Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Новый диагностический аллерген из растения золотарник канадский (Solidago canadensis) и его иммунобиологические свойства

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

На правах рукописи

ии3450231

Пронькина Ольга Владимировна

Новый диагностический аллерген из растения золотарник канадский (Solidago canadensis) и его иммунобиологические свойства

14.00.36- аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

? ~ ПЧТ 2008

Москва 2008 J

003450231

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Валентина Михайловна Бержец Официальные оппоненты:

1. Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Михаил Петрович Костинов

2. Член корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Геннадий Васильевич Порядин

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защита состоится 20 ноября 2008 года на заседании диссертационного совета Д 001.035.01. при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу. 105064, г. Москва, Малый Казенный переулок, д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан « /3» С¿7Я 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета'

Кандидат биологических наук

И.В.Яковлева

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Широкая распространенность аллергических заболеваний превратила проблему аллергии в глобальную медико-социальную проблему. Количество больных аллергическими заболеваниями во всем мире каждые 10 лет удваивается. Одним из самых распространенных аллергических заболеваний является поллиноз. В разных странах мира поллинозами страдают от 0,2 до 39% населения (Балаболкин И.И., 1996; Емельянов А., 2005; Paterson R. et al., 2000, Kjaer H.F. el al, 2008). Согласно прогнозу ученых к 2015 году более 50% населения Земли будут подвержены поллинозам.

Поллиноз встречается во всех возрастных группах, но обычно первые симптомы начинают беспокоить в детском или юношеском возрасте. По последним данным в Центральном районе европейской части России поллиноз встречается с частотой 20,6 случаев на 1000 детей. В южных областях России сенсибилизация к пыльце встречается чаще, чем в целом по России, у 1,2 до 5,7 % детей. (Астафьева Н.Г., Горячкина Л.А, 2004).

Семейство сложноцветных занимает одно из ведущих мест в развитии сенсибилизации у населения во всем мире (Горячкина Л.А.,2004; Olson et al., 1986; Wurthrich В. et al., 1995) В последнее время в Средней полосе РФ отмечают высокую сенсибилизацию к сорняковому растению золотарнику, особенно к североамериканскому виду Solidago canadensis. Однако данные о наличии аллергизирующих свойств у золотарника довольно противоречивы. Американские исследователи считают золотарник исключительно

насекомоопыляемым растением и, следовательно, ответственным за развитие контактного дерматита. По их мнению, комковатость и

клейкость пыльцы золотарника исключает вероятность развития пыльцевой сенсибилизации (De Jong N., Vermeulen A., 1998). Напротив, по сведениям европейских исследователей, золотарник канадский включен в группу растений, вызывающих поллиноз. Довольно часто обнаруживают сенсибилизацию к его пыльце у лиц с аллергической предрасположенностью (De la Torre Morin F., 2001).

Крупнейший производитель аллергенов «Sevapharma» (Чехия) выпускает наборы для диагностики и лечения, включающие аллерген Solidago canadensis. Эффективность данных препаратов при проведении специфической иммунотерапии доказана нашими исследователями (Манжос М.В. и др., 2005). Диагностические панели для иммуноферментного анализа известных производителей «Allergopharma» (Германия) также включают аллерген Solidago canadensis.

Несмотря на широкое распространение данного растения в Центральных районах Российской Федерации, отечественного препарата аллергена Solidago canadensis в настоящее время не существует. В связи с этим весьма актуальным является разработка технологии получения диагностического препарата аллергена из Solidago canadensis. Для исследования роли золотарника канадского в развитии сенсибилизации нами выбрано детское население такого модельного региона как Тульская область. Известно, что Тульская область является одним из индустриально развитых промышленных регионов с загрязненной поллютантами внешней средой. Экологические проблемы области обусловлены концентрацией на ее территории крупных предприятий химической и металлургической промышленности, нескольких мощных энергетических объектов, предприятий металлообработки и машиностроения. Выбросы вредных веществ в атмосферу промышленными предприятиями региона

составляют 21% от суммарных выбросов Центральной части России. В связи с этим в Тульской области отмечен рост аллергических заболеваний у детского населения. Однако структура пыльцевой сенсибилизации и состояние гуморального и клеточного иммунитета у детей с поллинозом на территории Тульской области до настоящего времени не изучались.

Цель исследования

Получить диагностические аллергены из золотарника канадского и исследовать их иммунобиологические свойства.

Задачи исследования

1. Приготовить препараты аллергенов из соцветий и пыльцы растения золотарник канадский.

2. Изучить физико-химические и иммунобиологические свойства полученных аллергенов.

3. Исследовать структуру пыльцевой сенсибилизации у детей в Тульской области и определить диагностическую значимость аллергенов из золотарника канадского (в тестах in vitro).

4. Определить клинико-иммунологические особенности поллинозов у детей в Тульской области в рамках доклинического исследования новых аллергенов.

Научная новизна

Впервые в нашей стране приготовлены отечественные аллергенные экстракты из пыльцы и соцветий золотарника канадского. Выявлено, что полученный нами препарат аллергена из пыльцы растения обладает высокой специфической активностью

(аллергенными и антигенными свойствами) и соответствует по своим физико-химическим и иммунобиологическим свойствам современным требованиям, предъявляемым к диагностическим аллергенам.

Впервые исследована структура пыльцевой сенсибилизации у детей в Тульской области. Показано, что сенсибилизация к пыльце деревьев встречается у 45% обследованных детей, к злаковым травам -у 68% и к сорным растениям - у 60%. Выявлен высокий процент сочетанной сенсибилизация к луговым и сорным травам. Показана диагностическая значимость аллергена из золотарника канадского в выявлении сенсибилизации у пациентов с поллинозом.

Впервые в Тульской области проведен комплекс клинико-иммунологических исследований, позволивший установить особенности течения, клинических проявлений и состояние гуморального и клеточного иммунитета у детей с поллинозом в рамках доклинического испытания новых аллергенов.

Практическая значимость

Результаты исследования легли в основу инструкции по изготовлению и контролю нового аллергена из пыльцы золотарника канадского. Подана заявка на изобретение нового аллергена.

Проведенные исследования позволят расширить панель для диагностики пыльцевой сенсибилизации в тестах in vitro с включением аллергена пыльцы золотарника канадского

Основные положения, выносимые на защиту

- Впервые в нашей стране получены аллергены из соцветий и пыльцы золотарника канадского. Специфическая активность полученных препаратов установлена в реакциях in vitro.

- Показана диагностическая значимость аллергена из пыльцы золотарника канадского и определена роль семейства сложноцветных в структуре полпинозов у детей в Тульской области.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные положения диссертации обсуждены на IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, 2004), VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2005), IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008) и других.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 110 листах машинописного текста, иллюстрированы 10 таблицами и 17 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Список цитируемой литературы включает 145 отечественных и зарубежных источников.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Сырьем для получения аллергенного препарата служили соцветия и пыльца золотарника канадского. При сборе пыльцы руководствовались стандартными методами (Адо и др., 1963 г.). Нами были приготовлены аллергенные экстракты из пыльцы и соцветий растения по методу Кока (Coca A. et al, 1922). В полученных препаратах

аллергенов определяли количественное содержание белка в единицах белкового азота (PNU) по методу Несслера (Фрадкин В.А., 1990).

Анализ фракционного состава аллергенных экстрактов, полученных из соцветий и пыльцы золотарника, проводили методом вертикального электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле

Сенсибилизирующие свойства приготовленных препаратов аллергенов изучали в опытах анафилаксии на морских свинках (Фрадкин В.А., 1990). Анафилактический шок вызывали двукратным введением препарата. Первую сенсибилизацию проводили с неполным адъювантом Фрейнда. Разрешающую дозу вводили на 21 день после последней инъекции. Результаты регистрировали путем вычисления анафилактического индекса по формуле Вейгла.

Для оценки специфической активности - аллергенных и иммуногенных свойств экстрактов из золотарника использовали метод непрямой дегрануляции тучных клеток крысы (НДТК) (Фрадкин В.А., 1990), иммуноферментный анализ (ИФА) (Гервазиева В.Б, 1986 и др.) и иммунодот (Михайлов А.Т, Симирский В.Н., 1991).

Методом иммуноферментного анализа определяли IgE-антитела в сыворотках больных с пыльцевой сенсибилизацией. В опыте использовали 60 сывороток больных, страдающих повышенной чувствительностью к пыльце сложноцветных растений, сенсибилизация к которым была подтверждена скарификационными пробами. Уровень lgE-антител оценивали в условных единицах и распределяли по классам от 0 до 4.

В тесте НДТК использовали 10 отобранных сывороток с максимальным уровнем специфических IgE-антител к золотарнику канадскому и водно-солевые экстракты аллергенов из соцветий и пыльцы золотарника. Контролем служила спонтанная дегрануляция

тучных клеток крысы. Результат считали отрицательным если процент дегранулированных клеток был менее 8%.

Методом иммунодота оценивали антигенные свойства полученных аллергенов (Михайлов А.Т, Симирский В.Н., 1991). Экстракты из пыльцы и соцветий золотарника, растворенные в жидкости Эванса-Кока, наносили на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл (концентрация белка в препарате 1 мкг/мл). В качестве негативных контролей использовали экстракты из бытовых аллергенов в той же концентрации, бычий сывороточный альбумин и фосфатно-солевой буфер Эванса-Кока. В качестве положительных контролей -суммарные ^в-антитела против иммуноглобулинов человека. Интенсивность окрашивания эрреев оценивали денситометрически в абсолютных значениях с помощью программы «1та£е<ЗиапЬ>.

Клиническое наблюдение за пациентами осуществлялось в условиях аллергологического кабинета и в пульмонологическом отделении Тульской областной детской больницы. Обследовано 100 детей от 5 до 16 лет с различными проявлениями поллиноза с давностью заболевания не менее 2 лет. Детям для верификации диагноза предварительно проводили скарификационные кожные пробы с пыльцевыми аллергенами. В группу наблюдений вошли 80 мальчиков и 20 девочек, группа контроля составила 40 человек.

Программа обследования пациентов включала:

• Кожные скарификационные пробы с пыльцевыми аллергенами;

• Исследование уровня общего и специфического 1§Е методом ИФА;

• Определение гематологических показателей: - абсолютное число лейкоцитов,

- относительное и абсолютное количество лимфоцитов;

• Исследование иммунного статуса включало: определение относительного и абсолютного количества CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеток, иммуноглобулинов А, М, G.

Концентрацию общего IgE определяли методом ИФА с использованием реагентов BEST-стрип (ЗАО «Вектор-Бест» г.Новосибирск).

Выявление IgE-антител к заданному спектру аллергенов проводилось полуколичественным способом с помощью метода иммуноферментного анализа в лаборатории аллергодиагностики ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови исследовали с помощью моноклональных антител полученных в ГНЦ «Институт Иммунологии ФМБА России»: ЛТ1 (CD3+), ЛТ4 (CD4+), JIT8 (CD8+) методом непрямой иммунофлуоресценции. В качестве люминесцентной сыворотки использовали Р(аЬ)2-фрагменты антимышиных иммуноглобулинов, меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Процент позитивных клеток определяли на иммуноцитометре FACS Calibur (Beckton Dikinson, США) с использованием программы CELL Qest (Beckton Dikinson, США).

Концентрацию сывороточных иммуноглобулинов А, М и G определяли методом радиальной диффузии в геле по Манчини (1965г) с использованием моноспецифических сывороток отечественного производства (Нижегородское предприятие по производству бактериальных препаратов).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Исходя из задач исследования на первом этапе изготовлено по 2 серии аллергенов из соцветий и пыльцы золотарника канадского. Важным этапом в разработке технологии изготовления явился подбор соотношения сырья и экстрагирующей жидкости. Экспериментально показано, что при приготовлении препаратов из соцветий и пыльцы золотарника канадского оптимальным является соотношение 3:100 г/мл (сырье и экстрагирующая жидкость соответственно). Экстракцию проводили в течение 3-х дней при t=4-8°C и pH 7,0-7,2. Содержание белкового азота в аллергенах из соцветий составило 6700 PNU, а в препаратах аллергенов из пыльцы - 8400 PNU.

Безвредность полученных препаратов проверяли на пяти белых мышах. Каждому животному вводили препарат в объеме 0,5 мл. В течение 7 дней гибели мышей не отмечали, что свидетельствует о безвредности аллергенных экстрактов из золотарника канадского.

Приготовленные серии аллергенов испытывали на стабильность. Препараты хранили при температуре от 2 до 4°С; определение содержания белка и оценку физических свойств проводили через 1, 1,5 и 2 года. Доказано, что препараты аллергенов не изменяли свои физические свойства при хранении более двух лет.

Анализ фракционного состава аллергенных экстрактов, полученных из соцветий и пыльцы золотарника, проводили методом вертикального электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле. Результаты электрофоретического разделения показали, что исследуемые препараты гетерогенны. Электрофоретические фракции аллергена из соцветий золотарника не содержали высокомолекулярных компонентов и были сильно пигментированы.

Рис. 1 Электрофорез аллергенов из соцветий (1) и пыльцы (2) золотарника канадского, пыльцы амброзии полыннолистной (3); белковые маркеры (Pharmacia, Sweden): 94,6 кДа - celluiase, 66,2 кДа -BSA, 45 кДа - ovalbumin, 31 кДа - carbonic anhidrase, 21,5 кДа - tripsin inhibitor, 14,4 кДа-lisozim.

Электрофоретическое разделение аллергена из пыльцы золотарника позволило определить четыре основные белковые группы данного препарата. Первая - высокомолекулярная фракция около 90 кДа, далее следует фракция от 31 до 66,2 кДа, третья белковая фракция от 21,5 до 31 кДа и низкомолекулярная в области 14,4 кДа.

Для выявления сенсибилизирующих свойств полученных аллергенов проводили модельные эксперименты по воспроизведению анафилактического шока у морских свинок. Предварительно in vivo на контрольной группе интактных морских свинок была определена максимальная доза аллергенов из соцветий и пыльцы золотарника, не вызывающая токсического эффекта у животных. Согласно полученным

результатам индекс Вейгла у морских свинок, получавших аллерген из соцветий золотарника, был равен с одной серией препарата 1,3, со второй серией -1,2. В группе животных, получавших аллерген из пыльцы золотарника двух серий, индекс Вейгла составил 1,9 и 1,6 соответственно (табл. 1).

Таблица № 1

Выраженность анафилактического шока

Сенсибилизирующий агент Количество животных в группе Количество животных с проявлением анафилактического шока (по степени выраженности в баллах) Индекс Вейгла

- + ++ +++ ++++

Аллерген из соцветий, серия 1.1 10 1 6 4 1,3

Аллерген из соцветий, серия 1.2 10 2 5 3 1,2

Аллерген из пыльцы, серия 2.1 10 0 2 7 1 1,9

Аллерген из пыльцы серия 2.1 10 1 2 7 1,6

Для исследования специфической активности полученных аллергенов из пыльцы и соцветий золотарника нами были отобраны сыворотки пациентов, страдающих поллинозом с преимущественной сенсибилизацией к растениям семейства сложноцветных. Методом ИФА было проанализировано 60 сывороток. Проведенное исследование подтвердило наличие аллергии в группе обследованных детей к нескольким видам пыльцевых аллергенов одновременно (табл 2).

Частота обнаружения ^Е-АТ в сыворотках пациентов с сенсибилизацией к пыльце сложноцветных (п=60) методом ИФА

Аллерген Положительный результат, кол-во сывороток

п %

Соцветия золотарника 14 23,3*

Пыльца золотарника 21 35,0*

Соцветия и пыльца золотарника 13 21,7

Полынь 38 63,3

Амброзия 8 13,3

*р<0,05

Выявлена разница в уровне сывороточных 1§Е-антител к аллергенам из пыльцы и соцветий золотарника. ^Е-АТ к аллергену из соцветий растения обнаружены в сыворотках 23,3% пациентов, а из пыльцы - 35,0% пациентов ( р<0,05). Таким образом, положительные реакции к аллергену из пыльцы золотарника встречались в 1,5 раза чаще, чем к аллергену из соцветий растения.

Высокая диагностическая значимость аллергена из пыльцы золотарника была обнаружена в реакциях ИФА: уровень ^Е-АТ первого класса был выявлен в сыворотках 18,3% пациентов с поллинозом, второго класса - 13,3% и третьего класса - 3,3% обследованных пациентов (Рис. 2).

АТ,%

Пыльца золотарника

Соцветия золотарника

Амброзия

76,8

18,3 13,3 3,3

21,6 1.6

11,6 1,6

48,3

11,6 3.3

□ О класс В 1 класс □ 2 класс ИЗ класс

Рис. 2. Распределение сывороток (%) по уровню 1§Е-антител к стандартизованным и экспериментальным аллергенам в реакции ИФА

(п=60).

Учитывая проведенный анализ, нами для дальнейших экспериментов по оценке специфической активности новых препаратов аллергенов были отобраны 10 сывороток с максимальным уровнем 1§Е-АТ как к соцветиям, так и к пыльце золотарника канадского. Специфическую активность аллергена из соцветий и аллергена из пыльцы оценивали в тесте непрямой дегрануляции тучных клеток (НДТК).

При постановке реакции НДТК предварительно проводили контроль тучных клеток крыс, аллергенных экстрактов и каждой сыворотки. Процент спонтанной дегрануляции тучных клеток не превышал 5-7% (табл.3).

Специфическая активность аллергенов из соцветий и пыльцы золотарника канадского в тесте НДТК

Уровень ^Е-АТ к аллергену из соцветий (класс реакции ИФА) % Дегрануляции тучных клеток с аллергеном из соцветий Уровень 1§Е-АТ к аллергену из пыльцы (класс реакции ИФА) % Дегрануляции тучных клеток с аллергеном из пыльцы

1 класс (п=8) 12,3±3,7 1 класс (п =0) -

2 класс (п=2) 23,0±1,5 2 класс (п=8) 29,0±5,3

3 класс (п=0) - 3 класс (п=2) 43,0±4,2

Согласно проведенным исследованиям высокий процент дегрануляции пассивно сенсибилизированных тучных клеток отмечался во всех 10-ти экспериментах с аллергеном из пыльцы золотарника. При обработке тучных клеток сыворотками с высоким содержанием ^Е-АТ (3 класс и 2 класс) процент дегрануляции составил 43,0±4,2% и 29,0±5,3% соответственно.

При проведении экспериментов с аллергеном из соцветий золотарника наибольший показатель дегрануляции тучных клеток составил 23,0±1,5%. Это связано с тем, что в сыворотках пациентов уровень специфических 1§Е-АТ к аллергену из соцветий был низким и соответствовал лишь первому классу в реакции ИФА. На основании полученных результатов можно сделать вывод о более частой встречаемости сенсибилизации к пыльце золотарника канадски» и, чем к его соцветиям.

Методом иммунодота показана способность полученных аллергенов связывать что предполагает наличие антигенных

свойств у препаратов. В опыте использовали 10 ранее отобранных сывороток пациентов с уровнем специфических ^Е-АТ второго и третьего класса к золотарнику канадскому и 2 контрольные сыворотки практически здоровых доноров. Об уровне 1£С-АТ в сыворотках пациентов судили качественно по интенсивности окрашивания микроточек на нитроцеллюлозной мембране, проинкубированной с сыворотками пациентов. Окрашенную мембрану сканировали и результаты обрабатывали денситометрически с помощью программы 1та§е0иаШ.

1 - суммарные ^ в-антитела человека (50 мкг/мл)

2 - аллерген из пыльцы золотарника канадского (1 мкг/мл)

3 - аллерген из соцветий золотарника (1 мкг/мл)

4 - бычий сывороточный альбумин (1 мкг/мл)

5 - фосфатио-солевой буфер Эванса -Кока

6 - аллерген из клещей О.Гаппае

Рис. 3 Схема микроточечного иммунодота

Методом иммунодота выявлены антигенные свойства препарата аллергена из пыльцы золотарника. Результаты экспериментов показали, что после инкубации стрипов с сыворотками больных интенсивность окрашивания микроточек, содержащих аллерген из пыльцы, на 30-50% превышала интенсивность окрашивания мембраны, инкубированной с сыворотками здоровых доноров. Серопозитивные реакции с аллергеном из пыльцы золотарника могут свидетельствовать о специфическом распознавании молекулами сывороток пациентов предполагаемых В-клеточных эпитопов в белковых молекулах пыльцы растения.

1 •

2 о

3 о

4 о

5 о

6 о

В соответствии с поставленными задачами охарактеризованы данные анамнеза пациентов. При исследовании преморбидного фона у детей было установлено, что наиболее часто развитию поллиноза предшествовали проявления атопического дерматита в раннем возрасте (53,0%), перенесенный обструктивный бронхит до 3-х лет (64,0%) и симптомы круглогодичного аллергического ринита (58,0%). К моменту манифестации клинических проявлений пыльцевой сенсибилизации 6% детей сохраняли кожные проявления, 49% обследованных страдали бронхиальной астмой с преимущественной сенсибилизацией к клещам домашней пыли. Изолированные сезонные проявления поллиноза встречались только у 36% детей. Сочетание пыльцевой и клещевой сенсибилизации {Э р1егопу$$тш, О/аппае) выявлено у 46% обследованных.

деревьев, луговых и сорных трав

Поливалентная пыльцевая сенсибилизация была установлена у 42 детей (56,4%). В исследуемой группе доминировала сенсибилизация к двум группам пыльцевых аллергенов (луговые и сорные травы), которая выявлена у 18 человек (24,3%) (рис.4). Моносенсибилизация к

луговым травам встречалась у 13 человек (17,5%), к сорным травам - у 11 человек (14,5%). Чувствительность к трем группам пыльцевых аллергенов (деревья, луговые и сорные травы) отмечена у 12 пациентов (15,6%).

Реже регистрировалась сенсибилизация к пыльце деревьев (10 человек - 12,0% случаев) и к сочетанию пыльцы деревьев и сорных трав (4 человека - 5,8% случаев). Пыльцевая аллергия, обусловленная комбинацией аллергенов деревьев и луговых трав, выявлена у 8 человек (10,7% случаев).

В рамках доклинического исследования аллергенов у пациентов изучены показатели Т-клеточного иммунитета. У детей с поллинозом независимо от стадии заболевания отмечается тенденция к снижению относительных и абсолютных показателей СОЗ+, С04+ и С08+ субпопуляций Т-лимфоцитов (табл.4). Несмотря на изменения в уровне клеток, исследуемые показатели оставались в пределах возрастной нормы.

Таблица 4

Содержание субпопуляций СОЗ+, С04+, СЭ8+ лимфоцитов у детей с поллинозом

Количество клеток (абс.) В период цветения (п=20) После цветения (п=20) Контрольная группа (п=20)

СЭЗ+ 1416±144 1116±175* 1777±275*

С04+ 789±103 624±102 935±211

СЭ8+ 528±62 381±67* 653±99*

*р<0,05

В исследуемой группе у 100% детей с поллинозом зарегистрирован высокий уровень общего 1§Е в сыворотке крови: в период обострения поллиноза - 306,6±27 МЕ/мл, в период ремиссии

показатели достоверно ниже - 211,2±8,1 МЕ/мл. Значения IgM и IgG у всех детей не отличались от показателей группы сравнения.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что препараты, полученные из соцветий и пыльцы золотарника канадского, отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим видам аллергенов. Они стабильны, безопасны, обладают специфической и антигенной активностью. Используя аллерген из пьшьцы золотарника канадского, в тестах in vitro был продемонстрирован его вклад в общую структуру пыльцевой сенсибилизации у детей с «поздним летним» поллинозом. Из 60 обследованных детей IgE-AT к пыльце золотарника обнаружены в 35 % случаев, к соцветиям золотарника - в 23,3%. Сочетанная сенсибилизация к пыльце и соцветиям выявлена у 21,7% детей группы исследования. Это свидетельствует об этиологической значимости полученного аллергена из пыльцы золотарника и необходимости создания лечебно-диагностического препарата для проведения скарификационных проб и специфической иммунотерапии.

В нашем исследовании у детей с поллинозом показатели Т-лимфоцитов с маркерами CD3+ и CD8+ имели тенденцию к снижению, это говорит о некоторых сдвигах в иммунном статусе обследованных (р<0,05). Данные изменения были более выраженными по окончании сезона цветения, когда из-за длительного воздействия пыльцевых аллергенов происходило нарастание дисбаланса показателей активности Т-клеточного звена иммунитета. Уровень общего IgE был высоким у пациентов в сезон пыления растений и не снижался по окончании цветения.

Таким образом, выявленные изменения иммунного статуса в рамках доклинического испытания новых аллергенов позволили оценить особенности иммунитета у детей страдающих поллинозом

Выводы

1. Впервые получены диагностические аллергены из соцветий и пыльцы золотарника канадского.

2. Установлено, что препараты новых аллергенов обладают стабильными физико-химическими свойствами, гетерогенны по белковому составу, безвредны и нетоксичны.

3. Аллергенный препарат из пыльцы золотарника обладает высокой специфической активностью в тестах in vitro, что было показано в реакциях НДТК, ИФА и иммунодоте.

4. Изучена структура поллинозов у детей в Тульской области. Показано, что сенсибилизация к аллергену из пыльцы золотарника канадского встречается в 35,0 % случаев.

5. Изучены клинико-иммунологические особенности поллиноза у детей. Выявлено снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов (CD3+, CD8+) и отмечен высокий уровень IgE в различные периоды заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бержец В М., Пронькина О.В, Злобина Ж М., Хлгатян C.B. Влияние факторов промышленного загрязнения на уровень сенсибилизации детей в Тульской области // IV Всемирный Конгресс по астме, IX Международный конгресс по клинической патологии. - 2004.- Т.6 - № 1.- С. 63.

2. Бержец В.М , Хлгатян C.B., Злобина Ж.М., Петрова Н.С., Пронькина О В Клинико-этиологические особенности аллергических заболеваний у подростков Тульской области. // Аллергология и иммунология,- 2005 - Т 6 - № 2,- С. 196.

3 Бержец В.М., Пронькина О.В , Хлгатян C.B., Злобина Ж.М., Бержец А И. Получение аллергена из растения солидаго и изучение его свойств // Аллергология и иммунология,- 2005.- Т.6.- № 10,- С. 352.

4 Бержец В.М., Пронькина О В , Злобина Ж М., Хлгатян C.B., Кропотова И С. Оценка влияния загрязнения атмосферного воздуха на больных бронхиальной астмой. // Научные труды VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке».- 2005.-Москва.- С. 81.

5. Пронькина О.В , Бержец В.М , Злобина Ж M , Хлгатян С В Роль растения солидаго в сенсибилизации детей страдающих поллинозами // Аллергология и иммунология - 2005,- Т.6 -№ 4.- С.501-503

6. Злобина Ж M , Пронькина О.В., Хлгатян С.В , Бержец А.И., Бержец В.М Клещевая аллергия у детей Тульской области // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии,- 2006,- №7.- С. 85-89.

7. Бержец В M , Пронькина О В , Хлгатян С.В , Бержец А.И. Анализ уровня сенсибилизации у детей к пыльцевым аллергенам и значение растения солидаго в развитии поллиноза // Педиатрия - 2007.-Т.86.- №4.- С.67-69

8 Бержец В.М., Пронькина О В., Хлгатян С В., Радикова О В. Частота выявления сенсибилизации к пыльце растений у детей, проживающих в Тульской области // Иммунология, аллергология, инфектология.- 2006 - № 4 - С.41-44

9 Бержец В М., Пронькина О В , Хлгатян С.В , Бержец А.И. Аллерген из растения солидаго и его иммунологические свойства.// Материалы И-го национального конгресса республики Молдова (Кишенев 27-28 сентября 2007г ) - С 188-189.

10 Бержец В M , Петрова H С , Пронькина О В. Разработка и изучение свойств препаратов аллергенов из соцветий и пыльцы растения золотарник канадский. //Российский аллергологический журнал.- 2008 -№1.- приложение 1 - С. 46

11. Бержец В M , Пронькина О В , Петрова H С , Хлгатян C.B., Радикова О.В Диагностический пыльцевой аллерген из растения Solidago canadensis // Материалы IV международной конференции по иммунотерапии (Москва 15-17 сентября 2008 г.)- Аллергология и иммунология - Т 9 -№3.-С 275

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Широкая распространенность аллергических заболеваний превратила проблему аллергии в глобальную медико-социальную проблему. Одним из самых известных аллергических заболеваний является поллиноз, распространенность и тяжесть проявлений которого постоянно растет (3,4,25,63,83,124,132,139,143). В разных странах мира поллинозами страдают от 0,2 до 39% населения. Количество больных с аллергическими заболеваниями во всем мире каждые 10 лет удваивается (45,59). Разработчики проекта «Европейская сеть по астме и аллергии» прогнозируют, что к 2015 году европейским странам грозит эпидемия аллергических заболеваний (44,92).

Поллиноз встречается во всех возрастных группах, но обычно первые симптомы начинают беспокоить в детском или юношеском возрасте. По последним данным в Центральном районе Европейской части России поллиноз встречается с частотой 20,6 случаев на 1000 детей. В южных областях России сенсибилизация к пыльце встречается чаще, чем в целом по России, у 1,2 - 5,7 % детей (2,3,26,29,44,61,72,78).

По данным литературы растения семейства сложноцветных занимают одно из ведущих мест в развитии сенсибилизации у населения во всем мире (5,15,28,29,32,121,132,144). В последнее время в Средней полосе РФ отмечают высокую сенсибилизацию к сорняковому растению золотарнику, к завозному североамериканскому виду (Solidago canadensis). Однако данные о наличии аллергизирующих свойств у золотарника довольно противоречивы. Американские исследователи считают золотарник исключительно насекомоопыляемым растением и, следовательно, ответственным за развитие контактного дерматита (90). По их мнению, комковатость и клейкость пыльцы золотарника исключает вероятность развития пыльцевой сенсибилизации у населения. Напротив, по сведениям европейских исследователей, золотарник канадский включен в группу растений, вызывающих поллиноз. Довольно часто обнаруживают сенсибилизацию к его пыльце у лиц с аллергической предрасположенностью (89,144).

Крупнейший производитель аллергенов «Sevapharma» (Чехия), выпускают наборы для диагностики и лечения, включающие аллерген Solidago canadensis (представляет собой смесь, в сочетании с различными видами полыни). Эффективность данных препаратов при проведении специфической иммунотерапии показана нашими исследователями (22,36). Диагностические панели известного производителя «Allergopharma» (Германия) так же включают аллерген Solidago canadensis для иммуноферментного анализа.

Несмотря на широкое распространение данного растения в Центральных районах Российской Федерации, отечественного препарата аллергена Solidago canadensis в настоящее время не существует. В связи с этим весьма актуальным является разработка технологии получения диагностического препарата аллергена Solidago canadensis. Для исследования роли золотарника в структуре сенсибилизации и течения поллиноза нами выбрано детское население такого модельного региона как Тульская область.

Известно, что Тульская область является одним из индустриально развитых промышленных регионов с загрязненной поллютантами внешней средой. Экологические проблемы области обусловлены концентрацией на ее территории крупных предприятий химической и металлургической промышленности, нескольких мощных энергетических объектов, предприятий металлообработки и машиностроения. Выбросы вредных веществ в атмосферу промышленными предприятиями региона составляют 21% от суммарных выбросов Центральной части России. В связи с этим в Тульской области отмечен рост аллергических заболеваний у детского населения. Однако структура пыльцевой сенсибилизации и состояние гуморального и клеточного иммунитета у детей с поллинозом на территории Тульской области до настоящего времени не изучались.

Цель исследования

Получить диагностические аллергены из золотарника канадского и исследовать их иммунобиологические свойства.

Задачи исследования 1. Приготовить препараты аллергенов из соцветий и пыльцы растения золотарник канадский.

2. Изучить физико-химические и иммунобиологические свойства полученных аллергенов.

3. Исследовать структуру пыльцевой сенсибилизации у детей в Тульской области (в тестах in vitro) и определить диагностическую значимость аллергенов из золотарника канадского.

4. Определить клинико-иммунологические особенности поллинозов у детей в Тульской области в рамках доклинического исследования новых аллергенов.

Научная новизна

Впервые в нашей стране приготовлены отечественные аллергенные экстракты из пыльцы и соцветий золотарника канадского. Выявлено, что полученный нами препарат аллергена из пыльцы растения обладает высокой специфической активностью (аллергенными, иммуногенными и антигенными свойствами) и соответствует по своим физико-химическим и иммунобиологическим свойствам современным требованиям, предъявляемым к диагностическим аллергенам.

Впервые исследована структура пыльцевой сенсибилизации у детей в Тульской области. Показано, что сенсибилизация к пыльце деревьев встречается у 45% обследованных детей, к злаковым травам - у 68% и к сорным растениям - у 60%. Выявлен высокий процент сочетанной сенсибилизация к луговым и сорным травам. Показана диагностическая значимость аллергена из золотарника канадского в выявлении сенсибилизации у пациентов с поллинозом.

Впервые в Тульской области проведен комплекс клинико-иммунологических исследований, позволивший установить особенности течения, клинических проявлений и состояние гуморального и клеточного иммунитета у детей с поллинозом в рамках доклинического испытания новых аллергенов.

Практическая значимость

Результаты исследования легли в основу инструкции по изготовлению и контролю нового аллергена из пыльцы золотарника канадского. Подана заявка на изобретение нового аллергена.

Проведенные исследования позволят расширить панель для диагностики пыльцевой сенсибилизации в тестах in vitro с включением аллергена пыльцы золотарника канадского.

Основные положения, выносимые на защиту

- Впервые в нашей стране получены аллергены из соцветий и пыльцы золотарника канадского. Специфическая активность полученных препаратов установлена в реакциях in vitro.

- Показана диагностическая значимость аллергена из пыльцы золотарника канадского и определена роль семейства сложноцветных в структуре поллинозов у детей в Тульской области.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. Впервые получены диагностические аллергены из соцветий и пыльцы золотарника канадского.

2. Установлено, что препараты новых аллергенов обладают стабильными физико-химическими свойствами, гетерогенны по белковому составу, безвредны и нетоксичны.

3. Аллергенный препарат из пыльцы золотарника обладает высокой специфической активностью в тестах in vitro, что было показано в реакциях НДТК, ИФА и иммунодоте.

4. Изучена структура поллинозов у детей в Тульской области. Показано, что сенсибилизация к аллергену из пыльцы золотарника канадского встречается в 35,0 % случаев.

5. Изучены клинико-иммунологические особенности поллиноза у детей. Выявлено снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов (CD3+, CD8+) и отмечен высокий уровень IgE в различные периоды заболевания.