Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Исследование влияния наноразмерных алмазных частиц на функциональный статус макрофагов in vitro

На правах рукописи

НЕЩАДИМ Дмитрий Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НАНОРАЗМЕРНЫХ АЛМАЗНЫХ ЧАСТИЦ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС МАКРОФАГОВ

IN VITRO

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 АПР 2015

г. Новосибирск - 2015

005567844

005567844

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины» (НИИЭКМ), г. Новосибирск

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ, академик Шкурупий Вячеслав Алексеевич РАН, доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Архипов Сергей Алексеевич

Усынин Иван Федорович

Бгатова Наталия Петровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, зав. лаб. механизмов межклеточных взаимодействий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биохимии»

доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. ультраструктурных исследований ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лим-фологии»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Томск).

Защита диссертации состоится: «9» июня 2015 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д001.048.01 в НИИЭКМ по адресу: г.Новосибирск, ул. Тимакова, д. 2., 630117. Тел./факс: 8 (383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭКМ и на сайте: http://centercem.ru/nauchnava <Зеуа1е1поя(/сН5зе11асюппу{ Бруе^.

Автореферат разослан 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

Пальчикова Наталья Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важной биологической проблемой в широком смысле является характер взаимодействия клеток и корпускулярных факторов не биологической природы. Частным случаем этой проблемы, имеющей прикладное значение, является взаимоотношение клеточных систем с наноразмернымн объектам нетканевой природы, среди которых одним из актуальных объектов являются наноразмерные синтетические наноалмазы.

В настоящее время в различных отраслях промышленности и науки используют множество наноразмерных искусственно созданных материалов, в том числе и наноразмер-ных алмазов (НА) (De Jong W.H., Borm P.J., 2008; Lewinski N. et al., 2008; Schrand A.M. et al., 2009; Shenderova O.A., Gruen D.M., 2012). В медицине одним из важнейших свойств наноматериалов являются их биосовместимость (Онищенко Г.Г. и др., 2007). Однако сведений, касающихся биосовместимости НА, еще недостаточно для их широкого использования в фармации и медицинской практике как с позиции биобезопасности, так и сопряженной с нею вероятности проявлений различного рода эффектов, которые могут быть факторами риска в конкретной патологической ситуации в связи с конкретными клеточными и тканевыми системами организма (Медведева Н.В. и др., 2006; Novikova M.S. et al., 2008; Schrand A.M. et al., 2009; Arkhipov S.A. et al., 2010).

В настоящее время в медицине и косметологии в качестве одного из перспективных наноматериалов рассматривают искусственно созданные НА (Бгатова Н.П. и др., 2008; Schrand A.M., Huang H. et al., 2007; Schrand A.M. et al., 2009; Li J. et al., 2010). Это обусловлено тем, что среди всех известных на данный момент наночастиц, используемых в биомедицинских технологиях, НА обладают наименьшей цитотоксичностью в отношении клеток различного гистогенеза (Schrand А.М. et al., 2009; Shenderova О.А., Gruen D.M., 2012). Более того, в ряде исследований на моделях irt vivo было показано, что в отличие от других наноматериалов, предлагаемых в качестве носителей для транспортировки лекарств, наноалмазы не вызывали воспаления в местах их введения или в «гка-нях-мишенях» и не вызывали профиброгенных эффектов (Пузырь А.П. и др., 2005а, 2005b, 2005с; Тян А.Г., 2005; Лазаренко Л.И., 2008, 2009; Прохоренко В.И. и др., 2014; Thomas V. et al., 2012). Показано, что гидрозоли НА не оказывают патологического действия на органы и ткани экспериментальных животных при различных способах их введения (Тян А.Г., 2005; Dolmatov V.Y., 2006). При введении НА непосредственно в область, где развивается воспалительный патологический процесс, отмечали купирование воспаления (Лазаренко Л.И., 2008, 2009). Имеются данные о способности НА стимулировать в очаге воспаления регенераторно-пластические процессы (Лазаренко Л.И., 2008, 2009). Однако имеются пока лишь единичные работы, в которых делаются попытки дать объяснения указанному феномену высокой биосовместимости наноалмазов и особенностям их влияния на такие типовые патологические процессы, развивающиеся вслед за повреждением клеток и тканевых структур, как воспаление и фиброз.

Степень разработанности темы исследования. Показано, что НА, несмотря на их относительную химическую инертность, не инертны в биологическом смысле. Так, например, будучи захваченными макрофагальными клетками, они ингибируют в них экспрессию генов хемокинов CCL2 и фактора роста тромбоцитов (PDGF; Thomas V. et al., 2012). Как известно, макрофаги (МФ) - клетки, способные к захвату многих корпускулярных объектов, причастны, так или иначе, к развитию ряда типовых патологических процессов в организме, таких как некроз, воспаление, фиброз (Струков А.И., Серов В.В., 2013; Burke В., Lewis С.Е., 2002; Serhan C.N. et al., 2010; Biswas S.K., Mantovani A., 2014; Kumar V. et al., 2014). В основе механизмов развития типового патологического процесса лежит целый комплекс взаимосвязанных изменений - повреждения и одновременно развивающихся процессов защиты, компенсации, репарации и приспособления (адаптации)

(Струков А.И., Серов В.В., 2013; Serhan C.N. et al„ 2010; Kumar V. et al„ 2014). Таким образом, изучение влияния НА частиц на функциональный статус МФ, их гидролитический и прорегенераторный потенциалы, определяющие развитие и течение типовых патофизиологических процессов, ассоциированных с МФ, является актуальным направлением исследований в области биомедицинских технологий.

Поскольку МФ рассматривают как один из главных «дирижеров» развития воспаления и ассоциированного с ним фиброза, как неполноценного (substitucio) репаративного заместительного процесса, так и полноценной (restitutio) репаративной регенерации (Струков А.И., Серов В.В., 2013; Burke В., Lewis С.Е., 2002; Biswas S.K., Mantovani А., 2014), представляется актуальным проведение исследований, в которых можно было бы в «чистом виде» изучить влияние НА частиц на проявления их функциональной активности, ассоциированной с их возможным участием в развитии и исходе воспалительной реакции организма при модулировании изменений их: фагоцитозной активности; выраженности процесса фагосомно-лизосомного слияния; экспрессии цитокинов, обладающих провоспалительной и антивоспалительной активностью; экспрессии и секреции гидролитических ферментов, принимающих участие в «санации» очага воспаления; в индукции или ингибировании фибропластического процесса (по экспрессии и секреции цитокинов — регуляторов этого процесса); в регенераторных процессах (по экспрессии факторов роста, обладающих прорегенераторной активностью). Все это определило цель и задачи исследования.

Цель исследования. Изучить влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДАВ-ГО», эндоцитированных макрофагами, на их функциональный статус, вероятность модуляции ими типовой реакции воспаления и его исходов.

Задачи исследования:

1. Изучить биотропность наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» в отношении макрофагальных клеток in vitro.

2. Изучить биосовместимость наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» в отношении макрофагальных клеток in vitro.

3. Изучить in vitro влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндоцитированных макрофагами, на экспрессию ими цитокинов, определяющих их про-воспалительный и профиброгенный потенциал.

4. Изучить in vitro влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндоцитированных макрофагами, на экспрессию и секрецию ими гидролитических ферментов, потенциально способных модулировать процессы воспаления и регенерации (substitucio и restitutio).

5. Изучить in vitro влияние наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО», эндоцитированных макрофагами, на экспрессию и секрецию ими ростовых факторов, потенциально способных модулировать развитие процесса воспаления на разных этапах его развития.

Научная новизна. Впервые in vitro показано, что захват наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» макрофагами может осуществляться одновременно различными механизмами эндоцитоза: активным адсорбционным пиноцитозом, эндоцитозом с формированием клатриновых эндоцитозных везикул и эндоцитозом крупных агрегатов наноалмазов (фагоцитозом), формирующихся внеклеточно.

Впервые установлено, что наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эн-доцитированные макрофагами in vitro, в широком диапазоне доз не индуцируют цитоток-сические эффекты, существенно не влияют на фагоцитозную активность в отношении корпускулярного материала биологической природы и степень пермеабилизации мембран лизосом, но стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния.

Впервые in vitro установлено, что наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами, «неоднонаправлено» модулируют экспрессию ими различных цитокинов, определяющих их провоспалительный и профиброгенный статусы.

Впервые in vitro показано, что наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами, модулируют экспрессию, продукцию и секрецию макрофагами гидролитических и ростовых факторов, потенциально способных модулировать развитие как воспалительного процесса в целом, так и процессы регенерации и/или фиброза.

Впервые in vitro выявлено отсутствие прямой зависимости между продукцией и секрецией макрофагами гидролитических ферментов и ростовых факторов, а также «однонаправленности» модуляции экспрессии последних макрофагами после эндоцитоза ими наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО».

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе получены данные, свидетельствующие о том, что наноразмерные алмазные частицы, воздействуя на макрофаги и изменяя их функциональный статус, потенциально «позитивно» могут модулировать процесс воспаления во всех фазах его развития: повреждения, воспаления и репарации, - в связи с умеренным увеличением их гидролитического и прорегенераторного потенциала в локусе повреждения и ингибированием процесса постдеструктивного воспаления и фиброзирования. Это предполагает возможность использования результатов данного исследования при разработке новых лекарственных средств на основе наноразмерных алмазных частиц для лечения поврежденных органов и тканей. Кроме того эти данные могут быть использованы для уточнения патогенеза процессов неспецифического воспаления и некоторых профессиональных заболеваний легких у человека, в преподавании этих вопросов по курсу общей патологии, патофизиологии воспаления и процессов репаративной регенерации в медицинских университетах и на медицинских факультетах классических университетов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» в диапазоне концентраций 10-30 мкг/мл обладают высокой биотропностью и биосовместимостью в отношении макрофагальных клеток in vitro. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» при концентрации в культуральной среде 20 мкг/мл обладают способностью модулировать in vitro провоспалительный и профиброгенный статус макрофагов: стимулируют экспрессию GM-CSF и IFN-y, снижает экспрессию IL-la, не изменяя экспрессии TNF-a; повыщают экспрессию, продукцию и секрецию факторов роста EGF, TGFB1/TGF-P, KGF/FGF-7 и в то же время снижают экспрессию и продукцию b-FGF/FGF-2.

2. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами in vitro, при концентрации 20 мкг/мл модулируют функциональный статус и гидролитический потенциал макрофагов: повышают экспрессию, продукцию и секрецию металлопротеиназ ММР-1 и ММР-9, катепсина В и катепсина D, стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах, не изменяя их фагоцитозной активности в отношении корпускулярных объектов биологической природы, и потенциально способны изменять процесс воспаления в фазе деструкции и неполноценной регенерации (фиброза).

Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в практику научных исследований и преподавания на кафедре патологической анатомии и патологической физиологии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России в соответствующие разделы: «Неспецифическое воспаление», «Регенерация. Заживление ран», «Склероз», «Профессиональные заболевания легких»; и «Воспаление», «Патология тканевого роста».

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (г.Новосибирск, 2011г.), конференции «Фундаментальных и прикладных исследований в медицине» (г. Сочи, 2011 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения; заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 322 источника (81 отечественный и 241 зарубежных), и иллюстрированного приложения. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и 7 таблицами.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины» (г. Новосибирск) темы НИР по госзаданию «Разработка новых молекулярно-наносомальных фармацевтических композиций направленного транспорта лекарственных средств для лечения гранулематозов инфекционной этиологии и их осложнений на основе изучения молекулярно-клеточных механизмов патогенеза» №0535-2014-0007. Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы» на базе НИИЭКМ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы выделения и культивирования перитонеальных макрофагов. Эксперименты были выполнены in vitro на макрофагах из перитонеального транссудата мышей самцов линии BALB/c 2-х месячного возраста, с массой тела 21-22 гр., полученных из питомника ФГБНУ «НИИ клинической иммунологии» (г. Новосибирск, Россия). Перито-неальные макрофаги (МФ) получали после выведения животных из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе под легким эфирным наркозом. Предварительно клетки из перитонеального транссудата эксплантировали в культуру и культивировали при 37°С, в течение 3-х часов на покровных стеклах для прикрепления МФ (106 клеток в 1,5 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров). Через 3 часа неадгези-рованные клетки смывали средой для культивирования. Полученные первичные культуры МФ культивировали в течение 24 часов с целью их адаптации.

Методика приготовления суспензии раствора наноразмерных алмазных частиц для инкубации в культуре макрофагов. Наноалмазы (НА) марки «УДА-В-ГО» были любезно предоставлены ОАО ФНПЦ (НПО) «Алтай», Россия. В исследовании использовали искусственно полученные НА размером в диапазоне 4-6 нм. Исследование вероятных биоактивных свойств НА в отношении перитонеальных МФ проводили через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в первичные 24-часовые культуры МФ. В среду для культивирования вносили 1,6% стерильную суспензию НА в бидистиллированной воде до конечной концентрации в культуральной среде в 10, 20, 30 и 60 мкг на 1 мл. После этого суспензию тщательно перемешивали и обрабатывали ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора МУЗА-0,1/22-М в течение 10 сек при мощности 75 Вт для разрушения вероятных агрегатов НА частиц. Внесение в культуру НА осуществляли путем замены изначальной среды культивирования на среду, содержащую НА в соответствующей концентрации.

Контролем служили МФ, в среду для культивирования которым через 24 часа культивирования вносили свежую среду культивирования взамен предыдущей, в нее предвари-

тельно вносили бидистиллированную стерильную воду в объеме, идентичном тому, который вносился с гидрозолем при приготовлении среды с НА частицами.

Методы светооптического и флуоресцентного микроскопического исследования биотропности макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц. Светооптическое исследование МФ в культурах проводили с помощью микроскопа «Axiolmager ZI» (Zeiss, Германия) в режиме светлого поля, фазового интерференционного контраста, дифференциально интерференционного контраста и флуоресцентной микроскопии. Препараты клеточных культур фотографировали при помощи цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия). Для анализа накопления НА в МФ был проведен морфометрический анализ микрофотографий агрегатов исследуемых НА частиц при исследовании их в проходящем свете и флуоресцентном освещении. Анализ яр-костных характеристик НА и их агрегатов на полученных цифровых фотографиях проводили при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (г. Санкт-Петербург). Для выявления НА в МФ было использовано комбинированное освещение препаратов - одновременно в проходящем свете при установленной зеленом светофильтре и индуцированной флуоресценции МФ (дополнительно окрашенных акридиновым оранжевым), в «зеленой» области флуоресценции (при установке узкополосного светофильтра, предназначенного для исследования ФИТЦ-флуоресценции).

Методы электронно-микроскопического исследования биотропности макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц. Образцы клеточных культур для электронной микроскопии фиксировали 2,5% раствором глутаро-вого альдегида в 0,1 M какодилатном буфере, дальнейшую обработку образцов проводили по методикам, описанным ранее (Уикли Б., 1975; Reynolds E.S., 1963). Микрофотографии были получены на трансмиссионном электронном микроскопе «JEM 1400» (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Для анализа захвата и интернализации НА частиц МФ проводили визуальный анализ полученных изображений для разных временных точек инкубации МФ с наночастицами и сопоставляли с изображениями, полученными в контроле. Данный фрагмент работы был выполнен с участием д.б.н., профессора, заместителя декана ФЕН и профессора кафедры физиологии ФЕН НГУ (ННИГУ) Шесто-паловой Л.В. и д.б.н., профессора, заведующей лабораторией клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции сектора морфологии и молекулярно-клеточных технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России Айдагуловой C.B.

Методы изучения свойств биосовместимости наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов. Жизнеспособность МФ (% живых клеток), или показатель жизнеспособности (ПЖ), в культурах определяли с помощью витального красителя -трипанового синего (2,5%). После окрашивания клетки фотографировали с помощью цифровой фотокамеры «Nicon Coolpix 5000» (Nikon Corporation, Япония) и микроскопа «Axiostar Plus» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз. О продукции активных форм кислорода (АФК) МФ косвенно судили с помощью НСТ-теста: МФ инкубировали в среде для культивирования, содержащей нитросиний тетразолий (0,05%), 1 час при температуре 37°С. Продукцию АФК МФ после инкубирования их в среде, содержащей НА, с помощью НСТ-теста учитывали через 1 час после внесения частиц НА в культуры МФ. После восстановления НСТ в МФ до формазана в стандартном и предположительно активированном НА в НСТ-тесте состояниях культуры, МФ фиксировали в водном растворе 4% формалина. Для визуализации ядер МФ их докрашивали 1% водным раствором метилового зеленого. Количество образовавшегося в МФ формазана, характеризующего интенсивность продукции ими активных форм кислорода, оценивали в условных единицах (площади окраски в кв. пике., приходящейся на один МФ) после фотографирования окрашенных цитологических препаратов с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc»

(Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Zl» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью цитометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (г. Санкт-Петербург). Продукцию АФК МФ оценивали по индексу продукции АФК (ИП АФК), равному произведению площади бинарных изображений формазана в МФ (для каждого МФ в отдельности в кв. пике.) на величину доли МФ, содержащих формазан, оцененной для соответствующей культуры.

Методы изучения функциональной активности макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц. Функциональную активность макрофагов, подвергнутых воздействию НА частиц, исследовали по показателям эндоцитозной активности и «распластывания» МФ, функциональному состоянию вакуолярно-лизосомальной системы МФ и процессов фагосомно-лизосомального слияния. Для этого НА частицы также вносили в 24-часовую культуру МФ с разными концентрациями суспензии НА частиц в полной культуральной среде: 10, 20, 30 и 60 мкг/мл; в разные временные интервалы: 1, 3, 24 и 48 часов. Для исследования влияния НА частиц на состояние лизосомальной системы и процесс фагосомно-лизосомного слияния в МФ была выбрана биосовместимая концентрация 20 мкг/мл НА. Контрольными точками служили 24-часовые культуры перитонеальных клеток через соответствующие временные интервалы инкубации с момента замены полной среды, в которую вносили бидистиллированную стерильную воду в объеме, идентичном тому, что получали МФ в суспензии с НА.

Методы изучения влияния наноалмазных частиц на показатели эндоцитозной активности и «распластывания» макрофагов. Расчет эндоцитозного индекса (ЭИ) производили путем подсчета доли МФ с эндоцитозными вакуолями в цитоплазме клеток. Индекс эндоцитозной активности (ИЭА) рассчитывали путем перемножения эндоцитозного индекса на количество эндоцитозных вакуолей с НА в них. Для выявления частиц НА в эндосомах МФ было использовано комбинированное освещение препаратов - одновременно в проходящем свете при установленном зеленом светофильтре и индуцированной флуоресценции МФ (в «зеленой» области спектра), дополнительно окрашенных в среде, содержащей акридиновый оранжевый (10 мкг/мл) в течение 15 мин при 37°С. Препараты клеточных культур при исследовании методами световой и флуоресцентной микроскопии фотографировали с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Zl» (Zeiss, Германия). Определение показателей «распластывания» осуществляли по цифровым фотографиям, полученным при проведении НСТ-теста. Расчет индекса «распластывания» (ИР) производили путем подсчета доли «распластывания» МФ с высокой степенью «распластывания» (при отношении площади проекции цитоплазмы «распластанных» МФ к площади проекции ядер > 5). Для расчета индекса активации МФ (ИАМФ) цифровые изображения для каждого из пяти полей бинаризи-ровали по яркости окраски цитоплазмы «распластанных» МФ при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (г. Санкт-Петербург). В данном случае индекс активации МФ соответствовал площади (в кв. пике.) «распластанных» МФ после захвата ими НА.

Методы изучения влияния наноалмазных частиц на функциональное состояние вакуолярно-лизосомальной системы и процессы фагосомно-лизосомного слияния макрофагов. Для исследования состояния вакуолярно-лизосомальной системы МФ в культуры вносили среду, содержащую лизосомотропный краситель акридиновый оранжевый (10 мкг/мл), и инкубировали в течение 15 минут при 37°С. Для изучения феномена фагосомно-лизосомного слияния в МФ после их инкубации с НА, инкубационную среду заменяли на аналогичную по составу — для культивирования, содержащую гранулы зимо-зана (15 мкг/мл). Через час после инкубации клеток с гранулами зимозана в культуры также вносили среду, содержащую лизосомотропный краситель акридиновый оранжевый (10 мкг/мл), и инкубировали в течение 15 минут при 37°С. В обоих случаях препараты

клеточных культур при исследовании методами световой и флуоресцентной микроскопии фотографировали с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision ZI» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз в двух режимах: зеленый спектр (530 нм) и красный спектр флуоресценции (620 нм). Показатель лабильности мембран лизосом (ПЛМЛ) определяли по соотношению размера и интенсивности окрашенной части цитоплазмы МФ (в кв. пикселях) (530 нм) к размеру и интенсивности окрашенных лизосом (620 нм) МФ при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (г. Санкт-Петербург). Расчет фагоцитозного индекса (ФИ) производили путем подсчета доли МФ с фагоцитозными вакуолями, содержащими частицы зимозана. Также вычисляли фагоцитозное число (ФЧ) - среднее арифметическое число фагоцитированных частиц зимозана на один МФ. Количество фаголизосом с гранулами зимозана, образующихся в фагоцитах, определяли по числу гранул зимозана, окрашенных в оранжево-красный цвет. По количеству неокрашенных акридиновым оранжевым гранул зимозана, фагоцитированных МФ, определяли число фагосом, не слившихся с лизосомами. Расчет индекса фагосомно-лизосомного слияния (ИФЛ) производили путем подсчета средней величины соотношения количества фаголизосом по отношению ко всем фагосомам в одном МФ.

Методы изучения биологических эффектов, оказываемых наноразмерными алмазными частицами в макрофагах. Изучение биологических эффектов, оказываемых НА частицами на МФ, осуществлялось при помощи иммуноцитохимических методов выявления экспрессии МФ провоспалительных, гидролитических и ростовых факторов и их секреции на миллипоровых фильтрах.

Иммуноцитохимические методы выявления внутриклеточной продукции провоспалительных, гидролитических и ростовых факторов в макрофагах. Иммуно-гистохимическое исследование МФ проводили непрямым иммуногистохимическим методом. В первичные 24-часовые культуры МФ вносили НА в концентрации 20 мкг/мл по той же схеме, что и в исследовании цитофизиологических характеристик МФ. МФ с НА культивировали в течение 48 часов при температуре 37°С. Культуры МФ фиксировали 4% водным раствором нейтрального формалина, демаскирование исследуемых кластеров дифференцирования проводили тритоном Х-100 (0,3% раствор в фосфатном буфере, рН=7,2). Контролем служили МФ, которым через 24 часа культивирования вносили свежую среду культивирования взамен предыдущей, в которую предварительно вносили бидистиллированную стерильную воду в объеме, идентичном тому, что получали МФ в суспензии с НА.

Экспрессию МФ IL-la, GM-CSF, TNF-a и IFN-y выявляли при помощи моноклональ-ных антител: anti-mouse IL-la (Isotype: Armenian Hamster Anti-Mouse IgGl, XI; Clone: ALF-161; кат. номер 559810, Becton Dickinson Pharmingen, США), anti-mouse GM-CSF (Isotype: Rat Anti-Mouse IgG2a; Clone: MP1-22E9; кат. номер 554404, Becton Dickinson Pharmingen, CILIA), anti-mouse TNF-a (Isotype: Rat Anti-Mouse IgGl; Clone: MP6-XT22; кат. номер 554416, Becton Dickinson Pharmingen, США); anti-mouse IFN-y (Isotype: Rat Anti-Mouse IgGl, к; Clone: XMG1.2; кат. номер 559065, Becton Dickinson Pharmingen, США). Экспрессию (и секрецию) МФ катепсина В, катепсина D, металлопротеиназы-1 (ММР-1) и металлопротеиназы-9 (ММР-9) выявляли при помощи моноклональных антител: anti-Cathepsin В (Isotype: Goat polyclonal antibody IgG, biotin conjugate; Entrez GenelD: 13030; кат. номер BAF965, R&D Systems, CIIIA); anti-Cathepsin D (Isotype: Rabbit monoclonal antibody IgG; Clone: EPR3057Y; кат. номер ab75852, Abeam, США), anti-MMP-1 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG; Entrez GenelD: 4312; кат. номер PAB12708, Abnova, США); anti-MMP-9 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG; кат. номер ab38898, Abeam, США). Экспрессию (и секрецию) МФ трансформирующего фактора роста TGFBl/TGF-ß, эпидермального фактора роста EGF, фактора роста кератиноцитов

KGF/FGF-7 и основного фактора роста фибробластов b-FGF/FGF-2 выявляли при помощи моноклональных антител: anti-TGFBl/TGF Beta 1 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG, unconjugate; Epitope: aa336-385; кат. номер LS-B5663-50; LifeSpan Biosciences, США); anti-mouse EGF (Isotype: Mouse Anti-Mouse IgGl, unconjugate; Clone: E5; кат. номер LS-C121770, LifeSpan Biosciences, США); anti-KGF/FGF-7 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG, unconjugate; Entrez GenelD: 2252; кат. номер bs-0734R; Bioss Antibodies, США); anti-b-FGF/FGF-2 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody IgG, unconjugate; Entrez GenelD: 14173; кат. номер bs-0217R; Bioss Antibodies, ClllA).

Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 минут во влажной камере при комнатной температуре (BD Pharmingen Technical Data Sheet). Для визуализации кроличьих первичных антител использовали полимерную систему ImmPRESS Anti-Rabbit Ig (peroxidase) Polymer Detection Kit - Vector Labs MP-7401-15 (США). Для визуализации биотинилированных антител использовали систему визуализации R.T.U. Vectastain Kit (Vectorlabs, США). Для визуализации первичных антител хомяка использовали биотинилированные антитела Anti-Hamster (BD Pharmingen) и стрептавидин-HRP из набора для иммуноцитохимии Novocastra 250 (Великобритания). Для визуализации мышиных первичных антител использовали полимерную систему ImmPRESS Anti-Mouse Ig (peroxidase) Polymer Detection Kit - Vector Labs MP-7402-15 (США). Окраску препаратов проводили в растворе диаминобензидина с субстратом, содержащим перекись водорода (BD DAB Kit). Использовали стандартный BD DAB Kit (BD PharmingenTM Technical Data Sheet). Клетки отмывали от свободного диаминобензидина дистиллированной водой, препараты высушивали при комнатной температуре в течение 1 часа, докрашивали водным 1% раствором метилового зеленого в течение 15 минут. Зоны клеточных мембран или цитоплазмы, содержащие выявляемые антигены, окрашивались в специфический коричневый цвет. Интенсивность такой окраски прямо пропорциональна количеству экс-прессируемого маркера. Размеры окрашенных зон цитоплазмы МФ измеряли морфомет-рически в условных единицах по общей площади (в кв. пике.) окрашенных зон после их фотографирования с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision Zl» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью цитометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (г. Санкт-Петербург). Далее для всех исследуемых факторов производили расчет средней площади окраски в пересчете на один МФ (в усл. ед.).

Иммуноцитохимические методы выявления секреции гидролитических и ростовых факторов на миллипоровых фильтрах. Исследование влияния НА частиц на секрецию гидролитических факторов: катепсинаВ и D, металлопротеиназы-1 (ММР-1) и металлопротеиназы-9 (ММР-9), - и ростовых факторов: TGFB1/TGF-P, EGF, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2, - в МФ проводили через 24 и 48 часов после внесения НА в первичные 24-часовые культуры МФ. Эксперименты по исследованию секреторной активности МФ в отношении исследуемых ферментов проводили по той же схеме, которую использовали для определения их экспрессии в МФ. Для этого в чашки Петри (40 мм) предварительно вносили не покровные стекла, а миллипоровые мембраны стандартных размеров (10х 10 мм). Все последующие операции с МФ, прикрепившимися к мембранам, были аналогичны тем, которые проводили с покровными стеклами. Определение секреторной активности МФ осуществляли иммуноцитохимическим методом. После завершения экспериментов in vitro мембраны с МФ отмывали в растворе Хенкса без фенолового красного, а затем проводили иммуноцитохимическую окраску. Зоны миллипоровых мембран вокруг прикрепленных к ним МФ, секретирующих выявляемые ферменты, окрашивались в специфический коричневый цвет. Специфичность окраски верифицировали при постановке контрольных тестов - «отрицательных контролей». В контрольных тестах часть тести-

руемых мембран инкубировали не с первичными антителами, используемыми для выявления ферментов, а с неиммунной сывороткой животного того вида, от которого были получены антитела. Яркость «фоновой» неспецифической окраски мембран принимали за нулевую при бинаризации цифровых фотографий мембран по яркости. Размеры специфически окрашенных зон на мембранах, обусловленных иммобилизацией секретируе-мых ферментов, измеряли морфометрически в условных единицах по общей площади (в кв. пике.) окрашенных зон на тестируемых мембранах после их фотографирования с помощью цифровой камеры «AxioCam HRc» (Zeiss, Германия) и микроскопа «AxioVision ZI» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью цитометриче-ского анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (г. Санкт-Петербург).

Методы статистического анализа. Полученные данные были статистически проанализированы с помощью лицензированных пакетов прикладных программ «Statistica v.6» и «Excel v.7». Вычисляли среднюю величину (М) и стандартную ошибку среднего (ш). Данные представлены в виде М ± т. Вероятность достоверности различий между исследуемыми средними величинами показателей в экспериментальных группах культур оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при величине вероятности принятия нулевой гипотезы о принадлежности сравниваемых независимых выборок к одной и той же генеральной совокупности (Н0) с вероятностью р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследования свойств биотропноети наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов

Результаты светооптического и флуоресцентного микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц

При исследовании культуры МФ через 24 часа после внесения в нее НА (при концентрации 20 мкг/мл) методом фазового контраста при обычном освещении выявляемые вакуоли выглядели как достаточно однородные оптически плотные структуры. Выявляемые вакуоли были гетерогенны по размерам и занимали значительную часть цитоплазмы МФ. При помощи метода фазово-контрастной микроскопии в поляризованном свете было показано, что исследуемые вакуоли МФ гетерогенны по оптической плотности даже в пределах отдельных вакуолей, что свидетельствовало о наличии в них частиц НА.

Однако указанные методы не позволяли морфометрически оценить количество НА, накапливающихся в МФ, поскольку метод фазово-контрастной микроскопии «высвечивает» все оптически разнородные клеточные структуры. Для качественного и полуколичественного анализа накопления НА в МФ было проведено исследование культур МФ при комбинированном освещении - проходящем свете и флуоресцентном освещении, при котором накопившиеся в МФ частицы НА выглядели значительно темнее (5-10 единиц по международной шкале градаций серого цвета, оцениваемого в диапазоне 0-255), чем стеклянная подложка (235-250). При таком способе анализа МФ было отчетливо видно, что эндоцитозные вакуоли содержали оптически плотный материал, соответствующей оптической яркости НА в проходящем свете - 5-10 единиц. Большинство эндо-сом при сходной оптической яркости значительно варьировало по величине, что косвенно указывало на то, что образование крупных фагосом может происходить в результате слияния более мелких эндосом, содержащих НА.

Время инкубации НА с МФ, ч

Рис. 1. Результаты исследования эндоцитоза наноразмерных алмазных частиц (НА) макрофагами (МФ) в культуре в зависимости от времени культивирования (при концентрации НА 20 мкг/мл). Примечание. Вероятность достоверности различий между средними величинами исследованных показателей: ** Р<0,01.

На рисунке 1 представлены результаты морфометрического исследования эндоцитоз-ной активности МФ в зависимости от времени культивирования НА в культуре при концентрации 20 мкг/мл. Установлено, что количество НА частиц в МФ возрастает с увеличением времени инкубирования МФ с НА частицами. При этом выявлено, что количество НА частиц в МФ достигает некоторого максимума на 24 часе культивирования. Эти данные косвенно указывают на то, что через 24 часа культивирования в среде, содержащее НА частицы, по-видимому, МФ полностью «насыщаются» НА, что, вероятно, сопряжено со снижением их эндоцитозной активности в отношении НА к этому времени.

Результаты электронно-микроскопического исследования макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц

Для исследования захвата и интернализации НА частиц в биосовместимой концентрации (20 мкг/мл) макрофагами их исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе. Через 1 сутки после внесения НА в культуры МФ эндосомы, содержащие НА, отмечали преимущественно в зонах, прилегающих к плазмолемме МФ. Размеры эндосом варьировали в диаметре от 0,1 до 0,3 мкм. При этом в эндосомах НА располагались в виде агрегатов в наноразмерном диапазоне 25-50 нм. Наряду с эндосомами в МФ выявлялись вторичные лизосомы, содержащие частицы НА. Плазмалемма образовывала большое количество цитоплазматических выростов.

В случаях, когда ядро располагалось достаточно близко к плазмолемме, эндосомы с НА выявлялись в перинуклеарной зоне МФ. Плотность содержания НА в фагоцитозных вакуолях, количество частиц НА в эндосомах и размеры эндосом - все эти показатели эндоцитозной активности МФ сильно варьировали по величине. Например, размеры эндосом варьировали в диапазоне 0,3-1,0 мкм, а количество НА в усл. ед. (площади, занимаемой наночастицами, в мкм2) в пересчете на одну эндосому варьировало от 0,04 до 0,09 мкм2. Также на 24 и 48 часе инкубации МФ с НА частицами были обнаружены единичные НА в цитозоле МФ.

Наряду с формированием типичных фагоцитозных эндосом, содержащих частицы НА, в МФ, культивируемых в среде с НА, отмечали в достаточно большом количестве эндосомы клатринового типа с размерами эндосом 100 им. Некоторые клатриновые везикулы находились вблизи крупных эндосом, что может свидетельствовать о высокой вероятности их последующего слияния с ними. Таким образом, накопление НА в МФ могло осуществляться, вероятно, в результате работы трех механизмов: в результате активного пиноцитоза питательной среды, содержащей отдельные НА и их небольшие агрегаты (50-100 нм); эндоцитоза крупных агрегатов НА (более 100 нм); эндоцитоза с формированием клатриновых эндоцитозных везикул с НА (в размерном диапазоне 5-10 нм). Отмечена высокая активность плазмалеммы, характеризующаяся образованием большого количества цитоплазматических выростов. При этом плазмалемма имела сложную конфигурацию с формированием смыкающихся друг с другом цитоплазматических выростов, формирующих эндоцитозные вакуоли.

Через 2 суток после внесения НА в культуры МФ эндосомы и вторичные лизосомы, содержащие НА, наблюдали достаточно равномерно по всей цитоплазме, от зоны, прилегающей к плазмолемме МФ, до перинуклеарной зоны. Размеры эндосом варьировали в диаметре от 0,5 до 0,9 мкм. В эндосомах НА располагались в виде плотных агрегатов в наноразмерном диапазоне 50-100 нм. Наряду с типичными эндосомами, содержащими НА, в МФ выявляли крупные вакуоли, содержащие частицы НА, с менее плотной их «упаковкой» и характерной компартментализаций, что свидетельствовало, о том, что такие эндоцитозные вакуоли могли образовываться в результате слияния более мелких эндосом.

Результаты исследования свойств бносовместимости наноразмерных алмазных частиц в отношении макрофагов

Результаты исследования влияния различных концентраций и экспозиций наноразмерных алмазных частиц с макрофагами на их жизнеспособность

Было показано, что культивирование МФ в культуральной среде, содержащей суспензии частиц НА в концентрации от 10 до 30 мкг/мл, равно как и время культивирования в пределах, определенных условиями эксперимента, не влияли на показатели жизнеспособности МФ (таблица 1). Исключение составляет период культивирования МФ в течение 48 часов в среде, содержащей 60 мкг/мл НА, после чего количество жизнеспособных клеток уменьшилось на 33%. Таким образом, по данным теста с трипановым синим НА частицы в концентрациях от 10 до 30 мкг/мл в культуральной среде проявляют свою биосовместимость.

Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на продукцию активных форм кислорода макрофагами

Было установлено, что НА частицы в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл в культуральной среде в пределах 24 часов культивирования не влияют на продукцию АФК МФ (см. таблица 1). НА частицы в концентрации 20 мкг/мл только через 48 часов культивирования с МФ индуцировали статистически значимое повышение продукции АФК макрофагами на 22%. Однако для концентраций НА частиц от 30 до 60 мкг/мл в среде уже с 3 часов культивирования наблюдали статистически значимые различия показателей продукций АФК клетками по сравнению с контролем. Через 3 часа культивирования МФ с НА частицами в концентрациях 30 и 60 мкг/мл (по сравнению с контролем) продукция АФК увеличилась соответственно в 1,36 и 1,45 раза, через 24 часа - в 1,44 и 1,59 раза и через 48 часов - в 1,51 и 1,63 раза. Таким образом, по данным НСТ-теста НА частицы в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл в культуральной среде проявляют свою биосовмести-

мость, а в концентрациях 30 и 60 мкг/мл в большей степени через 24 и 48 часов культивирования они способны стимулировать процесс продукции АФК в МФ. Также по данным НСТ-теста была отмечена зависимость цитотоксичности от дозы и времени инкубации с НА частицами при концентрации выше 30 мкг/мл и времени культивирования продолжительнее 48 часов.

Таблица 1

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на жизнеспособность макрофагов (МФ) и продукцию активных форм кислорода (АФК) в зависимости от концентрации НА в культуральной среде и от времени их инкуба-

Время инкубации, часы Концентрация НА, мкг/мл Доля живых МФ (ПЖ), % Индекс продукции АФК МФ (ИП АФК), усл. ед.

1 Контроль 93,5±5,5 95,1±5,3

10 95,6±4,3 105,0±6,7

20 93,8±5,8 120,4±8,2

30 95,9±4,3 127,2±7,8

60 94,8±4,1 132,1±9,0

3 Контроль 97,5±3,5 124,2±6,9#

10 94,9±4,9 139,3±6,4

20 96,6±4,6 154,1 ±7,9

30 97,9±3,7 168,4±8,6*

60 97,4±3,7 179,7±9,7*

24 Контроль 97,5±4,3 149,0±7,3

10 93,8±5,2 162,9±7,2

20 95,1±4,3 179,2±8,3

30 97,3±3,6 214,8±9,1*

60 90,7±3,7 236,4±9,6*

48 Контроль 97,3±3,1 160,7±7,7

10 98,2±2,7 182,9±9,2

20 96,1±2,4 196,2±8,5*

30 95,7±3,5 243,3±10,4*

60 66,1±2,6* 262,5±11,3*

Примечание. Различия представлены в виде: * Р<0,05 и ** Р<0,01 (при сравнении показателей группы «МФ без НА», или контроля, с показателями группы «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования); # Р<0,05 и ## Р<0,01 (при попарном сравнении показателей группы «МФ без НА», или контроль, в периоды наблюдения: 1-3, 3-24, 24-48 час). Обозначения: МФ - макрофаг, НА - наноалмазы; АФК - активные формы кислорода, ПЖ - показатель жизнеспособности, ИП АФК - индекс продукции АФК.

Полученные нами данные, указывают на «относительность» некой «инертности» НА в отношении их способности активировать продукцию АФК, поскольку при достижении какой-то пороговой дозы (для НА марки «УДА-В-ГО» она составила величину 30 мкг/мл) и увеличении времени после начала захвата НА частиц МФ отмечено незначительное (относительно контроля) повышение продукции АФК.

Результаты исследования влняння наноразмерных алмазных частиц на функциональную активность макрофагов

Результаты исследования показателей эндощггозной активности и «распластывания» макрофагов, подвергнутых воздействию наноразмерных алмазных частиц

Было показано, что доля МФ с эндоцитозными вакуолями, содержавшими НА частицы, очевидно, возрастала по мере увеличения времени культивирования и концентрации НА в культуральной среде (таблица 2). Через 24 часа культивирования МФ с НА частицами при их концентрации 60 мкг/мл отмечали статистически значимое увеличение доли МФ с эндоцитозными вакуолями на 27%, в то время как через 48 часов культивирования МФ при концентрациях НА в полной среде 30 и 60 мкг/мл отмечали соответственно увеличение доли МФ с эндоцитозными вакуолями, содержащими НА, на 24 и 28%.

Таблица 2

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на функциональную активность макрофагов (МФ) в зависимости от концентрации НА в культуральной среде и от времени их ннкубации с МФ (М±т)_

Время инкубации, часы Концентрация НА, мкг/мл Доля МФ с эндоцитозными вакуолями (ЭИ), % Индекс эндоцитозной активности МФ (ИЭА), усл. ед. Доля «распластанных» МФ (ИР), % Индекс активации МФ (ИАМФ), усл. ед.

1 Контроль - - 23,1±2,9 472,5±26,0

10 0 0 42,0±3,5* 495,1±29,7

20 3,0±0,7 17,0±0,9 47,2±3,3* 517,3±33,6

30 4,6±0,8 25,6±1,3* 51,9±2,3* 540,2±32,4

60 5,5±1,1 40,5±2,0* 74,8±4,2* 562,5±36,6

3 Контроль - - 62,7±3,6# 675,8±37,1#

10 39,1±3,6# 120,2±6,1# 71,7±2,6 697,5±41,9

20 42,6±3,9 180,6±9,1* 76,6±4,2* 826,6±53,7*

30 44,2±5,0 270,1±13,5* 86,4±4,5* 850,6±55,3*

60 45,5±6,0 340,5±17,2* 91,8±3,6* 867,7±52,0*

24 Контроль - - 65,6±4,1 922,5±50,7#

10 72,2±5,8# 620,2±31,1# 75,2±5,5 1152,7±69,1

20 74,9±6,3 707,9±35,4 89,7±4,5* 1491,5±89,6*

30 79,6±6,4 733,7±36,7* 92,9±3,3* 1467,2±95,4*

60 91,3±7,3* 781,3±39,1* 79,6±3,9 1435,6±86,1*

48 Контроль - - 87,1±4,9# 967,5±58,2

10 75,1±4,4 643,2±32,2 89,1±3,7 1182,1±65,1

20 89,2±5,9 738,9±37,0 82,5±5,4 1342,4±87,3*

30 93,3±6,7* 757,7±37,9* 75,3±5,7* 1167,6±70,2

60 95,8±4,5* 789,3±39,5* 51,0±5,8* 985,5±64,2

Примечание. Различия представлены в виде: * Р<0,05 и ** Р<0,01 (при сравнении показателей группы «МФ без НА», или контроля, с показателями группы «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования); # Р<0,05 и ##Р<0,01 (при попарном сравнении показателей группы «МФ без НА», или контроль, в периоды наблюдения: 1-3, 3-24, 24-48 час). Обозначения: МФ - макрофаг, НА - наноалмазы; ЭИ - эндоцитозный индекс (или индекс эндоцитоза), ИЭА - индекс эндоцитозной активности макрофагов, ИР - индекс «распластывания», ИАМФ - индекс активации макрофагов.

Исследование эндоцитозной активности позволило установить, что величины ее индексов возрастали по мере увеличения времени культивирования и концентрации НА частиц в культуральной среде. Например, можно отметить для НА частиц при концентрации 20 мкг/мл на 3-м часе по сравнению с 1-м часом культивирования статистически значимое увеличение индекса эндоцитозной активности МФ в 11 раз, а на 24-м часе по сравнению с 3-м часом - в 4 раза. В первый час культивирования индекс эндоцитозной активности МФ для НА частиц с концентрациями 20 и 60 мкг/мл статистически различаются в 2,4 раза, на третий час - в 1,9, а на 24-й час - в 1,1 раз. Следует, однако, отметить, что начиная с периода 24-х часов, величина индекса эндоцитозной активности МФ мало зависела от концентрации НА в культуральной среде и, видимо, она была детерминирована только эндоцитозной емкостью вакуолярного аппарата МФ и возможностью формировать эндоцитозные вакуоли. Следует также отметить, что эндоцитозные вакуоли с НА частицами нередко сливались между собой, формируя значительно более крупные эндо-сомы.

Согласно полученным данным захват МФ НА частиц был сопряжен с увеличением количества «распластанных» клеток уже в первый час после их взаимодействия с НА и динамика этого процесса была сопряжена с концентрацией НА в среде культивирования. Но уже начиная с 3 часа по 48 час культивирования МФ в среде с НА частицами вовлечение МФ в процесс «распластывания» МФ был менее динамичным. Следует отметить, что через 48 часов количество МФ, помещенных в среду с концентрацией НА в ней 60 мкг/мл, доля «распластанных» МФ уменьшалась на 42%, что можно связать с уменьшением количества жизнеспособных МФ на 33% в этот же временной период культивирования в среде с аналогичной концентрацией НА в ней (таблица 1). Возможно, что это был пул клеток с пониженной жизнеспособностью, что указывает на вероятную цитоток-сичносгь этой дозы НА в культуральной среде, для проявления которой необходимо время около 48 часов.

Величины индекса активации МФ свидетельствуют о том, что изменения этого параметра определяются не столько дозой НА в среде культивирования, сколько временем культивирования, или точнее, временем нахождения НА частиц в МФ (см. таблица 2). Например, на 3 часе культивирования с НА частицами в концентрациях между 20 и 60 мкг/мл отмечали статистически значимое увеличение показателей индекса активации МФ примерно на 22-28%, а на 24 часе - 56-62%. Согласно этим и приведенным ранее данным можно полагать, что НА в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл в культуральной среде обладают способностью модулировать функциональный статус МФ, не сопряженный с их цитотоксичностью для МФ, т.е. НА в указанных дозах проявили свою биосовместимость. Таким образом, динамика изменений величины индекса активации МФ свидетельствует о том, что параметры изменения функциональной активности МФ определяются не столько дозой НА в среде культивирования, сколько временем культивирования, или точнее, временем нахождения НА в МФ.

Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на функциональное состояние вакуольно-лизосомальной системы и процессы фагосомно-лизосомного слияния в макрофагах

Было показано, что НА частицы в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде в пределах 48 часов культивирования практически не влияют на повышение показателя лабильности мембран лизосом, определяемой флуорисцентным методом с использованием акридинового оранжевого (таблица 3). Было отмечено незначительное понижение величины данного показателя во временные точки - 3 и 24 часа, что отражает относительную стабильность лизосом при Культивировании с НА частицами. Также НА части-

цы в исследуемой концентрации в целом не влияли на величины фагоцитозного индекса и фагоцитозного числа. Было отмечено незначительное увеличение фагоцитозного индекса и фагоцитозного числа (относительно контрольной группы) соответственно через 24 и 48 часов. Однако отмечали различия величин индекса фагосомно-лизосомного слияния в экспериментальной группе по сравнению с контролем уже с первого часа. Через 1 час величина индекса фагосомно-лизосомного слияния для МФ, культивируемых с НА частицами, была увеличена на 21,6% (относительно контроля), через 3 часа - на 23,4%, через 24 часа - на 11,1% и через 48 часов - на 12,6%. При этом абсолютные величины индекса фагосомно-лизосомного слияния в контроле и в экспериментальной группе стала повышаться только через 24 часа культивирования.

Таблица 3

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл на состояние лизосомальной системы и процессы фагосомно-лизосомного слияния макрофагов (МФ) в зависимости от времени их инкубации с

Время инкубации, часы Группа Показатель лабильности мембран лизосом (ПЛМЛ), усл. ед. Фагоцитозный индекс (ФИ), % Фагоцитозное число (ФЧ), шт. Фагосомно-лизосомный индекс (ИФЛ), %

1 МФ без НА 58,7±2,0 3,3±0,2 41,9±3,6

МФ + НА 55,1±3,2 3,2±0,1 63,5±1,4**

3 МФ без НА 0,7±0,1 71,4±1,9## 3,6±0,1 38,2±1,7

МФ + НА 0,4±0,1* 71,6±2,0 3,7±0,2 61,6±1,4**

24 МФ без НА 0,3±0,1# 72,0±2,4 4,4±0,2# 56,2±1,9##

МФ + НА 0,1±0,0* 84,3±1,0** 4,6±0,2 67,3±0,8**

48 МФ без НА 0,1±0,0# 78,3±0,9 5,3±0,2# 65,0±2,4##

МФ + НА 0,1±0,0 80,1±1,8 4,3±0,1* 77,6±0,8**

Примечание. Различия представлены в виде: * Р<0,05 и ** Р<0,01 (при сравнении показателей группы «МФ без НА», или контроля, с показателями группы «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования); # Р<0,05 и ##Р<0,01 (при попарном сравнении показателей группы «МФ без НА», или контроль, в периоды наблюдения: 1-3, 3-24, 24-48 час). Обозначения: МФ - макрофаг, НА - наноалмазы; ПЛМЛ - показатель лабильности мембран лизосом, ФИ - фагоцитозный индекс, ФЧ - фагоцитозное число, ИФЛ - индекс фагосомно-лизосомного слияния.

Таким образом, по данным анализа влияния НА частиц в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде на функциональное состояние вакуолярно-лизосомального аппарата и процессы фагосомно-лизосомного слияния, было показано, что НА частицы не оказывали существенного влияния на процесс фагоцитоза частиц зимозана МФ и показатель пермеабилизации мембран лизосом. Однако было показано, что НА частицы в концентрации 20 мкг/мл в культуральной среде усиливают процесс фагосомно-лизосомного слияния через 1, 3, 24 и 48 часов, и при этом лабильность лизосомальных мембран была выше. Полученные данные указывают на способность НА стимулировать фагосомно-лизосомное слияние при одновременном сохранении фагоцитозной активности и стабильности мембран лизосом МФ.

Результаты исследования биологических эффектов. индуцированных наноразмерными алмазными частицами в макрофагах

Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию провоспалительных факторов макрофагами

Исследовали влияния НА частиц в концентрации 20 мкг/мл и времени культивирования МФ с НА 48 часов на экспрессию провоспалительных цитокинов: 1Ь-1а, СМ-СБР, ТЫБ-а и П-Ы-у. Согласно данным, представленным в таблице 4, захват МФ НА частиц был сопряжен с увеличением показателей экспрессии макрофагами ОМ-СЗБ в 2 раза, а ПТЧ-у в 2,8 раз. При этом на 39 % уменьшался показатель экспрессии II.-1а, и неизменной осталась экспрессия Т№-а.

Таким образом, полученные данные указывают на высокую биосовместимость НА в определенных дозах и их способность модулировать функциональное состояние МФ. Захват НА марки «УДА-В-ГО» МФ в обсуждаемой экспериментальной ситуации не сопряжен с очевидной стимуляцией провоспалительного статуса, но предполагает возможность стимулирующих эффектов НА частиц на способность МФ в отношении процессов пролиферации и антибактериальной защиты.

Таблица 4

Результаты исследования in vitro влияния частиц наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 48 часов культивирования с макрофагами (МФ) на экспрессию ими IL-la, TNF-a, GM-CSF и IFN-y (M±m)__

Группа Условный показатель экспрессии IL-la, кв. пике. Условный показатель экспрессии TNF-a, кв. пике. Условный показатель экспрессии GM-CSF, кв. пике. Условный показатель экспрессии IFN-y, кв. пике.

МФ без НА 65,1±3,6 22,0±3,1 12,2±1,6 17,4±3,9

МФ + НА 40,2±3,0** 26,1±3,4 25,3±3,0** 47,3±8,0**

Примечание. Различия представлены при сравнении показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01. Обозначения: МФ - макрофаги; НА - наноалмазы.

Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию и секрецию лизосомальных гидролаз и матриксных металлопротеиназ макрофагами

Для изучения влияния НА частиц на экспрессию гидролитических ферментов были выбраны следующие ферменты: катепсин В, катепсин Б, металлопротеиназа-1 (ММР-1) и металлопротеиназа-9 (ММР-9). По мере увеличения времени культивирования МФ с частицами НА количество МФ, экспрессирующих катепсин В, постоянно увеличивалось и достигло максимума к 48 часам (таблица 5). Через 24 часа уровень экспрессии фермента в экспериментальной группе по сравнению с контролем увеличился в 1,9 раза, а через 48 часов - в 2,7 раз. Уровень экспрессии катепсина О был увеличен по сравнению с контролем через 3 часа и 24 часа соответственно в 4,8 и 2 раза. Однако уровень экспрессии катепсина Б уменьшился через 48 часов культивирования МФ с частицами НА в 2,3 раза (по сравнению с величиной через 24 часа), но величина была больше контрольной в 1,9 раз. Величина экспрессии катепсина Б возросла в 4,8 раза после внесения НА в культуры МФ по сравнению с контролем уже через 3 часа и сохранялась без изменений до 24 часов.

Таблица 5

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл на экспрессию макрофагами (МФ) катепсина В, катепсина D, ме-таллопротеиназы-1 (ММР-1) и металлопротеиназы-9 (ММР-9) (М±ш)_

Время инкубации, часы Группа Условный показатель экспрессии катепсина В, кв. пике. Условный показатель экспрессии катепсина D, кв. пике.. Условный показатель экспрессии металлопро-теиназы-1 (ММР-1), кв. пике. Условный показатель экспрессии ; металло- 1 протеиназы-9 (ММР-9), кв. пике.

1 МФ без НА 39,1±3,9 10,9+1,7 35,2+3,2 46,0+5,7

МФ + НА 50,7+7,7 17,5+3,7 19,2+2,0* 48,8+7,0

3 МФ без НА 62,4+12,3 12,0+0,9 19,7+3,7 12,1+2,5

МФ + НА 63,2±4,9 57,2+4,6** 17,9+2,7 25,6+6,6*

24 МФ без НА 62,0+4,7 26,8+2,7 38,9+5,1 6,8+3,8

МФ + НА 118,5+11,3** 53,0+5,9** 68,9+12,2* 20,1+5,2*

48 МФ без НА 45,8+11,6 11,7+1,5 10,2+1,9 3,3+1,0

МФ + НА 124,4+16,4** 22,8+3,2* 30,5+6,9** 9,1+1,8*

Примечание. Различия представлены при сравнении показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01. Обозначения: МФ - макрофаги; НА - наноалмазы, ММР-1 - мегал-лопротеиназа-1, ММР-9 - металлопротеиназа-9.

Исследование экспрессии металлопротеиназы-1 (ММР-1) выявило увеличение уровня экспрессии данного фермента макрофагами только через 24 часа после внесения в куль-туральную среду НА, и величина этого показателя по сравнению с контролем была больше в 1,8 раза. Через 48 часа культивирования МФ с частицами НА уровень экспрессии макрофагами ММР-1 снизился в 2,3 раза, но был больше величины экспрессии ММР-1 в контроле в 3 раза. При исследовании экспрессии металлопротеиназы-9 (ММР-9) через 1 час культивирования МФ с частицами НА был обнаружен феномен повышения уровня экспрессии данного фермента как в контроле, так и в экспериментальной группе. Затем уровень экспрессии макрофагами ММР-9 постепенно снижался вплоть до 48 часов культивирования МФ с частицами НА, но оставался больше, чем в контрольных культурах -соответственно в 2,1, 3 и 2,8 раз.

Поскольку, согласно нашим данным, выбранная нами концентрация 20 мкг/мл НА не вызывала цитотоксических эффектов в отношении МФ in vitro (см. таблица 1, 2), то это позволило провести исследование влияния НА частиц на секрецию МФ изучаемых ферментов. Поскольку при изучении всех указанных ферментов их экспрессия в МФ после

воздействия НА заметно возрастала через 24 часа, то изучение их секреции проводили в интервале времени 24-48 часов после введения в культуральную среду НА.

Культивирование МФ с частицами НА не привело к увеличению показателя секреции катепсина В (относительно контроля), но он увеличился как в контроле, так и в экспериментальных группах по мере увеличения времени культивирования МФ (таблица 6). Исследование секреции катепсина О макрофагами после внесения в культуральную среду НА выявило многократное увеличение уровня секреции через 48 часов культивирования МФ с НА по сравнению с контролем. Кроме того, время культивирования, видимо, является фактором, стимулирующим секрецию катепсина О, поскольку его секреция через 48 часов культивирования МФ с НА была существенно большей, чем через 24 часа.

Таблица 6

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл на секрецию макрофагами (МФ) катепсина В, катепсина D, ме-таллопротеиназы-1 (ММР-1) и металлопротеиназы-9 (ММР-9) (М±ш)_

Время ! инкубации, j часы { Группа Показатель секреции катепсина В, тыс. кв. пике. Показатель секреции катепсина D, тыс. кв. пике. Показатель секреции металло-протеиназы-1 (ММР-1), тыс. кв. пике. Показатель секреции металло-протеиназы-9 (ММР-9), тыс. кв. пике.

24 МФ без НА 44,5±6,9 5,5±1,3 47,4±12,5 1,5±0,1

МФ+НА 44,9±10,0 5,1±1,1 111,4±21,1** 9,3±2,0*

48 МФ без НА 52,8±13,8 31,7±5,2 2,9±0,4 6,8±1,1

МФ+НА 69,0±12,5 78,8±5,8** 1,3±0,2 102,6±21,7**

Примечание. Различия представлены при сравнении показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01. Обозначения: МФ - макрофаги; НА - наноалмазы.

Согласно полученным данным, секреция ММР-1 макрофагами существенно снижалась к 48 часам культивирования МФ с НА, но в большей степени, чем в контрольной культуре. Как следует из данных по секреции ММР-9, было выявлено резкое увеличение секреции данного фермента к 48 часам культивирования МФ с НА. Через 24 часа после воздействия НА частиц на МФ показатель секреции исследуемого фермента возрастал в экспериментальной группе по сравнению с контролем в 6,1 раза и почти в 15 раз через 48 часов после инкубации МФ с НА.

Таким образом, увеличение секреции исследуемых ферментов наблюдали преимущественно через 48 часов после культивирования МФ в культуральной среде с НА. При этом ни в один из временных периодов не наблюдали сколь-нибудь существенных проявлений деструкции МФ (см. таблица 1). Сопоставление показателей экспрессии катепсина Б макрофагами (см. таблица 5) и величин показателей его секреции через 24 и 48 часов после начала воздействия НА (см. таблица 6) позволяет предположить, что уменьшение доли МФ, экспрессирующих катепсин Б, к 48 часу может быть обусловлено достаточно быстрой секрецией катепсина Б из МФ во внеклеточную среду, а не «выходом» из МФ в связи с деструкцией плазмалеммы, поскольку в популяции МФ в эти периоды наблюдали только единичные МФ с признаками их деструкции. Схожие результаты были получены в случае сопоставления данных по продукции и секреции ММР-9 (см. таблица 5, 6). В данном случае также выявили достаточно быструю секрецию ММР-9 с одновременным уменьшением продукции данного фермента к 48 часам. Однако уровни про-

дукции и секреции в случае ММР-9 были значительно выше, чем в случае с катепси-ном Б. Для ММР-1 отмечали обратную зависимость: более раннюю секрецию на 24 часе с последующей сохраняющейся продукцией данного фермента в МФ. В случае катепси-на В отмечали повышенную продукцию фермента МФ к 48 часам и сохранение его уровня секреции. Возможно, имела место отсроченная секреция продуцируемого МФ фермента.

Таким образом, НА частицы при концентрации 20 мкг/мл и при времени культивирования МФ с НА 48 часов значимо в 2,7 и почти в 2 раза повышали показатели экспрессии соответственно катепсинов ВиД а металлопротеиназ ММР-1 и ММР-9 - почти в три раза. НА частицы при концентрации 20 мкг/мл и при времени культивирования МФ с НА 48 часов значимо в 2,5 раза повышали секрецию катепсина Б, через 24 часа в 2,3 раза металлопротеиназы ММР-1 и через 24 и 48 часов соответственно в 6,1 и 15 раз металло-протеиназы ММР-9. Полученные данные указывают на способность НА модулировать функциональное состояние МФ, внутриклеточный и внеклеточный гидролитический потенциал МФ, проявляющийся повышением уровнем экспрессии и секреции МФ катепсина В, катепсина Б, ММР-1 и ММР-9.

Результаты исследования влияния наноразмерных алмазных частиц на экспрессию и секрецию ростовых факторов макрофагами

Для изучения влияния НА частиц на экспрессию ростовых факторов были выбраны следующие маркеры: ЕСР, ТСРВ1/ГСР-Р, КОР/ТСЕ-7 и Ь-РОЕ/РСЕ-2. Уровень экспрессии ЕвР начинал увеличиваться через 24 часа после внесения НА в культуры (таблица 7). Через 24 часа величина этого показателя в экспериментальной группе по сравнению ¡с контролем увеличилась в 1,8 раза, а через 48 часов - в 2,9 раз.

Таблица 7

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл на экспрессию макрофагами (МФ) EGF, TGFBl/TGF-p, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2 (Mini)

Время инкубации, часы Группа Условный показатель экспрессии EGF, кв. пике. Условный показатель экспрессии TGFB1/ TGF-P, кв. пике. Условный показатель экспрессии KGF/ FGF-7, кв. пике. Условный показатель экспрессии b-FGF/ FGF-2, кв. пике.

1 МФ без НА 8,4+2,4 13,2+1,7 9,7+0,9 12,6+2,6

МФ+НА 9,2+2,3 9,9+2,0 8,0+1,2 7,3+1,6

3 МФ без НА 8,3+1,4 15,3+2,5 5,4+1,4 10,7+2,2

МФ +НА 9,6+1,9 12,5+1,7 15,7+1,7** 11,2+2,3

24 МФ без НА 10,9+2,5 14,1+2,6 9,7+1,4 7,4+2,0

МФ + НА 19,4+1,6* 22,5+2,9* 13,6+1,8* 8,3+2,2

48 МФ без НА 10,5+1,6 6,8+0,5 17,4+1,6 21,3+2,6

МФ + НА 30,0+3,7** 15,7+1,0** 11,8+1,3* 9,8+1,2**

Примечание. Различия представлены при сравнении показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01. Обозначения: МФ - макрофаги; НА - наноалмазы.

Показатель экспрессии ТСРВ1/ТОР-Р, также как и ЕОБ, не изменялся через 3 часа после внесения ПА в культуры МФ. Однако через 24 часа этот показатель в экспериментальной группе уже превосходил величину экспрессии в контроле в 1,6 раза, а через 48 часов - в 2,3 раза. При этом величины исследуемых показателей уменьшались как в контрольной, так и экспериментальной группах.

Доля МФ, экспрессирующих КОР/ТОР-7, возросла в 2,9 раза после внесения НА в культуры МФ по сравнению с контролем уже через 3 часа. Через 24 часа величина этого параметра в экспериментальной группе также превышало этот показатель в контрольной группе клеток в 1,4 раз. Однако через 48 часов этот показатель снизился в экспериментальной группе относительно показателя через 24 часа на 13,2%. При этом экспрессия КХЗР/РОР-7 через 48 часов снизилась по сравнению с величиной в контроле в 1,5 раза, что было обусловлено увеличением количества МФ, экспрессирующих КСР/РОР-7, в контроле.

Влияние НА частиц на экспрессию Ь-РвР/РСР-2 в МФ было иным. В течение 24 часов после воздействия НА частиц на МФ не было выявлено какого-либо их влияния на экспрессию Ь-РОР/ТОР-2 в МФ. Через 48 часов отмечено заметное увеличение показателя экспрессии Ь-РОР/РОР-2 в МФ контрольной группы. При этом величина экспрессии этого фактора в экспериментальной группе практически не изменилась. Таким образом, в данном эксперименте был выявлен эффект ингибирования продукции Ь-РОР/ТОР-2 в МФ через 48 часов в 2,2 раза, если сравнивать показатели его экспрессии в экспериментальной и контрольной группе культур МФ.

Известно, что повышение экспрессии и продукции каких-либо ростовых факторов в МФ, обусловленное их ответом на какой-либо объект фагоцитоза, не всегда сопряжено с активацией процесса их внеклеточной секреции (Пальцев М.А. и др., 2003; Аз501ап II.К. « а1., 1987). В связи с этим нами было проведено исследование влияния НА частиц не только на внутриклеточную экспрессию в МФ ЕОР, ТОРВ1/ТОР-Р, КОР/РСР-7 и Ь-ГОР/РОГ-2, но и на их секрецию (таблица 8). Поскольку при изучении всех перечисленных факторов, за исключением Ь-РОР/ТОР-2, их экспрессия в МФ после воздействия НА заметно возрастала через 24 часа, то изучение их секреции проводили через этот период времени.

Таблица 8

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) в концентрации 20 мкг/мл через 24 часа культивирования с макрофагами (МФ) на секрецию ими EGF, TGFB1/GF-P, KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2 (Mim)__

Группа Показатель секреции EGF, кв. пике. Показатель секреции TGFB1/TGF-P, кв. пике. Показатель секреции KGF/FGF-7, кв. пике. Показатель секреции b-FGF/FGF-2, кв. пике.

МФ без НА 290,4±18,0 2065±445,5 15448,6±3460,7 2499,8±1240,6

МФ + НА 1543,6±493,6** 19033,2±2605,7** 12487,8±2892,2 2948±558,7

Примечание. Различия представлены при сравнении показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» через 24 часа культивирования в виде: * Р<0,05, ** Р<0,01. Обозначения: МФ — макрофаги; НА - наноалмазы.

Показатель секреции EGF возрастал в экспериментальной группе через 24 часа после воздействия НА по сравнению с контролем в 5,3 раза. Показатель секреции TGFB1/TGF-Р возрастал в экспериментальной группе через 24 часа после воздействия НА по сравнению с контролем в 9,2 раза. Хотя НА и приводили к значительному повышению экспрессии KGF/FGF-7 в МФ (см. таблица 7), это не влияло на уровень внеклеточной секреции этого фактора (см. таблица 8). Показатели секреции b-FGF/FGF-2 в контрольной и экспериментальной группах не различались по величине.

Таким образом, НА частицы в концентрации 20 мкг/мл и временем культивирования с МФ 24 и 48 часов значимо повышают показатели экспрессии ростовых факторов EGF соответственно в 1,8 и 2,9 раза и TGFBl/TGF-р в 1,6 и 2,3 раза, в то же время через 48 часов значимо снижают экспрессию KGF/FGF-7 и b-FGF/FGF-2 соответственно в 1,5 и 2,2 раза. НА частицы в концентрации 20 мкг/мл и временем культивирования с МФ 24 часа значимо повышали индекс секреции EGF и TGFBl/TGF-р соответственно в 5,3 и 9,2 раза, в то же время не влияли на уровень внеклеточной секреции KGF/FGF-7 и Ь-FGF/FGF-2. Полученные данные указывают на способность НА активировать МФ, модулировать их функциональное состояние, изменяя их прорегенераторный потенциал, обусловленный стимуляцией продукции и секреции таких важных в репаративных процессах ростовых факторов как EGF и TGFBl/TGF-p.

ВЫВОДЫ

1. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» обладают высокой био-тропностью к макрофагам в диапазоне доз в культуральной среде от 10 до 30 мкг/мл включительно и захватываются ими in vitro различными механизмами эндоцитоза: адсорбционным пиноцитозом, эндоцитозом с формированием клатриновых эндоцитозных везикул и эндоцитозом крупных агрегатов наноалмазов (фагоцитозом), формирующихся внеклеточно.

2. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО» в диапазоне доз 1030 мкг/мл биосовместимы с макрофагами in vitro и существенно не влияют на: продукцию ими активных форм кислорода, их фагоцитозную активность в отношении иных, чем наноалмазы, корпускулярных объектов биологической природы и лабилизацию мембран лизосом, но при этом стимулируют процесс фагосомно-лизосомного слияния.

3. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами in vitro, в концентрации 20 мкг/мл обладают способностью модулировать провоспалительный и профиброгенный статус макрофагов, стимулируя экспрессию GM-CSF и IFN-y; снижая экспрессию IL-la, b-FGF/FGF-2 и не изменяя экспрессию TNF-a, что свидетельствует о возможности использования наноалмазов без риска усиления проявления процесса воспаления.

4. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами in vitro, в концентрации 20 мкг/мл повышают экспрессию, продукцию и стимулируют секрецию макрофагами лизосомальных ферментов (катепсина В и катепси-на D) и матриксных металлопротеиназ (ММР-1 и ММР-9), которые потенциально способны модулировать развитие процессов повреждения, регенерации или фиброза. Отсутствует прямая зависимость между продукцией и секрецией гидролитических протеаз при модулирующем воздействии наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» на функциональный статус макрофагов после их эндоцитоза.

5. Наноразмерные алмазные частицы марки «УДА-В-ГО», эндоцитированные макрофагами in vitro, в концентрации 20 мкг/мл повышают экспрессию, продукцию и стимулируют секрецию макрофагами ростовых факторов: EGF, TGFBl/TGF-р,

KGF/FGF-7,- потенциально способных модулировать процессы воспаления, регенерации или фиброза. Отсутствует прямая зависимость между продукцией и секрецией ростовых факторов при модулирующем воздействии наноразмерных алмазных частиц марки «УДА-В-ГО» на функциональный статус макрофагов после их эндоцитоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нещадим Д.В., Архипов С.А. Исследование закономерностей слияния фагосом с лизосомами в макрофагах in vitro / Д.В. Нещадим, С.А. Архипов // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы 5-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2011. -С. 150-151.

2. Архипов С.А. Закономерности слияния фагосом с лизосомами в макрофагах в зависимости от объема фагоцитированного материала in vitro / С.А. Архипов, Д.В. Нещадим, В.А. Шкурупий // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - №9. - С. 88-89.

3. Исследование влияния частиц наноразмерных алмазов на макрофаги in vitro / В.А. Шкурупий, С.А. Архипов, Д.В. Нещадим, Е.С., Ахраменко, A.B. Троицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 158. - №10. - С. 503-506. (Из списка ВАК)

4. Модифицирующее влияние наноразмерных алмазов на гидролитический потенциал макрофагов in vitro / Д.В. Нещадим, С.А. Архипов, В.А. Шкурупий, Е.С. Ахраменко, A.B. Троицкий, М.А. Карпов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159. - №3. - С. 382-385. (Из списка ВАК)

5. Исследование влияния наноалмазов на прорегенераторный потенциал макрофагов in vitro / Д.В. Нещадим, С.А. Архипов, В.А. Шкурупий, Е.С. Ахраменко, A.B. Троицкий, М.А. Карпов // Фундаментальные исследования. - 2015. - №2. - Ч. 6. - С. 1222-1226. (Из списка ВАК)

6. Исследование биотропности и механизмов эндоцитоза частиц наноалмазов макрофагами in vitro / Д.В. Нещадим, С.А. Архипов, В.А. Шкурупий, Е.С. Ахраменко, A.B. Троицкий, C.B. Айдагулова, Л.В. Шестопалова // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2015. - №3. - Ч. 3. - С. 388-392.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ИАМФ - индекс активации макрофагов

ИП АФК - индекс продукции активной формы кислорода

ИР - индекс «распластывания»

ИЭА - индекс эндоцитозной активности макрофагов

МФ - макрофаг(-и)

НА - наноразмерная(-ые) алмазная(-ые) частица(-ы), наноалмазы НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием

ПЛМЛ - показатель лабильности (пермеабилизации) мембран лизосом

ПЖ - показатель жизнеспособности

ФИ - фагоцитозный индекс (или индекс фагоцитоза)

ФЛИ - индекс фагосомно-лизосомного слияния

ФЧ - фагоцитозное число

ЭИ - эндоцитозный индекс (или индекс эндоцитоза)

b-FGF/FGF-2 - основной фибробластический ростовой фактор

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

EGF - эпидермальный фактор роста

IFN-y - интерферон >

IL-1 - интерлейкин 1

KGF/FGF-7 - фактор роста кератиноцитов MMP(-s) - матриксная(-ые) металлопротеиназа(-ы) TGF-J3 - трансформирующий ростовой фактор бета TNF-a - фактор некроза опухоли альфа

Соискатель

Нещадим Д.В.

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630073, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 2112. Подписано в печать 09.04.2015 г.