Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Совершенствование методов контроля качества многокомпонентных фитопрепаратов "Простанорм" и "Фито Ново-Сед"

На правах рукописи

ЗАХАРОВА НАТАЛЬЯ ГЕОРГИЕВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ФИТОПРЕПАРАТОВ «ПРОСТАНОРМ» И «ФИТО НОВО-СЕД».

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 5 ОКТ 2012

МОСКВА-2012

005053999

005053999

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Белобородое Владимир Леонидович

Официальные оппоненты:

доктор хим. наук, профессор,

заведующий кафедрой аналитической,

физической и коллоидной химии

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздрава России Харитонов Юрий Яковлевич

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО Московский государственный

медико-стоматологический университет имени А.И.Евдокимова

Минздрава России Берлянд Александр Семёнович

Ведущая организация:

ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ"

Защита диссертации состоится «21» ноября 2012 г. в 14°" часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д.13

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан « ?! » 40 2012 г.

Ученый секретарь . . /у

диссертационного совета Д.208.040.09 /'/

доктор фармацевтических наук, профессор / Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы отмечается повышенный интерес к применению комплексных лекарственных средств растительного происхождения. Такие лекарственные средства, включающие в свой состав несколько видов лекарственного растительного сырья, содержат комплекс биологически активных веществ с разносторонним фармакологическим действием, что расширяет диапазон лечебных свойств, обеспечивая длительный корригирующий и заместительный эффект при различных заболеваниях.

Представителями группы мультиисточниковых фитопрепаратов являются оригинальные отечественные средства «Простанорм®» и «Фито Ново-Сед®» (ЗАО «ФПК ФармВИЛАР», Москва). Препарат Простанорм представляет собой водно-спиртовой экстракт смеси четырех видов лекарственного растительного сырья - травы зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L., травы золотарника канадского Solidago Canadensis L., корня солодки Glycyrrhiza glabra L., корневищ с корнями эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea (L.) Moench в равных соотношениях. В состав препарата включены растительные источники, обладающие простатотропной активностью, улучшающие микроциркуляторные процессы в предстательной железе, нормализующие мочеотделение, оказывающие противовоспалительное, капилляропротекторное, анальгетическое и антимикробное действие.

Препарат Фито Ново-Сед® содержит водно-спиртовой экстракт из травы пустырника -Leonurus cardiaca L.; травы мелиссы лекарственной - Melissa officinalis L.; плодов боярышника - Fructus Craiaegi, плодов шиповника - Frnctus Rosae, травы эхинацеи пурпурной - Herba Echinacea purpureae (L.) Moench в массовых соотношениях 2:2:1:2:1. Фито Ново-Сед оказывает кардиотоническое действие, повышает устойчивость сердечно-сосудистой системы к повышенной нагрузке, стабилизирует уровень артериального давления.

Многокомпонентность состава комплексных препаратов, наличие сложного матрикса биологически активных веществ различной химической природы обусловливает необходимость разработки оптимальных путей их фармацевтического анализа. Существующие методы стандартизации препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед включают качественные реакции на фенольные соединения и спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов. До начала работы не был установлен качественный и количественный состав препаратов, достоверные критерии идентификации индивидуальных соединений, а также методы контроля комбинации действующих веществ в составе препаратов и методы контроля лекарственных источников, составляющих препарат. Наиболее перспективными методами для решения этих задач

являются хромагографические, сочетающие эффективность разделения компонентов сложных смесей с избирательностью и чувствительностью детектирования.

Цель исследования. Целью исследования являлась разработка оптимизированных способов хроматографического анализа биологически активных веществ препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед, идентификация основных компонентов и совершенствование системы стандартизации препаратов.

Задачи исследования. Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. изучить физико-химические характеристики (положение и интенсивность полос в УФ-спектрах, хроматографическая подвижность в различных системах) экстрактов препаратов, экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в состав препаратов, и индивидуальных соединений — биологически активных веществ;

2. выявить оптимальные пути пробоподготовки лекарственного сырья и лекарственных форм комплексных препаратов для анализа;

3. разработать оптимальные способы разделения многокомпонентных смесей веществ, входящих в состав лекарственного растительного сырья и препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед;

4. идентифицировать основные компоненты препаратов и лекарственного сырья, входящего в их состав;

5. выявить маркерные (индикаторные) соединения, характерные для каждого вида сырья, входящего в состав препаратов и предложить методики их определения, как характеристику подлинности препаратов;

6. разработать селеюивные хромагографические методики количественного анализа основных компонентов с учетом специфичности состава комплексных фитопрепаратов;

7. валидировать разработанные методики на основе изучения соответствующих валидационных характеристик с целью их последующего применения для стандартизации лекарственных форм препаратов;

8. апробировать разработанные методики в анализе серий образцов препаратов различных производителей.

Научная новизна. Научная новизна представленной работы заключается в следующем:

• Впервые предложены оптимизированные и валидированные методики анализа индивидуальных компонентов оригинальных комплексных отечественных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед на основе вариантов метода ВЭЖХ.

• Впервые идентифицирован комплекс биологически активных веществ экстрактов смеси лекарственного сырья,' составляющих основу фитопрепаратов, и, тем самым, определен качественный состав компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед.

• Установлены индикаторные (маркерные) компоненты, характеризующие наличие каждого вида сырья в составе фитопрепаратов. Разработаны методики определения подлинности препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методом ТСХ, базирующиеся на анализе маркерных компонентов.

• На основе оригинальных способов пробоподготовки с использованием твердофазной экстракции и последовательного двухкратного градиентного анализа методом ВЭЖХ, впервые осуществлена количественная оценка содержания основных индивидуальных компонентов в составе препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед различных серий и производителей.

• Разработанные методики качественного и количественного определения содержания компонентов препаратов составляют основу системы их стандартизации.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику Предложены и внедрены методы определения подлинности препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед с использованием метода ТСХ на основе анализа маркерных компонентов, характеризующих каждый вид лекарственного сырья в составе комплексных фитопрепаратов. Разработаны оригинальные методики качественного и количественного определения компонентов препаратов на основе обращенно-фазового градиентного варианта метода ВЭЖХ. Осуществлена количественная оценка содержания биологически активных компонентов в различных сериях исследуемых препаратов. Методики качественного анализа препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед внедрены в работу отдела контроля качества ЗАО «ФПК ФармВИЛАР», а также контрольных лабораторий Министерства Здравоохранения республики Беларусь, (имеются акты внедрения)

Разработан и внедрен в учебный курс «Физико-химические методы исследования органических соединений» на кафедре органической химии ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова методологический подход к анализу комплексных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методами ВЭЖХ и ТСХ. (имеется акт внедрения).

Основные положения, выносимые на защиту. ^ Результаты изучения спектральных и хроматографических характеристик экстрактов препаратов, экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в состав препаратов, и компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед.

Способы пробоподготовки и проведения анализа многокомпонентных смесей, составляющих экстракты исследуемых препаратов и отдельных видов сырья, г- Разработанные оптимизированные и валидированные методики качественного и

количественного анализа компонентов препаратов методом ВЭЖХ.

> Результаты установления состава препаратов и экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в их состав.

> Предложенные методики определения подлинности фитопрепаратов.

> Количественная оценка индивидуальных биологически активных веществ в производственных сериях фитопрепаратов.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV Всероссийской с международным участием научно-методической Конференции «Фармобразование 2010» (Воронеж, 2010 г.); на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г.); на итоговой научной конференции студентов и молодых исследователей с международным участием «Тагьянин день» (Москва, 2010 г.); на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011 г.); на XIII Школе молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2011 г.) и на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично разработаны методики качественного и количественного анализа фитопрепаратов, проведена аналитическая и статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от научного обоснования и постановки целей и задач, их экспериментальной реализации до аналитической и статистической обработки, обобщения и обсуждения полученных результатов и рекомендаций по их внедрению в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры органической хи-

мии «Разработка способов анализа и стандартизации флавоноидсодержащих лекарственных средств, изучение их антиоксидантной активности и фармакокинетики».

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе четыре в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, отражающих собственные экспериментальные исследования и обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицами, 42 рисунками. Библиографический список включает 205 источника литературы, из них 157 отечественных и 48 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования Объекты. Объектами исследования являлись: лекарственное средство ПросгаНорм®, лек. форма - простанорм экстракт жидкий (50% этанол) 50 или 100 мл для приема внутрь (ЗАО «ФПК ФармВИЛАР» серия 130510; ОАО «Фармсгандарт-Томскхимфарм» серия 271108; ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ серия 130507, 120408, 311208 и 301208) и таблетки покрытые оболочкой по 0,2 г простанорма экстракта сухого (НПО «Вирион» г. Томск серия 601208; ЗАО «ФПК ФармВИЛАР» г. Москва серия 071211). Лекарственное средство Фито Ново-Сед®, лек. форма - экстракт жидкий (40% этанол) 50 или 100 мл для приема внутрь (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ серия 040410 и 050410 и 060410; ЗАО «ФПК Фармцентр ВИЛАР» г. Москва серия 010311; ООО «Ватхэм-Фармация» серия 040408, 060808, 071208, 030809 и 071211). Лекарственное растительное сырье получено от ЗАО ФПК ФармВИЛАР: трава зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L., трава золотарника канадского Solidago Canadensis L., корни солодки Glycyrrhiza glabra L., корневища с корнями эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea (L.) Moench, трава пустырника - Leonurus cardiaca L., трава мелиссы лекарственной - Melissa officinalis L., плоды боярышника - Fructus Crataegi, плоды шиповника - Fructus Rosae, трава эхинацеи пурпурной - Herba Echinacea purpureae (L.) Moench.

Стандартные образцы: хлорогеновая кислота, кафтаровая кислота, аммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам), рутин, кофейная кислота, цикориевая кислота, розмариновая кислота, лютеолин, салициловая кислота, транс-феруловая кислота, 3,4-ди-гидроксибензойная кислота, галловая кислота, коричная кислота, 2-гидроксикоричная кислота (все Sigma); гиперозид, апигенин, цитраль, цитронеллаль, гераниол (все Merck, Germany); кверцетин, нарингенин (оба Acres Organics), кемпферол (Fluka), аскорбиновая кислота (Марбиофарм), ликуразид (ГНЦЛС, Харьков), ликвиритин (ВИЛАР, Москва), нарингенин-5-глюкозид (ВИЛАР).

Реактивы и растворители: дигидрофосфат калия (ч.д.а., Авогадро), ортофосфорная кислота «осч» (Реахим), метанол (Merck, Germany), ацетонитрил (HPLC, Lab-Scan), тетра-гидрофуран (HPLC, Merck), диметилформамид «хч» (ЗАО ЭКОС-1), спирт этиловый 96,6% (Merck, Germany), метилэтилкетон (Reanal, Budapest,Hungary), изопропиловый спирт осч, (Реахим), этилацетат хч, (Экос-1), муравьиная кислота (Sigma), аммиак водный осч, (Хром Ресурс), дистиллированная и деионизованная вода

Методы исследования. В процессе исследований использованы методы УФ-спек-троскопии, ВЭЖХ, ТСХ, твердофазной экстракции. УФ-спектры получены на спектрофотометре Сагу 100 (Varían, USA). Анализ методом ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе ProStar 230 со спектрофотометрическим детектором ProStar 325 (Varían, USA). Анализ методом ТСХ проводили в камере 15x15 см. Использовали пластинки с алюминиевой и стеклянной подложкой DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 («Merck», Германия) и алюминиевой и пластиковой подложкой Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ и ПТСХ-П-А-УФ (Краснодар, Россия). Детектирование веществ осуществляли в видимом и УФ-свете до и после обработки 10% раствором аммония молибдата.

Дня разделения многокомпонентных смесей на стадии пробоподготовки применялась твердофазная экстракция в ее современном техническом исполнении (вакуумная камера, патроны - Discovery DPA 6S (250 mg) и Discovery DSC-18 LT SPE (500 mg), Supelco).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.1, стр. 199-251 с использованием t-критерия Стьюдента).

Методология исследования Простанорм и Фито Ново-Сед содержат в своем составе комплекс экстрактивных биологически активных веществ смеси лекарственного растительного сырья.

Для определения качественного и количественного состава многокомпонентных фитопрепаратов и создания методов оценки их качества разработан общий методологический подход, включающий разноплановые, но сопряженные между собой этапы:

• выявление на основе анализа данных литературы о составах экстрактов лек. сырья, наиболее вероятных потенциальных компонентов жидких экстрактов фитопрепаратов и использование их как «свидетелей» в экспериментальных исследованиях;

•изучение спектральных и хроматографических характеристик экстрактов препаратов, экстрактов каждого вида сырья и индивидуальных компонентов с целью выявления оптимального способа анализа и детектирования;

•разработка способов разделения компонентов сложных смесей, составляющих данные препараты, методом ВЭЖХ;

•оптимизация хроматографических методик качественного анализа на основе хроматографических параметров;

•идентификация основных компонентов препаратов и исходного сырья; •выявление индикаторных (маркерных) компонентов, характеризующих каждый вид сырья в составе препаратов;

•разработка способов оценки подлинности препаратов методом ТСХ, основанных на детектировании индикаторных (маркерных) компонентов, характеризующих тот или иной вид сырья в составе препаратов;

•оптимизация способа пробоподготовки и хромагографических методик для целей количественного анализа маркерных компонентов и освобождения мешающих сопутствующих компонентов смеси, валидация разработанных методик;

•количественный анализ маркерных компонентов препаратов различных серий и производителей как основа последующей разработки системы стандартизации препаратов.

Для идентификации компонентов экстрактов в работе применяли подход, основанный на двух критериях — относительных временах удерживания и спектральном отношении. Эти два параметра наименее подверженные изменениям хроматографической системы. В анализируемые образцы вводили внутренний стандарт (для образцов препарата Просганорм — ванилин, препарата Фито Ново-Сед — салициловую кислоту). Установлено, что относительные времена удерживания (¡¡ь/1кстандарт) менее чувствительны к небольшим изменениям хроматографической системы и, таким образом, больше соответствуют целям идентификации, чем абсолютное время удерживания пиков. Современные способы детектирования позволяют получить хроматограмму при нескольких длинах волн одновременно и рассчитать дополнительный параметр для идентификации — спектральное отношение . В нашем случае спектральное отношение определяли для каждого из свидетелей и компонентов препаратов в одних и тех же хромагографических условиях как отношение оптических плотностей Ац/Ац.. Применение перечисленных критериев позволило избежать возможных случайных совпадений времен удерживания и надежно идентифицировать компоненты сложных смесей.

Спеюрофотометрический анализ препаратов и компонентов. С целью разработки способа детектирования получены УФ-спектры жидких лек. форм препаратов, водно-спиртовых экстрактов каждого вида лекарственного сырья (50% этанольный экстракт травы зверобоя, травы золотарника, корней солодки, корневищ с корнями эхинацеи пурпурной как видов сырья препарата Простанорм и 40% этанольный экстракт травы пустырника, травы мелиссы лекарственной, плодов боярышника, плодов шиповника, травы эхинацеи пурпурной как видов сырья препарата Фито Ново-Сед) и ряда соединений, которые рассматривали как потенциальные компоненты фитопрепаратов (гидроксикоричные кислоты и их сложные эфиры, флавоноиды и их гликозиды, тритерпеновые гликозиды).

Большинство образцов, характеризующих препарат Простанорм, имеют полосы поглощения или «плечо» в области 240-270 нм и 310-330 нм. На основании этого анализ

образцов данного препарата осуществляли при двух аналитических длинах волн 255 и 320 нм, используя соответствующее спектральное отношение. Детектирование компонентов препарата Фиш Ново-Сед осуществляли аналогично при аналитических длинах волн 285 и 325 нм.

Универсальный способ анализа и идентификации компонентов экстрактов растительного сырья методом ВЭЖХ. Учитывая, что Простанорм представляет собой экстракт смеси четырех видов растительного сырья, а Фиш Ново-Сед — пяти, первоначальный анализ каждого сырья в индивидуальном виде представлял собой менее сложную задачу, чем анализ комплексных препаратов. С этой целью разработан универсальный способ хромагографирования (колонка Luna С18, 5 мкм, в составе подвижной фазы (ПФ) использованы — CH3CN (А), — 0,1% Н3Р04 (В), скорость потока - 1,0 мл/мин, градиент потока: 0-3 мин 5%А и 95%В; 3-14 мин 20%А и 80%В; 14-19 мин 30%А и 70%В; 19-26 мин 50%А и 50%В; 26-35 мин 95%А и 5%В).

Экстракты растительного сырья получены в условиях, моделирующих технологический процесс (эксграгенты — 50% этанол для сырья, входящего в состав препарата Простанорм и 40% этанол для препарата Фиш Ново-Сед). Для идентификации компонентов использовали стандартные образцы. На хромагограммах экстрактов травы зверобоя обнаружено 53 пика, среди них 7 интенсивных, идентифицированы: рутин, ликвиритин, гиперицин, гиперфорин, кверцегин, гиперозид, хлорогеновая кислота. На хромагограммах экстрактов корня солодки проявляется 69 пиков, из них 12 интенсивных, идентифицированы: глицирризиновая кислота, ликвириган, ликуразид, формононетин, кверцетин. Экстракт корней и корневищ эхинацеи характеризуется 54 пиками, детектируемыми на длине волны 255 нм, и 28 пиками на длине волны 320 нм (рис. 2.15), из них 9 интенсивных, идентифицированы: кафтаровая, хлорогеновая, цикориевая, коричная, кофейная, 3,4-дигидроксибензойная (прогокатеховая), транс-о-гидроксикоричная, m/кшс-феруловая, аскорбиновая кислоты, рутин, кверцетин. На хромагограммах экстрактов травы золотарника обнаружено 39 пиков, из них 8 интенсивных, идентифицированы: ругин, кемпферол, кверцетин, изорамнетин, нарингенин, нарингенин-5-глкжозид. Кислотный гидролиз экстракта травы золотарника (кипячение с 1М НС1 ) показал рост пиков агликонов (кемпферол, изорамнетин, появляется пик кверцегтина) с одновременным исчезновением пиков гликозидов. Доминирующим компонентом экстракта является гликозид кемпферола (природа углеводной части не устанавливалась).

Экстракт правы эхинацеи содержит фенолокислоты — галловую, протокатеховую, гидроксикоричные кислоты и их производные — кафгаровую, хлорогеновую, цикориевую, кофейную, флавоноиды — люгеолин, гиперозид, кверцетин и его гликозид рутин. Анализ хромагограмм экстракта травы мелиссы лекарственной, детектированных на длинах волн 255 и 320 нм, свидетельствует, что основными компонентами являются фенолокислоты (галловая, прогокатеховая, ванилиновая, сиреневая), гидроксикоричные кислоты и их эфиры

(коричная, и-кумаровая, кофейная, феруловая, хлорогеновая, розмариновая), а также флавоноиды кверцетин и лютеолин (на хроматограмме, зарегистрированной на длине волны 255 нм отмечается до 80 пиков). На хромато граммах экстракта травы пустырника отмечены аскорбиновая, протокатеховая, хлорогеновая, кофейная кислоты, гиперозид, кверцетин, рутин. На хроматограммах экстракта плодов боярышника, зарегистрированных на длинах волн 255 и 320 нм, обнаружены аскорбиновая, кофейная, протокатеховая, коричная, хлорогеновая кислоты, флавоноиды - гиперозид, кверцетин, рутин. В небольших количествах отмечены катехин и эпикатехин. Анализ хроматограмм экстракта плодов шиповника свидетельствует, что данный экстракт по химическому составу подобен экстракту плодов боярышника, но беднее по количеству компонентов. Идентифицированы аскорбиновая, протокатеховая, кофейная, коричная, хлорогеновая кислоты, лютеолин, гиперозид, кемпферол, рутин.

Разработка оптимизированной по хроматографическим параметрам методики определения компонентов препарата Простанорм методом ВЭЖХ. При выборе неподвижной фазы проанализировали качество разделения с использованием трех типов сорбентов - октилсилановых, октадецилсилановых и цианопропилсилановых как в изократических, так и градиентных режимах элюирования. Более эффективное разделение достигается на октадецилсилановом сорбенте. Выбор ПФ осуществляли в условиях обращенно-фазового варианта по нескольким направлениям — выбор органического компонента, кислотного модификатора, условий градиентного элюирования. Поиск лучшего варианта хроматографических условий свидетельствует, что для анализа всей совокупности компонентов необходим сложный состав ПФ и сложный нелинейный градиентный режим элюирования. С помощью фосфатного буфера (0,1% Н3РО4 и 0,02 M КН2РО4, рН 3) поддерживается кислотность среды, которая подавляет диссоциацию фенольных и карбоксильных групп соединений смеси. Основным элюирующим компонентом ПФ является ацетонитрил, для увеличения селективности хроматографической системы использовали метанол и диметилформамид (ДМФА). Наилучшее разделение компонентов смеси достигается в градиентном режиме с ПФ: метанол (А), ацетонитрил (В) и фосфатный буфер + ДМФА 0,15 об.% (С) (А:В:С): 0 мин -5:5:90 об.%, 0,1-3 мин 10:10:80 об.%, 3,1-10 мин - 15:15:70 об.%, 10,1-21 мин -15:25:60об.%, 21,1-31 мин 15:45:40об.%, 31,1^0мин 0:95:5 об.%, 40,1^5 мин 0:95:5 об.%. Хроматограммы экстракта препарата Простанорм представлены на рис. 1 и 2.

Идентификация соединений, входящих в состав препарата Простанорм. На хроматограммах образцов экстрактов препарата Простанорм, зарегистрированных одновременно при аналитических длинах волн 255 и 320 нм, наблюдается 92 пика интенсивность которых превышает 0,3% по абсолютной калибровке.

Рис. 1. Хроматограмма образца препарата Простанорм экстракт жидкий. Аналитическая

длина волны 320 нм. Номера пиков соответствуют номерам соединений в табл.1.

Идентификацию основных компонентов фитопрепарата проводили с участием "свидетелей" по двум критериям — относительным временам удерживания (внутренний стандарт — ванилин) и на основании спектрального отношения. Результаты качественного анализа и хроматографические параметры, характеризующие методику, представлены в табл.1.

Таблица 1. Идентифицированные компоненты препарата Простанорм*

№ пи ка Относительное время удерживания ^»/(„СТ. Коэффициент емкости к Эффективность колонки N Спектральное отношение А255/А32в Идентификация пика Растительный источник

1 0,153 0,23 - 13,43 гтротокатеховая эхинацея

2 0,193 0,27 10100 1,54 аскорбиновая кислота эхинацея

3 0,579 2,79 12300 0,384 кафтаровая кислота эхинацея

4 0,623 3,08 15900 0,373 хлорогеновая кислота эхинацея, зверобой

5 0,797 4,79 11100 0,351 кофейная кислота эхинацея

6 0,837 4,95 11400 0,778 гиперицин зверобой

7 0,915 5,23 12100 0,37 ликвиритин зверобой, солодка

8 1,023 5,51 19600 0,532 транс- феруловая кислота эхинацея

9 1,043 5,72 30800 0,9 нарингенин-5-глюкозид золотарник

10 1,044 5,98 30800 0,37 рутин зверобой, золотарник

11 1,093 6,15 52200 0,373 цикориевая кислота эхинацея

12 1,128 6,38 57500 0,372 гиперозид зверобой

13 1,287 7,43 81800 - гликозид кемпферола золотарник

14 1,417 8,28 45700 0,742 ликуразид солодка

15 1,44 8,55 81900 0,805 2-гидроксикоричная кислота эхинацея

16 1,545 9,23 6700 2,019 гиперфорин зверобой

17 1,634 9,69 105700 2,445 кверцетин зверобой, золотарник

18 1,659 9,85 80100 44,02 коричная кислота эхинацея

19 1,829 10,61 54500 0,687 нарингенин золотарник

20 1,902 11,68 29800 3,52 кемпферол золотарник

21 1,937 11,83 181000 2,308 изорамнетин золотарник

22 2,057 11,97 69100 6,095 формононетин солодка

23 2,153 12,24 267000 нет при 320 нм глицирризиновая кислота солодка

•-среднее из 5 независимых определений

Значения коэффициентов емкости к! находятся в оптимальном диапазоне. Пики всех соединений симметричны. Эффективность колонки (ЛО для большинства пиков высока. Значение параметров селективности (а) и разрешающей способности рассчитанные для пар мажорных соединений (например, кафтаровая-хлорогеновая кислоты а=1,11 свидетельствуют об удовлетворительном качестве разделения и о высокой селективности хроматографического процесса.

В табл. 1 представлены также растительные источники, в экстрактах которых наблюдались идентифицированные соединения и которые, тем самым, характеризуют данный вид сырья в составе препарата. На основании изложенного методика может быть использована для определения подлинности препарата «Простанорм».

Методика оценки подлинности препарата Простанорм методом ТСХ на основе определения индикаторных компонентов. Идентифицированные компоненты суммарного экстракта, составляющего препарат, служили основой для выбора индикаторных (маркерных) соединений, характеризующих каждый вид сырья в составе препарата.

При разработке методики использовали пластинки с силикагелем со стеклянной и алюминиевой подложкой и УФ-индикатором размером 15x15 см. В качестве ПФ опробованы различные органические компоненты (полярные — метанол, 96% этанол, пропанол-2, бутанол-1; метилэтилкетон, этилацетат; малополярные — хлороформ, толуол); органические кислоты (муравьиная, уксусная, трихлоруксусная), а также водный аммиак и вода. Оптимальные условия разделения с широким интервалом значений Иг достигнуты в ПФ: муравьиная кислота— вода — этанол — этилацетат (7:8:15:70 об. частей). Лучшим проявляющим реагентом оказался аммония молибдат. Детектирование зон осуществляли в два этапа: первый этап — пластинку просматривали в УФ-свете при длине волны 254 нм. На хроматограмме раствора препарата и «свидетелей» отмечаются зоны розово-фиолетового цвета Одна из них, соответствующая глицирризиновой кислоте, обесцвечивается при дальнейшем опрыскивании раствором аммония молибдата. Второй этап: •— пластинку опрыскивают раствором аммония молибдата. На хроматограмме испытуемого раствора и растворов «свидетелей» в средней и верхней третях обнаруживаются три зоны желто-оранжевого цвета (рутин, хлорогеновая кислота, гиперозид) и зона коричневого цвета (кофейная кислота). На хроматограмме испытуемого раствора и экстракта травы золотарника проявляются также две зоны — в нижней трети синего цвета (гликозид кемпферола), в верхней желто-оранжевого. Эти два компонента можно идентифицировать по цвету зон и по соответствующим значениям Яг. и, тем самым, охарактеризовать наличие экстракта травы золотарника в составе препарата Простанорм.

В табл. 2 представлены значения Кг определяемых компонентов в оптимальной системе растворителей. Данные хроматографические условия обеспечивают высокую воспроизводимость определения индикаторных компонентов. Методика качественного анализа индикаторных компонентов методом ТСХ рекомендована как способ определения подлинности препарата Простанорм.

Название стандарта: Среднее значение и дов. интервал (п=б, Р=0,95) Эффективность разделения (N1 теор. тарелок) Разделяющая способность

Гликозид кемпферола (золотарник) 0,22+0,03 52

2,4

Глицирризиновая кислота (солодка) 0,44±0,03 1220

1,1

Рутин (зверобой) 0,51 ±0,02 1880

1,2

Хлорогеновая кислота (эхинацея) 0,57±0,01 1890

1,6

Гиперозид (зверобой) 0,71 ±0,01 2530

1,6

Компонент травы золотарника 0,84±0,01 5580

1,4

Кофейная кислота (эхинацея) 0,97±0,01 7400

Разработка методики количественного определения маркерных компонентов препарата Простанорм методами твердофазной экстракции и ВЭЖХ. Для целей стандартизации таких многокомпонентных препаратов как «Простанорм» необходимым и достаточным является количественный анализ маркерных соединений. В качестве маркеров использовали наиболее доступные с точки зрения стоимости вещества, такие как хлорогеновая кислота, глицирризиновая кислота (глицирам), рутин, кверцетин. Анализ таких маркерных соединений, как кафтаровая, цикориевая, 2-гидроксикоричная и кофейная кислоты можно осуществлять в пересчете через хлорогеновую кислоту, учитывая близкие хромофорные системы в их структуре и включая в расчет разность в молярных коэффициентах экстинкции при аналитических длинах волн. Аналогичным образом анализ гиперозида и кемпферола можно осуществлять в пересчете через кверцетин. Представленная выше методика анализа экстракта препарата Простанорм методом ВЭЖХ направлена на анализ всей совокупности компонентов (порядка ста соединений). При анализе такой совокупности соединений селективность разделения и разрешающая способность многих пар соединений недостаточна для целей количественного определения. Для решения этой задачи применили комбинированный подход, включающий способ пробоподготовки методом твердофазной экстракции (ТФЭ) и анализ методом ВЭЖХ.

Процесс пробоподготовки направлен на выделение анализируемых маркерных соединений и освобождение экстракта от мешающих определению сопутствующих компонентов смеси. Удовлетворительные результаты получены при использовании октадецил-

силановых сорбентов Discovery DSC-18 LT SPE. На примере модельной смеси стандартных соединений (кафтаровая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, 2-гидроксикоричная, глицирризиновая кислоты, гиперозид, кверцетин, кемпферол, рутин) отработаны условия проведения ТФЭ и оценена ее эффективность. Проба объемом 0,2 мл полностью сорбировалась на патроне емкостью 500 мг. Для фракционирования достаточно использовать два элюента — 0,2% раствор ортофосфорной кислоты pH 2.8 и 96% этанол. Более полярные маркерные соединения (кафтаровая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая и 2-гидроксикоричная кислоты, рутин и гиперозид) элюируются с патрона 0,2% раствором Н3Р04 (фракция 1), менее полярные маркеры (кверцетин, кемпферол и глицирризиновая кислота) затем элюируются этанолом (фракция 2). Степень эффективности ТФЭ составила для стандартных соединений: хлорогеновая кислота — 69,7% рутин — 36,9%, кверцетин — 83,7%, глицирризиновая кислота — 80,2%.

Для оптимизации анализа маркеров методом ВЭЖХ разработан способ, основанный на проведении двух разгонок с применением одной и той-же ПФ, но различающихся условиями изменения градиента потока Для анализа первой фракции с патрона ТФЭ изменение градиента ПФ характеризуется в начальный момент времени медленным нарастанием наиболее сильного элюента — ацетонигрила, (что создает оптимальные условия анализа полярных соединений), а затем резким повышением доли ацетонигрила, для удаления с колонки сопутствующих примесей (градиент 1). Для анализа второй фракции, содержащей менее полярные компоненты, применяли условия, характеризующиеся резким нарастанием доли ацетонигрила в начальный момент времени, а затем, при проведении анализа, пологим изменением (градиент 2).

На рис. 3 и 4 представлены хроматограммы препарата «Простанорм» экстракт жидкий после фракционирования методом ТФЭ. Фракционирование позволяет значительно «разрядить» хроматограмму по количеству пиков и оптимизировать условия количественного анализа

Способ анализа маркерных компонентов, с использованием сочетания методов ТФЭ и ВЭЖХ, валидирован по хроматографическим параметрам и специфичности и воспроизводимости) результатов. Параметры, характеризующие пригодность хроматографической системы, оценены как для модельной смеси, так и для нативного экстракта препарата Значения коэффициента емкости к' находятся в оптимальном диапазоне от 3,6 до 9,6, эффективность N по каждому пику не ниже 18000 теоретических тарелок, параметры селективности а и критерий разделения Rs являются оптимальными для модельной смеси. В нативном экстракте в силу сложного характера матрицы, появляются дополнительные пики малой интенсивности, что несколько ухудшает качество разделения, но, тем не менее, оно вполне достаточно для количественного определения.

Рис. 3. Хроматограмма образца препарата Простанорм экстракт жидкий после пробоподготовки методом ТФЭ. Аналитическая длина волны 320 нм. Хроматографические условия — градиент 1. Номера пиков соответствуют номерам соединений в табл.3.

пробоподготовки методом ТФЭ. Аналитическая длина волны 255 нм. Хроматографические условия — градиент 2. ВС - салициловая кислота

Воспроизводимость площади пиков аналитов модельной смеси стандартных соединений, охарактеризованная относительной ошибкой определения среднего результата (относительным стандартным отклонением), укладывается в интервал ± 2% (хлорогеновая кислота 1,6%, рутин 1,8%, кверцетин 1,1%, глицирризиновая кислота 0,3%).

Таблица 3. Параметры хроматографического разделения маркерных компонентов

после проведения твердофазной экстракции и оценка их количественного _содержания в препарате Простанорм (Микроген, серия 130507)_

№ п и к а Соединение Эффективность ЛГ, т.т. (п=5) Коэффициент емкости к' (п=5) Селективность а (п=5) Критери й разделения Я* (п=5) Относительная ошибка определения площади пнка,% (Р = 0,95, п=9) Содержание хер± ДХср, мг/мл (Р = 0,95, п=9)

1. Кафтаровая кислота 20800 3,6 1,09 5,7 . 5,8 0,89±0,05

2. Хлорогено-вая кислота 34100 4,2 1,08 5,1 3,1 1,18±0,04

3. Кофейная кислота 59200 5,2 1,03 2,7 5,9 0,18±0,01

4. Рутин 111600 7,1 1,02 и 7,5 2,10±0,16

5. Гиперозид 107000 7,6 1,02 1,2 3,2 1,81±0,06

6. Цикориевая кислота 98100 8,3 1,02 4,1 2,3 3,04±0,07

7. 2-гидрокси-коричная кислота 149600 9,6 1,02 3,5 5,7 0,49±0,03

8. Кверцетин 38300 2,3 1,02 2,8 1,1 1,02±0,02

9. Кемпферол 57900 4,6 1,04 4,4 6,8 0,06±0,01

10 Глицирри-зиновая кислота 28300 5,6 1,02 6,6 4,1 15,70±0,64

Специфичность методики основана на возможности достоверно определять количественное содержание маркеров в присутствии сопутствующих компонентов экстракта. Модельная смесь стандартных образцов подвергалась той же процедуре пробоподготовки методом ТФЭ и в тех же условиях, что и нативный экстракт. Пики маркеров хорошо разделяются с пиками сопутствующих компонентов. Для всех определяемых соединений соотношение сигнал/шум имеет значение свыше 100.

Повторяемость (сходимость) методики охарактеризована степенью совпадения результатов индивидуальных определений при многократном повторении (не менее 9 определений). В табл. 3 представлены данные воспроизводимости площади пика маркерных компонентов в образце препарата Простанорм («Микроген», серия 130510). По представленным параметрам можно сделать заключение о хорошей воспроизводимости данной методики. Относительная ошибка среднего результата определения площади пика в анализе нативного экстракта препарата выше чем для модельной смеси (наибольшее расхождение наблюдается для рутина — 7,5% в анализе нативного препарата и 1,8% в анализе модельной смеси, соответственно), но в тоже время вполне приемлема для количественного определения.

Разработка оптимизированной по хроматографическим параметрам методики ВЭЖХ анализа компонентов препарата Фито Ново-Сед. В результате проведенного поиска способа пробоподготовки с использованием различных вариантов твердофазной и жидкостной экстракции установлено, что для анализа всей суммы компонентов оптимальным является использование непосредственно жидкого экстракта препарата.

Удовлетворительное разделение всех компонентов экстракта достигнуто в обращено-фазовом варианте на октадецилсилановых сорбентах в нелинейных градиентных условиях с использованием сложного состава ПФ. Введение в состав ПФ наряду с ацетонитрилом и фосфатным буфером (рН 3.0) диметилформамида и тетрагидрофурана значительно улучшило форму пиков и разрешающую способность соседних пар пиков.

Рис. 5. Хроматограмма образца препарата «Фито Ново-Сед экстракт жидкий». Условия анализа указаны в тексте. Номера пиков на хроматограмме соответствуют порядковым номерам в таблице 5. ВС - внутренний стандарт - салициловая кислота.

На хроматограммах образцов препарата «Фито Ново-Сед» (рис. 5) присутствуют 66 пиков, интенсивность каждого из которых превышает 0,25%. Большинство компонентов экстракта характеризуется низкой интенсивностью, количество интенсивных пиков не превышает 20. Наибольшее количество пиков наблюдается при детектировании на длине волны 285 нм, лучшее разрешение пиков при детектировании на 325 нм.

Качественный анализ препарата Фито Ново-Сед, идентификация соединений, входящих в его состав. Для идентификации основных компонентов фитопрепарата применили тот же методологический подход, основанный на двух критериях — относительных временах удерживания и спектральном отношении А285/А320.

Minutes

На основании данного подхода идентифицированы 17 биологически активных компонентов препарата «Фито Ново-Сед» (табл. 4). Основными компонентами препарата яв-

ляются эфиры гидроксикоричных кислот и флавоноиды. (агликоны и гликозиды).

Таблица 4. Идентифицированные компоненты препарата «Фито Ново-Сед».

№ пи ка Относительное время удерживания 1кхЛкст. Коэффициент емкости к' Спектральное отношение А285/А325 Идентификация пика Растительный источник

1 0,098 0,24 2,803 аскорбиновая кислота шиповник

7. 0,206 1,62 Нет на 325нм галловая эхинацея

3. 0,313 2,98 1,85 протокатеховая эхинацея

4 0,374 3,75 0,709 кафтаровая кислота эхинацея

5. 0,385 3,89 0,664 хлорогеновая кислота эхинацея, боярышник

6. 0,467 4,94 1,019 ванилиновая кислота мелисса

7 0,493 5,27 0,845 кофейная кислота эхинацея, боярышник

8 0,634 7,06 0,778 рутин шиповник, пустырник, мелисса

9 0,649 7,26 0,905 нарингенин-5-глюкозид эхинацея

10 0,676 7,60 0,746 гиперозид боярышник

11. 0,701 7,92 1,63 лютеолин мелисса

12 0,841 9,69 0,601 цикориевая кислота эхинацея

13 1,032 12,12 0,879 розмариновая кислота мелисса

14. 1,069 12,59 0,924 коричная кислота эхинацея

15 1,079 12,73 0,884 кверцетин шиповник, пустырник

16. 1,118 13,23 1,017 апигенин мелисса

17. 1,171 | 13,89 0,962 кемпферол шиповник

Это подтверждается анализом хроматограмм после гидролиза: при щелочном гидролизе (кипячение с 0,1% раствором натрия карбоната) значительно уменьшаются или исчезают пики кафтаровой, хлорогеновой, розмариновой, цикориевой кислот и увеличивается пик кофейной кислоты, сложными эфирами которой они являются; при кислотном гидролизе (кипячение с 1М раствором НС1) уменьшаются пики рутина, нарингенин-5-глюкозида и некоторых других минорных компонентов и возрастают пики агликонов флавоноидов и галловой кислоты. Применение стандартов — терпеноидов (цитраль, цитронеллаль, гераниол), характерных компонентов травы мелиссы, показало отсутствие этих соединений в экстракте препарата Анализ хроматограмм препарата при 215 нм свидетельствует о появлении некоторых дополнительных малоинтенсивных пиков, которые исходя из хромофорной структуры соединений могут быть отнесены к иридоидам (пустырник) или сапонинам (эхинацея, пустырник).

Разработка методики оценки подлинности компонентов препарата Фито Ново-Сед методом ТСХ. Для характеристики 4'вйдов сырья в составе препарата можно использовать доступные «свидетели» - розмариновую (мелиссы трава), аскорбиновую (шиповника плоды), хлорогеновую и цикориевую (эхинацеи пурпурной трава) кислоты и гиперозид (боярышника плоды). Для характеристики травы пустырника отличительными маркерами являются иридоиды. Однако эти соединения практически недоступны в качестве стандартов. Поэтому, при разработке методики в качестве «свидетеля» использовали непосредственно 40% спиртовой экстракт травы пустырника.

Оптимальные условия разделения достигнуты в системе растворителей: муравьиная кислота: вода: изопропиловый спирт: этилацетат 5:5:15:75 об%. Одновременное определение всех индикаторных компонентов на одном сорбенте в процессе одной разгонки невозможно, так как для обнаружения аскорбиновой кислоты и иридоидов нужны отличные от других компонентов способы детектирования. Поэтому разработан способ, основанный на применении двух сорбентов и двух вариантов детектирования. На пластинках без УФ-индикатора (например, TLC Silica gel 60) при опрыскивании раствором аммония молибдата обнаруживаются зоны синего цвета, соответствующие компонентам травы пустырника - иридоидам (Rf =0,2±0,02) и аскорбиновой кислоте (Rf =0,41+0,03, шиповник). После второй разгонки на пластинках с УФ-индикатором (например, Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ) и последующей обработкой раствором аммония молибдата проявляются зоны с R|=0,46±0,03 и R(=0,86±0,03 (хлорогеновая и цикориевые кислоты, эхинацея), с Rf=0,55±0,03 (гиперозид, боярышник) и Rr=0,92±0,03 (розмариновая кислота, мелисса).

Разработка способа количественного анализа основных компонентов препарата Фито Ново-Сед. С точки зрения доступности и экономичности для стандартизации препарата целесообразно использовать в качестве маркерных следующие соединения: аскорбиновую кислоту (плоды шиповника), цикориевую и 2-гидроксикоричную кислоты (трава эхинацеи пурпурной), розмариновую кислоту (трава мелиссы), гиперозид (плоды боярышника) хлорогеновую и кофейную кислоты (трава эхинацеи пурпурной и плоды боярышника), рутин (плоды шиповника, трава пустырника и трава мелиссы), кверцетин (плоды шиповника, трава пустырника).

Количественный анализ маркерных компонентов в оптимальном диапазоне хроматографических параметров удалось реализовать используя методический подход, включающий две последовательные разгонки на октадецилсилановом сорбенте в различных градиентных условиях с применением ПФ, включающей ацетонитрил (А), тетрагидрофуран (В), фосфатный буфер (0,1% Н3Р04 и 0,02М КН2Р04, рНЗ,) с добавлением диметилформамида 1,5 oG.% (С). Первая разгонка (градиент потока 1) характеризуется

медленным повышением доли сильного элюента - ацетонитрила, (0-10мин- 10%А, 3%В, 87%С; 10-20мин - 15%А, 3%В, 82%С; 20-30мин - 20%А, 3%В, 77%С; 30-35мин- 90%А, 0%В, 10%С). Эти условия оптимизированы по хроматографическим параметрам для анализа аскорбиновой, хлорогеиовой, кофейной кислоты, рутина. Таблица 5. Параметры хроматографического разделения маркерных компонентов и

оценка их количественного содержания в образце препарата Фито Ново-Сед (Микроген, серия 040410)

№ п и к а Соединение Эффективность /V, т. т. (ч=5) Коэффициент емкости к' (п=5) Селективность а (п=5) Критерий разделения (п=5) Относительная ошибка определения площади пика,% (Р = 0,95, п=5) Содержание Хср^ ДХср, мг/мл (Р=0,95, п=5)

1. Аскорбиновая кислота 18400 2,1 1,42 3,6 1,1 7,76+0,03

2. Хлорогеновая кислота 24000 2,5 1,64 5,3 0,8 0,92+0,09

3. Кофейная кислота 31400 3,8 1,61 2,4 1,3 0,25+0,03

4. Рутин 36600 6,2 1,62 1,3 2,0 0,84+0,07

5. Гиперозид 39100 7,4 1,59 2,7 1,3 0,31+0,03

6. Цикориевая кислота 23400 8,9 1,27 4,1 1,2 0,51+0,05

7. Розмариновая кислота 28500 3,7 1,12 6,1 3,0 1,10+0,2

8. 2- гидрокси-коричная кислота 23000 4,1 1,24 3,1 1,6 0,14+0,38

9. Кверцетин 91600 6,4 1,55 1,7 2,8 0,39+0,03

Вторая разгонка (градиент 2) характеризуется быстрым достижением более жестких условий элюирования (0-10мин - 20%А 3%В 77%С; 10-20мин - 25%А 3%В 72%С; 20-30мин - 35%А 3%В 62%С; 30-35мин - 90%А 0%В 10%С. Эти условия оптимальны для анализа гиперозида, кверцетина, цикориевой, розмариновой и 2-гидроксикоричной кислот.

Предлагаемый способ анализа валидирован по хроматографическим параметрам и специфичности и воспроизводимости результатов (табл. 5). Повторяемость (сходимость) методики охарактеризована на примере анализа одной из серий препарата, произведенной ФГУП НПО «Микроген». В таблице 6 представлены результаты применения разработанной методики для количественного определения содержания маркеров в образцах препарата Фито Ново-Сед некоторых других серий и производителей.

Анализ данных табл. 6 свидетельствует, что существует некоторая вариабельность результатов. Наибольшее содержание характерно для таких компонентов как аскорбиновая, розмариновая, хлорогеновая кислоты, а также рутин и кверцетин.

Таблица 6. Количественное содержание маркерных компонентов в образцах

трех различных производителей (мг/мл) препарата Фито Ново-Сед*

Соединение Образец 1 Образец 2 Образец 3 Образец 4 Образец 5

серия 050410 серия 060410 серия 030809 серия 071208 серия 010311

Микроген Микроген Ватхзм-фармация Ватхэм-фармация В11ЛАР

X, X, Х3 X, X,

Аскорбиновая кислота 5,44 4,69 5,08 5,86 5,45

Хлорогеновая кислота 0,13 0,10 0,29 0,18 0,27

Кофейная кислота 0,11 0,12 0,12 0,10 0,08

Рутин 0,70 0,61 0,16 0,23 0,53

Гиперозид 0,09 0,27 0,10 0,12 0,15

Цикориевая кислота 0,34 0,45 0,24 0,15 0,35

Розмариновая кислота 1,04 1,09 0,75 0,54 0,83

т-г-коричная кислота 0,14 0,03 0,02 0,03 0,03

Кверцетин 0,33 0,42 0,47 0,22 0,25

* среднее из 3 независимых определений

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Сформулирован методический подход к разработке методик качественного и количественного анализа многокомпонентных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед, как основа системы контроля их качества и стандартизации.

2. Изучены спектральные характеристики экстрактов препаратов, экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в состав препаратов, стандартных образцов и выявлены аналитические длины волн, и соотношения молярных коэффициентов экстинкций (спектральное отношение) при аналитических длинах волн, позволяющие осуществлять оптимальное детектирование образцов препаратов.

3. Предложена универсальная методика хроматографического анализа экстрактов каждого вида смеси лекарственного сырья, составляющей основу исследованных препаратов. Идентифицированы основные компоненты экстрактов (50% этанол) травы зверобоя продырявленного, золотарника канадского, корня солодки, корневищ с корнями эхинацеи пурпурной (для характеристики препарата Простанорм) и экстрактов (40% этанол) травы пустырника, мелиссы лекарственной, эхинацеи пурпурной, плодов боярышника и шиповника (для характеристики препарата Фито Ново-Сед).

4. Разработаны оригинальные методики качественного анализа компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методом ВЭЖХ. Определены оптимальные условия хроматографического разделения. Идентифицировано 23 биологически активных компонента препарата Простанорм и 17 компонентов препарата Фито Ново-Сед.

Показано, что препараты содержат большой набор полифенолов, таких как флавоноиды (агликоны и гликозиды) и эфиры гидроксикоричных кислот.

5. Выявлены индикаторные (маркерные) компоненты, характеризующие каждый вид растительного сырья в составе комплексных препаратов и обоснована возможность их применения в качестве «свидетелей» для определения подлинности данных препаратов и их количественной характеристики.

6. Разработаны методики качественного определения маркерных компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методом ТСХ, позволяющие охарактеризовать каждый вид лекарственного сырья в составе препарата Определены оптимальные хроматографические условия и двухэтапный способ детектирования, обеспечивающие высокую воспроизводимость результатов. Методики ТСХ анализа позволяют осуществлять определение подлинности препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед.

7. Разработаны селективные методики количественного определения маркерных компонентов препаратов методом ВЭЖХ. Комбинированная методика количественного анализа компонентов препарата Простанорм включает способ пробоподготовки методом твердофазной экстракции и последующий анализ методом ВЭЖХ, основанный на проведении двух разгонок, различающихся условиями изменения градиента потока. Количественный анализ маркерных компонентов препарата Фито Ново-Сед базируется на двух последовательных хроматографических разгонках; градиентные условия первой разгонки оптимизированы для анализа более полярных компонентов, второй — менее полярных компонентов. По валидационным характеристикам разработанные методики являются специфичными, характеризуются корректной повторяемостью (сходимостью), что позволяет использовать их для достоверной оценки аналитов в составе препарата.

8. Дана количественная оценка содержания маркеров комплексных препаратов ряда образцов различных производителей. Доминирующими компонентами препарата Простанорм являются (в порядке убывания) глицирризиновая, цикориевая кислоты, рутин, гиперозид, хлорогеновая кислога, кверцегин, кафгаровая кислота Доминирующими компонентами препарата Фито Ново-Сед являются аскорбиновая, розмариновая, хлорогеновая кислоты, ругин, цикориевая кислота, гиперозид, кверцетин., кофейная кислота

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Захарова Н.Г., Белобородое BJ1., Савватеев А.М., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Идентификация компонентов комплексного фитопрепарата Простанорм методом ВЭЖХ // Матер. IV Всеросс. с междунар. участием научно-методической конференции «Фармобразование 2010» Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых

физиологически акшвных веществ Ч. 2. Научные основы создания новых лекарственных средств. Воронеж. - 2010. - С. 153-155.

2. Захарова Н.Г., Савватеев A.M., Белобородое В.Л., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Разработка универсального способа анализа компонентов в составе комплексного препарата простанорм методом ВЭЖХ // Материалы XVII Росс, нац. конгр. «Человек и лекарство», М. -2010.-С. 619.

3. Захарова Н.Г., Белобородов В.Л. Разработка универсального способа анализа составных частей комплексного фитопрепарата простанорм // Тезисы итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» Москва. - 2010. - С. 60.

4. Захарова Н.Г., Савватеев A.M., Белобородов В.Л., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Качественное определение препарата Фиго Ново-Сед методом ТСХ // Материалы XVIII Росс, нац. конгр. «Человек и лекарство», М. - 2011. - С. 504.

5. Захарова Н.Г., Савватеев A.M., Белобородов В.Л., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Разработка методики качественной оценки подлинное™ компонентов комплексного фитопрепарата «ПРОСТАНОРМ0» методом ТСХ. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2011 - № 3 С. 18-22

6. Белобородов BJI., Захарова Н.Г., Савватеев А.М., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Разработка хромагографических способов анализа и идентификации компонентов комплексного препарата «ФИТО НОВО-СЕД» // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2011 - № 9 С.23-28

7. Белобородов BJI., Захарова Н.Г., Савватеев А.М., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Разделение и идентификация компонентов комплексного фитопрепарата Простанорм методом ВЭЖХ//Хим-фарм.журнал2011 -Т.45 №9СЗЗ-З6

8. Захарова Н.Г. Исследование состава многокомпонентных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед хроматографическими методами. //Матер, итоговой всеросс. научн. конференц. молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» М.-2011.- С.59

9. Захарова Н.Г., Савватеев A.M., Белобородов В.Л., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Выделение маркерных компонентов фитопрепарата Простанорм методом твердофазной экстракции//Материалы XIX Росс. нац. конгр. «Человек и лекарство», М.- 2012. -С.378.

10. Захарова Н.Г., Савватеев A.M., Белобородов В.Л., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Определение маркерных компонентов препарата Фито Ново-Сед методом ВЭЖХ// Материалы XIX Росс, наа конгр. «Человек и лекарство», М. -2012. -С.378.

11. Белобородов В Л., Захарова Н.Г., Савватеев А.М., Колхир В.К., Воскобойникова И.В. Методика количественною определения маркерных компонентов фитопрепарата «Простанорм» методами твердофазной экстракции и ВЭЖХ // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012 -№ 5 С. 9-14

Подписано в печать: 08.10.2012 Объем: 1,0усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 502 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул.Рождественка, 5/7,стр.1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

В последние годы отмечается повышенный интерес к применению комплексных лекарственных средств растительного происхождения. Такие лекарственные средства, включающие в свой состав несколько видов лекарственного растительного сырья, содержат комплекс биологически активных веществ с разносторонним фармакологическим действием, что расширяет диапазон лечебных свойств, обеспечивая длительный корригирующий и заместительный эффект при различных заболеваниях.

Представителями группы мультиисточниковых фитопрепаратов являются оригинальные отечественные средства «Простанорм®» и «Фито Ново-Сед®» (ЗАО «ФПК ФармВИЛАР», Москва). Препарат Простанорм представляет собой водно-спиртовой экстракт смеси четырех видов лекарственного растительного сырья - травы зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L., травы золотарника канадского Solidago Canadensis L., корня солодки Glycyrrhiza glabra L., корневищ с корнями эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea (L.) Moench в равных соотношениях. В состав препарата включены растительные источники, обладающие простатотропной активностью, улучшающие микроциркуляторные процессы в предстательной железе, нормализующие мочеотделение, оказывающие противовоспалительное, капилляропротекторное, анальгетическое и антимикробное действие [41].

Препарат Фито Ново-Сед® содержит водно-спиртовой экстракт из травы пустырника - Leonurus cardiaca L.; травы мелиссы лекарственной - Melissa officinalis L.; плодов боярышника - Fructus Crataegi, плодов шиповника - Fructus Rosae, травы эхинацеи пурпурной - Herba Echinacea purpureae (L.) Moench в массовых соотношениях 2:2:1:2:1. Фито Ново-Сед оказывает кардиотоническое действие, повышает устойчивость сердечно-сосудистой системы к повышенной нагрузке, стабилизирует уровень артериального давления [42].

Многокомпонентность состава комплексных препаратов, наличие сложного матрикса биологически активных веществ различной химической природы обусловливает необходимость разработки оптимальных путей их фармацевтического анализа. Существующие методы стандартизации препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед включают качественные реакции на фенольные соединения и спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов. До начала работы не был установлен качественный и количественный состав препаратов, достоверные критерии идентификации индивидуальных соединений, а также методы контроля комбинации действующих веществ в составе препаратов и методы контроля лекарственных источников, составляющих препарат. Наиболее перспективными методами для решения этих задач являются хроматографические, сочетающие эффективность разделения компонентов сложных смесей с избирательностью и чувствительностью детектирования.

Цель исследования. Целью исследования являлась разработка оптимизированных способов хроматографического анализа биологически активных веществ препаратов Простанорм и Фйто Ново-Сед, идентификация основных компонентов и совершенствование системы стандартизации препаратов.

Задачи исследования. Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить физико-химические характеристики (положение и интенсивность полос в УФ-спектрах, хроматографическая подвижность в различных системах) экстрактов препаратов, экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в состав препаратов, и индивидуальных соединений — биологически активных веществ; выявить оптимальные пути пробоподготовки лекарственного сырья и лекарственных форм комплексных препаратов для анализа;

• разработать оптимальные способы разделения многокомпонентных смесей веществ, входящих в состав лекарственного растительного сырья и препаратов 6

Простанорм и Фито Ново-Сед;

• идентифицировать основные компоненты препаратов и лекарственного сырья, входящего в их состав;

• выявить маркерные (индикаторные) соединения, характерные для каждого вида сырья, входящего в состав препаратов и предложить методики их определения, как характеристику подлинности препаратов;

• разработать селективные хроматографические методики количественного анализа основных компонентов с учетом специфичности состава комплексных фитопрепаратов;

• валидировать разработанные методики на основе изучения соответствующих валидационных характеристик с целью их последующего применения для стандартизации лекарственных форм препаратов;

• апробировать разработанные методики в анализе серий образцов препаратов различных производителей.

Научная новизна. Научная новизна представленной работы заключается в следующем:

Впервые предложены оптимизированные и валидированные методики анализа индивидуальных компонентов оригинальных комплексных отечественных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед на основе вариантов метода ВЭЖХ.

Впервые идентифицирован комплекс биологически активных веществ экстрактов смеси лекарственного сырья, составляющих основу фитопрепаратов, и, тем самым, определен качественный состав компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед.

Установлены индикаторные (маркерные) компоненты, характеризующие наличие каждого вида сырья в составе фитопрепаратов. Разработаны методики определения подлинности препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методом ТСХ, базирующиеся на анализе маркерных компонентов.

На основе оригинальных способов пробоподготовки с использованием твердофазной экстракции и последовательного двухкратного градиентного 7 анализа методом ВЭЖХ, впервые осуществлена количественная оценка содержания основных индивидуальных компонентов в составе препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед различных серий и производителей.

Разработанные методики качественного и количественного определения содержания компонентов препаратов составляют основу системы их стандартизации.

Практическая значимость работы н внедрение результатов в практику. Предложены и внедрены методы определения подлинности препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед с использованием метода ТСХ на основе анализа маркерных компонентов, характеризующих каждый вид лекарственного сырья в составе комплексных фитопрепаратов. Разработаны оригинальные методики качественного и количественного определения компонентов препаратов на основе обращенно-фазового градиентного варианта метода ВЭЖХ. Осуществлена количественная оценка содержания биологически активных компонентов в различных сериях исследуемых препаратов. Методики качественного анализа препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед внедрены в работу отдела контроля качества ЗАО «ФПК ФармВИЛАР», а также контрольных лабораторий Министерства Здравоохранения республики Беларусь, (имеются акты внедрения)

Разработан и внедрен в учебный курс «Физико-химические методы исследования органических соединений» на кафедре органической химии ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова методологический подход к анализу комплексных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методами ВЭЖХ и ТСХ. (имеется акт внедрения).

Основные положения, выносимые на защиту.

Результаты изучения спектральных и хроматографических характеристик экстрактов препаратов, экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в состав препаратов, и компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед.

Способы пробоподготовки и проведения анализа многокомпонентных 8 смесей, составляющих экстракты исследуемых препаратов и отдельных видов сырья.

Разработанные оптимизированные и валидированные методики качественного и количественного анализа компонентов препаратов методом ВЭЖХ.

Результаты установления состава препаратов и экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в их состав.

Предложенные методики определения подлинности фитопрепаратов.

Количественная оценка индивидуальных биологически активных веществ в производственных сериях фитопрепаратов.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV Всероссийской с международным участием научно-методической Конференции «Фармобразование 2010» (Воронеж, 2010 г.); на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г.); на итоговой научной конференции студентов и молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2010 г.); на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011 г.); на XIII Школе молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2011 г.) и на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 г.).

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично разработаны методики качественного и количественного анализа фитопрепаратов, проведена аналитическая и статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от научного обоснования и постановки целей и задач, их экспериментальной реализации до аналитической и статистической обработки, обобщения и обсуждения полученных результатов и рекомендаций по их внедрению в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры органической химии «Разработка способов анализа и стандартизации флавоноидсодержащих лекарственных средств, изучение их антиоксидантной активности и фармакокинетики».

Публикации результатов исследования. По результатам диссертационного исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе четыре в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, отражающих собственные экспериментальные исследования и обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицами, 42 рисунками. Библиографический список включает 205 источник литературы, из них 157 отечественных и 48 зарубежных источников.

выводы

1. Сформулирован методический подход к разработке методик качественного и количественного анализа многокомпонентных фитопрепаратов Простанорм и Фито Ново-Сед, как основа системы контроля их качества и стандартизации.

2. Изучены спектральные характеристики экстрактов препаратов, экстрактов отдельных видов лекарственного сырья, входящего в состав препаратов, стандартных образцов и выявлены аналитические длины волн, и соотношения молярных коэффициентов экстинкций (спектральное отношение) при аналитических длинах волн, позволяющие осуществлять оптимальное детектирование образцов препаратов.

3. Предложена универсальная методика хроматографического анализа экстрактов каждого вида смеси лекарственного сырья, составляющей основу исследованных препаратов. Идентифицированы основные компоненты экстрактов (50% этанол) травы зверобоя продырявленного, золотарника канадского, корня солодки, корневищ с корнями эхинацеи пурпурной (для характеристики препарата Простанорм) и экстрактов (40% этанол) травы пустырника, мелиссы лекарственной, эхинацеи пурпурной, плодов боярышника и шиповника (для характеристики препарата Фито Ново-Сед).

4. Разработаны оригинальные методики качественного анализа компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методом ВЭЖХ. Определены оптимальные условия хроматографического разделения. Идентифицировано 23 биологически активных компонента препарата Простанорм и 17 компонентов препарата Фито Ново-Сед. Показано, что препараты содержат большой набор полифенолов, таких как флавоноиды (агликоны и гликозиды) и эфиры гидроксикоричных кислот.

5. Выявлены индикаторные (маркерные) компоненты, характеризующие каждый вид растительного сырья в составе комплексных препаратов и обоснована возможность их применения в качестве «свидетелей» для определения подлинности данных препаратов и их количественной характеристики.

6. Разработаны методики качественного определения маркерных компонентов препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед методом ТСХ, позволяющие охарактеризовать каждый вид лекарственного сырья в составе препарата. Определены оптимальные хроматографические условия и двухэтапный способ детектирования, обеспечивающие высокую воспроизводимость результатов. Методики ТСХ анализа позволяют осуществлять определение подлинности препаратов Простанорм и Фито Ново-Сед.

7. Разработаны селективные методики количественного определения маркерных компонентов препаратов методом ВЭЖХ. Комбинированная методика количественного анализа компонентов препарата Простанорм включает способ пробоподготовки методом твердофазной экстракции и последующий анализ методом ВЭЖХ, основанный на проведении двух разгонок, различающихся условиями изменения градиента потока. Количественный анализ маркерных компонентов препарата Фито Ново-Сед базируется на двух последовательных хроматографических разгонках; градиентные условия первой разгонки оптимизированы для анализа более полярных компонентов, второй — менее полярных компонентов. По валидационным характеристикам разработанные методики являются специфичными, характеризуются корректной повторяемостью (сходимостью), что позволяет использовать их для достоверной оценки аналитов в составе препарата.

8. Дана количественная оценка содержания маркеров комплексных препаратов ряда образцов различных производителей. Доминирующими компонентами препарата Простанорм являются (в порядке убывания) глицирризиновая, цикориевая кислоты, рутин, гиперозид, хлорогеновая кислота, кверцетин, кафтаровая кислота. Доминирующими компонентами препарата Фито

Ново-Сед являются аскорбиновая, розмариновая, хлорогеновая кислоты, рутин, цикориевая кислота, гиперозид, кверцетин., кофейная кислота.