Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Сравнительная оценка эффективности экспресс-методов исследования токсических свойств наноматериалов

На правах рукописи

ГУСЬКОВА Оксана Альбертовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСПРЕСС-МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НАНОМАТЕРИАЛОВ

14.02.01 - гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

,-3 2015

Москва- 2015

005558342

005558342

Работа выполнена в ГБОУДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Хамидулина Халидя Хизбулаевна

Официальные оппоненты:

Ревич Борис Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией прогнозирования качества окружающей среды и здоровья населения Института народнохозяйственного прогнозирования РАН

Капцов Валерий Александрович, член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела гигиены труда Всероссийского НИИ железнодорожной гигиены Роспотребнадзора

Ведущая организация: ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России

Защита диссертации состоится 2015 г. в часов на

заседании Диссертационного совета Д.208.040.02 в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 1. НИЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49 и на сайте организации: www.mma.ru

Автореферат разослан « О 2015

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.м. н., профессор Манерова Ольга Александровна

Актуальность темы

Нанотехнологии в настоящее время рассматриваются как новая промышленная революция. Создание структур в нанометровом диапазоне позволяет придать им принципиально новые свойства, такие как уникальная механическая прочность, особые спектральные, электрические, магнитные, химические и биологические характеристики. Области применения наноматериалов (НМ) в современной науке и технике чрезвычайно разнообразны [Онищенко Г. Г. 2010]. Преобладающее место в структуре потребительской продукции наноиндустрии занимает косметическая продукция - 73%; пищевая продукция и упаковка для пищевых продуктов -10%; строительные материалы и бытовая химия - 8%; медицинские изделия -2% [Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Казак А.А., 2014].

В связи с тем, что в число наиболее приоритетных нановеществ, используемых в различных товарах народного потребления, входят серебро, соединения цинка и титана (парфюмерно-косметическая, пищевая и лакокрасочная продукция, медицинские изделия, упаковка для пищевых продуктов) вопросы оценки их опасности для здоровья человека становятся особенно актуальными.

В соответствии с «Концепцией токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов», утверждённой Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 31 октября 2007 г. N 79, перед Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека стоит чрезвычайно важная задача по экспертной оценке токсичности и безопасному регулированию НМ и наносодержащей продукции, обращающейся на территории РФ и других стран ЕврАзЭС.

Количество промышленно производимых НМ и наносодержащей продукции ежегодно существенно увеличивается [Гмошинский И.В., Смирнова В.В., Хотимченко С.А., 2010; Попов Н.И., Филиппов А.П., Хуршудян С.А., 2009], что затрудняет проведение оценки безопасности всех важнейших НМ обычными классическими токсикологическими методами, т.к. для этого необходимы время, большие трудозатраты и материальные ресурсы. Поэтому одним из путей интенсификации испытаний и снижения их себестоимости является применение ускоренных токсикологических

исследований на простых биологических системах, позволяющих проводить испытания in vitro.

Всё возрастающая на рынке страны номенклатура продукции, содержащей нановещества и НМ, и стоящие перед Роспотребнадзором задачи обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения требуют при проведении экспресс-оценки инновационных продуктов наноиндустрии использования альтернативных методов in vitro, наиболее эквивалентных методам in vivo. В связи с этим возникает проблема необходимости выбора среди разнообразных методик и тест-систем таких, которые были бы наиболее информативны, стандартизованы, имели объективную цифровую оценку результатов и хорошо коррелировали с данными, полученными на животных.

В соответствии с требованиями Технических Регламентов Таможенного Союза - TP ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-косметической продукции», TP ТС 008/2011 «О безопасности игрушек», утвержденных 23 сентября 2011г. и Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) раздел 5. Требования к товарам бытовой химии и лакокрасочным материалам и раздел 20. Требования к дезинфицирующим средствам, утвержденных 28 мая 2010 г. для оценки токсикологических показателей безопасности органами и организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека активно применяются такие альтернативные модели, как фотобактерии «Эколюм», сперма КРС и сосуды ХАО куриного эмбриона.

Степень разработанности проблемы

Несмотря на большое количество в отечественной и зарубежной литературе публикаций о токсичности некоторых НМ, значительная часть из них посвящена исследованиям на животных [Распопов Р.В., 2011; Шумакова А. А., 2011; Смирнова В .В., 2012; Бочарова Л .Ю., 2014; Rahman М. F., 2009; Kim Y .S., 2010; Pasupuleti S., 2012].

Следует отметить, что классические токсикологические исследования, проводимые на животных, трудоёмки, дорогостоящи и не позволяют справиться с всё возрастающими объёмами токсикологической экспертизы продукции, обращающейся как на мировом рынке, так и на территории

4

Российской Федерации. Поэтому разработка и внедрение альтернативных методов in vitro стали одним из ведущих направлений токсикологических исследований в мире.

Необходимо отметить, что имеющиеся результаты исследований на гидробионтах [Гремячих В. А., Томилина И. И. 2013; Skjolding L .М. 2014; Rosenfeldt R. R. 2014; Mwaanga Р. 2014] более приемлемы в области экологической токсикологии, а исследования на культурах клеток [Chiang Н. М. 2012; Demir Е. 2013; Tilton S. С. 2013; Sahu D. 2013] позволяют оценить лишь узкоспецифическое действие, что не всегда отвечает задачам Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по экспертной оценке токсичности НМ и наносодержащей продукции.

В доступной литературе отсутствует информация о сравнительной оценке токсичности наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vitro и in vivo. Данные обстоятельства определили цель настоящего исследования.

Цель исследования: Сравнительная оценка эффективности экспресс-методов исследования токсических свойств наноматериалов.

Задачи исследования:

1. Оценить чувствительность к наноматериалам моделей in vitro на основе параметров функционального состояния тест объектов (двигательная активность сперматозоидов (т), интенсивность биолюминесценции фотобактерий, линейная скорость кровотока).

2. Изучить общетоксическое действие наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro.

3. Изучить раздражающее действие наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro.

4. Провести сравнительную оценку эффективности использования экспресс-методов при исследовании токсических свойств наноматериалов.

5. Оценить возможность использования альтернативных моделей спермы КРС и сосудов ХАО куриного эмбриона для установления характера и выраженности общетоксического и раздражающего действия наноматериалов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено совпадение результатов изучения общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида, полученных в классических токсикологических экспериментах на животных и альтернативных моделях in vitro, что свидетельствует о возможности использования альтернативных методов при оценке токсичности наноразмерных частиц, в том числе на предварительном этапе токсиколого-гигиенических исследований при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы наносодержащей продукции.

2. Доказана высокая чувствительность альтернативных моделей и их способность в остром эксперименте улавливать токсический эффект доз, вызывающих подобный общетоксический эффект на животных лишь в условиях длительных экспериментов, что позволяет рекомендовать использование альтернативных моделей спермы КРС для скрининговой оценки общетоксического и сосудов ХАО куриного эмбриона для раздражающего действия наноматериалов.

3. Выявлено, что наиболее выраженное общетоксическое и раздражающее действие как на моделях in vivo, так и на моделях in vitro оказывают наноразмерные частицы серебра, в меньшей степени наноразмерные частицы цинка и титана диоксида. В тестах альтернативных моделей установлены параметры их цитотоксического действия.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые проведена сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в опытах на животных и на альтернативных моделях in vitro.

Установлены параметры цитотоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида на альтернативные модели: сперма КРС и фотобактерии «Эколюм».

Проведенные исследования в экспериментах на животных и альтернативных моделях: фотобактериях «Эколюм», сперме КРС и сосудах ХАО куриного эмбриона позволили выявить, что наиболее выраженное общетоксическое и раздражающее действие как в опытах in vivo, так и на моделях in vitro оказывают наноразмерные частицы серебра, в меньшей степени наноразмерные частицы цинка и титана диоксида.

Научно обосновано использование высокочувствительных альтернативных моделей для выявления различных видов токсического действия наноразмерных веществ и наноматериалов на организм.

Практическая значимость работы и внедрение результатов I исследования в практику

Обоснована прогнозирующая способность альтернативных методов при оценке токсичности наноразмерных веществ и их применение в качестве скрининга на предварительном этапе токсиколого-гигиенических ! исследований при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы наносодержащей продукции.

Материалы проведённых исследований использованы при разработке Руководства Р. 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека» в рамках выполнения Ведомственной программы Федеральной службы по надзору в сфере защиты и благополучия человека по реализации принципов надлежащей лабораторной практики в области неклинических лабораторных исследований в деятельности испытательных центров.

Результаты диссертационной работы применяются в практической деятельности ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы наносодержащей продукции (парфюмерно-косметическая продукция) для оценки общетоксического и раздражающего действия на альтернативных биологических моделях in vitro.

Работа выполнена в рамках государственного задания по науке ГБОУ ДПО РМАПО на 2012-2014 гг. «Изучение токсичности НМ в эксперименте на лабораторных животных in vivo, in vitro и ex vivo». Полученные материалы используются в учебном процессе кафедры общей гигиены и медицины труда факультета профилактической медицины и организации здравоохранения ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.

Соответствие диссертации наспорту научной специальности В соответствии с формулой специальности 14.02.01- «Гигиена», охватывающей проблемы изучения влияния факторов окружающей среды на здоровье человека, в диссертационном исследовании доказана высокая чувствительность альтернативных моделей спермы КРС и сосудов ХАО куриного эмбриона и возможность использования данных методов для

скрининговой оценки общетоксического и раздражающего действия при проведении экспертной оценки токсичности наносодержащей продукции, что соответствует области исследований п.№1 (общая гигиена).

Тема и предмет диссертации, материалы и методы исследования обсуждены на заседании Комитета по этике научных исследований ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России 24 июня 2014 года (протокол №6).

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III и V конференциях молодых учёных ГБОУ ДПО РМАПО (Москва, 2012, 2014); IV Всероссийской Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые учёные за устойчивое развитие страны в глобальном мире» (Москва, 2012); лабораторном совете ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» (Москва, 2013); IV съезде токсикологов России с международным участием (Москва, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 публикации в периодических изданиях рекомендованных ВАК, 1 международная публикация на 9 Всемирном конгрессе по альтернативным методам (Prague, 2014) и соавторство в Руководстве Р. 1.2.3156-13 «Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека».

Личный вклад автора

Автором совместно с научным руководителем разработана основная идея работы, для выполнения поставленных задач и достижения цели выбраны современные методы исследования токсичности наноразмерных веществ, обоснованы полученные результаты и практические рекомендации, вытекающие из выводов. При планировании, организации, проведении исследований по всем разделам работы доля личного вклада автора составляет не менее 80%.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы и иллюстрирована 12 рисунками. Состоит из 5 глав: введения, обзора литературы, описания методов, объёма исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических

рекомендаций и списка литературы, включающего 57 отечественных и 118 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объектами исследования являлись наноразмерные частицы

металлического серебра (Ag6noH-2), цинка в водном растворе крахмала

Zn WDx и порошка титана диоксида (ТЮ2), по данным ПЭМ, XRD и

лазерной гранулометрии средний размер (гидродинамический диаметр)

которых составлял 10 нм, 24 нм и 20 нм соответственно (Рис. 1.)

f I

Б

Рисунок 1 - Электронная микрофотография НЧ металлического серебра (А), НЧ цинка (Б).

Предметом исследований являлись токсикологические методы исследования опасных свойств наноматериалов в опытах in vitro и in vivo.

Материалы, методы и объем исследования. В работе использован комплекс экспериментальных (токсикологических, клинических, физиологических, патоморфологических, цитотоксических, физических), статистических, аналитических и библиографических методов

исследований.

Исследования проведены на базе ИЛЦ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» (аттестаты аккредитации № ГСЭН. 1Ш.ЦОА.021; № РОСС RU.0001.510895; № D-PL-14246-01-00) в соответствии с требованиями стандарта ISO/IEC 17025:2005 (DIN EN ISO 17025:2005, ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006) и Приказа Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Проведенное исследование явилось многоэтапным. Основные этапы, методы и объём исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Программа и этапы исследования.

№ Этапы исследования Методы исследования Объём исследования

1 Аналитический обзор литературы и нормативно-методических документов Библиографический Аналитический 175 литературных источников 62 нормативно-методических документа

2 Изучение общетоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в опытах in vivo и in vitro Экспериментальный (13Ь5о мг/кг, клинические, физиологические, патоморфологические показатели; Т; И) Статистический Аналитический 3340 исследований (240 нелинейных мышей, модели спермы КРС, фотобактерии «Эколюм»)

3 Изучение раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в опытах in vivo и in vitro Экспериментальный (КРД, РДС, X) Статистический Аналитический 320 исследований (80 морских свинок, 40 кроликов, 150 куриных эмбрионов)

4 Сравнительная оценка общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в опытах in vivo и in vitro Статистический Аналитический Библиографический 3660 исследований; 175 литературных источников

Токсикологические исследования на экспериментальных животных проводили в соответствии с МУ 1.2.2520-09, МУ 1.2.2635-10. Общетоксическое действие изучали комплексно по клиническим, физиологическим и патоморфологическим показателям при однократном внутрижелудочном введении. По величине ВЬ50 мг/кг; гибели животных, признакам интоксикации; наличию и характеру судорог оценивали клинические показатели. По общему состоянию животных (внешний вид,

поведение, двигательная активность, состояние шерстного покрова, потребление корма и воды, частота мочеиспускания, динамика массы тела) оценивали физиологические показатели. По макроскопическим и микроскопическим исследованиям внутренних органов и показателям весовых коэффициентов печени, почек, селезенки, надпочечников оценивали патоморфологические показатели. Местные воспалительные реакции изучали с помощью накожных аппликаций и конъюнктивальной пробы.

В целях определения возможности использования экспресс-методов in vitro для изучения общетоксического действия наноразмерных частиц проводили токсикологические исследования на сперме КРС (ГОСТ 26030-83) и фотобактериях «Эколюм» (ТУ 6-09-20-236-01). Исследования интегральной токсичности с использованием спермы КРС проводили в соответствии с МУ 1.1.037-95 на приборе «Анализатор изображений АТ-05». Результаты оценивали по изменению суммарной двигательной активности сперматозоидов S (1) контрольной и опытной проб

S=2mi (1)

и вычислению индекса токсичности И (2), представляющего собой отношение усредненной суммарной двигательной активности сперматозоидов опытной и контрольной проб, выраженное в процентах

-о

It = t-SE— ■ 100% (2)

-к

*сР

Исследование на альтернативной модели фотобактерии «Эколюм» проводили в соответствии с МУ 1.2.2634-10 с использованием люминометра «Биотоке-ЮМ». Токсическое действие исследуемой пробы определяли по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции в виде - индекса токсичности "Т" (3)

Т = 100 (Io -1) / 1о (3)

В целях оценки возможности использования альтернативного метода для установления характера и степени выраженности раздражающего действия наноразмерных частиц на слизистые оболочки использовали метод высокочастотной допплерографии на сосудах хориоаллантоисной оболочки (ХАО) 10 —дневных куриных эмбрионов кур породы белый леггорн. Оценку результатов испытаний проводили по изменению скорости кровотока (X), выраженному в процентном соотношении относительно нулевой точки

измерения по формуле (4):

(ГХ-Ю о

v sJ0-100 (УХ (4)

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel, Probit Analys, Statistica. Величины параметров токсикометрии определяли методом наименьших квадратов с помощью программы внутрилабораторного контроля Q Control v. 5. Достоверность различий определяли по критерию Манна-Уитни и t — тесту Стьюдента. Различия между группами признавали достоверными при уровне значимости Р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

На первом этапе научных исследований осуществлялась сравнительная оценка общетоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro.

При изучении общетоксического действия в экспериментах in vivo было установлено, что по показателям среднесмертельной дозы наноразмерные частицы серебра, цинка и титана при однократном внутрижелудочном пути поступления относятся к малоопасным веществам (4 класс опасности, DL>5000 мг/кг). В условиях данного эксперимента, несмотря на отсутствие летальности при однократном внутрижелудочном введении наноразмерных частиц серебра в дозе 5000 мг/кг (150 мг/животное), отмечались признаки токсического действия на центральную нервную систему, проявлявшиеся изменением двигательной активности животных (Р<0,05) (табл. 2).

Таблица 2 - Показатели поведенческих реакций у исследуемых животных после внутрижелудочного введения наночастиц серебра в дозе 5000 мг/кг.

Группы животных Комплексный метод с интегральной оценкой поведенческих параметров (время измерения 3 минуты)

Горизонтальная двигательная активность Вертикальная двигательная активность «Норковый рефлекс» Интегральная активность

Опыт 29,2±2,3 13,3±2,1* 12,2±1,3 54,8±1,8*

Контроль 32,1±1,7 18,9±1,2 13,2±1,0 64,9±2,4

*- достоверные различия Р<0,05

Проведенные исследования позволяют предположить, что наиболее чувствительным органом при воздействии наноразмерных частиц серебра является центральная нервная система. Подтверждением этому являются исследования [Rahman M.F. et al., 2009], наблюдавших при остром внутрижелудочном воздействии наноразмерных частиц серебра в дозе 1000 мг/кг (30 мг/животное) повреждение клеток головного мозга с признаками оксидантного стресса в результате проникновения наноразмерных частиц серебра через гемато-энцефалический барьер.

Следует отметить, что в литературе имеется информация о проявлении общетоксического действия наноразмерных частиц серебра при введении ещё более низких доз, но в условиях субхронических и хронических экспериментов 90 мг/кг (2,7 мг на одно животное) [van der Zande М. et al. 2012] и 5 мг/л (0,005 мг/мл) [Рахманин Ю.А. и др. 2014].

В результате изучения общетоксического действия в опытах in vitro было выявлено, что наноразмерные частицы серебра оказывают дозозависимое действие на фотобактерии «Эколюм» и сперму КРС. Действующие концентрации МО"' г/л, 1-Ю"2 г/л, 1 • 10"3г/л, МО"4 г/л вызывали тушение свечения биосенсора (рис. 2) и снижали подвижность сперматозоидов (рис. 3), что указывает на высокую чувствительность используемых моделей.

Концентрации (г/л)

Рисунок 2 - Изменение индекса токсичности при исследовании общетоксического действия наноразмерных частиц серебра на альтернативной модели фотобактерий «Эколюм».

— — - Индекс токсичности (нижняя граница нормы)

—--Индекс токсичности (верхняя граница норма)

120 ~ 100

0 -I-,-I-,-,-

0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 Концентрации (г/л)

Рисунок 3 - Изменение индекса токсичности при исследовании общетоксического действия наноразмерных частиц серебра на альтернативной модели спермы КРС.

Для удобства сравнительной оценки общетоксического действия в экспериментах in vivo и in vitro величины доз и концентраций, оказывающих токсическое воздействие, были приведены к единообразным показателям (табл. 3).

Как показывает сравнительный анализ, признаки общетоксического действия наноразмерных частиц серебра в опытах in vivo отмечались в дозах 30-150 мг/животное при изучении острой токсичности, в дозе 2,7 мг/животное в опытах по субхронической токсичности и в дозе 0,005 мг/мл при проведении длительных экспериментов на животных (табл.3).

Общетоксическое действие наноразмерных частиц серебра в опытах in vitro было выявлено в концентрациях 0,001 и 0,005 мг/мл на одну пробу культуры бактерий «Эколюм» и спермы КРС соответственно (таблица 3), аналогичные величины эффективных токсических концентраций были получены на клетках человеческого лёгкого [Gliga A. R, Skoglund S., 2013].

При изучении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не оказывает общетоксического эффекта и не вызывает признаков интоксикации и патоморфологических нарушений.

Таблица 3 - Сравнительная оценка общетоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментахт vivo и in vitro (* результаты собственных исследований).

Вид исследования Наноразмерные частицы

As Zn Ti02

Эксперименты in vivo (Животные) Острая токсичность (14 дней) 150 мг/ животное (5000 мг/кг) DL50>5000 мг/кг изменение двигательной активности животных* Острая токсичность ( 14 дней) 150 мг/ животное (5000 мг/кг) DLso>5000 мг/кг общетоксическое действие не выявлено* Острая токсичность (14 дней) 150 мг/ животное (5000 мг/кг) DLso>5000 мг/кг общетоксическое действие не выявлено*

Острая токсичность (14 дней) 30 мг/ животное (1000 мг/кг) [Rahman M.F. et al., 2009] Субхроническая токсичность(28 дней) 2,7 мг/животное (90 мг/кг) [van der Zande М. et al., 2012] Хроническая токсичность (6 месяцев) 0,005 мг/мл (5 мг/л) [Рахманин Ю.А и др., 2014] Субхроническая токсичность(28 Дней) 15 мг/животное (500 мг/кг) [Shrivastava R., et al., 2014] [Jo Е., etal., 2013] Субхроническая токсичность(28 дней) 15 мг/животное (500 мг/кг) [Shrivastava R., etal., 2014] 10 мг/животное (200 мг/кг) [Wang Y., etal., 2013] Хроническая токсичность (90 дней) 0,3 мг/животное ( 10 мг/кг) [Gui S., et al., 2013]

Эксперименты in vitro (Альтернативные модели) 0,005 мг/мл (2 дня) на одну пробу спермы* 0,001 мг/мл (1 день) на одну пробу бактерий* 20 мг/мл (2 дня) на одну пробу спермы* 0,005 мг/мл (1 день) на одну пробу бактерий* 0,2 мг/мл ( 1 день) на одну пробу бактерий*

0,002-0,005 мг/мл (1-2 дня) на клеточных культурах [GligaA. R, et al., 20131 0,005 мг/мл (1-2 дня) на культуре пневмоцитов [Gliga A. R„ et al., 2013] 0,2 мг/мл (1-2 дня) на клеточных культурах [Demir. Е„ etal., 2013]

Вместе с тем в литературе имеются сведения о проявлении общетоксического действия наноразмерных частиц цинка при введении дозы 500 мг/кг (15 мг/ на одно животное) в исследованиях субхронической токсичности [Shrivastava R. et al. 2014; Jo E. et al. 2013].

При изучении общетоксического действия в опытах in vitro было выявлено, что наноразмерные частицы цинка оказывают дозозависимое действие на альтернативные модели фотобактерий «Эколюм» и спермы КРС. Действующие концентрации 2-10"3 г/л, 3-10"3 г/л, 4-10"3г/л, 5-Ю"3 г/л вызывали тушение свечения биосенсора (рис. 4). Снижали подвижность сперматозоидов в концентрации 20 г/л, 30 г/л, 40 г/л, 50 г/л (рис. 5). Результаты исследования указывают на высокую чувствительность альтернативной модели фотобактерии «Эколюм» к воздействию наноразмерных частиц цинка и позволяют, в соответствии с классификацией токсичности по методике исследования, отнести наноразмерные частицы цинка к высокотоксичным соединениям для данной альтернативной модели.

- Индекс токсичности (нижняя граница нормы)

■ (верхняя граница норма)

100

90

73,5

0

0,001

0,002

0,003

Концентрации (г/л)

,004

0,005

Рисунок 4 - Изменение индекса токсичности при исследовании общетоксического действия наноразмерных частиц цинка на альтернативной модели фотобактерий «Эколюм».

Рисунок 5 - Изменение индекса токсичности при исследовании общетоксического действия наноразмерных частиц цинка на альтернативной модели спермы КРС.

Проведенный сравнительный анализ общетоксического действия наноразмерных частиц цинка в опытах in vivo показал, что изучаемое вещество в дозе 150 мг/животное не обладает острой токсичностью, тем не менее, в условиях субхронического эксперимента признаки интоксикации отмечались в дозе 15 мг/животное (табл. 3).

Токсическая концентрация наноразмерных частиц цинка для альтернативной модели фотобактерий «Эколюм» составила 0,005 мг/мл на одну пробу культуры, а для модели спермы КРС - 20 мг/мл на одну пробу сперматозоидов (табл. 3), что указывает на более высокую чувствительность альтернативной модели фотобактерий «Эколюм». Аналогичные токсические концентрации были получены на пневмоцитах человека [Sahu D. at al. 2013].

При изучении общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида в экспериментах in vivo было установлено, что при остром воздействии доза 5000 мг/кг (150 мг/ на одно животное) не вызывает общетоксического эффекта: отсутствуют признаки интоксикации и патоморфологических нарушений. Тем не менее, в литературе имеются сведения о признаках общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида, вызванных более низкими концентрациями в субхронических и хронических экспериментах: 15 мг/животное

[ShrivastavaR. et al. 2014], 10 мг/животное [Wang. Y. et al. 2013] и 0,3 мг/животное [Gui S. et al. 2013].

В результате исследований по изучению общетоксического действия в опытах in vitro было выявлено, что наноразмерные частицы титана диоксида оказывают дозозависимое действие только на альтернативную модель фотобактерии «Эколюм» в концентрациях 2,5- 10"'г/л, 2,5 г/л, 25 г/л и 250 г/л, вызывая тушение свечения биосенсора по сравнению с контролем (рис. 6). Наноразмерные частицы титана не оказывали общетоксического действия на альтернативную модель спермы КРС в концентрациях 250 г/л, 300 г/л, 400 г/л, индекс токсичности находился в нормативном интервале (70-120%).

Концентрации (г/л)

Рисунок 6 - Изменение индекса токсичности при исследовании общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида на альтернативной модели фотобактерий «Эколюм».

Изучение общетоксического действия наноразмерных частиц титана диоксида в опытах in vivo показало, что изучаемое вещество в дозе 150 мг/животное не обладает острой токсичностью, в то время как в условиях субхронического эксперимента признаки интоксикации отмечались в дозах 10-15 мг/животное. При проведении длительных экспериментов на животных токсичной была доза 0,3 мг/животное (табл. 3).

В опытах in vitro токсическая концентрация наноразмерных частиц титана диоксида составила 0,2 мг/мл на одну пробу фотобактерий «Эколюм»,

что указывает на высокую чувствительность данной модели. Аналогичные величины токсических концентраций были получены на лимфоцитах периферической крови, макрофагах, эпителиальных клетках дыхательных путей и кишечника человека [Demir. Е., et al. 2013; Tilton. S.C. et al. 2014].

Результаты сравнительных исследований общетоксического действия в экспериментах in vivo и in vitro свидетельствуют о том, что несмотря на то, что наноразмерные частицы серебра, цинка и титана диоксида не вызывают гибели лабораторных животных при однократном остром внутрижелудочном воздействии дозы 5000 мг/кг, они способны оказывать токсическое действие на организм человека на клеточном уровне.

Следует отметить, что исследования по изучению общетоксического действия наноразмерных частиц серебра, титана и цинка в длительных субхронических и хронических экспериментах на животных проводились с привлечением высокотехнологичного оборудования, которое в обычной практике при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы не применяется в виду отсутствия возможности оснащения испытательных лабораторных центров таким дорогостоящим оборудованием и ограниченностью сроков проведения экспертизы (не более 1 месяца). При этом, как показали результаты исследований, чувствительность используемых в работе методов in vivo не позволяет выявить токсическое действие в острых опытах, для этого необходимо проведение длительных экспериментов на животных с применением высокотехнологичного оборудования, тогда как чувствительность методов in vitro способна выявить токсический эффект даже в острых опытах.

Результаты исследований показали высокую чувствительность альтернативных моделей и их способность в остром опыте улавливать токсический эффект тех доз, которые вызывают подобный эффект у животных лишь в условиях длительных экспериментов и требуют использования высокочувствительного специального оборудования. Этот факт чрезвычайно важен, так как использование альтернативных методов позволит получить скрининговую оценку токсичности исследуемых наноматериалов или наносодержащей продукции, что очень актуально в условиях нарастающих объемов токсикологической экспертизы.

Учитывая увеличение на рынке ассортимента и объёмов наносодержащей продукции, с которой человек имеет длительный контакт (парфюмерно-косметическая продукция, упаковка продуктов питания, медицинские изделия и т.д.) достаточно низкие дозы наноразмерных частиц, в условиях продолжительного воздействия могут оказывать токсическое действие на организм человека. Известно также, что одной из важных проблем профилактической токсикологии является проблема воздействия сверхмалых количеств вещества и возникновение парадоксальных эффектов [Курляндский Б.А., 2007].

Следующим этапом исследований было изучение в сравнительном плане раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro. При изучении раздражающего действия в экспериментах in vivo было выявлено, что наноразмерные частицы серебра не оказывают раздражающего действия на кожные покровы, но умеренно раздражают слизистые оболочки. Уже через 1 час после внесения в коньюктивальный мешок глаза кролика раствора наноразмерных частиц серебра в концентрации 50 г/л отмечались гиперемия коньюктивы глаза, которая оценивалась в 2 балла (отдельные сосуды трудно различимы), отёк века- 1 балл (слабый) и наличие выделений - 1 балл (минимальные, в углу глаза). Общая суммарная оценка раздражающего действия на слизистую глаз составила 4 балла, что позволяет отнести НЧ серебра к умеренно раздражающим веществам.

Способность наноразмерных частиц серебра раздражать слизистые оболочки была подтверждена исследованиями в опытах in vitro на сосудах ХАО куриного эмбриона (табл. 4). Об этом свидетельствует изменение линейной скорости кровотока (X) на 16,4% (Р<0,05). Наноразмерные частицы цинка и титана диоксида не оказывали раздражающего действия на кожные покровы и слизистые оболочки лабораторных животных, а также на сосуды ХАО куриного эмбриона (табл. 4).

Таким образом, было установлено совпадение результатов изучения раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана, полученных в классических токсикологических экспериментах на животных и на альтернативных моделях.

Таблица 4 - Изменение линейной скорости кровотока X (%) при воздействии наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида на сосуды ХАО куриного эмбриона.

Исследуемые группы Изменение линейной скорости кровотока X (%)

НЧ металлического серебра (Agбиoн-2) (50 г/л) 16,4 (а 4,5)*

НЧ цинка в водном растворе крахмала 7л\ \\Т)х (нативный раствор) 3,4 (а 2,1)

НЧ титана диоксид (250 г/л) 4,0 (а 2,0)

Контроль негативный 0,05 (а 0,06)

Контроль позитивный 40,7 (а 1,2)*

*- достоверные различия Р<0,05

Полученные результаты сравнительной оценки общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в экспериментах in vivo и in vitro свидетельствуют о высокой чувствительности таких альтернативных моделей, как фотобактерии «Эколюм», сперма КРС и сосуды ХАО куриного эмбриона и возможности их использования для скрининговой оценки токсичности наноразмерных частиц.

ВЫВОДЫ

1. Установлено совпадение результатов изучения общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида, полученных в классических токсикологических экспериментах на животных и альтернативных моделях in vitro, что свидетельствует о возможности использования альтернативных методов в качестве скрининговой оценки общетоксического и раздражающего действия на предварительном этапе токсиколого-гигиенических исследований наносодержащей продукции.

2. Выявлена высокая чувствительность альтернативных моделей и их способность в остром эксперименте улавливать токсический эффект доз, вызывающих подобный общетоксический эффект у животных лишь в условиях длительных экспериментов.

3. Установлены параметры цитотоксического действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида на альтернативные модели спермы КРС и люминесцентных бактерий «Эколюм». При изучении общетоксического действия токсичные концентрации для бактерий «Эколюм» и спермы КРС соответственно составили: при воздействии

наноразмерных частиц серебра 0,001 мг/мл и 0,005 мг/мл; наноразмерных частиц цинка 0,005 мг/мл и 20 мг/мл; наноразмерных частиц титана диоксида - 0,2 мг/мл для бактерий «Эколюм».

4. Выявлено, что среди используемых альтернативных тест-объектов наиболее чувствительным по отношению к изучаемым веществам оказалась модель фотобактерий «Эколюм», что, прежде всего, связано с высокой бактерицидной активностью наноразмерных частиц серебра и цинка.

5. Выявлено раздражающее действие на слизистые оболочки наноразмерных частиц серебра и отсутствие раздражающего эффекта при воздействии наноразмерных частиц цинка и титана диоксида в опытах in vitro на сосудах ХАО куриного эмбриона, что подтверждается в исследованиях на лабораторных животных.

6. При изучении общетоксического действия в экспериментах in vivo установлено, что однократное внутрижелудочное введение наноразмерных частиц серебра в дозе 5000 мг/кг оказывает токсическое действие на центральную нервную систему, проявляющееся изменением двигательной активности животных (Р<0,05).

7. В результате сравнительной оценки общетоксического и раздражающего действия наноразмерных частиц серебра, цинка и титана диоксида в опытах in vitro обнаружено, что наиболее выраженное действие на альтернативные модели оказывают наноразмерные частицы серебра, в меньшей степени наноразмерные частицы цинка и титана диоксида, что коррелирует с экспериментальными данными, полученными в опытах на животных.

Практические рекомендации:

1. Для специалистов Роспотребнадзора: шире использовать альтернативные модели: сперма КРС и сосуды ХАО куриного эмбриона для скрининговой оценки общетоксического и раздражающего действия на предварительном этапе токсиколого-гигиенических исследований при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы наносодержащей продукции.

2. Для научных сотрудников профильных гигиенических институтов: продолжать работы в области изучения альтернативных методов исследований с целью разработки методических рекомендаций и указаний по оценке токсичности наноразмерных веществ с помощью моделей спермы КРС и сосудов ХАО куриного эмбриона.

3. Для преподавателей учреждений высшего дополнительного профессионального образования: осуществлять подготовку ординаторов и специалистов по специальностям «Общая гигиена», «Гигиена труда» и

«Санитарно-гигиенические лабораторные исследования» с учётом современных направлений исследований токсичности и опасности наноразмерных форм химических веществ с использованием альтернативных методов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гуськова O.A. Использование альтернативных токсикологических методов при исследовании средств гигиены полости рта, содержащих наноматериалы // Санитарный врач.- 2013.- №11.- С.10-15.

2. Гуськова O.A., Завьялов Н.В, Скворцова E.JI. Оценка токсичности химической продукции с использованием альтернативных методов // Токсикологический вестник.- 2013.-№6.- С.34-39.

3. Гуськова O.A., Завьялов Н.В, Скворцова Е.Л. Наночастицы серебра, титана, цинка. Обзор современных токсикологических данных // Санитарный врач.- 2014.- №6.- С.47-52.

4. Гуськова O.A. К вопросу о необходимости разработки экспресс-методов оценки воздействия наноматериалов для целей гигиенического нормирования // Сборник материалов III конференции молодых учёных РМАПО.-М., 2012. - С. 126-129.

5. Попова А. Ю., Брагина И. В., Смоленский В. Ю., Завистяева Т. Ю., Гуськова O.A. и др. Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека Руководство Р. 1.2.3156-13 // М., 2014. -639 с. / Гуськова O.A. 11 с.

6. Баранов В.И., Жукоцкий A.B., Завьялов Н.В., Гуськова O.A. и др. Применение метода ультразвуковой допплерографии на сосудах ХАО куриного эмбриона ex vivo для тестирования парфюмерно-косметической продукции, содержащей наноматериалы // Сб. ст. III Международной Научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине».- СПб., 2012. — С. 132-134.

7. Баранов В.И., Жукоцкий A.B., Завьялов Н.В., Гуськова O.A. и др. Использование экспресс метода оценки воздействи наноматериалов на репродуктивную функцию млекопитающих // Сб. ст. III Международной Научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине».- СПб., 2012. — С. 134-138.

8. Гуськова O.A., Каткова-Жукоцкая O.A., Баранов В.И. и др. К вопросу о применимости альтернативных моделей в объективизации оценки воздействия наноматериалов // Материалы IV Всероссийской Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая

среда и здоровье. Молодые учёные за устойчивое развитие страны в глобальном мире»,-М., 2012.-С. 113-115.

9. Сафонкина С.Г., Завьялов Н.В., Скворцова E.JL, Гуськова О.А. и др. Альтернативные токсикологические методы при исследовании средств гигиены полости рта, содержащих наноматериалы // Сборник трудов IV съезда токсикологов России.-М., 2013.- С. 415-417.

10. Сафонкина С.Г., Завьялов Н.В., Скворцова E.JL, Гуськова О.А. и др. Опыт использования альтернативных методов при оценке безопасности товаров народного потребления // Сборник трудов IV съезда токсикологов России,-М., 2013,- С. 424-426.

11. Гуськова О.А. Сравнительная оценка токсичности наноразмерных частиц серебра, титана и цинка, в экспериментах in vivo и in vitro // Сборник статей V конференции молодых учёных РМАПО,- М., 2014.- С. 71-74.

12. Завьялов Н.В., Гуськова О.А. Современные альтернативные методы токсикологических исследований продукции // СЭС.-2014.-№6,-С. 30-32.

13. ZavyalovN., Guskova О., SkvortsovaE. The Experience of using the alternative in vitro methods for testing and safety assessment of goods for children, detergents, cosmetics, including raw nanomaterials // 9th World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences, Prague 2014, V.3, No. 1. P.60

Список сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов

НМ - наноматериалы

НЧ - наночастицы

ХАО - хориоаллантоисная оболочка

ИЛЦ - испытательным лабораторный центр

ФБУЗ - федеральное бюджетное учреждение здравоохранения

КРС - крупного рогатого скота

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

ХК1) - рентгеновская дифрактометрия

иЬ5(| . среднесмертельная доза, вызывающая гибель 50% животных

при однократном пероральном введении

КРД - кожно-раздражающее действие

РДС - раздражающее действие на слизистые

8 - суммарная двигательная активность сперматозоидов

И - индекс токсичности

Т - индекс токсичности

1о - интенсивность биолюминесценции контроля

I - интенсивность биолюминесценции опыта

X - изменение скорости кровотока

(У$)п - линейная скорость кровотока в динамике измерений

(Ув)о - линейная скорость кровотока на нулевой минуте - значение показателя подвижности

Подписано в печать 29.12.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ №52-1-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39