Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Новые подходы к предимплантационной подготовке ксенобиопротезов клапанов сердца. Клинические и экспериментальные аспекты

Ч *\1

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

На правах рукописи

УДК 616-089.843-615.477.2: 616-089.28./29-611.126

ЭЛЬГУДИН Яков Львович

НОВЫЕ подходы К ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННОЙ ПОДГОТОВКЕ КСЕНОБИОПРОТЕЗОВ КЛАПАНОВ СЕРДЦА КЛИНИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ

14.00,41 — Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Кемеровском государственном медицинском институте и Кемеровском учебно-научно-производственном объединении «Кардиология».

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Л. С. Барбараш, доктор биологических наук С. П. Новикова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор М. Л. Семеновский, доктор медицинских наук, профессор А. Н. Кайдаш.

Ведущее учреждение — Институт сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева АМН СССР.

Защита состоится «

в М _час. на заседании Специализированного ученого

совета Д.074.34.01 при Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР (Москва, 123436, ул. Щукинская, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР.

Автореферат разослан «30 », _199_^.г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор

А. А. ПИСАРЕВСКИИ

уальность проблемы. Биологические протезы клапанов в течение двух последних десятилетий заняли видное место среди клапанных заменителей при коррекции приобретенных пороков сердца (Фурсов Б. А. ,1982; Семеновский И. JL с соавт., 1990; Morgan е. а. ,1985).

Главной причиной неудач при имплантации биоклапанов является их относительно низкая долговечность. Причиной дисфункций биопротезов в большинстве случаев является первичная тканевая несостоятельность и кальцификация биоткани (Малиновский RE с соавт. ,1988; Константинов. Б. А. с соавт., 1990; Цукерман Г..И. с соавт. ,1988; Levy R.J. е. а ,1985; Schoen F.J. е. а. ,1988 ). Это осложнение развивается у 20-25% Эольных в первые 7-10 лет после операции,* а у детей и лиц молодого возраста частота кальцификации. достигает 50-60% в течение первых 2-5 лет ( Дземешевич С. Л., 1984; Барбараш IL С. , 1986; Schoen F.J. е. а. , 198?).

Решающим фактором, определяющим судьбу имплантированных биопротезов, является способ их предимплантационной юдготовки.

Общепринятой при изготовлении ксенобиопротезов клала- ■ юв сердца является их консервация в глутаровом альдегиде Carpantier А. ,1969; Фурсов Б. А. , 1982). С целью повышения >езистентности к минерализации были предложены некоторые ;пособы дополнительной обработки биоткани, в частности, им-юбилизация ' на ткани ингибиторов кальцификации различных ;лаесов (Зайцев В. В. , 1988; Красовская С. Е , 1990).

На решение проблемы специфических осложнений биопроте-:ирования направлен стадийный способ предимплантационной юдготовки, экспериментально обоснованный ранее ( Журавлева [. Ю. , 1988). Данный способ включает стабилизацию в глутаро-ом альдегиде по традиционной схеме, ферментативный протео-из с использованием папаина, иммобилизацию З-амино-1-ок-ипропилидендифосфоновой кислоты (АОДДФК) и гепарина.

Реализация принципа стадийной модификации ксеноклапа-ов в предимплантационном периоде требует исследования геодинамической функции протезов в клинических условиях, ценки результатов имплантации модифицированных клапанов.

Кроме того, изложенный способ консервации не лишен некоторых недостатков, устранение которых является насущной задачей дня.

Актуальность работы определяется тем, что она направлена на оценку гемодинамической адекватности биопротезов с противокальциевой защитой и разработку биопротеза, структурно стабильного и резистентного к кальцификации и тромбо-образованию.

Цель настоящего исследования - оценка- непосредственных гемодинамических и отдаленных клинических результатов биопротезирования митрального клапана модифицированными биопротезами, а также теоритическое обоснование и экспериментальная разработка нового способа предимплантадионной подготовки ксенобиопротезов клапанов сердца

Задачи.исследования.

1. Оценить гемодинамическую функцию модифицировании биопротезов в митральной позиции.

2. Оценить в сравнительном аспекте непосредственные и отдаленные клинические результаты имплантации традиционных и модифицированных биопротезов.

3. Теоретически обосновать "и разработать новый способ предимплантационной подготовки, направленный.на комплексное повышение биосовместимости ксеноклапанов, в т. ч. резистентности к кальцификации и тромбообразованию.

4. Изучить вопросы стабильности и физико-механических свойств ксеноткани и функциональных параметров ксенобиопротезов, подготовленных в соответствии с предложенным способс

Научная новизна Впервые оценена гемодимамическая функция биопротезов, подготовленных в соответствии с модифицированной технологией предимплантационной подготовки. Оценены непосредственные гемодинамические и отдаленные клинические результаты биопротезирования митрального клапана модифицированными биопрогезами.

Впервые показана возможность использования дифосфонат-содержащих полимеров при . консервации ксенобиопротезов с целью комплексного повышения биосовместимости последних При этом доказано сохранение высокой степени поперечной сшивки коллагена после обработки глутаральдегидом, папаином и дифосфонатссщержащим полимером ( ДФСП ) и повышенная устойчивость интерполимерного комплекса коллаген-ДФСП к действию специфического фермента - коллагеназы. Установлено, что ткань, обработанная ДФСП, почти вдвое превосходит по механической прочности традиционно подготовленный материал, имеет адекватные упруго-деформативные свойства. Гидродинамические параметры новых протезов соответствуют показателям традиционных ксеноклапанов.

Впервые установлена и доказана высокая противокальцие-вая активность иммобилизованного на ксеноткани ДФСП.

Доказано благоприятное влияние иммобилизации ДФСП на модификацию ткани гепарином и тромборезистентные свойства биоматериала.

Практическая ценность и реализация результатов работы. Показано, что биопротезы, подготовленные в соответствии с модифицированной технологией, позволяют эффективно корригировать внутрисердечную гемодинамику при имплантации их в митральную позицию. Показано, что по основным гемодинами-ческим параметрами модифицированные биопротезы не уступают традиционным биоклапанам.

Установленно, что у больных с модифицированными клапанами отсутствуют тромбоэмболические осложнения в течение самого опасного периода - первого послеоперационного года.

Показана возможность применения дифосфонатсодержащих полимеров для иммобилизации на ксеноклапанах с целью повышения биосовместимости последних. (Положительное решение по заявке на изобретение N4812886/14 от 9.04.90г.).

На основании всестороннего изучения этих соединений признано целесообразным включение их в схему предимпланта-ционной подготовки ксенобиопротезов клапанов сердца. Подго-

товлены образцы биопротезов для апробации е Кемеровском кардиохирургическом центре.

Результаты настоящего исследования используются в работе предприятия по производству биопротезов клапанов сердца и сосудов при изготовлении алловенозных сосудистых протезов (обработка гепарином (АС СССР N1614183) и ДФСП). Результаты работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами Кемеровского медицинского института и практическими врачами области.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ,их список прилагается, получено ,1 авторское свидетельство и 1 положительное решение по заявке на изобретение.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на: 1 Всесоюзном съезде сердечно-сосудистых хирургов - 2 сообщения (Москва, 1990); 1 Всесоюзном симпозиуме "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия" (Суздаль,1991); Всесоюзной конференции "Прогресс в хирургии" (Москва, 1990); Всесоюзном семинаре "Актуальные проблемы торакальной и сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 1990); региональной научно-практической конференции "Молодые ученые Кузбасса - народному хозяйству" (Кемерово,1990); объединенной конференции кафедры хирургических болезней N1 Кемеровского мединститута и областных обществ хирургов и сердечно-сосудистых хирургов (Кемерово, 1991).

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций, содержит рисунка, таблиц. Указатель литературы включает 84 работы отечественных и 163 работы зарубежных авторов.

Содержание работы.

Клиническая часть работы выполнена по материалам Кемеровского кардиохирургического центра (руководитель проф. Л. С. Барбараш).

Экспериментальные исследования проведены совместно с сотрудниками Новосибирских институтов Химической кинетики и горения (к. х. н. И. С. Алферьев), Биоорганичёской химии (Л.В. Гаевая) и ' Молекулярной биологии СО АН СССР (К.Х.Н.ЕВ,Самуков); Института сердечно-сосудистой хирургии имени А. Н. Бакулева АМН СССР (А. Ф. Фадеев); Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (к. м. н. 3. Р. Милованова); НПО "Экран" БНИИШГ (к. т. н. Г. М. Деркач).

Клинические результаты применения модифицированных биопротезов клапанов сердца.

Гемодинамические и клинические результаты биопротезирования митрального клапана изучены у 96 выписанных из стационара больных. 79-и из них были имплантировании традиционные биопротезы (ТВ) - 1 группа, подготовленные по стандартизованной схеме (Барбараш Л. С., 1986), 17-и модифицированные биопротезы (МБ) - 2 группа, схема консервации которых включала дополнительный папаиновый протеолиз и иммобилизацию АОГЩФК и гепарина.

Основные параметры, характеризующие исходное состояние пациентов обеих групп приведены в таблице N1.

Таблица 1.

Клиническая характеристика больных Г и II групп.

Группа Средний Срок набл. Мерц-я Каль- Число Средн.

больных возраст (лет) аритмия циноз б-х с ФК

с (лет) сред. макс. % МК, % IV ФКД МУНАД

1п=79 42,0+0,8. 3,3+0,5 6 74,3 46 51,9 3,51

Пп=17 31,5+1,5 1,1+0,1 3,5 76,1 35 53,1 3,35

Пациенты обеих групп были людьми трудоспособного возраста. Отбор молодых больных (р< 0,01) для имплантации им МБ был основан на результатах предварительных экспериментов, показавших потенциальную резистентность МБ к кальцификации.

По длительности существования порока (более десяти лет - 57% случаев в 1 и 47% - во II группах), наличию осложнений, тяжести гемодинамических раетройств и общего состояния (IV ФК - 51,9% больных в 1 и 53,1% - во II группах) пациенты не отличались друг от друга. Сопутствующие пороки три-куспидального клапана имели место у 16 больных 1 группы и одного больного II группы, из них коррекция порока проведена в 7 случаях в 1 группе больных. Аортальные пороки имели место в четырех случаях в 1 группе (все корригированы).

Методика проведения операций, включая хирургическую технику и кардиоплегичеекую зашдту во всех случаях соответствовало таковой, принятой в ИССХ им. А. Е Бакулева АМН СССР и Кемеровском кардиохирургическом центре.

Функция протеза и гемодинамические результаты операции оценены по данным интраоперационной манометрии, эхокардиог-рафии через 6 и 12 месяцев после операции и велозргометри-ческой пробы через 2 и 12 месяцев после вмешательства.

В госпитальном периоде летальных исходов, связаннх с функцией протеза не было. В отдаленном периоде в 1 группе умерло Р. больных, оба в течении перього года после операции. Во £ группе летальных исходов не зарегистрированно.

Неосложенное течение послеоперационного периода соответствовало динамике состояния пациентов с нормально функцио пирующими биопротезами (Барбараш Л. С. ,1986). Это нашло свое отражение в снижении среднего функционального класса к году после операции с 3,51 до 1,51 в 1 группе и с 3,35 до 1,83 во II группе.

Функциональные параметры клапанов - эффективная гидравлическая площадь (ЭГП) и среднедиастолический градиент (СДГ), а также сердечный индекс (СИ) при интраоперационной

маномегрии составили для II группы: 3,5+ 0,1 см* и 4,7+ 0,1.. мм рт. ст. и 3,91+0,13, что достоверно не отличается от соответствующих показателей традиционных биопротезов -3,3+0,1 см', 5,3 +0,2 мм рт. ст. и 3,83+0,11 (р>0,05).

При эхокардиографии в обеих группах выявлены однотипные тенденции к уменьшению размеров полости левого предсердия по мере увелечения срока после операции. При этом достоверное уменьшение размера левого предсердия у больных с МБ происходит уже к полугоду после операции (р< 0,05), тогда как у больных с ТБ аналогичный результат достигнут через год после вмешательства (р< 0,001). У пациентов II группы заметнее прирост сократительной способности миокарда, так что уже через полгода показатель ФИ приближается к значению здоровых лиц (р< 0,05). К году после операции не различаются показатели минутного объема (5,83+0,52 л/мин и 5,11+0,55 л/мин. для 1 и II группы) и сердечного индекса (3,4+0,4 и 2,9+0,3 для 1 и II соответственно).

Показатели функии протеза по данным эхокардиографии и допплерометрии приведены в таблице N2.

Таблица N2.

Показатели функции Традиционных (ТБ) и модифицированных (МБ) биопротезов в митральной позиции (по данным ЭХО КГ)

Показа- ЭПО (см1) СДГ (мм рт. ст.) Слин. Соб. тели 6 мес 12 мес 6 мес 12 мес (м/сек) (мл/сек) группы_;_12мес_

1 гр. 2,01 1,99 4,82 4,21 1,66 1492

0,13 0,16 0,13 0,31 0,09 140

II гр. 1,85 2,09 4,91 3,66 1,66 1659

0,11 0,16 0,43 0,33 0,01 • 209

Примечание: верхняя цифра соответствует значению средней величины; нижняя-ее ошибке;ЭПО - эффективная площадь открытия биопротеза;Слин. и Соб.-линейная и объемная скорости кровотока.

Очевидно, что значения интегральных показателей функции биоклапанов той и другой модели не имеют значимых отличий. Отмечается лишь тенденция к несколько улучшенной пропускной способности МБ - величина объемной скорости через протез 1659+209 мл/сек против 1492+140 мл/сек для ТБ (р> 0,05).

При велозргометрической пробе у пациентов обех групп выявлены схожие тенденции к более экономному расходованию хронотропных ресурсов миокарда при приросте инотропных возможностей последнего. На этом фоне обнаружено достоверное снижение ЧСС в покое и при средней нагрузке 1,0 Вт/кг у больных II группы к году после операции в сравнении с пока-• зателями, полученными через два месяца после имплантации протеза (р< 0,05). У пациентов I и II групп отмечается достоверное увеличение толерантности к физической нагрузке через 12 месяцев после операции по сравнению с данными раннего послеоперационного периода (р< 0,05). Другие значения велоэргометрической пробы не имеют достоверных различий между пациентами сравниваемых групп.

Результаты биопротезирования оценены как хорошие в 92,4% случаев в 1 и в 94,2% - во II группе. Причинами плохих и посредственных результатов ( 6,4% - в 1 и 5,8% - во II группах соответственно) были специфические клапаннообус-ловленные осложнения. Актуарное отсутствие (с учетом выживаемости) специфических осложнений у больных с ТБ составило к 3 году 82,4% и не изменилось в сроки до шести лет после операции. Аналогичный показатель в группе больных с МБ составил к 3 году 92,6%. (рис.1 и 2).

90

80

V i \ А

1, Б

N * L

ЗГ 1 i

г В

Рис.1.

*

12 3 4 5 6 срок табл. (лет)

100%

90

8С

л-о-:—л

I

X

л-а

X

1

Рис. 2.

0 1 2 3 4 5 6 срок набл. (лет) Рис. 1 и 2. Актуарный анализ выживаемости и отсутствия специфических осложнений в; 1- группе больных с ТБ; 2- в группе с МБ. А- умершие больные; Б-выжившие с осложнениями; В-выжившие без осложнений.

Тромбоэмболические осложнения встретились в 3 случаях в I группе, в т. ч. в двух случаях - на первом году и в одном случае - на третьем году после операции. Во II группе тромбоэмболические эксцессы не зарегистрированы. С учетом эквивалентности исходного состояния пациентов I и II групп и того, что все больные с МБ пережили период наивысшего риска развития тромбоэмболий, можно предполагать, что отсутствие названных осложнений обусловлено более высокой тромборезистентностью МБ.

О

Бактериальный эндокардит протезов имел место в 2 случаях в I группе (в течение 1 года после операций), что составило 2,5% или 0,8% на больного ь год. В обоих случаях осложнение расценено как поздний эндокардит протеза. Оба осложнения привели к гибели больных. Во II группе имел место 1 случай эндокардита, развившийся через полтора месяца после операции. Осложнение расценено как ранний эндокардит, больной был реолерирован с имплантацией ему механического клапана. Во всех случаях были обнаружены массивные тромбо-вегетации на створках биопротезов. В I группе имелись признаки фиброкальциноза клапана как исхода инфекционного поражения протеза.

В I группе отмечено также развитие паравальвулярной фистулы вследствие технической ошибки при имплантации протеза, что повлекло за собой повторную операцию.

Случаев первичной дисфункции биопротезов не зарегистрировано ни в I, ни во II группах. С учетом молодого возраста пациентов II группы (более 2/3 больных оперированы в возрасте до 35 лет), отсутствие случаев первичной дисфункции в сроки до 3,5 лет после операции может быть расценено как благоприятный признак.

Таким образом, проведенный клинический разбор показал, что модифицированный способ "преимплантационной подготовки не оказывает негативного влияния на гидро- гемодинамическую функцию ксенобиопротезов при их имплантации в митральную позицию. МБ гемодинамичееки адекватны на всем протяжении исследуемого периода. Пациенты с МБ не имеют тромбоэмболи-ческих осложнений, ранних дисфункций, несмотря на повышенный риск их развития.

Это дает основания продолжать клиническое применение МБ у больных молодого возраста с высоким риском развития специфических осложнений. С другой стороны, очевидна потребность в совершенствовании способа консервации в целях повышения стабильности ткани и надежности протикальциевой и ат-ромбогенной зашиты биопротезов.

Теоретическое и экспериментальное обоснование нового

способа консервации ксенобиопрогезов клапанов сердца.

Выраженность и стабильность прогивокальциевого эффекта дифосфонатов (ДФ) зависит от структуры и, главное, от количества активного вещества, коваленгно иммобилизованного на ткани. Повышение степени модификации биоматериала ДФ - без снижения стабильности и ухудшения биомеханических свойств ткани представляется наиболее продуктивным и реальным подходом к совершенствованию способа предимплантационной подготовки ксенобиопротезов.

Количество иммобилизованной на ткани АОПДФК лимитировано, с одной стороны, числом альдегидных молекул, связанных с коллагеновой матрицей одной функциональной группой, а с другой - наличием в структуре АОПДФК единственной реакци-онноспособной аминогруппы. В результате,- возможность адекватного насыщения ткани ДФ при иммобилизации АОПДФК представляется проблематичной.

■Увеличение степени модификации ткани может быть достигнуто при иммобилизации на ткани полимерных соединений, синтезированных в НИХКиГ СО АН СССР ( к, х. н. И. С. Алферьев). Данные соединения представляют собой полизтиленимин или полиэтиленполиамин, модифицированные винилидендифосфоновой кислотой. Особенностью их структуры является сочетание реакционно-способных вторичных и первичных аминогрупп ( субстрат для фиксации вещества к коллагену) и дифосфозтильных остатков, выполняющих функцию противокальциевого барьера.

Иммобилизация дифосфонатсодержащего полимера (ДФСП) проведена по стадийной схеме после первональной стабилизации ткани в глутаровом альдегиде и папаинового протеолиза. Последний, теоритически, высвобождает дополнительные аминогруппы коллагеновой молекулы и улучшает условия для последующей направленной модификации ткани. Концентрация раствора ДФСП ( на базе полизтиленполиашна) - 0,8%, при этом по количеству дифосфоновых групп раствор соответствует 1,6% раствору АОПДФК.

Ковалентная иммобилизация ДЮП с помощью глутаральде-гида приводит к образованию интерполимерного комплекса кол-

лаген-ДФСП. Теоретически,названный комплекс обладает следующими принципиальными особенностями:

1) содержание большого количества рекционноспособных аминогрупп, что создает благоприятные условия для насыщения ткани биологически активными веществами, прежде всего, гепарином; целесообразность ионно-ковалентной иммобилизации гепарина не вызывает сомнений, в первую очередь, с позиций повышения громборезистентности биоткани;

2) высокая степень насыщения дифосфоновыми группами, реализующими противокальциевый эффект;

3) высокая стабильность и резистентность к ферментативному и механическому разрушению.

Экспериментальные исследования'были продиктованы приведенными положениями и включали-определение степени модификации ткани при иммобилизации ДФСП, структурной стабильности, физико-механических свойств , устойчивости биоматериала к кальцификации и тромбообразованию, гидродинамических параметров биопротезов, подготовленных по предлагаемой технологии.

Количество фиксированного на ткани Д2СП (в сравнении с АОПДФК) определяли с помбщью ыикрометода Бартледа (Кейтс,1978), а также методом эмиссионной сперктрофотомет-рии. Данные таблицы 3 показывают, что иммобилизация Д$СП обеспечивает максимальную степень модификации дифосфонатом.

Количество иммобилизованных дифоефонатов ( по содержанию общего фосфора) в створках ксеноклапанов.

Таблица 3.

Вид обработки

Кол-во Р (М+м) мкг/мг

1. Глутаральдегид

2. АОПДФК

3. ДФСП

С 24] [25] С 27]

1,51+0,11 14,76+1,94 25,68+2,25

Примечание: [ ] -число образцов 3>2 при р<0,001

3,2> I р<0,001

Изучение стабильности ткани включало определение аминокислотного состава и устойчивости ткани створок к действию коллагеназы.

Известно, что степень поперечной сшивки коллагена наиболее адекватно отражается в динамике содержания остатков лизина и гидроксилизина в ткани до и после консервации, поскольку именно е-аминогруппы названных аминокислот являются основным биохимическим субстратом для образования инт-ра- и ин^ермолекулярных связей в молекуле коллагена, индуцированных глутаровым альдегидом. В нативной ткани обнаруживают до 40-45 остатков лизина и гидроксилизина на 1000 остатков, а после консервации в глутаральдегиде это число снижается до 5-7 (йоХотЬ Б. е. а. ,1987). При этом доказано, что адекватная сшивка коллагена, являясь условием стабильности, детерминирует интенсивную минерализацию ксеноткани и серьезно ограничивает возможности ковалентной иммобилизации на ткани каких-либо соединений, в частности, ДФ.

Степень сшивки и устойчивоть к коллагеназному перевариванию определяли в трех группах образцов: 1-нативные; 2-обработанные глутаральдегидом;3-обработанные папаином и ДФСЕ

Аминокислотный анализ проведен на автоматическом аминокислотном анализаторе "СЬ 5001" фирмы "ВЮЬгомк" (ФРГ), сопряженном с компьютерным интегратором СИ ЗА "ЗЫтасЗги".

Установлено, что содержание остатков лизина и гидроксилизина в нативной ткани составляет соответственно 36,47+3,14 и 9,36+0,13 (в сумме около 46) на 1000 остатков. После консервации в глутаральдегиде происходит закономерное уменьшение этого количества до 5,2 / 1000 ( лизина - 3,85+0,33, гидроксилизина - 1,38+0,06). В образцах третьей группы обнаружены аналогичные значения, достоверно не отличающиеся от показателей второй группы (р>0,05). Очевидно, ферментативно-химическая обработка ксеноматериала не влечет негативных последствий в плане характера и плотности поперечной сшивки коллагена.

Известно, что фибриллярную основу ксеноткани створок составляет коллаген. В то же время, именно коллагеновая матрица является главной точкой приложения консервирующих агентов. Поэтому представляется обоснованным судить о сообщенной при консервации стабильности по результатам теста на устойчивость ткани к действию специфического фермента -коллагеназы.

В настоящей работе использована крабья коллагеназа (НПК "Камчатка"), активность которой по результатм предварительного определения составляла 32 ед. акт/мг. Резистентность к действию фермента оценивали по величине остаточного веса лиофилизированных створок после инкубации в растворе коллагеназы в течение суток ( в % к исходному весу).

Таблица 4.

Остаточный вес (в % к исходному) створок, подвергнутых воздействию коллагеназы, в зависимости от способа обработки.

способ Средний (М+ге) Средний (М+ш) % остат.

обработки начальный вес (мг) остат-ый вес (мг) веса

1 7,97+1,41 О О

2 15,59+2,13 12,08+1,51 77

3 16,34+1,84 16,19+1,78 99

В избранных условиях нативная ткань подвергается растворению без остатка (таблица 4). Консервация створок по традиционной схеме приводит к существенному повышению устойчивости к перевариванию коллагеназой, так что процент остаточного веса ткани во второй группе равен 77 Материал тертьей группы оказался, по сути дела, абсолютно резистентным к действию специфического фермента - 99% остаточного веса. Вероятно, формирование интерполимерного комплекса коллаген-ДФСП ставит коллагеназные молекулы в пространст-

венно и энергетически невыгодные условия, блокируя коллаге-нолизис. Полученные результаты, в сочетании с данными аминокислотного анализа, говорят о весьма высоком уровне стабильности ткани, обработанной ДФСЕ

Физико-механические испытания проведены на разрывной машине "Instron -1122". У каждого образца определяли: h-толщину и 1-исходную длину. Расчет показателей разрушающего напряжения при растяжении (3) и относительного удлинения (<?) производили по машинным диаграммам. Материалом для испытаний служили образцы, обработанные стандартно глутаровым альдегидом (1), подвергнутые папаиновой обработке и стабилизации, в глутаровом альдегиде (2) и дополнительно к 2 обработанные Д$СП (3).

Результаты испытаний показали, что образцы третьей группы по прочности почти вдвое превосходят традиционно подготовленный материал ( £-124,06+6,10 кг/см* против 62,35+3,39 в 1 группе при р<0,001) и имеют улучшенные упру-го-деформативные характеристики (6 - 57,55+1,59% против 41,51+1,881 в 1 группе при р<0,001).

Гидродинамические параметры изучены при стендовых испытаниях 9 ксенобиопротезов диаметром 32 мм в дубликаторе пульса. Установлено, что по основным показателям биопротезы, подготовленные с использованием папаинового протеолиза и иммобилизации ДФСП и гепарина (2), не отличаются от традиционно подготовленных биоклапанов (1). Так, величина обратного перетока за один цикл составила 7,0+0,4 мл и 8,0+0,3 мл для традиционных и предлагаемых биопротезов соответственно (р>0,05). Средний перепад давления и площадь открытия составили для 1 группы 3,8+0,3 мм рт. ст. и 4,17+0,3 см4, а для 2 - 4,0+0,3 мм рт. ст. и 3,96+0,35 см* соответственно ( для обоих показателей р>0,05).

Исследование противокальциевой эффективности нового способа предимплантационной подготовки проведено на классической модели ускоренной кальцификации при подкожной имплантации створок ксеноклапанов крысам (Levy R. J. ,1985).

Настоящий эксперимент воспроизведен на 60 молодых крысах самках линии Vistar весом 50-55г, которым в подкожную клетчатку были имплантированы образцы, подготовленные в соответствии с одним из ниже приведенных способов:!. Контрольная группа - обработка по стандартной схеме глутаровым альдегидом; 2. Дополнительно к 1 обработка папаином и иммобилизация АОПДФК. Материал этой группы служил добавочным контролем для оценки результатов в следующей серии; 3. Дополнительно к 1 обработка папаином и иммобилизация ДФСП; 4. Дополнительно к 3 иммобилизация гепарина/ Методика ион-но-ковалентной фиксации гепарина на ксеноткани разработана ранее (АС СССР N1614183).

Сроки подкожной имплантации составили 30, 60 и 90 суток. Эксплантированнный материал подвергали количественному анализу на содержание кальция (методом атомной абсорбционной спектроскопии) и морфологическому исследованию с помощью световой и электронной микроскопии. Всего изучено 240 образцов.

Как следует из данных таблицы 5, проградиентный рост содержания кальция отмечен в контрольной группе образцов.

Количество кальция в зксплангированных створгах ксенокла-панов в зависимости от способа обработки и продолжительности подкожной имплантации.

Таблица 5.

Группа

Количество кальция (Ш-п\),мкг/мг

30 сут.

60 сут.

90 сут.

1 2

3

4

125,75±9,56 8,68±1,65 8,29+1,16 17,41±4,17

199,64+7,33 56,28±6,35 22,84+2,27 38,50±4,51

261,62±16,34 71,81±8,28 25,31±3,05 41,7214,56

5( неимпл. створки)

1,61±0,04

1>2,3,4 р<0,001

1>2,3,4 р<0,001

2>3; р<0,01

2>3;р<0,05

Через 90 суток количество кальция превышает 260 мкг/мг, что представляет собой максимальный уровень минерализации, который обнаруживают в эксплантированных вследствие кальциноза биопротезах через 10-12 лет функционирования (Schoen F.J. ,1984).

В образцах второй группы уровень содержания кальция при всех сроках наблюдения достоверно ниже, чем в контроле. Однако, к 60 и 90 суткам количество депонированного кальция достигает 56 мкг/мг и 71 мкг/мг соответственно. F. J. Schoen е. а. ,1988, приводит критические значения накопления кальция для митральных биопротезов равные 37 мкг/мг. В этой связи приходится поставить под сомнение эффективность противо-кальциевого действия АОПДФК при длительных сроках имплантации и максимальной "нагрузке" кальцием. Возможно, сказывается недостаточная степень модификации ткани при иммобилизации АОПДФК.

В эксплантатах третьей группы даже при длительном наблюдении количество кальция более чем в 10 раз меньше, чем в контрольном материале. Причем, с увеличением срока имплантации от 60 до 90 суток вообще не отмечено достоверного эоста содержания кальция в створках данной группы (р>0,05).

Створки четвертой группы через два и три месяца наблю-?ения содержат в 6-7 раз меньше кальция, чем контрольные, и >ти значения лишь приближаются к упомянутому критическому гровню кальцификации. Иммобилизация гепарина 2б3,3±12,4мкг/мг), в целом, не нарушает прогивокальциевый -арьер,созданный ДФСП. В то же время, наличие столь значи-ельного количества гепарина , безусловно, скажется положи-ельно на тромборезиетентных свойствах ткани.

Данные количественного анализа подтверждены результа-ами морфологического исследования. В контрольной группе ри световой и электронной микроскопии обнаружены признаки регрессирующей дегенерации клеточных и фибриллярных зле-энтов ткани и их массивный кальциноз. В образцах третьей эуппы световая микроскопия даже при больших сроках имплан-

тации обнаруживает сохранную структуру ткани и отсутствие, очагов обызвествления. При ультраструктурном исследовании в створках обнаружены адсорбированные на коллагеновых фибриллах глобулы - очевидьо, молекулы ДФСП,-маскирующие участга коллагеновой молекулы с периодом вдоль оси 640 нм. Признаки деполимеризации глобул появляются через три месяца имплантации, что сопровождается явлениями фрагментации коллагеновых волокон. Аналогичная картина найдена в образцах четвертой группы. Створки второй группы занимает промежуточное положение по характеру деструктивных изменений и степени минерализации между контрольной и опытными группами.

Мощный противокальциевый эффект ДФСП обусловлен, по-видимому, сложным мультифакторным механизмом его действия. Последний включает блокирование полимерными молекулами участков коллагеновых фибрилл, способных нуклеировать кальций-фосфатные комплексы, антикальциевое действие дифосфо-натных групп и, возможно, торможение аккумуляции в ткани до полнительных центров кристаллизации - плазменных белков и липидов. Тем самым, иммобилизация ДФСП препятствует как "extrinsic", так и "intrinsic" кальцификации.

Для оценки влияния нового способа обработки на тромбо-резистентные свойства биоткани испльзована модель ex vivo. Количество тромботических масс на поверхности ткани, контактировавшей с кровью, служит показателем тромбогенносту исследуемого материала. В данном эксперименте материалок служили фрагменты большой подкожной вены человека, обработанные: 1) глутаральдегидом-контроль;2)дополнительно папаи-ном и ДЗСЛ; и 3) дополнительно к 2 гепарином.

Результаты эксперимента ex vivo показали, что при количестве иммобилизованного гепарина, равном 150,3 мкг/г количество тромботических масс на поверхности образцо; третьей группы составляет 14%, 25% и 30% от контрольных зн; чений через 9, 12 и 14 минут контакта с кровью соответст венно (рис. 3). В образцах второй группы аналогичные показ тели составили 25%, 22% и 60% соответственно. Получении

результаты свидетельствуют об улучшении гемосовместимых свойств биологического материала, подготовленного с применением ДФСП и гепарина.

1007» I

75

50

25 14 О

12

14

время контакта . , с кровью (мин).

Рис. 3. Количество тромботических масс в Ъ по отношению к контролю. 1-контроль; 2-обработка ДФСП; 3-обработка ДФСП и гепарином.

Комплекс проведенных исследований и экспериментов позволяет рекомендовать ксенобиопротезы, подготовленные путем стабилизации в глутаровом альдегиде, папаинового протеолиза и иммобилизации ДФСП и гепарина, к клинической апробации.

Выводы.

1. Ксенобиопротезы клапанов сердца , подготовленные по модифицированной схеме (стабилизация в глутаровом альдегиде, папаиновый протеолиз, иммобилизация З-амино-1-оксипро-пилидендифосфоновой кислоты и гепарина - МБ) являются адекватной альтернативой современным традиционным биопротезам (ТБ), обеспечивают высокое качество жизни пациентов.

2. МБ адекватно корригируют внутрисердечную гемодинамику при имплантации в митральную позицию. Эффективная гидравлическая площадь и среднедиастолический градиент для МБ

к году после операции составляют (по данным эхокардиогра-фии) 2,09±0,16 см и 3,66±0,33 мм рт. ст. , что достоверно не отличается от аналогичных показателей ТБ.

3. Имплантация МБ сопровождается низким риском летальности и развития специфических осложнений. В сроки до 3,5 лет после операции в группе больных с МБ не зарегистрировано летальных исходов. Отсутствие тромбозмболических осложнений в течение первого послеоперационного года обусловлено, вероятно, повышенной тромборезистентностью МБ вследствие иммобилизации на ткани гепарина. МБ могут быть рекомендованы для имплантации пациентам с повышенным риском каль-цификации и тромбозмболических осложнений.

4. Новый способ предимплантационной подготовки, включающий иммобилизацию дифосфонатсодержащего полимера (ДФСП), обеспечивает высокую стабильность, улучшенные биомеханические и функциональные параметры ксеноклапанов.

A. По данным аминокислотного анализа ткань содержит 4-5 остатков лизина и гидроксилизина на 1000 остатков аминокислот, что отражает высокую плотность поперечной сшивки коллагена

Б. В тесте с перевариванием коллагеназой остаточный вес створок составляет 99%, в то время как нативный материал растворяется полностью, а подготовленный стандартно - на 25%.

B. Механическая прочность ткани после иммобилизации Д2СП вдвое превосходит прочность контрольного' материала (р<0,001) имеет улучшенные упруго-деформативные свойства.

Г. По результатам стендовых испытаний гидродинамические параметры новых биопротезов соответствуют показателям традиционной модели.

5. В пролонгированном эксперименте in vivo ткань, обработанная ДФСП, содержит в десять раз меньше кальция (р<0,001), чем контрольные образцы (22-25 мкг/мг против 200-260 мкг/мг в контроле). • Дополнительная иммобилизация гепарина не нарушает противокальциевый барьер.

6. В эксперименте ex vivo количество тромботических

масс в материале, обработанном ДФСП и гепарином, составляет 14-30% от контрольного показателя, что доказывает повышенную тромборезистентность изученного биоматериала.

7. Предимплантационная подготовка ксенобиопротезов, включающая стабилизацию в глутаровом альдегиде, папаиновый протеолиз и иммобилизацию ДФСП и гепарина, обеспечивает комплексное повышение резистентности ксеноклапанов к важнейшим специфическим осложнениям, в т.ч. кальцификации и троьйообразованию, что позволяет рассчитывать на расширение показаний и улучшение отдаленных результатов биопротезирования клапанов сердца.

Практические рекомендации.

1. Ксенобиопротезы, подготовленные путем стабилизации в глутаральдегиде, обработки папаином и иммобилизации АОП-ДФК и гепарина, могут быть имплантированы пациентам с повышенным риском кальцификаци и тромбоэмболических .осложнений.

2. Современная технология предимплантационной подготовки ксенобиопротезов должна включать следующие основные этапы:

А. Стабилизация в 0,625% растворе глутарового альдегида по стандартизованной схеме.

К Обработка папаином в дозе 30 мг/г ткани.

К Иммобилизация полиэтилентполиамина, модифицированного винилидендифосфоновой кислотой (ДФСП) по стадийной зхеме. Концентрация раствора - 0,8%, рН=6,5, Т=20 С, „ро-цолжительность стадии 12 часов. Сшивка после каждой стадии стандартным раствором глутарового альдегида.

Г. Иммобилизация гепарина ионно-ковалентным путем. Для этого биопротезы инкубируют в растворе человеческого альбумина с концентрацией 3 г/л при Т=37 С, рН=3,4-3,9 в течение . часа, а затем - в растворе гепарина с концентрацией 100 !Д/мл, при рН=3,3-3,7 и Т=34 С в течение 1,5 часа.

Д. Стабилизация в стандартном растворе глутарового альдегида в течение не менее, чем 7 суток до имплантации.

3. Для контроля иммобилизации ДФОП рекомендуется опре-делеление содержания общего фосфора в ткани. Оптимальной является модификация до 20-25 мкг/мг.

4. Стабильность ткани следует оценивать по результатам исследования плотности поперечной сшивки коллагена ( по данным аминокислотного аналчза), устойчивости к действию специфического фермента - коллагеназы и физико-механических свойств ткани.

5. Резистентность к кьльцификации необходимо оценивать по результатам пролонгированного (сроки имплантации - 30, 60 и 90 суток) эксперимента на модели in vivo. При содержании кальция в контроле - 200-250 мкг/мг, количество кальция в исследуемой ткани не должно превышать 20-25 мкг/мг.

6. Для оценки повышения тромборезистентности ткани i результате предимплантационной подготовки следует использовать эксперимент на модели ex vivo.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. А. С. 1568961 (СССР) М.КЛ. А0Ш/02; А61Р2/24. Способ консервации клапанов и сосудов сердца для биопротезирования / Л. С. Барбараш, И. Ю. Журавлева, С. Е Новикова, А." И. Оф-фенгенден, Я. Л. Эльгудин. -..Опубл. 7. Об. 90. -Б. И. -И 21.

2. Новый способ консервации ксенобиопротезов клапанов сердца // В сб.: Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии. -Ч. 2. -Иркутск, 1988. - С. 34-36 ( со-авт. И. Ю. Журавлева, Б. К. Нехорошев, Л. С. Барбараш).

3. Гемодинамические параметры модифицированных биопротезов // В сб.: Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии. Ч. 1. -Иркутск, 1989. - С. 124 ( соавт. Л. С. Барбараш, И. Ю. Журавлева, Б. К Нехорошев).

4. Способ предимплантационной биохимическойобработки биопротезов клапанов сердца 7/ Тез. докл. IV Всесоюзной научной конференции "Кровоснабжение, метаболизм и функция органов при реконструктивных операциях".- Ереван,1989.-С. 383-384 (соавт. Л. С. Барбараш, И. Ю. Журавлева).

5. Новые подходы к созданию биопротезов клапанов сердца, резистентных к кальцификации // Тез. докл. Всесоюзной научной конференций "Прогресс в хирургии".-М, 1990.-С. 21-22.

6. Создание интерполимерных комплексов при консервации ксенобиопротезов // Тез. докл. 2-й Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы". - Рига,1989.- С. 350-353 (соавт. И. Ю. Журавлева, И. С. Алферьев, Л С. Барбараш).

7. Способ профилактики кальцификации ксенобиопротезов клапанов сердца // Тез. докл. Научно-практической конференции "Молодые ученые.Кузбасса - народному хозяйству". - Кемерово, 1990. - С. 26 (соавт. А. Н. Шапошников, А. Ю. Бураго).

8. Оценка гемодинамических параметров модифицированных биопротезов // Тез. докл. Научно-практической конференции "Молодые ученые Кузбасса - народному хозяйству". - Кемерово, 1990. - С. 41 (соавт. А. Н Шапошников, А.К1 Бураго).

9. Новые подходы к предимплантационной подготовке ксенобиопротезов клапанов сердца // Тез. докл. Всесоюзного се-

минара "Актуальные проблемы торакальной и сердечно-сосудистой хирургии". - М. ,1990. - С. 13-15 (соавт. А. Е Шапошников).

10. Современное состояние и перспективы развития проблемы биопротезирования клапанов сердцав Кемеровском кардио-хирургическом центре // Тез. докл. I Всесоюзного съезда сердечно-сосудистых хирургов. -М. ,1990. - С.409-410 (соавт. Л. С. Барбараш, Б. К. Нехорошев, К В. Попов, С. Г. Кокорин, А. Е Шапошников).

11. Клинико-экспериментальная оценка новых подходов к созданию ксенобиопротезов клапанов сердца // Тез. докл. I Всесоюзного съезда сердечно-сосудистых хирургов.- М. ,1990.-С. 416-417 (соавт. Л С. Барбараш, Б. К. Нехорошев, А. Е Шапошников, С. Г. Кокорин, А. Ю. Бураго, И. Ю. Журавлева, Б. А. Федоров).

12. Первый клинический опыт замены митрального клапана новыми моделями биопротезов клапанов сердца '// Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Экспериментальная ссердечно-сосудистая хирургия". - М.,1991.- С. 100-101 (соавт. Б. К. Нехорошев, А. Ю. Бураго, И. ¡0. Журавлева, С. Г. Кокорин, М. Ю. Огарков, А. Е Шапошников, X С. Барбараш).

13. Профилактика кальцификации биопротезов клапанов сердца на основе предимплантационной модификации ксеноткани // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия"_ М.,1991.- С.104-105 (соавт. А. Е Шапошников, А. Ю. Бураго, Л С. Барбараш, С. Е Новикова, Б. К. Нехорошев, А. К Петров, В. А. Багрянский, 3. Е Милованова, Г. М. Деркач).

14. Профилактика кальцификации биопротезов клапанов сердца путем иммобилизации дифосфонатов // Грудная хирургия. - 1988.- 4.- С. 38-42 (соавт. Л. С. Барбараш, И. Ю. Журавлева, И. С. Алферьев, И. Л. Котляревский, Е К Михалин, Б. К Нехорошев) .

15. Новый подход к созданию ксенобиопротезов клапанов сердца, резистентных к кальцификации // Грудная хирургия. -1989. - 5. - С. 25-30 (соавт. И. Ю. Журавлева, Е Б. Доброва, С. Е Новикова, Г. М. Деркач, Л. Д. Костерина, А. И. Оффенгенден,

Б. К Не хорошев, к С. Барбараш).

25

.16. 10-леткий опыт биопротезирования клапанов сердца. Современное состояние и перспективы развития // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. -1991. - В печати (соавт. Л. С. Барбараш, С. П. Новикова, Б. К. Нехорошее, Е К Попов, С. Г. Кокорин, А. Е Шапошников, А. Ю. Бураго, К Ю, Журавлева, Б. А. Федоров, И. С. Алферьев, А. К. Петров).

17. Профилактика специфических осложнений ксенобиопро-тезирования клапанов сердца // Тез. докл. Всероссийской научной хирургической конференции памяти проф. А. Т. Лидского. -Свердловск,1990. - С. 120-122 (соавт. А. Ю, Бураго, А. Е Шапошни-

ков).