Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Окислительно-антиоксидантный потенциал липопротеинов низкой плотности и содержание окисленных производных холестерина в динамике развития коронарного атеросклероза

На правахрукописи

Каштанова Елена Владимировна

ОКИСЛИТЕЛЬНО-АНТИОКСИДАНТНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ И СОДЕРЖАНИЕ ОКИСЛЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХОЛЕСТЕРИНА В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ КОРОНАРНОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ' диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК-2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Душкин Михаил Иванович Рагино Юлия Игоревна

Поляков Лев Михайлович Сафронов Игорь Дмитриевич

Ведущая организация: Новосибирская государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита состоится «г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 001.048 01 в ГУ Научном центре клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (3832) 33-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научного центра клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания атеросклероти-ческого генеза являются основной причиной смертности трудоспособного населения во всех высокоразвитых странах, включая Россию (Оганов Р. Г., 2004; Murray С J, Lopez A.D., 1997).

В последние годы в патогенезе атеросклероза все большее признание получает концепция ключевой роли окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛНП) как инициаторов, провокаторов и индукторов атерогенеза в сосудистой стенке (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., 1996; Heinecke J.W., 1987; Sparrow СР., 1989; Zhang Z. et al., 1990; Lamb D.J., 1992; Zieden В., 1992; Jessup W. et al., 1993; Keidar S. et al., 1994; Westhuyzen J., 1997). Окислительная модификация ЛНП способствует их быстрому и нерегулируемому захвату через скэвенджер-рецепторы макрофагов (МФ), что приводит к массивному внутриклеточному накоплению холестерина (ХС) и его эфиров и трансформации макрофагов в пенистые клетки (Никитин ЮЛ. и др., 1998; Ланкин В.З. и др., 2000; Steinbrecher U.P., 1990; Krauss R. M, 1991; Westhuyzen J., 1997; Steinberg D., 2002). Атерогенность окисленных ЛНП связана не только с повышенным содержанием в них ХС, но и с их способностью стимулировать продукцию целого ряда воспалительных медиаторов: хемоаттрактантов к моноцитам и лимфоцитам, цитокинов, активных кислородных метаболитов (АКМ) (Steinberg D. et al., 1989; Esterbauer H. et al., 1989-1993; Steinbrecher U.P., 1990; Leake D.S., 1991; Aviram M., 1993; Aviram M., 1995; Aviram M., 1998; Huang Y. et al., 1999; Petit L. et al., 1999).

Впервые исследовать степень "предрасположенности" ЛНП к окислительной модификации по показателю устойчивости ЛНП к окислению in vitro было предложено Г. Эстербауэром и соавт. (Esterbauer H. et al., 1989). Они предложили оценивать продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) в выделенных ультрацентрифугированием ЛНП в динамике их окисления в присутствии ионов металлов переменной валентности. Авторы назвали этот показатель резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению in vitro. В дальнейшем было показано, что устойчивость ЛНП к окислению отражает баланс прооксидантов и антиоксидантов в крови и в ЛНП, нарушение которого ассоциируется с развитием атеросклероза (Esterbauer H. et al., 1989; Cominacini L. et al., 1991). Этот комплексный показатель отражает, с одной стороны, количество в ЛНП полиненасыщенных жирных кислот (основного субстрата окисления) и продуктов ПОЛ (диены, малоновый диальдегид и др.) и, с другой стороны, антиоксидантный потенциал ЛНП (Cominacini L. et al., 1991).

Основным антиоксидантом в ЛНП является а-токоферол, количество которого в частицах ЛНП превалирует над другими липофильными антиоксидантами. Альфа-токоферол первым расходуется при окислении ЛНП (Esterbauer H. et al., 1989,1992). Ретинол содержится в ЛНП в меньшем количестве, но также препятствует их окислительной модификации (Esterbauer Н. et al., 1992). Поскольку ЛНП крови являются основной мишенью процесса

ПОЛ, их резистентность к окислен»

служить

показателем, характеризующим окислительно-антиоксидантную систему в целом.

Окисление ЛНП сопровождается образованием окисленных производных ХС, называемых оксистеролами. В последнее время интерес к участию этих соединений в атерогенезе значительно повысился. Это связано с обнаружением высоких концентраций оксистеролов в атеросклеротических бляшках и в макрофаг/пенистых клетках (Bjorkhem L. et al., 1991; Mattsson L., 1996; Jessup W.et al., 1997).

Известно, что оксистеролы обладают индуцирующим атерогенным эффектом в сформированных атеросклеротических бляшках человека и кролика (Bjorkhem L. et al., 1994; Mattsson L. et al., 1996; Brown M.S. et al, 1997, 1999) Однако, изменение количественного и качественного состава этих соединений в динамике стадийного развития атеросклероза мало изучено.

Таким образом, окисление ЛНП и образование оксистеролов в атеросклеротичекой бляшке являются важными показателями развития атеросклероза. Взаимосвязь же между степенью окисления ЛНП и содержанием оксистеролов (таких, как 7-кето-ХС) остается мало изученной. Более того, практически нет данных о степени выраженности окислительной модификации ЛНП в зависимости от распространенности в сосудах атеросклеротических очагов.

Цель исследования:

Изучить взаимосвязь между окислительно-антиоксидантным потенциалом липопротеинов низкой плотности и накоплением окисленных производных холестерина (оксистеролов) в процессе развития атеросклероза

Задачи исследования:

1. Исследовать резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению т vitro у пациентов с различной выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий в сравнении с контрольной группой лиц.

2. Исследовать содержание а-токоферола и ретинола в липопротеинах низкой плотности у пациентов с различной степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий в сравнении с контрольной группой лиц

3. Исследовать соотношение 7-кето-холестерина и 27-ОН-холестерина в процессе развития атероматозных бляшек коронарных артерий пациентов с коронарным атеросклерозом.

4. Исследовать регуляторную роль различных оксистеролов в процессах эстерификации холестерина и накопления липидов в атеросклеротических бляшках человека и на модели культивируемых макрофагов.

Научная новизна.

Впервые было обнаружено, что резистентность ЛНП к окислению связана с выраженностью и распространенностью поражения коронарных артерий

атеросклерозом: при 2-,3-,4-сосудистом поражении этот показатель более низкий, по сравнению с одно-сосудистым поражением.

Впервые показано, что характер окисления холестерина зависит от стадии развития атеросклеротической бляшки: на стадии раннего атеросклероза (липидное пятно) превалирует 27-ОН-ХС (продукт внутриклеточной гидроксилазы), стимулирующий эстерификацию ХС в макрофаг/пенистых клетках. На поздних стадиях атеросклероза основным оксистеролом в бляшке является 7-кето-ХС (продукт процесса аутоокисления ХС), который значительно в меньшей степени оказывает влияние на эстерификацию ХС.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в том, что установлены особенности накопления оксистеролов различного происхождения (основного продукта аутоокисления холестерина 7-кето-ХС и продукта ферментативного гидроксилирования холестерина 27-ОН-ХС) в динамике развития атеросклеротической бляшки. Установлено, что на ранних стадиях развития атеросклеротической бляшки в меньшей степени присутствует 7-кето-ХС, содержание которого увеличивается по мере развития атеросклероза. В тоже время 27-ОН-ХС обнаруживается как на ранних, так и на поздних стадиях развития атеросклеротической бляшки. Эксперименты, проведенные на модели макрофагов, свидетельствуют, что эти оксистеролы могут являться стимуляторами накопления липидов в атеросклеротической бляшке.

Практическое значение работы заключается в том, что продемонстрирована возможность применения в клинической биохимии простого оригинального и информативного способа оценки показателя окислительной резистентности ЛНП, низкое значение которого может являться дополнительным маркером атеросклероза. Показатель уровней а-токоферола и ретинола непосредственно в ЛНП является более информативным, чем определение этих антиоксидантов в крови, поскольку реально отражает окислительно-антиоксидантный дисбаланс в ЛНП.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характерными показателями, отражающими окислительно-антиоксидантный дисбаланс при коронарном атеросклерозе, являются сниженные окислительная резистентность и антиоксидантный потенциал липопротеинов низкой плотности. Эти изменения более выражены при значительном распространении атеросклеротического поражения коронарных артерий.

2. На ранних стадиях развития атеросклеротического поражения наблюдается более низкое содержание аутоокисленных форм холестерина по отношению к продуктам ферментативного гидроксилирования холестерина. На поздних стадиях развития атеросклеротического поражения соотношение этих оксистеролов сдвигается в сторону увеличения концентрации 7-кето-ХС.

3. Оксистеролы 27-ОН-ХС и 7-кето-ХС, накапливающиеся в атеросклеротической бляшке по мере ее развития, стимулируют синтез липидов в макрофаг/пенистых клетках.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на 11-ой научно-практической конференции "Актуальные вопросы современной медицины" (Новосибирск, 2001); Сибирской научно-практической конференции "Проблемы кардиологии пожилого и старческого возраста" (Барнаул, 2002); III научных чтениях, посвященных памяти академика Е.Н. Мешалкина (Новосибирск, 2002); X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003); Всероссийской научной конференции с международным участием "Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний" (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты, обсуждение, выводы, список используемой литературы. Текст изложен на 101 странице машинописного текста, иллюстрирован 18 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 156 работ, из них 26 отечественных и 130 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основную группу наблюдения составили 62 мужчины с ишемической болезнью сердца (ИБС) в форме стабильной стенокардии напряжения II или III функционального класса в возрасте от 38 до 60 лет, в среднем 50,7+2,1 года. Диагноз ИБС был верифицирован данными коронароангиографического исследования, а также по наличию в анамнезе перенесенного инфаркта миокарда или эпизодов нестабильной стенокардии, документированных описанием клинической картины заболевания, результатами ЭКГ-исследования и биохимических анализов крови. Согласно данным коронароангиографии, у всех мужчин (100%) имелось одно-, двух-, трех- или четырех-сосудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий. Инфаркт миокарда в анамнезе был у 43 человек (69%). Согласно данным клинической картины заболевания и ЭКГ-исследований, у всех мужчин (100%) была ИБС в форме стабильной стенокардии напряжения II и III функционального класса. Длительность заболевания колебалась от 3 до 22 лет. Все 62 пациента были госпитализированы в Научно-исследовательский институт патологии кровообращения (НИИПК) им. Е.Н. Мешалкина МЗ РФ, где им выполнялась коронароангиография (КАТ). Далее, у части пациентов по показаниям была проведена операция аортокоронарное шунтирование. Забор биологического материала у пациентов (кровь, операционный материал) проводили в НИИПК им. Е.Н. Мешалкина МЗ РФ под руководством, д.м.н., профессора Чернявского A.M. Дальнейшие биохимические исследования биологического материала проводили в НИИ терапии СО РАМН. Координатор исследования д.м.н., профессор Воевода М.И.

Контрольную группу составили 95 мужчин в возрасте от 36 до 59 лет (в

среднем 50,0+7,0 лет), без клинических признаков ИБС и без факторов риска. Обследованные не имели признаков сердечно-сосудистых заболеваний согласно клинических и ЭКГ данных. В группу не включали мужчин с сахарным диабетом. Все мужчины контрольной группы имели нормальные показатели биохимического и лабораторного исследований крови и мочи. Поэтому их можно применительно к данной работе назвать практически здоровыми.

У всех пациентов кровь для биохимического исследования брали утром натощак из локтевой вены не ранее, чем через 12 часов после последнего приема пищи. Содержание общего ХС, ТГ и ХС-ЛВП (липидный профиль) в сыворотке крови определяли ферментативными методами с использованием стандартных реактивов "Biocon" на биохимическом автоанализаторе "Labsystem". Исследования выполнены совместно со ст.н.с. НИИ терапии СО РАМН Ивановой М. В.

Концентрации жирорастворимых витаминов (а-токоферола и ретинола) в сыворотке крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в модификации, используя оригинальный микрометод анализа содержания токоферола в биоматериале с помощью ВЭЖХ, на отечественном, микроколоночном хроматографе «Милихром» (Микичур Н.И., Сафронов И.Д., 1998). Хроматографический анализ проводился в НЦ КЭМ СО РАМН. Концентрации а-токоферола и ретинола непосредственно в ЛНП определяли флуориметрическим способом (Taylor S.L. el al., 1976) в оригинальной модификации (Рагино Ю.И., Каштанова Е.В., 2002).

Окислительную резистентность ЛНП in vitro оценивали оригинальным способом, разработанным в НИИ терапии СО РАМН (Рагино Ю.И, Душкин М.И., 1998). Суммарную фракцию ЛНП и ЛОНП (преимущественно ЛНП) получали из 0,5 мл сыворотки крови методом осаждения (Карманский И.М., Шпикитер В.О., 1981, Burstein M., Scholnik H.R., 1973), в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки). В полученных липопротеинах определяли содержание белка по методу Лоури (Lowry H., Roenbrought N.J. et al., 1951). Окислительную модификацию ЛНП проводили в среде Дульбекко без кальция и магния, содержащей 50 мкмоль CuSO4 в присутствии 0,2 мг/мл белка ЛНП. Пробы инкубировали при 37°С на водяной бане. Через определенные промежутки времени (0 ч, 0,5ч, 1ч, 2 ч) оценивали уровень ТБК-реактивных продуктов в 0,3 мл инкубационной среды, содержащей ЛНП. Определение ТБК-реактивных продуктов (МДА) проводили флуориметрическим методом на спектрофлуориметре "Hitachi F-300" (Schuh J., Fairclough G.F., 1978).

Операционный материал забирали во время операции аортокоронарного шунтирования, в ходе которого проводили по показаниям эндартериоэктомию нижней части правой коронарной артерии. Полный гистологический анализ забранного операционного материала проводили в НИИПК им. Е.Н. Мешалкина МЗ РФ. Для получения гомогената образцы замораживали в жидком азоте и растирали в фарфоровой ступке в растворе PBS (фосфатно-солевой буфер).

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ :метанол (2:1, об об), содержащем 10 мкМ антиоксиданта бутирилгидрокситолуола (Folch et al., 1957). Липиды разделяли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в 2-х системах растворителей гексан:диэтиловый эфир:уксусная кислота 60:40:1 и 90:10:1, фракции липидов экстрагировали хлороформ:метанол 2:1 и содержание свободного и эстерифицированного ХС определяли с использованием о-фталевого альдегида (Morel et al., 1973).

Анализ оксистеролов в липидном экстракте проводили после мягкой сапонификации экстрактов в растворе метанол:вода (5:1, об:об), содержащем 5М NaOH и бутирилгидрокситолуол, в течение 15 ч при комнатной температуре (Bjorkhem et al., 1994). Стероидную фракцию экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1) и концентрированные под током азота образцы разделяли на свободный ХС и общие оксистеролы на ТСХ пластинах в системе толуолэтилацетат (40:60) по методу Гупта (Gupta et al., 1986).

Фракцию оксистеролов экстрагировали из силикагеля хлороформ: метанолом и экстракты использовали для анализа методом ЖХВД.

Макрофаги получали из перитонеальной жидкости мышей (линии C57Bt) на 5-е сутки после введения 5% крахмала и культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крови, 50 мкг/мл гентамицина в чашках Петри плотностью 1,5-2х106 клеток на чашку. После инкубации в течении двух часов в атмосфере 5% СС2 при 37°С в СО2-инкубаторе клеточный монослой отмывали 3 раза средой RPMI-1640 для удаления не прикрепившихся клеток и культивируемые клетки использовали для дальнейших экспериментов.

Скорость биосинтеза ЭХС, ТГ в монослое МФ оценивали по включению Н"С]-олеата в ЭХС. Для этого в среду RPMM640, содержащую 0,2% БСА, 2мМ L-глютатиона, вводили [14С]-олеат, связанный с БСА, в концентрации 0,2мМ. Макрофаги инкубировали 4 часа. Липиды экстрагировали in situ смесью гексан:изопропанол (3:2, об:об), высушивали под азотом и растворяли в хлороформе. Затем проводили разделение липидов методом тонкослойной хроматографии. Пятна ЭХС и ТГ проявляли в парах йода, соскребали их в сцинтилляционные флаконы и считали радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике Mark-З по программе STD-2.

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием пакета статистических программ SPSS for Windows (версия 10). Значения в таблицах представлены как М±т, где М - среднее арифметическое значение, m - стандартная ошибка среднего. Достоверность различий между средними значениями оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при 5% уровне значимости (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Резистентность ЛНП к окислению и уровни а-токоферола и ретинола в крови и в ЛНП у здоровых мужчин и у мужчин с коронарным атеросклерозом

Для оценки окислительно-антиоксидантного потенциала ЛНП у мужчин с коронарным атеросклерозом и у практически здоровых мужчин были исследованы исходный уровень ТБК-реактивных продуктов в ЛНП, резистентность ЛНП в динамике окисления in vitro и концентрация жирорастворимых антиоксидантов - а-токоферола и ретинола в крови и в ЛНП.

Показано, что ЛНП у больных коронарным атеросклерозом содержали более, чем в 4 раза, повышенный (р<0,001) исходный уровень продуктов ПОЛ по сравнению с ЛНП у лиц контрольной группы. Выявлено значительное снижение резистентности ЛНП к окислению у больных коронарным атеросклерозом (рис. 1). Так, ЛНП у них после 0,5, 1 и 2 ч инкубации с катализаторами окисления - ионами меди - содержали почти в 5, 3 и 2 раза, соответственно, повышенное количество продуктов ПОЛ в сравнении со здоровыми мужчинами.

нмольМДА'мг белка ЛНП

Рис. 1. Резистентность ЛНП к окислению у здоровых мужчин и мужчин с коронарным атеросклерозом. Отличия достоверны по сравнению с группой здоровых мужчин, * - р<0,001.

Поскольку витамины а-токоферол и ретинол играют большую роль в защите ЛНП от окислительных изменений, для оценки антиоксидантного потенциала ЛНП были исследованы концентрации этих витаминов в сыворотке крови и в ЛНП. При коронарном атеросклерозе концентрации а-токоферола и ретинола в ЛНП были снижены (рис. 2). Так, у мужчин с коронарным атеросклерозом концентрация а-токоферола в ЛНП была ниже в 13 раза, чем у практически здоровых мужчин (1,35+0,22 и 1,83±0,25 мг/мг белка ЛНП, соответственно, р<0,01). Концентрация ретинола в ЛНП при коронарном

атеросклерозе была ниже в 1,4 раза, чем у мужчин контрольной группы (56,7+9,9 и 79,9+11,2 мкг/мг белка ЛНП, соответственно, р<0,01)

Рис. 2. Концентрация а-токоферола и ретинола в ЛНП у здоровых мужчин и мужчин с коронарным атеросклерозом. Отличия достоверны по сравнению с группой здоровых мужчин, * - р<0,01.

Были получены данные различий резистентности ЛНП к окислению в возрастных группах здоровых мужчин. Окислительная резистентность ЛНП у мужчин возрастной группы 51-59 лет была ниже, чем у возрастной группы 3540 лет (рис 3) При этом не было выявлено отличий в содержании витамина Е и А в ЛНП и в сыворотке крови в возрастных группах здоровых мужчин Полученные данные свидетельствуют о том, что резистентность ЛНП к окислению является высоко чувствительным показателем в отношении выявления признаков "окислительного стресса" в атерогенезе, приводящего к дисбалансу прооксидантно/антиоксидантной системы.

Подобных различий резистентности ЛНП к окислению между разными возрастными группами пациентов с коронарным атеросклерозом не отмечено.

нмоль МДА/мг белка ЛНП

х ,

* ^

10

*

£

0

0 05 1 г

Возраст 35-40 лет 18 3 69 83

Возраст 41 50 пет 22 43 88 13 3

Возраст 51-59 пет 21 52 89 135

Возраст 35-4О лег ^-Возраст 41-50 лет Я-Возраст 51-56 лет

Рис. 3. Резистентность ЛНП к окислению у практически здоровых мужчин различных возрастных групп. Отличия достоверны по сравнению с группой 35-40 лет, * - р<0,01.

При исследовании подгрупп пациентов с коронарным атеросклерозом со стабильной стенокардией напряжения П и Ш функционального класса не было выявлено статистически значимых различий как в показатели резистентности ЛНП к окислению, так и в уровнях а-токоферола и ретинола в сыворотке крови и в ЛНП.

В то же время, отмечены явные различия в показателе исходного уровня продуктов ПОЛ в ЛНП и в резистентности ЛНП к окислению на протяжении всего периода их инкубации с катализаторами окисления между подгруппами пациентов с коронарным атеросклерозом в зависимости от количества атеросклеротически пораженных артерий (рис.4). Так, исходный уровень продуктов ПОЛ в ЛНП у лиц с 2-, 3- и 4-х сосудистым поражением коронарных артерий был в 1,3, 2,2 и 2,4 раза выше, чем у мужчин с одно-сосудистым поражением коронарных артерий. Уровень ТБК-реактивных продуктов в ЛНП после 0,5ч, 1ч и 2ч их инкубации с ионами меди у лиц с 2-, 3- и 4-х сосудистым поражением коронарных артерий был в среднем в 1,5, 2,2 и 2,1 раза выше, чем у мужчин с одно-сосудистым поражением коронарных артерий. Были выявлены статистически значимые снижения концентрации а-токоферола и ретинола (р<0,05) в группе пациентов с 4-х сосудистым поражением коронарных артерий в сравнении с больными коронарным атеросклерозом с одно-сосудистым поражением.

Рисунок 4. Резистентность ЛНП к окислению у мужчин с коронарным атеросклерозом в зависимости от количества атеросклеротически пораженных артерий. Отличия достоверны по сравнению с подгруппой с одно-сосудистым поражением, *- р<0,05

Известно, что при остром инфаркте миокарда наблюдается снижение активности ферментативных антиоксидантных систем крови (Коган А. и др, 1992).

Таблица 1

Исходный уровень продуктов ПОЛ в ЛНП и устойчивость ЛНП к окислению (нмоль МДА/мг белка ЛНП) у мужчин с коронарным атеросклерозом в зависимости от наличия в анамнезе перенесенного инфаркта миокарда

Примечание: * - достоверность различий по сравнению с больными ИБС без инфаркта миокарда в анамнезе, р<0,01.

При проведении сравнительного анализа исследуемых показателей в зависимости от наличия в анамнезе перенесенного инфаркта миокарда пациентами с коронарным атеросклерозом нами обнаружено, что в этом случае исходный уровень продуктов ПОЛ был выше, а резистентность ЛНП к

окислению ниже в сравнении с мужчинами без инфаркта миокарда в анамнезе (табл. 1). Полученный результат отражает большую степень выраженности прооксидантно/антиоксидантного дисбаланса при значительном коронарном атеросклерозе, приводящем ранее к развитию инфаркта.

Различий в уровнях а-токоферола и ретинола в ЛНП между указанными группами пациентов нами не отмечено. Получены данные неизмененного уровня а-токоферола и ретинола в ЛНП в подгруппах пациентов с коронарным атеросклерозом в зависимости от перенесенного инфаркта миокарда и в подгруппах здоровых мужчин разного возраста. Эти результаты свидетельствуют о том, что резистентность ЛНП к окислению in vitro является, по сравнению с одним только содержанием антиоксидантов в ЛНП, более комплексным и информативным показателем, реально отражающим антиоксидантно-прооксидантные процессы в ЛНП и, более чувствительно реагирующим на их дисбаланс.

Таким образом, у мужчин с коронарным атеросклерозом выявлены атерогенные изменения в виде повышенного исходного уровня продуктов ПОЛ в ЛНП и сниженной их резистентности к окислению по сравнению с практически здоровыми мужчинами. При выраженной распространенности атеросклеротического процесса (4-х сосудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий) исходный уровень продуктов ПОЛ в ЛНП выше, а резистентность ЛНП к окислению ниже более, чем в 1,5 раза в сравнении с менее распространенным атеросклеротическим процессом (одно-сосудистое поражение).

Содержание оксистеролов, холестерина и его эфиров на разных стадиях развития коронарного атеросклероза

Известно, что окисленные ЛНП и макрофаг/пенистые клетки, выделенные из атеросклеротических бляшек человека и экспериментальных животных, содержат значительные количества окисленных производных ХС (оксистеролов), которые могут инициировать образование атеросклероза. С целью изучения накопления различных оксистеролов и определения их роли в последовательных стадиях развития атеросклероза было исследовано 16 образцов атеросклеротической и нормальной ткани коронарных артерий, полученных во время операции аорто-коронарного шунтирования у пациентов с коронарным атеросклерозом. Образцы, согласно гистологическим исследованиям, проведенным в НИИПК им. Е.Н. Мешалкина, классифицировали на 3 типа: 1) без признаков атеросклероза; 2) атеросклероз на стадии "липидного пятна"; 3) атеросклеротические фиброзные бляшки.

Результаты исследования липидного состава представлены в таблице 2. Они свидетельствуют, что в нормальной ткани коронарной артерии наблюдается низкий уровень свободного ХС (9,5±0,8 мкг/мг белка) и практически отсутствуют эфиры ХС (ЭХС). В образцах на стадии "липидного пятна" и фиброзной бляшки отмечается прогрессивный рост уровня СХС в 2,5 и 6,6 раз, соответственно, в сравнении с нормальной тканью. Содержание

эфиров ХС на стадии "липидного пятна" сразу очень высокое, и увеличивается в процессе развития фиброзной бляшки еще в 2,8 раз (р<0,05).

В образцах нормальной ткани было обнаружено присутствие только 27-ОН-ХС в низкой концентрации (табл. 2), в то время как другие оксистеролы не детектировались. На стадии "липидного пятна" отмечался 22-кратный рост концентрации 27-ОН-ХС в ткани и появление относительно низких концентраций 7-кето-ХС. На стадии фиброзной бляшки наблюдалось дальнейшее повышение в 2 раза концентрации 27-ОН-ХС и появление значительной концентрации 7-кето-ХС (2,4±0,4), в 6 раз превышающей таковую на стадии "липидного пятна". Различия между стадиями липидного пятна и фиброзной бляшки были статистически достоверны (р<0,05).

Таблица 2

Содержание оксистеролов, ХС и его эфиров на разных стадиях развития атеросклеротического поражения

Наименование образцов Содержание ХС, мкг/мг белка Содержание оксистеролов, мкг/мг ХС

СХС эхе 7-кето-ХС 27-ОН-ХС

Нормальная ткань (п=5) 9,5±0,8 нд. Н.Д. 0,06±0,0

Липидное пятао (п=5) 24,0±6,3 163,0±24,0 0,4±0,04 1,3±0,2

Фиброзная бляшка (п=6) 63,0±9,9* 449,0±79,0* 2,4±0,40* 2,6±0,3*

н.д. - не детектировались.

Примечание: * - достоверность различий по сравнению с липидным пятном, р<0,05.

На рисунке 5 представлена хроматограмма детекции различных оксистеролов на последовательных стадиях развития атеросклеротического поражения (метод ЖХВД).

Таким образом, в процессе развития атеросклеротического поражения от липидного пятна к фиброзной бляшке уровень 27-ОН-ХС увеличивается в 2 раза, а содержание 7-кето-ХС повышается в 6 раз, что свидетельствует об изменении соотношения между этими оксистеролами. Так, на ранних стадиях развития атеросклеротического поражения наблюдается более низкое содержание аутоокисленных форм холестерина по отношению к продуктам ферментативного гидроксилирования холестерина (27-ОН-ХС:7-кето-ХС=3:1). На поздних стадиях развития атеросклеротического поражения соотношение этих оксистеролов выравнивается (27-ОН-ХС:7-кето-ХС=1:1). Полученные данные позволяют предполагать, что на ранних стадиях развития атеросклеротической бляшки в основном происходит образование внутриклеточных форм гидроксилированного ХС, тогда как на более поздних стадиях образуются как аутоокисленные, так и энзиматически гидроксилированные формы оксистеролов.

ЖХВД ОКСИСТЕРОЛОВ, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЗ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХКОРОНАРНЫХ СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА

Прибор - нМШ!!!Х|М>М-2' Каяонка - ЯР-18

~)тснг - граяисит ксжиектрач'И! - И30 шпъиоя

Слрестъ-100 мкл/мин

Дм™ «оли (им)-210, 220 230.240.2^0

Рис. 5. ЖХВД оксистеролов, экстрагированных из атеросклеротических коронарных сосудов человека

Влияние оксистеролов на липидный обмен в макрофагах

Поскольку нами было выявлено, что основными компонентами атеросклеротической бляшки являются 7-кето-ХС - продукт аутоокисления ХС и 27-ОН-ХС - продукт внутриклеточного гидроксилирования ХС, концентрации которых совпадают с увеличением содержания ЭХС в атеросклеротических бляшках, мы исследовали влияние этих оксистеролов на скорость образования ЭХС и ТГ. Показано, что 27-ОН-ХС в 1,9 раз более эффективно в сравнении с 7-кето-ХС стимулирует синтез ЭХС (рис. 6).

Рис 6. Влияние экзогенных оксистеролов (5мкг/мл) на скорость включения [14С]-олеата в эфиры ХС. Отличия достоверны по сравнению с контролем, *-р<0,05.

Известно, что активация синтеза ТГ возникает при нарушении р-окисления ЖК в митохондриях, после нарушения митохондриальных мембран. Поэтому мы исследовали влияние двух оксистеролов на включение меченного [14С]-олеата в ТГ (рис.7). При этом было обнаружено, что 27-ОН-ХС не влияет на синтез ТГ в макрофагах. В то же время, как видно из рисунка 7, 7-кето-ХС повышает уровень синтеза ТГ на 60% от контрольного уровня

Рис. 7. Влияние экзогенных оксистеролов (5мкг/мл) на скорость включения [14С]-олеата в ТГ. Отличия достоверны по сравнению с контролем, *- р<0,05.

Таким образом, оксистеролы 27-ОН-ХС и 7-кето-ХС, накапливающиеся в атеросклеротической бляшке по мере ее развития, стимулируют синтез липидов, прежде всего ЭХС, в макрофагах, приводя к их трансформации в "пенистые клетки".

ВЫВОДЫ:

1. У мужчин с коронарным атеросклерозом значительно повышен исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности и снижена резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению по сравнению с практически здоровыми мужчинами.

2. При выраженной распространенности атеросклеротического процесса (4-х сосудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий) исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности выше, а резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению ниже в сравнении с менее распространенным атеросклеротическим процессом (одно-сосудистое поражение).

3. У мужчин с коронарным атеросклерозом снижена концентрация в липопротеинах низкой плотности а-токоферола и ретинола по сравнению с практически здоровыми мужчинами. При выраженной распространенности атеросклеротического ' процесса (4-х сосудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий) уровень а-токоферола и ретинола в сыворотке крови ниже в сравнении с менее распространенным атеросклеротическим процессом (одно-сосудистое поражение).

4. При коронарном атеросклерозе, в процессе развития атеросклеротического поражения в коронарных артериях от липидного пятна к

фиброзной бляшке уровень 27-ОН-ХС увеличивается в 2 раза, а содержание 7-кето-ХС повышается в 6 раз.

5. В атеросклеротических поражениях, по мере развития и трансформации липидного пятна в фиброзную бляшку, повышенный уровень оксистеролов, ассоциируется с увеличением эфиров холестерина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Окислительная способность липопротеинов низкой плотности, концентрации жирорастворимых антиоксидантов и субфракционный состав липопротеинов крови при коронарном атеросклерозе / Ю.И. Рагино, Е.В. Семаева, Е.В. Каштанова, Е.В. Березовская, Е.П. Гусар, Ф.В. Тузиков, А.М. Чернявский, М.И. Воевода, Ю.П. Никитин // Тез. докл. 11 науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы современной медицины». -Новосибирск, 2001. - С. 328.

2. Study of changes in oxidative/antioxidative status of low-density lipoproteins in middle aged, elderly and long-living men in Novosibirsk / Yu. Ragino, V. Pentegova, E. Kashtanova, E. Berezovskaja, A. Shabalin // Abstract of 72th EAS Congress, Atherosclerosis. (Suppl.). - 2001. - Vol. 2/2. - P. 58.

3. Heterogeneos composition of lipoprotein subtractions and oxidative capacity of low density lipoproteins in coronary artery disease patients with hyperlipidaemia / Yu. Ragino, E. Kashtanova, E. Berezovskaja, F. Tuzikov, N. Tuzikova, M. Voevoda // Abstract of 72th EAS Congress, Atherosclerosis. (Suppl.). - 2001. - Vol. 2/2. - P. 120.

4. Окислительная резистентность липопротеинов низкой плотности, концентрация жирорастворимых антиоксидантов у людей старческого возраста и долгожителей г. Новосибирска / А.В. Шабалин, Ю.И. Рагино, М.И. Воевода, Е.В. Каштанова, В.Н. Максимов, В.А. Пентегова, Ю.А. Курова // Тез. докл. Сиб. науч.-практ. конф. «Проблемы кардиологии пожилого и старческого возраста, г. Барнаул. - 2002. - С. 140-141.

5. Oxidative resistance and liposoluble antioxidants of low density lipoproteins in old people and long-living people in Novosibirsk / A. Shabalin, Yu Ragino, E. Kashtanova, V, Pentegova, Yu. Nikitin // Клин, геронтология. - 2002. - Т. 8. -№5.-C. 155.

6. Рагино Ю.И. Простой способ оценки концентрации витаминов Е и А в липопротеинах низкой плотности / Ю.И. Рагино, Е.В.Каштанова // Клин.

, лаб. диагностика. -2002. -№ 12. - С. 11-13.

7. Липиды крови, окислительная резистентность липопротеинов низкой плотности, концентрация жирорастворимых антиоксидантов у людей старческого возраста и долгожителей г. Новосибирска / А В. Шабалин, Ю.П. Никитин, Ю.И. Рагино, Е.В. Каштанова, В.А. Пентегова // Успехи геронтологии. -2002. -Вып. 10. - С. 64-68.

8. Липиды, субфракции липопротеинов крови и окислительно-антиоксидантный потенциал липопротеинов низкой плотности у

пациентов с коронарным атеросклерозом / Ю.И. Рагино, Е.В. Семаева, Е.В. Каштанова, Ф.В. Тузиков, Н.А. Тузикова, М.В. Иванова, Р.В. Галимов, А.М. Чернявский, MR Воевода // III науч. чтения, посвящ. памяти акад. Е Н. Мешалкина: Тез. докл. - Новосибирск, 2002. - С. 86-87.

9. Рагино Ю.И. Устойчивость липопротеинов низкой плотности к окислению как критерий эффективности антиатерогенной терапии / Ю.И Рагино, Е.В. Каштанова, ЮЛ. Никитин// Тез. докл X Рос. национ. конгресса "Человек и лекарство", Москва. - 2003. - С. 444.

10.Липидный спектр крови и резистентность к окислению липопротеинов сыворотки крови у больных коронарным атеросклерозом в Западной Сибири / М.И. Воевода, Ю.И. Рагино, Е.В. Каштанова, Е.В. Семаева, М.В. Иванова, A.M. Чернявский, Ю.П. Никитин // Бюл. СО РАМН. - 2003. - № 3(109).-С. 47-50.

11.Уровни и ассоциации продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности у подростков с гиперхолестеронемией и их родителей / СВ. Петухова, Е.В. Каштанова, Ю.И. Рагино, ДВ. Денисова, Е.В. Завьялова // Тез. докл. Всерос. науч. конф. с междунар. участием "Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний". -Москва, 2003. - С. 193-194.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АКМ - активные кислородные метаболиты

БСА - бычий сывороточный альбумин

ЖК - жирные кислоты

ЖХВД - жидкостная хроматография высокого давления

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ЛВП - липопротеины высокой плотности

ЛНП -липопротеины низкой плотности

ЛОНП - липопротеины очень низкой плотности

МДА - малоновый диальдегид

МФ - макрофаги

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СХС - свободный холестерин

ТБК -тиобарбитуровая кислота

ТГ - триглицериды

ТСХ - тонкослойная хроматография

ХС - холестерин

ЭХС - эфиры холестерина

Соискатель

Каштанова Е. В.

»--536

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета формат 60x84/16, объем 1,0 п л, тираж 100 экз, заказ № 472 , подписано в печать 23 12 04 г

Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания атеросклеротического генеза являются основной причиной смертности трудоспособного населения во всех высокоразвитых странах, включая Россию (Оганов Р. Г., 2004; Murray C.J, Lopez A.D., 1997).

В последние годы в патогенезе атеросклероза все большее признание получает концепция ключевой роли окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛНП) как инициаторов, провокаторов и индукторов атерогенеза в сосудистой стенке (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995; Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б., 1996; Heinecke J.W., 1987; Sparrow С.Р., 1989; Zhang Z. et al, 1990; Lamb D.J., 1992; Zieden В., 1992; Jessup W. et al., 1993; Keidar S. et al., 1994; Westhuyzen J., 1997). Окислительная модификация ЛНП способствует их быстрому и нерегулируемому захвату через скэвенджер-рецепторы макрофагов (МФ), что приводит к массивному внутриклеточному накоплению холестерина (ХС) и его эфиров и трансформации макрофагов в пенистые клетки (Никитин Ю.П. и др., 1998; Ланкин В.З. и др., 2000; Steinbrecher U.P., 1990; Krauss R. М., 1991; Westhuyzen J., 1997; Steinberg D., 2002). Атерогенность окисленных ЛНП связана не только с повышенным содержанием в них ХС, но и с их способностью стимулировать продукцию целого ряда воспалительных медиаторов: хемоатграктантов к моноцитам и лимфоцитам, цитокинов, активных кислородных метаболитов (АКМ) (Steinberg D. et al., 1989; Esterbauer H. et al, 1989-1993; Steinbrecher U.P., 1990; Leake D.S, 1991; Aviram M, 1993; Aviram M, 1995; Aviram M, 1998; Huang Y. et al, 1999; Petit L. et al, 1999).

Впервые исследовать степень "предрасположенности" ЛНП к окислительной модификации по показателю устойчивости ЛНП к окислению in vitro было предложено Г. Эстербауэром и соавт. (Esterbauer Н. et al, 1989). Они предложили оценивать продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) в выделенных ультрацентрифугированием ЛНП в динамике их окисления в присутствии ионов металлов переменной валентности. Авторы назвали этот показатель резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению in vitro. В дальнейшем было показано, что устойчивость ЛНП к окислению отражает баланс прооксидантов и антиоксидантов в крови и в ЛНП, нарушение которого ассоциируется с развитием атеросклероза (Esterbauer Н. et al., 1989; Cominacini L. et al., 1991). Этот комплексный показатель отражает, с одной стороны, количество в ЛНП полиненасыщенных жирных кислот (основного субстрата окисления) и продуктов ПОЛ (диены, малоновый диальдегид и др.) и, с другой стороны, антиоксидантный потенциал ЛНП (Cominacini L. et al., 1991).

Основным антиоксидантом в ЛНП является а-токоферол, количество которого в частицах ЛНП превалирует над другими липофильными антиоксидантами. Альфа-токоферол первым расходуется при окислении ЛНП (Esterbauer Н. et al., 1989,1992). Ретинол содержится в ЛНП в меньшем количестве, но также препятствует их окислительной модификации (Esterbauer Н. et al., 1992). Поскольку ЛНП крови являются основной мишенью процесса ПОЛ, их резистентность к окислению, в какой-то мере, может служить показателем, характеризующим окислительно-антиоксидантную систему в целом.

Окисление ЛНП сопровождается образованием окисленных производных ХС, называемых оксистеролами. В последнее время интерес к участию этих соединений в атерогенезе значительно повысился. Это связано с обнаружением высоких концентраций оксистеролов в атеросклеротических бляшках и в МФ/пенистых клетках (Bjorkhem L. et al., 1991; Mattsson L., 1996; Jessup W. et al., 1997).

Известно, что оксистеролы обладают индуцирующим атерогенным эффектом в сформированных атеросклеротических бляшках человека и кролика (Bjorkhem L. et al., 1994; Mattsson L. et al., 1996; Brown M.S. et al.,

1997, 1999). Однако, изменение количественного и качественного состава этих соединений в динамике стадийного развития атеросклероза мало изучено.

Таким образом, окисление ЛНП и образование оксистеролов в атеросклеротичекой бляшке являются важными показателями развития атеросклероза. Взаимосвязь же между степенью окисления ЛНП и содержанием оксистеролов (таких, как 7-кето-ХС) остается мало изученной. Более того, практически нет данных о степени выраженности окислительной модификации ЛНП в зависимости от распространенности в сосудах атеросклеротических очагов.

Цель исследования:

Изучить взаимосвязь между окислительно-антиоксидантным потенциалом липопротеинов низкой плотности и накоплением окисленных производных холестерина (оксистеролов) в процессе развития атеросклероза.

Задачи исследования:

1. Исследовать резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению in vitro у пациентов с различной выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий в сравнении с контрольной группой лиц.

2. Исследовать содержание а-токоферола и ретинола в липопротеинах низкой плотности у пациентов с различной степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий в сравнении с контрольной группой лиц

3. Исследовать соотношение 7-кето-холестерина и 27-ОН-холестерина в процессе развития атероматозных бляшек коронарных артерий пациентов с коронарным атеросклерозом.

4. Исследовать регуляторную роль различных оксистеролов в процессах эстерификации холестерина и накопления липидов в атеросклеротических бляшках человека и на модели культивируемых макрофагов. Щ

Научная новизна

Впервые было обнаружено, что резистентность ЛИП к окислению связана с выраженностью и распространенностью поражения коронарных артерий атеросклерозом: при 2-,3-,4-сосудистом поражении этот показатель более низкий, по сравнению с одно-сосудистым поражением.

Впервые показано, что характер окисления холестерина зависит от * стадии развития атеросклеротической бляшки: на стадии раннего атеросклероза (липидное пятно) превалирует 27-ОН-ХС (продукт внутриклеточной гидроксилазы), стимулирующий эстерификацию ХС в МФ/пенистых клетках. На поздних стадиях атеросклероза основным оксистеролом в бляшке является 7-кето-ХС (продукт процесса аутоокисления ХС), который значительно в меньшей степени оказывает влияние на эстерификацию ХС.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в том, что установлены особенности накопления оксистеролов различного происхождения (основного продукта аутоокисления холестерина 7-кето-ХС и продукта ферментативного гидроксилирования холестерина 27-ОН-ХС) в динамике развития атеросклеротической бляшки. Установлено, что на ранних стадиях развития атеросклеротической бляшки в меньшей степени присутствует 7-кето-ХС, содержание которого увеличивается по мере развития & атеросклероза. В тоже время 27-ОН-ХС обнаруживается как на ранних, так и на поздних стадиях развития атеросклеротической бляшки. Эксперименты, проведенные на модели макрофагов, свидетельствуют, что эти оксистеролы могут являться стимуляторами накопления липидов в атеросклеротической бляшке.

Практическое значение работы заключается в том, что продемонстрирована возможность применения в клинической биохимии простого оригинального и информативного способа оценки показателя окислительной резистентности ЛНП, низкое значение которого может являться дополнительным маркером атеросклероза. Показатель уровней а-токоферола и ретинола непосредственно в ЛНП является более информативным, чем определение этих антиоксидантов в крови, поскольку реально отражает окислительно-антиоксидантный дисбаланс в ЛНП.

Положения, выносимые на защиту:

1. Характерными показателями, отражающими окислительно-антиоксидантный дисбаланс при коронарном атеросклерозе, являются сниженные окислительная резистентность и антиоксидантный потенциал липопротеинов низкой плотности. Эти изменения более выражены при значительном распространении атеросклеротического поражения коронарных артерий.

2. На ранних стадиях развития атеросклеротического поражения наблюдается более низкое содержание аутоокисленных форм холестерина по отношению к продуктам ферментативного гидроксилирования холестерина. На поздних стадиях развития атеросклеротического поражения соотношение этих оксистеролов сдвигается в сторону увеличения концентрации 7-кето-ХС.

3. Оксистеролы 27-ОН-ХС и 7-кето-ХС, накапливающиеся в атеросклеротической бляшке по мере ее развития, стимулируют синтез липидов в макрофаг/пенистых клетках.

ВЫВОДЫ:

1. У мужчин с коронарным атеросклерозом значительно повышен исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкои плотности и снижена резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению по сравнению с практически здоровыми мужчинами.

2. При выраженной распространенности атеросклеротического процесса (4-х сосудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий) исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности выше, а резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению ниже в сравнении с менее распространенным атеросклеротическим процессом (одно-сосудистое поражение).

3. У мужчин с коронарным атеросклерозом снижена концентрация в липопротеинах низкой плотности а-токоферола и ретинола по сравнению с практически здоровыми мужчинами. При выраженной распространенности атеросклеротического процесса (4-х сосудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий) уровень а-токоферола и ретинола в сыворотке крови ниже в сравнении с менее распространенным атеросклеротическим процессом (одно-сосудистое поражение).

4. При коронарном атеросклерозе, в процессе развития атеросклеротического поражения в коронарных артериях от липидного пятна к фиброзной бляшке уровень 27-ОН-ХС увеличивается в 2 раза, а содержание 7-кето-ХС повышается в 6 раз.

5. В атеросклеротических поражениях, по мере развития и if трансформации липидного пятна в фиброзную бляшку, повышенный уровень оксистеролов, ассоциируется с увеличением эфиров холестерина.