекарственным веществам.

Э.Мастоэритроцитарное и мэстолимфоцитзрное розеткообрззо-взние свидетельствуют об участии перитонезльных мастоцитов в кооперативных взаимоотношениях с другими иимунокоадетентными клетками, реализующими иммунный ответ.

- 23 -

10.Способность тучных клеток реагировать на медиаторы аллергии, наличие на их мембране рецепторов к ним дало основание разрзботать и широко апробировать в клинических условиях способ оценки аллергизвции организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ : Предложенный способ первичной оценки аллергического статуса организма человека имеет диагностическое и профилактическое знание и может быть использован в эллергологических отделениях боль-нлц для целензправленной знтиаллергической терапии. Способность

!стэмино,-серотонино,-кннинолитаков снижать или устрзнять де-грзаудирующий эффект сыворотки крови больных аллергическими заболеваниями дзет возыокность проведения коррекции знтизллерги-ческой терапии. По угнетающему влиянию тех или иных фармакологических блокаторов на феномены дегрзнуляции и мастолимфоцитар-ного розеткообрэзовзния можно выявить или установить медиатор, ответственный за аллергические проявления у денного больного и проводить целенаправленную антиаллергическую терапию (анти-гистаминовую, энтисвротониновуп , знтикининовую и т.д.).

Описанные феномены мэотсэритроцитаряого и мастолимфоцитар-ного розеткообрэзовзния иогут быть применены для оценки иммунного статуса организма человека.

СПИСОК РАБОТ,ОГОБлйКОЬШЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммунологический способ изучения химической структуры лабро-цитов // Экспериментальная разработка и применение в клинике современных методов иммунологических исследований. Об.науч.тр. Пермского мец.ин-та. 197 8. - T.I44.-C.23-26 { Ооаат. A.C. Закс, А.А.Быкова, В.П.Хоринко).

2. Прямой тест цегрануяяции тучных клеток как показатель аллер-гизации организма // 2-й Всесоюзн. съезд врачей-лаборантов. Тез. докя. Москва, 1979.- С. 177-178 (Соавт. А.А.Быкова, A.C. Закс).

3. О механизме действия интала // Химико-фармац. журн.19Э0.-№9.-С. 11-13 ( Соавт. А.А.Быкова, А.С.Закс, Т.А.Евтеева).

4. Иммунофармако логический анализ рецепторов тучных клеток // Фармакологические пути решения актуальных клинических проблем. Тез. докл. 8-й Уральской конф. фармакологов,- Пермь. i960.-С.20 ( Соавт. А.С.Закс, А.А.Быкова).

5. Об усилении иммунного ответа на брацикинин и другие гаптены их конъюгацией о аутодогичкыми эритроцитами // Фармаксг. . пути решения актуальных клинических проблем: Тез. докл. 8-й Уральской науч. конф. фармакологов.-Пермь, 1990.- С. 119.

6. Изучение иммунного механизма химического гомеостаза методом ЭПР - спектроскопии // Современные проблемы гемосорбции и трансплантации тканей: Тез. докл. 3-го Всерооо. пленума: Москва, 1930.- С.17( Соавт. А.А.Быкова, А.С.Закс, Г.М.Слаути-на, В.А.Демидоаич).

7. ИммунохимичеС1Сий гомеостаз и вазоактивные средства // Актуальные вопросы фармакологии кровообращения: Тез. науч. конф. Горький,- 1930. - С.22 ( Соавт. А.С.Закс, А.А.Быкова, Т.А. Евгееаа).

3. Иммунофармакологическая характеристика мембранных структур перитокеальных тучных клеток // Физиология и патология соединительной ткани. Тез. докл. У-й Всесоюзн. конф. Новосибирск. 19ЭЭ.- С. 45-46 ( Соавт.А.С.Закс, А.А.Быкова).

9. О раннем иммуностимулирующем эффекте раусецила, соединения 4Е/9Э, прозерина, эфедрина, букарбана // Изучение биологического действия новых продуктов органического синтеза и пси-родных соединений. Сб. науч.тр., Пермь. 1931,- С. 113-124 ( Соавт. А.А.Быкова, Т.А.Евтеева, Г.М.Слаутина).

10. О ранней специфической иммунной реакции на экзо- и эндогенные химические соединения // Механизмы регуляции иммунитета и ранняя иммунологическая диагностика. Труды Пермского мед. ин-та, 1981.- Т.149.-С.35-38 ( Соавт.А.А.Быкова, А.С.Закс, Т.А.Евтеева, Г.М.Слаутина, В.А.Демидович).

11. Иммунологический гомеостаз // Регуляция иммунного гомеостаза Тез. докл. 3-го Всесоюзного симпозиума. Ленинград, 1932.-

С.130-131 ( Соавт. А.С.Закс, А.А.Быкова).

12. Выявление рецепторннх структур к гистамину, серотонину, кал-ликреину и брадикинину на мембране псритонеальных тучных клеток // Новые методы в теории и практике медицины. Сб.науч.тр. Пермского мед.ин-та, 19 33.- С.61.

13. Тучные клетки и иммунный механизм химического гомеостаза// Современное состояние иммунофармаколпгии. Сб.науч.тр. Челябинского медицинского ин-та, 1934С.32 ( Соавт.Л.А.Овоценко).

14. О возможной иммуномодулирующей роли тучных клеток // Регуляция иммунного ответа. Сб.науч.трудов Пермского мзд.ин-та, 1937.- С. 63-67.

15. Мета лет очки е взаимодействия при активации тучных кяеток гис-таминояибератореши // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях . Тез. докл. чекинстит. науч. конференции.Челябинск, 1933,- С. 175-175.

15. Поликлональность и полиспсцифичкостъ иммунного ответа на

якзо- и янцогенные химические соединения // Актуальные вопросы иммунодиагностики и иммунорегуляции.- Тр. Таллин, 1983.-С.59-70 С Соавт. А.А.Бажова, А.С.Закс, Т.А.Юшкова).

17. А.с. 1101768 СССР. Способ определения холинотропкых свойств веаеотв / А.А.Быкова, З.В.Савкин, Г.А.Попыванова.-

3242505 /23-13 заявлено 03.02.81. Билл, открытий и изобретений, 193^.- № 25. ''