Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Эпоксисоединения в консервации биологических протезов клапанов сердца (экспериментальное исследование)

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов

На правах рукописи УДК: 616.126.3+615.477.2:(615.011.41+547.91)

ШАПОШНИКОВ Александр Никифорович

ЭПОКСИСОЕДИНЕНИЯ В КОНСЕРВАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОТЕЗОВ КЛАПАНОВ СЕРДЦА

(экспериментальное исследование) 14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

/У».-, >

Работа выполнена * Кемеровском государственном медицинском институте и Кемеровском учебно-научно-производственном предприятии "Кардиология".

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Л.С, Барбараш,

доктор биологических наук С.П. Новикова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор А.И. Малашенков, доктор биологических наук, профессор В.И. Севастьянов.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Всероссийский научный центр хирургии АМН Российской

Федерации. __^

• » г—

Защита состоится * "^Ю " ¡((_1992 г. в /час, на заседании

Специализированного Ученого Совета Д.074.34.01. при Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов Минздрава Российской Федерации (123436, Мосхвз, ул. Щукинская, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Минздрава Российской Федерации

¡4

Автореферат разослан " / ( "_Л__1992 г.

Ученый Секретарь Специализированного Совета, Заслуженный деятель науки РСФСР,

доктор медицинских наук, профессор

А.А. ПИСАРЕВСКИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

( Актуальность работы. Основной причиной неудач при имплантации биологических протезов клапанов сердца является их отно- . сительная недолговечность. Первичная тканевая дегенерация и минерализация створчатого аппарата биопротезов развиваются у 25-40% взрослых больных в течение первых 7-10 лет после опера-ции.У детей и лиц молодого возраста подобное состояние" возникает уже в первые 3-5 лег не менее чем в 50-®>?& случаев (Бар-- "'-бараш Л.С, 1986; БсЬоеп РХ ел, 1987). -

Экспериментальные и клинические исследования на протяжении последнего десятилетия показывают, что решающим фактором в сохранении структурной стабильности протезов'является способ их консервации. Среди многочисленных консервирующих средств наиболее эффективно используемым оказался глютаровый альдегид (ГА). Данный химический агент максимально отвечал требованиям, выдвигаемым к консерванту биологических тканей. Это были -обеспечение стерильности, сохранение основных механических свойств ткани (прочности и эластичности), профилактика иммунных реакций, защита имплантата от врастания клеток реципиента, предупреждение отдаленной тканевой дегенерации. Однако, добившись максимальной структурной стабильности биоткани, безусловно отдаляющей развитие тканевой дегенерации, исследователи столкнулись с проблемой хальциноза, вызванного именно глюта-ральдешдом (Сагрепйег А. е.а, 1969; Со1отЪ Э. ед, 1987).

На сегодня не ясны окончательные механизмы первичной кальцификации обработанной ГА биоткани, но необходимость в получении протезов, устойчивых к данному патологическому процессу заставляет вести интенсивные поиски в решении згой проблемы. Согласно современным представлениям о возможных путях подавления калыргаоза предпочтение отдается воздействию на факторы имплантата, а именно модификации самого биопротеза различными химическими соединениями, способными задерживать развитие кальцификации. Используются дифосфонаты, гликозаминогликаны, поверхностно-активные вещества. Последние сообщения говорят о перспективном использовании в качестве ингибиторов минерализации дифосфонатходержащих полимеров. Однако, полностью блокировать процессы минерализации такими способами модификации биоткани не удается. В то же время, способность самого _ГА провоцировать кальциноз, а также сложность и многостадииносгь практически всех известных вариантов модификаций ГА-обработан-ных протезов приводит к необходимости поиска комплексного решения проблемы, в том числе и замены традиционного консерванта

- глютаральдегада на новый сшивающий агент (Ыо^п С ел,1987)

Актуальность настоящей работы определяется тем, что она направлена на поиск оптимального, пути замены традиционного консерванта глютаральдегада на новый сшивающий агент из класса зпоксисоединений, с сохранением всех положительных свойств, присущих глютаральдегидному воздействию на биоткань, и предупреждением основных специфических осложнений биопротезирования

- кальцификации, тромбообразования.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - обоснование и разработка способа консервации биопротезов клапанов сердца эпоксисоединением, с обеспечением структурной стабильности биоткани и приданием биоклапанам устойчивости к каль-цификации, тромбообразованию.

В соответствии с поставленной целью основные задачи диссертации следующие:

- обоснование необходимости замены традиционного консерванта биологических тканей - глютаральдегида и выбор нового сшивающего агента;

- обоснование и разработка оптимальных параметров способа. консервации биоткани с использованием эпоксисоединения и его стандартизация;

- оценка эффективности структурной стабилизации биоткани ксеноклапанов под влиянием эпокси соединения;

' - оценка в сравнительном аспекте кальций-связывающей и . тромбогенной активности биоткани, обработанной эпоксисоединением;

- изучение прочностных и функциональных характеристик биопротезов, обработанных эпоксисоединением, а также оценка его стерилизующей, иммуногенной и токсикологической активности.

Научная новизна. Впервые обоснован, разработан и стандартизирован способ консервации одним из представителей класса эпоксисоедииений - диглицидиловым эфиром этиленгликоля (приоритетная справка по заявке на изобретение N 4880039/14 (108086) от 05.11.1990 г.).

Впервые показана необходимая и достаточная структурная стабильность биоткани, обработанной эпоксисоединением. Разработаны режимы обработки и метод комплексной оценки структурной стабильности.

Впервые показаны прочностные свойства биоткани створок протезов клапанов сердца, обработанных эпоксисоединением.

Впервые экспериментально доказана продолжительная эффективность консервации эпоксисоединением в отношении устойчивости биоткани к капьцификации.

Впервые установлена возможность повышения тромборезис-тентных свойств биоткани, обработанной диэпоксисоединением с последующей ковалентаой фиксацией гепарина..

Практическая значимость. Экспериментально доказано влияние нового сшивающего агента из класса эпоксисоединений (ЭПС) на повышение устойчивости ксенобиопротезов клапанов сердца к кальцификации, тромбообразованию. Применение ЭПС позволило осуществить эффективное связывание гепарина и упростить технологию обработки биоткани, сведя к минимуму количество стадий модификации. Разработаны оптимальные параметры обработки биоматериала ЭПС с сохранением положительных качеств, присущих

- з -

биоткани, консервированной глютаровым альдегидом. Показана возможность полной" замены традиционного консерванта - глюта-ральдегида на сшивающий агент из класса эпоксисоединений.

Разработанный способ консервации внедрен в лаборатории биопротезированшг клапанов сердца и сосудов Кемеровского учеб-но-научно-проговодственного предприятия "Кардиология". Результаты, полученные при изучении проблемы замены консерванта, ис-. пользуются в Кемеровском кардиохирургяческом центре для создания аллогенных сосудистых протезов малого диаметра для аорто-коронарного шунтирования.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на региональной научно-практической конференции "Молодые ученые Кузбасса - народному хозяйству" (Кемерово, 1990); 1 Всесоюзном съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 1990); Всесоюзном семинаре " Актуальные проблемы торакальной и сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 1990); 1 Всесоюзном симпозиуме "Экспериментальная сердечно-сосудистая хирургия (Суздаль, 1991); обьединенной конференции кафедры хирургических болезней N 1 Кемеровского медицинского института, областной клинической больницы N 1 и УНПП "Кардиология" (Кемерово, 1991).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, получено 2 положительных решения по заявкам на изобретения, 3 рацпредложения.

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, _результатов и обсуждений экспериментальной части, состоящей из двух глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

Во введении обоснована актуальность темы, поставлена цель и сформулированы задачи исследования.

В обзоре литературы дан анализ опубликованных работ отечественных и зарубежных авторов по проблеме использования биологических протезов в клинической практике. Приведена структура основных специфических осложнений биопротезирования клапанов сердца. Сделаны выводы о провоцирующей роли глюта-ральдегида в отношении минерализации имплантированных биопротезов. Показано малоэффективное влияние на кальцификацию различных вариантов противокальциевой обработки биопротезов, консервированных глютаровым альдегидом. Сделаны выводы о необходимости полной замены традиционного консерванта на новый сшивающий агент.

В разделе 'Материалы и методы" обоснованы и разработаны параметры обработки биоматериала даппщидаяогым эфиром эта-ленгликоля (диэ.чоксид, ДЭ). Приведены методы комплексной оценки структурной стабильности биоткани, а также экспериментального изучения биологических эффектов нового способа консервации в сравнении с контрольным (традиционным способом обработки глютаральдегидом, ГА). Приводится детальный анализ

каждого этапа экспериментального изучения биоматериала (забор, подготовка образцов, консервация, выбор оптимальных экспериментальных условий).

В разделе "Обсуждение результатов комплексной оценки структурной стабильности биоткани, обработанной диэпоксидом" приведены результаты фюико-химических, морфологических и физико-механических исследований. На основании полного аминокислотного анализа биоткани, исследований коллагеназного воздействия, прочностных и морфологических характеристик сделан вывод об эффективности ДЭ как нового сшивающего агента.

В разделе "Экспериментальное изучение кальций-связывающей и тромбогенной активности биоматериала, консервированного в диэпоксиде" приведены результаты, полученные на модели ускоренной кальцификации при подкожной имплантации крысам, а также изучен вопрос гемосовмесгимости биоматериала, обработанного ДЭ с использованием модели "ex vivo".

Исследованы функциональные гидродинамические параметры новых биопротезов клаланов сердца, консервированных в диэпоксиде. Показана эффективная стерилизующая активность консерванта при выбранных режимах обработки. Приведены сведения об иммунологической и токсикологической экспертизе новых протезов.

"Разделы "Заключение", "Выводы", "Практические рекомендации" построены по общепринятому принципу, в каждом из них отражены сведения, полученные в ходе выполнения работы.

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 5 таблиц, список литературы из 70 наименований отечественных и 141 зарубежных работ.

Содержание работы.

Материалы и методы.

1. Обьекгы исследования.

При изучении влияния эпоксисоедошения на биоматериал использовали некоронарные и левые коронарные створки аортальных комплексов свиней, применяемых при изготовлении биологических протезов клапанов сердца.

Настоящая работа построена по принципу сравнительной оценки биоматериала, консервированного новым сшивающим агентом со стандартно (0,625% ГА) отработанной тканью клапанов, а также с натавным биоматериалом при изучении аминокислотного состава и определении устойчивости к коллагеназному перевариванию.

Створки ксеноклапанов не позднее 3-4 часов с момента забора у донора помещали в консервирующие растворы. В качестве контрольного способа обработки использовали стандартную консервацию в 0,625% растворе глютарового альдегида, при рН 7,4 (фосфатный буфер). Биоткань консервировали в течение 28 суток с 3-х кратной сменой раствора на % 3 и 7 сутки от начала обработки при 20*С в защищенном от света месте.

В качестве исследуемого использован водный раствор дигли-цидилового эфира эшленглихоля при рН 7,4 (фосфатный буфер).

Изучено консервирующее влияние трех различных концентраций (1%, 2% и 5%). Консервация проводилась в статическом режиме без смен растворов. Максимальная продолжительность консервации составила 21 сутки при 20*С в светонепроницаемых контейнерах.

2. Методы исследования структурной стабильности консервированного материала.

Использован прямой метод оценки расходования первичных аминогрупп лизина и гидроксилизина с помощью аминокислотного анализа. Сравнивали остаточное количество "неизрасходованных" на образование поперечных связей первичных аминогрупп указанных кислот в консервированной разными сшивающими агентами биоткани. Исследовано исходное содержание указанных аминокислот в нативном биоматериале.

Изучены пять серий биоматериала, включая нативный, обработанный 0,625% ГА и три опытные серии, соответственно обработанные 1%, 2% и 5% диэпоксидом. Исследовано 52 образца.

Полный амино-кисяотный анализ проведен по методике, принятой Всесоюзным НИИ Молекулярной биалопш СО АН СССР с использованием автоматического аминокислотного анализатора "СЬ 5001" фирмы "Вюй-ошк" (ФРГ), с компьютерной обработкой на комплексе С11 ЗА "ЪЫтадш" (Япония).

Данные АА оценивали в сочетании с результатами определения устойчивости к коллагеназному перевариванию, проведенному в Институте биоорганической химии СО АН СССР. На предварительном этапе установлена активность используемого фермента - коллагеназы, приготовленной из печени краба (НПО "Камчатка"). Она составила 32 едакт/мг.

Устойчивость к воздействию коллагеназой определяли по изменению веса створки после инкубации в растворе коллагеназы по сравнению с исходным весом. Лиофилизированные взвешенные створки заливали соответствующим количеством фермента и выдерживали в течение 24 часов, при 37 С, в шейкере. Продолжительность инкубации выбрана с учетом 100% растворения нативной биоткани. Исследовано 50 образцов.

Картина структурной стабилизации была подтверждена результатами прочностных характеристик консервированного биоматериала при одноосно-продольном растяжении однотипно приготовленных образцов на разрывной машине "1ш1гоп-1122". Исследование осуществлено в НПО "Экран" ВНИИИМТ МЗ СССР. Запись диаграмм "усиление-перемещение" проводили в масштабе 2:1 с расчетом ^следующих показателей:

о = РгаахгЗ, где & - разрушающее напряжение при растяжении (кг/см2).

Ртах- разрушающая нагрузка (кг).

Б - площадь поперечного сечения образца (см*).

Изучены четыре серии биоматериала: обработанного 0,625% ГА, 1%, 1% и 5% ДЭ. Всего исследовано 118 образцов. •

Морфологическое исследование биоткани, обработанной ДЭ.

В качестве контроля адекватности выбранных условий обработки использовали морфологическую оценку бяоматериала клала-

нов. С помощью световой, электронной трансмиссионной и сканирующей микроскопии исследованы 56 створок, обработанных стандартно ГА, а также 1%, 2% и 5% ДЭ.

Проведено ИК-спектроскопическое исследование биоткани, консервированной в ДЭ с целью контроля раскрытия эпоксигрупп нового консерванта при завершении взаимодействия с биотканью. Исследовано 18 образцов створок, обработанных 2% и 5% ДЭ без и с дополнительной обработкой гепарином. Анализ проведен на ли о-фильно высушенных образцах, измельченных и запресованных с калия бромидом в виде таблеток на приборе "Specora 70ML". Всего исследовано 12 образцов.

3. Изучение устойчивости биоматериала к кальцификации. В настоящем исследовании использована модель ускоренной кальцификации при подкожной имплантации биоматериала крысам (Levy RJ. е.а„ 1983).

Время, необходимое для достижения половины максимальной минерализации в работе с крысами составляет 21 сутки. Ранее показано, что у молодых животных кальцинсо имплантатов протекает интенсивнее, поэтому в настоящем исследовании использованы крысы-самки 2-3 недельного возраста, линии Vistar. Эксперимент проведен на 120 животных весом 50-55 г. Животные были разделены на 3 группы соответ&енно срокам наблюдения, которые составили 30, 60 и 90 суток. Каждому животному в асептических условиях под эфирным наркозом из отдельных разрезов длиной 1 см вдоль позвоночника формировали четыре подкожных кармана, в каждый из которых в строгай последовательности имплантировали контрольный и опытные образцы (1%, 2% и 5% ДЭ), приготовленные в виде секторов створок размером 1x1x1 см. Всего имплантировано 480 образцов.

С целью изучения влияния гепаринизации на процессы каль-цингоа в эксперимент была включена серия образцов, исходно обработанных 2% ДЭ с последующей иммобилизацией гепарина. После имплантации образцов раны были ушиты атравматичесхим шовным материалом с последующей обработкой медицинским клеем. На протяжении всего периода наблюдения за животными не было отмечено ни одного случая нагноения рая. По окончании соответствующего срока наблюдения животных забивали сверхдозой эфира с последующей эксплантацией створок. Извлеченный материал до исследования хранили в 0,625% ТА. Весь материал был разделен на две части, одна из которых была использована для биохимического анализа на содержание кальция, а вторая часть - для морфологической оценки изменений ткани в процессе имплантации, включая изучение кальциноза.

В настоящей работе использован метод атомной абсорбцион- -ной спектрофсггометрии для количественной оценки содержания кальция в биоткани клапанов. Образцы отмывали от остатков ГА в течение 3 часов с 5-ти кратной сменой дистиллированной воды, высушивали при 55* С в течение 12 часов до постоянного веса. Каждый образец взвешивали и помещали в пробирку с добавлением 0,5 мл концентрированной хлорной кислоты. Затем пробу минерализовали в песочной бане при температуре 250-280"С до полного

обесцвечивания раствора, наступавшего через 30-35 минут. После этого пробу разводили бидистиллированной водой до 15 мл ( до получения концентрации кальция в пределах калибровочного графика, построенного от 0 до 50 мкг/мл). Определение проводили на атомно-абсорбционном спектроскопе AAS-1 (ГДР) при следующих режимах: длина волны 422,7 нм; щель 0,10 мм; фотгалектродный умножитель 60-65 мА; ток лампы 70 мА; постоянная времени 1,0; расход воздуха 420 л/час; расход ацетилена 72 л/час; усиление 1; чувствительность 4; Для устранения негативного влияния фосфат-ионов на количественное определение кальция в пробы добавляли этилендиаминотетрауксусную кислоту (трилон Б).

По результатам спектроскопии расчет количественного содержания кальция в пробе проводили в соответствии с калибровочной кривой по формуле: С=Спр х Vnp : m, где

С - относительное содержание кальция (мкг) на 1 мг сухого веса биоткани;

Спр - содержание кальция в 1 мл пробы (мкг/мл),. полученное по калибровочной кривой;

Vnp - обьем пробы (мл) (в случае, если показания прибора . не укладывались в калибровочную кривую, готовили дополнительное разведение пробы с последующим пересчетом.

Методом атомно-абсорбционной спектроскопии исследовали 303 образца. Статистическую обработку проводили с помощью прикладного статпакета "Microstat" на компьютере IBM PC/AT. Рассчитывали значения средней арифметической ряда (М), ошибки средней (ш), критерия Сгъюдента (t).

В настоящем исследовании впервые для изучения процессов минерализации стандартно и ДЭ обработанной ткани применен также метод эмиссионном спектрофотомеггрии. Этот метод позволяет комплексно оценить содержание нескольких элементов, содержащихся в одном образце и фотодокумеитировать результаты исследования. Для этого навески биоткани в 20 мг высушивали до постоянного веса, затем подвергали озолению в дуге электрического разряда и осуществляли запись спектрограмм на эмиссионном спектрографе ПГС-2 (ГДР). Количественное определение кальция по интенсивности полученных спектральных линий (длина еолны 317,9 нм) осуществляли с помощью микрофотометра МФ-4. Исследовано 95 образцов.

4. Изучение тромборезистентных свойств биоткани.

Одной из наиболее информативных моделей для оценки тром-богенных свойств является тест с пристеночным тромбообразова-нием в эксперименте "ex vivo" при контакте материала с кровью без добавления антикоагулянтов и гемосгабилизаторов. Метод разработан з Лаборатории медицинских полимеров Института сердечно-сосудистой хкрурпш им. АЛ. Бакулева АМН СССР и рекомендован Комитетом по новой технике МЗ СССР в качестве одного из методов контроля гемосовиесгимосш материалов.

В названном тесте имитируются условия функционирования,

максимально приближенные к реальным. Количество тромботических масс, осевших на поверхности материала после контакта с кровью служит показателем степени тромбогенносги исследуемого образца. Метод основан на сравнительной оценке количества тромботических масс через определенные временные интервалы контакта с кровью. В виду отсутствия адекватной модели для изучения ех vivo створчатого аппарата клапанов сердца на основании максимально приближенного по биохимическим и морфологическим признакам структуры поверхности сосудистого биоматериала (JIM. Слуц- • кий, 1969; A AL Хильхин и'др, 1976; ВВ. Серов и др., 1981; W.W. Angelí ел., 1974) мы посчитали целесообразным изучение тромбогенной активности последнего с последующей возможной экстраполяцией данных на прогнозирование поведения замыкатель-ного элемента биопропгезов клапанов сердца.

Сосудистые фрагменты готовили следующим образом. Трупные (в сроки до б часов) большие подкожные вены немедленно помещали в холодный стерильный физраствор, тщательно отвязывали притоки, удаляли жировую ткань. Отмытые в физрастворе вены помещали в стандартный раствор глютарового альдегида - контрольная серия и в растворы диэпоксида 2% и 5% концентраций - опытные серии. Половину опьтшых образцов дополнительно обрабатывали гепарином из расчета 100 ед/мл при рН 7,4; 20*С, экспозиция 3 часа. После обработки проведено количественное определение иммобилизованного гепарина. Для этого образцы тщательно отмывали дистиллированной водой от неприсоединившегося гепарина в течение б часов с 5-ти кратной сменой воды при постоянном помешивании в шейкере. Затем, с использованием толуидинового синего фотоколориме-грически на спектрофотометре СФ-26 проводили количественное определение гепарина. Исследовано 23 образца.

В эксперименте "ex vivo" применены сосудистые фрагменты длиной 5 см и внутренним диаметром 3-4 мм. В опыте использовано по ■ 9 образцов каждой серии (всего 45 образцов) с применением трех устройств для испытания трех партий исследуемых групп образцов, которые подключали к животному последовательно на разное время. Эксперимент выполнен на беспородной собаке весом 12 кг. После перфузии систему с образцами промывали стерильным физраствором, образцы снимали и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса, затем взвешивали на аналитических весах. Данные регистрировали как значения кшёчнбгсГвёса" с наличием тромбомасс. Затем образцы тщательно . отмывали от тромбомасс, высушивали при тех же условиях и определяли исходный вес образцов. Относительное увеличение веса опытных образцов по сравнению с увеличением веса контрольных образцов вычисляли по формуле:

А =(Ро-Ро'):(Рк-Рк')х100%, где

А - отношение веса тромбомасс в опыте по сравнению с контролем (%).

Ро и Ро* - вес опытных образцов до и после контакта с кровью, соответственно, (г).

Рк и Рк' - исходный и конечные веса контрольных образцов

5. Исследование основных гидродинамических параметров биопротезов, обработанных диэпоксидом.

В зависимости от способа консервации, вида последующих модификаций с антикальцифицирующей или тромборезистентной обработкой, может изменяться функционирование запирательного элемента ксенобиопротеза. Эта изменения зависят от протекающих п биоткани структурных трансформаций, происходящих под влиянием обработки.

С целью комплексной оценки влияния предлагаемого способа консервации на биопрогез, проведено изучение гидродинамических характеристик в стендовых условиях. Испытаны 9 ксенобиопроте-зов клапанов, консервированных в 5% ДЭ с дополнительной обработкой гепарином. Для стандартизации условий исследования использованы биопротезы с одинаковым диаметром посадочного кольца 32 мм. Проводилось сравнение с биопротезамк, обработанными стандартно 0,625% ГА. (б биопротезов).

Испытания проводили на стенде с пульсирующим потокам (пульс-душшкаторе) в соответствии с требованиями ГОСТа по исследованию искусственных клапанов сердца. Использованы следующие режимы: п - частота циклов 70 в 1 минуту. Ро - давление в "предсердии" - 10 им рт.сг. Pv - давление в "желудочке" - 120 мм рт.ст. Т - длительность "систолы" - 0Д5 с. Определяли ударный объем (Ууд) - характеристика пропускной способности биопротеза; средний граднент давления на протезе (дРср); обь-ем обратного перетока па 1 удар (Vo6p). Показатели эффективной пгдравлической площади открытия клапана рассчитывали по формуле: ЭПО = Мо': лРср, где "" , "

Мо - минутный обьем (л/мин) дРср- средний граднент давления на протезе (мм рт.сг.).

Рассчитывали также относительные показатели: соотношение обьема обратного перетока к ударному обьему (1) и отношение эффективной гидравлической площади к анатомической площади биопротеза (2).

(1) Vo6p : Ууд х 100%; (2) ЭПО : Банат х 100%.

6. Метод контроля стерильности консервирующих растворов дтопохсида.

С целью определения стерилизующей активности консервирующих растворов дшглицидилового эфира этилеягликоля кспользован метод посева консерванта. Забор проб осуществляли каждые трое суток в течение всего периода консервации (21 сутки), а затем каждый месяц при хранении консервированного биоматериала. В качестве питательной среды для выявления аэробной флоры попользован кроЕявой агар, для анаэробной флоры - тиогликолевзя среда. По окончании срока консервации биопротезы заливали свежей порцией консерванта с целью окончательной стерилизации и хранения. Концентрация новой порции ДЭ соответствовала таковой, примененной на этапе консервации. Т.е., биопротез, консервированный в 1% ДЭ заливали новой порцией консерванта такой

же концентрации и тл Хранение Оиопротезов осуществляли в герметичных светонепроницаемых контейнерах при 20* С в сухом месте. ----

7. Токсикологические и иммунологические испытания биопротезов, консервированных в дюпоксиде.

Для токсикологической и иммунологической оценки во ВНИИ испытательной и медицинской техники МЗ СССР были подготовлены шесть биопротсзов, обработанных по предлагаемой методике с использованием 5% раствора диглицидилового эфира этиленгликоля и гепарина. Методика испытаний утверждена Комитетом по новой технике МЗ СССР и предложена в качестве определяющей при внедрении в клиническую практику обьектоз медицинского назначения.

В вытяжках, приготовленных из биологической части протезов, определяли наличие окисляющих и бромирующих веществ, а также сенсибилизирующее и иммтногенное влияние на организм экспериментальных животных. Исследовано б биопротезов клапанов сердца.______

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ , СТАБИЛЬНОСТИ БИОТКАНИ, ОБРАБОТАННОЙ ДЭС.

1. Результаты аминокислотного анализа.

Известно, что материальным субстратом для образования ин-тра- и интермслекулярных связей при обработке бифункциональным сшивающим агентом служат ЫН2-группы лизина и гидроксилизина. В нативной биоткани обнаруживаются до 40-45 остатков указанных аминокислот на 1000 всех аминокислот. После консервации в глю-таровом альдегиде используются около 90% первичных аминогрупп, а число остатков снижается до 5-8. В таблице 1 указано среднее содержание всех исследованных аминокислот в расчете на 1000 аминокислотных остатков.

Таблица 1.

Относительное содержание аминокислот в створках ксенобиопроте-зов клапанов сердца на 1000 аминокислотных остатков (М±ш). АА I 0--1 2 3 '4

ТРИ

СЕР

ГЛУ

оПРО

ПРО

ГЛИ

АЛА

ВАЛ

МЕТ

ИЛЕ

ЛЕЙ

ТИР

ФЕН

ГИС

оЛИЗ

ЛИЗ

АСП

АРГ

28.76 ±2.47 14830+2.59 9752±3.38 49.98±2.91 149.0±5.70 1515±13.8 110.4+6.991 46.49±2.41 13.00+1.03 25.62+2.07 48.04+2.94 14.49+252 24.05±130 14.13+139 9361±0.13 36.47±3.14 69.77+1.45 62.96+1.75

3057 ±129 148.42±2.18 1025±320 4Ш±3.62 145.4+850 161.7±12.8 119.7+550 5051 ±7.04 1324+126 27.72+128 50.82+1.93 14.б4±1.66 25.18+2.06 18.44 ±0.98 1378±0.06 &848±033 7251+0.82| 63.72+1.93

2825 ±135 47.17 ±1.86 9756 ±353 51.78±3.67 1492 ±14.6 155.9 ±132 1202+112 49.18+2.99 5397±056 27.47 ±1.77 48.0б±155 13.15+1.47 23.16 ±1.07 19.19+1.92 7.126+0.88 26.64+157 69.44±1.69 163.82+152

2856+1.70 47.62 ±3.02 96.48±5.10 5537 ±836 151.4 ±17.9 157.1±19.0 121.6 ±15.4 50.60+4.01 4.026+059 2524+1.43 48.15 ±230 9299 ±131 2427±159 3350 ±1.94 4.787 ±026 7.644+0.61 69.80±238 6439+2.14

28.41+1.14 4822±2.44 98.07±2.45 54.88±331 157.8±926 156.6+8.76 122.8+10.8 48.48 ±335 4.013+0.82 24.76 ±124 4758±1.76 4.401±051 2421±121 3734±2.98 2.653 ±0.63 1.752+025 71.03+2.04 66.88+1.67

- и -

Примечание: 0 - натавная ткань, 1 - биоткань, консервированная 0,625% ппотаральдегидом, 2 - обработка 1% диэпоксидом, 3 - обработка 2% диэпоксидом, 4 - обработка 5% диэпоксидом.

Содержание свободных лгоиновых и гидроксилизиновых остатков в нативной ткани составило соответственно 36,47+3.14 и 936 ±0,13 (в сумме 45,83/1000 АА). Стандартная обработка биоткани ппотаральдегидом обеспечила падение свободных остатков этих кислот до 3,85 и 1,38 соответственно. Для удобства сравнения приводится сумма остатков (5,2/1000 АА). Достоверное снижение на 90% (р <0,001) остатков аминокислот, содержащих ре-акционноспособные аминогруппы, используемые на образование поперечных связей отражает высокую плотность поперечной сшивки, индуцированной ппотаральдегидом. Достоверных различий в аминокислотном составе по другим аминокислотам между нативной и ГА-обработанной тканью нет, хотя прослеживается тенденция к увеличению остатков гистидина в обработанном биоматериале.

Приведенные в таблице 1 данные в отношении биоткани, консервированной в диэпоксиде разных концентраций интересны не только в сравнении с ГА обработкой, но и между собой. Так биоткань, консервированная в 1% ДЭ показала снижение остатков лизина и гвдроксилизина на 26% (34 против 46 в нативной ткани). Это доказывает то, что предположения об аналогичном глютаральдегаду механизме взаимодействия с коллагеновой матрицей (по первичным аминогруппам) состоятельны. Однако, содержание неиспользованных остатков (34/1000 АА) не позволяет говорить о том, что достигнута максимальная степень сшивки. Таким образом, с точки зрения структурной стабильности использование 1% концентрации неправомерно.

Обработка 2% ДЭ позволила осуществить конверсию 76% свободных первичных аминогрупп лизина и гидроксилизина. Однако, этого также недостаточно фи сравнении с ГА обработкой.

Наиболее оптимальной концентрацией, с точки зрения, аминокислотного анализа, следует считать 5% ДЭ, тле. в этом случае отмечено снижение остатков указанных кислот на 92% и которое достоверно не отличается от такового при использовании ГА. Однако, окончательную оценку можно дать после обсуждения результатов всего комплекса исследований.

В отношении состава других аминокислот отмечен ряд достоверных изменений в содержании метионина, тирозина, гистидина. Детальный анализ этих данных представляет интерес для выяснения механизма биологического воздействия дюпоксида, и, вероятно, позволит определиться с новыми звеньями структурирующего воздействия на биоткань нового консерванта.

2. Результаты исследования устойчивости биотаани створок ксеноклапанов к воздействию коллагеназой.

Данные определения процентного соотношения остаточного веса к исходному приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Остаточный вес створок (в % к исходному после воздействия коллагеназой (М+ш).

способ обработки

исходный вес, мг, 1

7.УУ ±1.41 15.59 ±2.13 16.10 ±2.09 14.95 ±1.97 15.40+2.10

остаточный вес, мг, -2

соотношение 2/1, %

-о—

77.40 ±330 59.40+320 63.60 ±3.10 7320+3.70

0 1 2

3

4

О

12.08+151 926+1.47 951+152 1127 ±Ш

Примечание: и, 1, А 3, 4 - см. примечание таблицы 1. N = 10 во всех группах.

Из таблицы видно, что исследование проведено при условиях полного растворения натавной биоткани. Именно этот факт позволяет рассматривать действие опивающего агента в достаточно изолированном виде. В данном исследовании критерием степени устойчивости к коллагеназному воздействию явился остаточный вес контрольных образцов, равный 77%. Достоверных различий с контролем не выявлено при изучении биоткани, консервированной в 5% ДЭ (остаточный вес 73%). Очевидно, что процессы коллаге-нолиза идут в равной степени как в ГА-обработанной биоткани, так и в ткани, стабилизированной 5% ДЭ. Вероятно, образованные поперечные связи под влиянием ДЭ возникают с участием тех же звеньев макромолекул биоткани что и при воздействии глютараль-дегада. Хотя, сами реакции химических превращений альдегидной и эпоксигрупп могут различаться.

Таким образом, результаты аминокислотного анализа и исследования устойчивости к коллагеназному перевариванию свидетельствуют о высоком уровне стабильности биоткани, достигнутом под воздействием ДЭ, в частности, 5% концентрации, не уступающем глготаральдещдной обработке.

3. Прочностные свойства биоткани ксеноклапанов после обработки диэпоксидом.

Важным требованием к способу консервации является сохранение тканью основных механических свойств (прочности и гибкости). Полученные в результате испытании данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Влияние способа консервации на прочность хсеногенной ткани створчатого аппарата биопрогезов (М+т).

спосоо обработки Ь, толщина, см разрушающее на ряженке, кг/см2 п-1 относительное удлинение, %

1 ..... 2 3 4 0 0.Ц47±и.ШЗ"" 0.046 ±0.002 0.044+0.003 0.045+0.003 0.045+0.002 623о±ЗЗУ..... 59.12+4.80 61.15+520 7224±5.15 355 * 4151+1.88 49.60+2.12 47.12+2.40 4525 ±3.11 нет данных

Примечание: О, 1, 2, 3, 4 - см. примечание таблицы 1. * - данные РЛ. БсЬоеп еа, 1986.

Анализ результатов позволил выявить следующее: толщина створок после ДЭ обработки достоверно не изменяется. Обработка 1% и 2% ДЭ обработка позволяет упрочнить биоткань до уровня, достоверно не отличающегося от ГА обработки, а фиксация в 5% ДЭ повышает этот показатель в 1,15 раза (р<0,01). Эта данные в совокупности с результатами аминокислотного анализа и исследования устойчивости к коллагеназному перевариванию позволяют заключить, что ДЭ обработка (5% концентрация) обеспечивает адекватное структурирование биоткани, не уступающее глютараль-дегидной обработке.

4. Результаты ИК-спектроскопического исследования биоткани створок, консервированных в диэпоксиде с дополнительной обработкой гепарином показали, что в ткани отсутствуют пики нераскрывшихся эпоксидных колец в зоне 920-905 обратных см, причем это касается и зон цис- и трансмодификаций дизпоксида.

5. Морфологическая оценка неимплантированного биоматериала, обработанного диэпоксидом.

Гистологическое исследование показало, что коллагеновые волокна как в контрольных (ГА-обработанных образцах, так и в биоткани, консервированной в диэпоксиде всех исследуемых концентраций сохраняют пучковую структуру и фуксинофильное окрашивание. Деление на слои отчетливо, коллагеновые волокна фиброзного слоя расположены компактно, извиты. Фиброциты мелкие, единичные. Эластические волокна расположены рыхло, местами фрагменгированы. Окраска по фон Косса не выявила присутсвия солей кальция и позволила составить исходное представление при дальнейшем изучении морфологии имплантированных на различные сроки образцов.

При электронномикроскопическом трансмиссионном исследовании обнаружено, что консервация как в глюгаровом альдегиде, так и в 2% и 5% ДЭ хорошо сохраняет поперечную исчерченностъ коллагеновых фибрилл. Последние располагаются параллельно друг другу, формируя плотные пучки. 1% концентрация ДЭ не обеспечила необходимого структурирования коллагена. Последний местами фрагментирован.

Электронная сканирующая микроскопия выявила качественные различия в* поверхности контрольных и обработанных ДЭ образцов как без, так и с дополнительной гепаринизацией. Максимальное сглаживание поверхности отмечено на образцах, обработанных 5% ДЭ с гепаринизацией. Возможно, это произошло за счет заполнения естественных неровностей поверхности биоткани гепарином. Выявляются также качественные различия между контрольными образцами и обработанными 5% ДЭ без дополнительной иммобилизации гепарина. В последних степень сглаживания несколько уступает серии с гепаринизацией.

Экспериментальное изучение кальций-связывающей и тромбо-

геннои активности биоматериала, консервированного диэпоксидом.

Проведенное количественное определение содержания кальция свидетельствует об уникальной противохальциевой активности ДЭ обработки. Результаты определения представлены в таблице 4.

. - 14 -Таблица 4.

Среднее содержание кальция в эксплантированных створках ксеноклапанов, консервированных разными сшивающими агентами

Способ обработки [а] 30 суток

Количество кальция (М±т) мкг/мг

[п] 60 суток [п] 90 суток

1. 0,625% ГА 120

2. 1% ДЭ 3; 2% ДЭ '

4. 5% ДЭ

5. 2% ДЭ + гепарин

126,7 ±9^6 22.71 +-2.43 1.64+023 1.22 ±0.08

тщпг

71.14 ±635 1.72+0.12 152 ±0.08

265.6 ±27.4

105.7 ±13.6 1.95 ±0.10 1.55±0.08

[15] 1.85±0.09 [15] 1.88 ±0.14 [15] 1.90±0.09 б. неимплант. биоткань [20] 134±0.07

Достоверность 1 >2,3,4д6 при р <0,001 по всем срокам

различий 2 >3,4^,6 при р <0,001 наблюдения

Приведенные в таблице результаты показывают, что максимальный рост кальциезых отложений наблюдается в контрольной серии образцов. Уже через месяц имплантации количество кальция достигает )25.7мкг/мг, а через 90 суток - 265.6 мкг/мг. Последняя цифра представляет собой максимальное содержание кальция, обнаруживаемое в удаленных по причине кальцификации и дисфункции биопротезах, функционировавших в организме больного.

Массивная кальцификации в эксперименте отражает невыгодные условия, в которых находятся створки в организме быстро растущей крысы. Таким образом, удается воспроизвести влияние и такого важного факторы, провоцирующего хальциноз как молодой возраст реципиента.

Фиксация биоматериала в 1% ДЭ обеспечила достоверно более низкие значения среднего содержания кальция на всех сроках наблюдения. Через месяц после имплантации биоткань створок содержала в 5,7 раза меньше кальция по сравнению с контролем! увеличением срока наблюдения это различие снижается до 2,7 раза на 60 сутки имплантации, а через три месяца до 2,46 раза. То есть, отмечается проградиентный рост кальцификации в этой опытной серки. Динамика отражена на рисунке 1.

мкг/мг, Са 1

250

1ЯГ сутки Рис.1 Динамика роста кальция в биоткани, обработанной вазными сшивающими агентами.

Примечание: 1.2Д4Д6 - см. табл. 4

Обработка биоткани 1% ДЭ оказывается недостаточной для эффективной противокальциевой защиты.

Динамика кальций-связывающей активности биоткани, обработанной более высокими концентрациями ДЭ (2% и 5%) показывает, что уровень кальция в образцах биоткани соответствует "метаболическому", существующему в неимшгантированной ткани (1,5-2,0 мкг/мг). С увеличением срока наблюдения уровень кальция не увеличивается. Эти данные примечательны еще и тем, что биоткань, обработанная ДЭ не подвергалась дополнительным целенаправленным модификациям противокальциевыми препаратами, например, дифосфонатами, считающимися наиболее перспективными в настоящее время. Дополнительная обработка гепарином с целью повышения тромборезисгентности также не приводит к накоплению солей кальция, т.е. не снижает противокальциевый эффект, достигнутый при обработке ДЭ.

Данные количественного атомно-абсорционного определения кальция подтверждены результатами эмиссионной спектро1рафии, а также данными морфологического исследования. Так, в контрольной серии при световой микроскопии выявлены признаки деструктивных изменений коллатеновой основы в виде нарушения структуры и дифференцировки слоев. Определяются диффузные и узловые кальциевые депозиты с распространением на все слои. Эти явления неуклонно нарастают с увеличением срока наблюдения. При электронной микроскопии обнаружены признаки прогрессирующей дегенерации клеточных элементов и фибриллярной основы, с краевым лизисом и резорбцией коллагеновых структур под воздействием тучных клеток, моноцитов, макрофагов реципиента. Кристаллический кальций расположен между пучками коллагеновых волокон, адсорбирован на них, а также выявляется внутриклеточно и перицеллю-лярно. В образцах серии с 1% ДЭ обработкой обнаруживаются аналогичные, хотя значительно менее выраженные повреждения ткани. Максимальные изменения отмечены после 90 суток имплантации. Единичные кристаллы кальция при электронной микроскопии ассоциированы с атрофированными клеточными элементами и самими коллагеновыми структурами. Фибриллы теряют поперечную исчер-ченность, присутствуют очаш распада и люиса волокон.

Морфологическая картина образцов, обработанных 2% и 5% ДЭ отличается друг от друга в пользу последней. При всех сроках наблюдения обнаружен распад эластических волокон, аналогичный картине в неимплантированных образцах этих же серий. Сохраняется дифференцировка слоев створок. Структура коллагеновой основы не повреждена при всех сроках имплантации. Кальциевые депозиты не выявляются. Электронномикроскопическая картина соответствует таковой в неимплактированном материале.

Для оценки влияния нового способа обработки на тромборе-зисгентные свойства биоткани проведены испытания с использованием обработанных сосудистых сегментов в контакте с кровью ех vivo. Результаты динамики пристеночного тромбообразования

пред 100,

»едставяены на рис. 2. 001% ___

1

25-

0

Рис2. Количество тромботических масс на биоткани в % по отношению к массе тромбов на контрольных образцах (0,625% ГА).

Примечание: 1 - масса тромбов на контрольных образцах, принятая за 100%. 2 - масса тромбов в сериях с 2% и 5% ДЭ обработкой. 3 - масса тромбов в сериях с 2% и 5% ДЭ обработкой и с дополнительной иммобилизацией гепарина в количестве 280+18 мкг/г и 302+ 22 мкг/г, соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о меньшей, достоверно отличимой тромбогенной активности биоматериала, обработанного диэпоксидом, и о возможности углубления и пролонгирования эффекта при помощи дополнительной гепаринизации.

По совокупности проведенных биологических экспериментов можно заключил., что использование нового альтернативного глю-таральдешду консерванта из класса эпоксисоединений обеспечивает гораздо большую биосовмесгимосгь ткани, используемой при изготовлении биологических протезов клапанов сердца и сосудов по сравнению с традиционной консервацией в ГА.

Эти положительные результаты дополнены данными стендовых испытаний протезов. Так, величина обратного перетока, на протезе с ДЭ обработкой в 137 раза ниже (р<0,05) по сравнению с контрольными. Отмечено более выгодное соотношение обратного перетока к ударному объему, что характеризует большую пропускную способность новых протезов, а показатель отношения ЭПО к Банат у новых протезов на 12% выше. Таким образом, можно заключить, что по основным параметрам гидродинамики новые протезы не уступают традиционным моделям, а по некоторым достоверно их превосходят, что позволяет надеяться на адекватное функционирование в организме реципиента.

В результате проведенного исследования стерильности консервирующих растворов дитлицидилового эфира эткленгликоля показано, что на этапах консервации, т.е. в срохи до 21 суток, а также в период хранения биопрогезов не отмечено роста микрофлоры при использовании 2% и 5% ДЭ. Это позволяет считать, что использование 2% ДЭ достаточно при хранении консервщгаван-ных протезов.

В результате проведения токсикологических и иммунологических испытаний показано, что по признаку нетоксичносга и низкой иммунологической активности биопротезы, обработанные 5% ДЭ и гепарином могут бьгть использованы в кардиохирургии.

Таким образом, биопротезы клапанов сердца,, обработанные новым сшивающим агентом из класса эпоксисоединений пригодны

для клинического использования с перспективой расширения показаний к биологическому протезированию, в частности, у молодых пациентов и больных с повышенным риском тромбообразования и минерализации.

ВЫВОДЫ.

1. На основе анализа собственных и литературных данных обоснован, разработан и экспериментально подтвержден новый эффективный способ консервации биопротезов клапанов сердца, ин-гибирующий склонность к кальцификации и тромбообразованию.

2. В эксперименте на животных показано, что использование нового сшивающего агента - диглицидилового эфира эгаленгликоля позволило максимально снизить степень кальцификации до метаболического уровня (1,5-2,0 мкг/мг), что значительно ниже, чем

при традиционном способе обработки 0,625% ГА.

3 А. Физико-химическими, физико-механическими и морфологическими исследованиями установлено, что разработанный способ консервации биопротезов клапанов сердца новым сшивающим агентом обеспечивает структурную стабильность биоткани, не уступающую таковой при использовании традиционного консерванта -глютарового альдегида.

- - Б. Достоверные различия в аминокислотном составе консервированной биоткани по метионину, тирозину и гистидину позволяют говорить о дополнительных звеньях структурирующего воздействия на биоткань нового сшивающего агента в сравнении с воздействием традиционного консерванта.

4. Доказано, что использование диэпоксисоединения повышает тромборезисгентносгь биоткани с углублением и пролонгированием эффекта при непосредственном связывании гепарина без применения промежуточных активирующих веществ, что значительно упрощает технологию гепаринизации.

5. Новый способ консервации обеспечивает более высокие прочностные характеристики и надежные гидродинамические параметры по сравнению с традиционным способом.

6. Токсикологические и иммунологические испытания положительно оценивают новые биопротезы клапанов сердца и позволяют использование их в клиническои практике по признаку нетоксич-носги и низкой иммунологической активности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1 Биопротезы клапанов сердца, консервированные диэпокси-соединением могут быть рекомендованы для клинической апробации при замене пораженных клапанов сердца у больных с повышенным риском кальцингоа и тромбообразования.

2. Для необходимой структурной стабильности биоткани ксе-ноклапанов рекомендуется 5% концентрация диглицидилового эфира этиленгликоля при следующих режимах обработки: фосфатный буфер с рН среды 7,4, приготовленный на 0,9% водном растворе хлорида натрия. Температура 20 С, продолжительность инкубации 21 сутки.

3. С целью стерилизации м хранения рекомендуется использование 2% диэпоксида, приготовленного на фосфатном буфере с рН 7,4 и 0,9% хлоридом натрия. Хранение осуществлять при комнатной температуре в защищенном от света месте.

4. Для повышения тромборезистентных свойств ДЭ-обработан-ной биоткани рекомендуется использование гепарина при следующих режимах обработки: концентрация гепарина 100 ед/мя, рН 7,4 при температуре 20 С, время экспозиции 3 часа. Для гарантированной стерильности последующее хранение биоматериала осущесг-. влять в 2% ДЭ не менее 7 суток до имплантации.

5. Консервацию клапанов в диэпоксиде и обработку гепарином, а также последующее хранение необходимо проводить в специальных' контейнерах с соотношением веса биоклапана и раствора не менее 1:15.

6. Для комплексной оценки структурной стабильности биоматериала, консервированного сшивающим агентом необходимо и достаточно проведение амино-кислотного анализа, исследования устойчивости к коллагеназному перевариванию, гаучения прочностных характеристик консервированного биоматериала.

7. Резистентность к минерализации и тромборезисгентные свойства биоматериала рекомендуется изучать на моделях подкожной имплантации с максимальным сроком наблюдения до 90 суток и модели "ex vivo" на сосудистом материале с использованием па-ракорпорального шунта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Пути профилактики хальцификации биопротезов клапанов сердца // ■ Бюлл. эксп.биолл1ед.-1988.-12.-С.732-734 (соавт.

Л.С. Барбараш, И.Ю. Журавлева, ЕШ. Медведева).

2. Первичная тканевая дегенерация (ПТД) биопротезов митрального клапана сердца // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургаи.-ЧЛ.-Иркутск, Í989.-C.44 (соавт.

Б.К. Нехорошев, Л.С. Барбараш, А.Ю. Бураго).

3. Отдаленные результата биопротезирования митрального клапана сердца // Проблемы кардиохирургии в связи с динамизмом пороков сердца.-Новосибирск, 1989.-С.127-129 (соавт. Б.К. Нехорошее, JI.C. Барбараш).

4. Способы профилактики кальцификации ксенобиопротезов клапанов сердца //Тез. докл. Научно-практической конференции "Молодые ученые Кузбасса - народному хазяйству".-Кемеро-во,1990.-С2б (соавт. ЯЛ. Эльгудин, А.Ю. Бураго).

5. Оценка гемодинамических параметров модифицированных биопрогезов // Тезлокл. Научно-практической конференции "Молодые ученые Кузбасса - народному хшяйсгву".-Кемерово, 1990.-С.41 (соавт. ЯЛ. Эльгудин, А.Ю. Бураго).

6. К вопросу о необходимости предимплантационной защиты _ биопротезов от инфекционной агрессии // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии.-Ч.1.-Иркутск, 1990.-С. 180-181 (соавт. Б.К. Нехорошев, ЯЛ. Эльгудин, БА. Федоров).

7. Непосредственные гемодинамические результаты протезирования митрального клапана биопротезами с противокальдиевой обработкой // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургаи.-Ч^.-Иркутск, 1990.-С34-35 (соавт. ЯЛ. Эльгудин, БХ Нехорошев, АЮ. Бураго).

8. Оценка структуры потока жидкости в полости левого желудочка при использовании дисхово-откидного протеза митрального клапана сердца // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирурши.-Ч^.-Иркутск, Í990.-C35-36 (соавт.

Б.К. Нехорошев, Н.Б. Кузьмина, JI.C. Барбараш).

9. Профилактика специфических осложнений ксенобиопротези-рования клапанов сердца //Тез. докл. Всероссийской научной хирургической конференции памяти проф. А.ТЛидского.-Свердловск, 1990.-С120-122 (соавт. AJO. Бураго, ЯЛ. Эльгудин).

10. Новые подходы к предимплантационной подготовке ксено-биопрогезов клапанов сердца //Тез.докл. Всесоюзного семинара "Актуальные проблемы торакальной и сердечно-сосудистой хирур-гии".-М, 1990.-С.13-15 (соавт. ЯЛ. Эльгудин).

11. Современное состояние и перспективы развития проблемы биопротезирования клапанов сердца в Кемеровском кардиохирурш-ческом центре //Тез .докл. 1 Всесоюзного сьезда сердечно-сосудистых хиртогов.-М-Д990.-С.409-410 (соавт. Л.С. Барбараш, Б.К. Нехорошев, ВБ. Попов, СТ. Кокорин, ЯЛ. Эльгудин).

12. Клинико-экспериментальная оценка новых подходов к созданию ксенобиопротезов клапанов сердца //Тезлокл. 1 Всесоюзного съезда сердечно-сосудистых хирургов.-М, 1990.- С.416-417 (соавт. Л.С. Барбараш, Б.К. Нехорошее, СГ. Кокорин, AJO. Бураго, И.Ю. Журавлева, БА. Федоров, ЯЛ. Эльгудин).

13. Первый клинический опыт замены митрального клапана новыми моделями биопротезов клапанов сердца //Тезлокл. Всесоюзного симпозиума "Экспериментальная сердечно-сосудистая хируо-гия".-МД991.-С.100-101 (соавг. БЗС. Нехорошев, AJO. Бураго,

И.Ю. Журавлева, ЯЛ. Эльгудин, СТ. Кокорин. М.Ю. Огарков, Л.С. Барбараш).

14. Профилактика кальцификации биопротезов клапанов сердца на основе предимплантационной модификации ксеноткани //Тез. докл. Всесоюзного симпозиума 'Экспериментальная сердечно-сосудистая хиртогия".-М,1991.-С.104-305 (соавт. AJO. Бураго, ЯЛ. Эльгудин, КС. Барбараш, СЛ. Новикова, Б.К. Нехорошев, AJK. Петров, ВА. Багрянский, 3JX Милованова, ГМ. Деркач).

15. 10-летний опыт биопротезирования клапанов сердца. Современное состояние и перспективы развития //Грудная и сердечно -сосудистая хирургия.-1991.-7.-С. 21-2S (соавт. Л.С. Барбараш,

CIL Новикова, BJC. Нехорошев, BJB. Попов, СТ. Кокорин, ЯЛ. Эльгудин, AJO. Бураго, И.Ю. Журавлева, БА. Федоров, И.С. Ал-ферьев, А.К. Петров).

16. Полож.решение на авторское свидетельство СССР N 4753282, 1989, Способ изготовления протеза клапана сердца" (соавт. Л.С Барбараш, БХ Нехорошев, Т.Н. Исаева).

17. Рацлредложение КГМИ N 1510, 1986, "Способ подкожной имплантации створок сердечных клапанов свиньи, кроликам для изучения капьциноза створок в эксперименте" (соавт. ШО.Жу-равлева, С.С Ким). '

- 18. Рацлредложение КГМИ N 1511, 1986, "Применение комп-лексона в эксперименте для профилактики кальцинооа биопротезов сердечных клапанов" (соавтЛю. Журавлева, ВМДулая, АЛ Фирсов).

19. Рацлредложение КГМИ N 1512, 1986, "Инструмент для подкожной имплантации створок сердечных клапанов в "эксперименте" (соавт. ШО. Журавлева, ВМ. Цомая).