Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Новые методы лабораторной диагностики атопической бронхиальной астмы

VI и 12

РОССИЙСКАЯ АКАДВШ МедИЦИНСКИХ НАУК ОРДШ ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАИВНК ИНСТИТУТ „ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ НДДИЦИШ

На правах рукописи

НОВЫЕ МЕТОДЫ 1АБ0РАТ0РН03 ДИАГНОСТИКИ АТОНИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТНН

14.00.36 - аллергология к кмыунодогм

Автореферат ' двесвргацта на соноканиэ учёной степена кандидата модвцинакнх наук

ДОЦЕНКО Эдуард Анатольевич

Саякт-Петербург - 1992

Работа выполнена в Витебском ордена Дружбы народов- к&-дицннском институте на кафедре клинической иммунологии и аллергологии.

Научный руководитель: доктор медицинских наук» профессор ¿»К. НОВИКОВ

Официальные оппоненты;

доктор медицинских наук; профессор И.С. ЙРЕЙДЛИН доктор медицинских наук, профессор Г.Б. ФЕДОСЕЕВ

Ведущее учреждение2-ой""Московский медицинский институт им. Н.И. Пирогрва.

Защита диссертации состоится " 1ЭЭ2 г.

на заседании специализированного совета Д 001.23.02 при научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (1»/622, г. Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЗМ РАМН.

Автореферат разослан » /¿- » ¿¿¿¿^¿¿'¿¿-^ 1з92 г.

Учёный секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

1.А. БУРОВА

i

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность темы. Для специфичэскоа диагностики атопкчес-схоа бронхиальной астмы (АБА) применяет комплекс методов, направленных на выявление аллергена или группа аллергенов, вызывавяих заболеззние у больного. Одним из зтанзз азлерголсгаческого обследования являвтея лабораторные тесты, которые позволяет расаи^ро-вать этиопатогенетичеекп е механизмы заболевания. Обследование vitro инеет ряд прекмуцветв перед методами VLVO (Моакезич B.C., Назаров A.A., I9d9; Федосеев Г.Б., Хлопотоза Г.il., I9od; Фрадкин В.А., 1975; SigaAn. С. , 19о9; %ггД /. , 1983).

По мнении экспертов Американской академии Аллергии и Иммунологии {¡n-ritro .... I9S7) наиболее перспективными для лабораторной диагностики АБА является оценка пула сенсибилизированных лимфзцитоз (РБТ!) и такаю изучение езободноциркулируваах йгЕ (Международный ..., 1965; Новиков Д.К.. 1990; Дыцкиа З.И. с coast., 1990; Ha^Leien Я. 0-. , I9ÖJ).

Индукция БТ1 в присутствии» аллергена служит доказательством ямозвегсся ранее контакта о ш. Считает (Каюурик А.Х., Зайце-каусюйте P.J., I96o; Gurte. 6-. , 1968; HsLeA £.-/f. et aZ., I9S7), что при пвловоа аллергии БТ1 на специфический аллерген по-аыгакз; у здоровых подобного феномена не паблвдали. Другие авторы С И. Hzivorsien. с£ а£. , 1966) на обнаруаили достоверного поза-аения бластов. .

Причини таких противоречий в тон, что синтез ДНК л пролиферация - конечный розультат действия ряда факторов, которые во многой зависят от сроков культивирования (1анг Н.Р., 1971; L&£of*-..., 1983). Техническая сложность БТ1 не позволяет вироко троводкть оценку сенсибилизации лимфоцитов.

Персязктязао изучение ранаах амизационинх маркеров; их по-[влекао продяеотзуот сснтэзу ДНК и определяет последупщие процес-ш превраа-нкя клетки s лгмфоблает. К числу таких маркеров отно-1ятся ргцапторы к Ш2. Для определения лимфоцитов, наоуяих рацап-■оры s '¿12 оптимальным является, метод, оснозашшй на-спецвфичес-:ся связывания меченого KI2, поскольку позволяет выявлять не ан-'йговвдэ структура, а функционально полноценный рецептор, способна связывать Ш (Черодэоэ А.Н.,. Еовальчук Л.В., IS69; tyCetse-nt XU et a£\ , I9ö7; fi-ista. M.E. e£ a£. , иьо).

Клиническая картина при АН определяется наличием б сыворотке крови реагиновых ИгЕ-антител, которые изучают методами радиоиммуиоэссея и энзимшшуноэссек. Последний по многим соображениям предпочтительней, хотя чувствительность его ниже Сдэавтиев Б.Б., Осипова А.Г., 1957; Покровский В.И. с соавтв,

Полагает, что высокий уровень аллергенспецкфических ИгЕ имеется я 93-96$ случаев заболевания АБА С бгш-ип VаЯ., Мал^осМ Е. {£ о£. , 1УоЙ; (кге&ъиШг- Е. о£. . . 1УЬ5). Б то же время К.Л. Голыаева с соавт., 1У6Э обнаружили аллергенспецифические антитела только у Ы% обследованных больных АБА.

Иммуиоферментный анализ для определения аллергекспецифичес-ких антител требует дальнейпой разработки сЛо/сс...., 1965

Перспективным представляется использование в качестве маркерного энзима фермента, который обладает лучсшмй биологическими и коммерческими свойствами по сравнении с традиционными маркерами - пенициллиназы и применение техники "двойного сэндвича" с обоим антивидовым коньвгатом.

Учитывая "двойственней" характер аллергической реакции, ее клеточный и гуморальный компоненты, цальо работы была разработю комбинации тестов» выявдявних сенсибилизацию лимфоцитов к аллергену н аллергенопецкфнческих ИгЕ-антител у больных АБА. Для достижения указанной цели необходимо, решить следующие задачи:

1) разработать диагностику»» возводящий характеризовать лимфо циты, несущие рецепторы к

'¿) оценить клиническое значение обнаружения активированных лимфоцитов в периферической крови, & также в культуре лимфоцитов, стимулированных митогенамн в аллергенами;

3) разработать юшуноферментнув тест-систему для определения ал аергенспецифических ИгЕ на основе пенициллиназы, изучить специфичность и чувствительность системы;

4) выяснить возможность использования комбинации этих двух тестов для диагностики АЕА.

Положения, выносимые на защиту I,) Разработанный метод определения лимфоцитов, несущих рецептор к И12 позволяет выявлять их как в периферической крови, так и после стимуляции культуры лимфоцитов митогенаки и аллергенами.

2) Специфическая активация лимфоцитов аллергеном домавней пыли, оцениваемая по экспрессии ¿ПНР обнаруживается у 83,42 больных атонической бронхиальной астиок, сенсибилизированных к алльрге!

Новый вариант ИФА тест-систзми на основе пвнициллиназы позволяет выявить аллергенспецифические ИгБ-антитела у 91% больных АБА, сенсибилизированных к аллергену домашней пыли. 4) При комбинированном применении разработанных кетодов секси-сибилнзааия к аллергену домашней пыли подтверждается у 97,6^ больных атонической бронхиальной астмой с гиперчувствительностьв к аллергену.

Научная новизна Впервые разработаны диагностику^ для определения активированных лимфоцитов, несущих рецепторы к ИЛ2 и разработана техника ускоренной оценки РБТЛ при воздействии как митогенов, так и аллергенов. Показано высокое клиническое значение определения такой активации дикфоцитов в диагностике АБА. Впервые разработан новый вариант имнукоферментной тест-системы для определения Игй, специфических к аллергену домаяней пыли, с использованием фермента пе-иицилдииаза, которая обладает более эффективными коммерческими и биологическими свойствами. Установлено, что применение комбинации 2-х методов - индукция ИЛ-2?-позитквных лимфоцитов аллергеном до-каиней пыли и выявление аллергекспецифаческих ИгВ - позволяет более эффективно д::агносцироЕать АБА в сравнении с другими методами.

Практическая ценность

1. Разработан метод определения лимфоцитов, несущих рецепторы к интзрлейкину 2. Индукция ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов под влиянием аллергена дог таеЯ пыли может использоваться в качестве лабораторного, теста для изучения специфической сенсибилизации у больных АЕА. ,

2. 7ровень л®!фоцигоз, экспрессирувзнх рецепторы к ЙЛ2 в- периферической крози и культуре, стимулированной митогенаии может слупить для характеристики иммунного статуса.

3. Предлагается новый вариант иммучоферментной тест-системы для определения специфичных к аллергену дояапней пыли ЙгЕ антител.

Комбинированное применение двух методов рекомендуется для оценки клеточной и гуморальной сенсибилизации к аллергену докавней пыли у больных АБА.

Вналреиио полученных результатов Разработанный диагностику!» для определения ликдоцитоз, несущих рецепторы г ЯЗ-2 признается для оценки уровня активированных лимфоцитов в периферической крови как одного из показателей иммунного статуса и в культуре их. у1Ь~о под влиянием патогенов и алдаргзиез з оедегонаяя гсразззтзчгского и хирургического срара-

А-ей Витебской областной клинической больницы, кафедрах неонатоло-гии 5>УВ и урологии донецкого медицинского института, клинико-диагностической лаборатории Донецкой областной клинической больницы, центральной научно-исследовательской лаборатории БелГКУВ. Разработанная шжуноферкентная. тест-система определения аллергекспецн-фических ¿1гЕ применяется а ал лергологическом отделеьии Витебской областной ¡ушинческой больница.

Совместно с проф. Нсвикоэым ¿.К., асс. Колосовой Т.С., Сты соновым Н.м. издана информационная справка РО-ь'ш МЗ БССР "Принципы лабораторной диагностики аллергических заболеваний", 19Э1; Минск. Получено авторское свидетельство £ 1607574 на изобретение "Способ выявления..лимфоцитов периферической крови, несущих рецепторы к интерлейкику-2" (в соавторстве с Д.К. Новиковым) и утверждены И рационализаторских предложения.

.Материалы работы докладывались на Республиканских и Бсесосэ-ных конференциях, используются в учебном процессе кафедры клинической аллергологии Витебского медицинского института.

Апробация работы Материалы работы доложены и обсуждены на Пленуме правления Белорусского научного общества кнмунологов, Витебск, 1УЬо г.; на Всесопзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунологии", Москва, КсУ г.; на пленуме правления Всесовзного общества имиунологов "Экология и аллергий", Витебск, 19Ь9 г.; ва Всесовзной научней конференции "еакторы клеточного в гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях", Челябинск, аУЬЭ г.; на I Якнуцологическои съезде Белоруссии, Линек, 1990 г.; на Международном симпозиума "Регуляция и клиническое значение иммуноглобулина £".

Основные полоазная диссертации изложены в 9 работах, получено авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации Работа выполнена в соответствии с научным планом НИР "Разработка методов диагностики, оценки активности и кммунокоррекции при вторичных иммуноДецкфитах и аллергических заболеваниях", номер госрегистрааии 01. Ь6 ОЭОЭ '¿46. Вклвчает введение, обзор литераторы, главу "материалы и методы", три главы собственных исследований, обсувденив полученных результатов, выводы, список литературы, состоящий из 79 отечественных и 167 зарубежных источников. Текст изложен на 160 страницах; имеется 21 таблица, 1е

рИОуНКОВ.

Материал и методы

Гфи разработка эритроцитаряого диагностикума использованы варианта связывания рИ12 с частицами с покоив хлористого хрома, в присутствии свободного глвтарового альдегида и метода пассивной сорбции субстрата на предварительно активированные глстаро-вш альдегидом эритроцита (Д.К. Новиков, В.И. Новикова', 1979). Аффиннуо очистку антител против иммуноглобулинов барана, реакция встречной икмуноди^фузии, диск-электрофорез проводили как описано (Туркова 3., 1939; Иммунологические ..... 1989). Синтез конь-сгата антитеха-пгннциллиназа проводили одностадианым глвтараль-дегидным способом С J Avr-ctsntcLS . 1969). Техника №А: твердой фазе, сенсибилизированной аллергеном домавней пыли добавляли сыворотку больного, затем антятэла барана против иммуноглобулинов В человека и^затем коньвгат с пеницилланазой против иммуноглобулинов барана (Воробьев С.М. с соавт., 1966; Сакаян H.H. о соавт., 1939).

Культивирование лимфоцитов периферической крови проводили микро- и накронетодама (Новиков Д.К., Новикова В.Ы., 1979), с морфологической оценкой И32Р-позитивншс лимфоцитов и лимфоблас-тов через 24, 72 k I2Ö часов культивирования; оценивали гклв-чение^Н-тимидякаа 12&-ти часовой культуре. Лимфоциты стимулировали митсгеяаьи (ЗГА, 1ПС, PWM) и специфическим аллергеном домавней шли (АДП).

Диагноз ЛБАн сенсибилизация к аллергену домавней пыли верифицировали клиахческсо. инструментальными я лабораторными исследованиями (Новиков Д.К., 1990; Чучалин A.F., 1955). Заклвчитель-ный диагноз выставляли в соответствии с классификацией А.Д. Адо и O.K. Булатова (1969 г.) о учетом формы ЕА, стадии и степени тяжести (по Г.Е. Федосееву¿ 1967). ■...'.'

Оболодсгзны слэдувава доноры: Г группа, здоровые 62 человека; 2 группа, 77 больных АБА: с сенсибилизацией к домавней пыли; J группа, 35 больных о бронхо-ббструктивндаи заболеваниями; 4 группа. 46 больных аллергическими заболеваниями, не связанными с сенсибилизацией к домаэией пыли; 5'Группа, в ее состаз возло 9 здоровых, 10 больных АБА к 16 больных хроническим лкифолейкозсм (XII). Г пациентов I-4-рЯ групп изучали специфическуп андукцип ДЛ2Р-по-гитнвных лимфоцитов аллергеном и уровень аллоргенспецвфнческих.

ь

ИгЕ, в 5-о# - содержание активированных лимфоцитов в периферической крови. Кроме того, у доноров 1-ой группы исследовали ми-тогеннув активацию культуры лимфоцитов. Статистический анализ проведен традиционными методами (Власов В.В., .1986; Лакин Г.$., 1990).

Результаты собственных исследований

Только диагностикум, приготовленный пассивной сорбцией рШ!2 на активированные глвтаровым альдегидом эритроциты удовлетворял общепринятым критериям специфичности ( О. йетСй^с. , 1988),: повышение числа выявляемых лимфоцитов после стимуляции их ¿»г ¿■ГА, снижение количества открываемых клегок в присутствии экзогенного свободного И12. Методов непрямой.иммувофлюоресценции с моноклональными антителами к рИЛ2 доказано присутствие рШ2 на частицах диагно.стнкума. Оптимальные условия проведения реакции розэткообразовайия лимфоцитов с препаратом были следувщини: 30-ти минутная инкубация при 37°С, оптимальное соотношение лимфоцит: эритроцит - 1:25; их нарушение приводило к увеличение неспецифических адгезивных свойств диагностикума.

Уровень лимфоцитов, несущих И32Р (л-ИЛ2Р) в периферической крови здоровых доноров составил 10,3 - 1,1% (Рис. I). У больных АБА в фазе ремиссии их количество имело тенденции к снижению -Ь,6 - 0,72/Ь. У пациентов, которым необходима была медикаментозная терапия содержание Л-И12Р было достоверно выше - I4,4 £ 1,5$, как по сравнение со здоровыми (р<0,05), так и по сравнении с больными АБА, обследованными в фазе полной ремиссии (р<0,01). При нормализации клинических показателей, уровень активированных лимфоцитов снижался (9,5 £ 2,0, р<0,01). Число лимфоцитов, несущих ИЛ2Р повышено у больных хроническим лимфолейкозом - 41,4 -3.242 (р< 0,001) независимо от формы ХЛ1. Вероятно, уровень активированных лимфоцитов отражает активность процесса, обуславливаемого иммунологическими механизмами.

При стимуляции лимфоцитов периферической крови человека ФГА, динамика изменения лимфоцитов« несущих активационный маркер отличается от таковой для лимфобластов большим увеличением числа Ш2Р-П03ИТИВНЫХ клеток в течение 24 - 72-х часов (Рис. 2). Через 24 часа число активированных лимфоцитов составляет 22,6 ± 2,922, в то время как присутствует ,2,9 ± лимфобластов. В конце инкубации количество лимфобластов превышает число активированных

% Л-КЛ2Р

PKO.QOI

1 - здоровые доноры

2 - бальные хроническим

лкмфолетссоом

О

Рис.1 Содержание активированных лимфоцитов а перифе-рнчвсхоп крови обслсдоедниых.

X во г

в 4а 72 : IZO час»

Ряе.2 Временна» дхкипа вопмви Smctób и активированных лимфашпеа под деяствисм ФГА .

клеток (51,8*3,14* м соответственно, р<0.05). Содер-

хаше лимфобдастов на mucé ответа (120 часов) важбоаее высоко коррелирует с активированными лимфоцитами через 2Н чаев, что до-. дает это время оптимальным да оценки потенциальной способности меток к пролиферации < г «+0,75, р<0,05).Корреляционная связь между содержа киек Щ2Р-позитивных лимфоцитов через 24 часа в включением 3Б-тимиднва в ДНК лимфобластоз через 120 часов оказалась близкой к сильной - г 0,59, р<0,05). Для изучения вопроса о фенотипе клеток, экспрессируваих И12Р ни поставили серив экспериментов по стимуляции клеток различными видами китогеиов. Добавление F V/ и приводило к нарастании числа активированных кл&-ток (опыт - 15,^1,5Î, контроль - 6.2-1,6,«, р<0,05). Поликло-нальнай стимулятор В лимфоцитов (illС) также вызывал увеличение количества активированных клеток (через 24 часа - 2,5±0,<ю; через кЬ - 3,9^0,56,0 во в мевьией степени, чем при внесении Т-кле-точвих митогенов (р< 0,001}.

для стимуляции лимфоцитов специфическим аллергеном дсмахней пила к 2,0 мд стерильно приготовленной дзвкосуспекзни добавляй АДП в конечной концентрация 100 P VU /м; в контрольные проба вносила 0,2 кл разводяиой жидкости. Время иикубации составляло 2'> часа. Кратковременная ннкубация с аллергеном ие приводе? к sa метиой стимуляции лимфоцитов здоровых доноров: контроль - D,X± 1,7%, опыт - 14,3-1,661 I больных без сенсибилизации к АДП. К 24 часам взаимодействие АДП с лимфоцитами бохьвнх АБА приводит к выраженному росту числа иктивировсиных клеток (5,5tû,44, р <0,01 Рис. J).

С учетом того, что в группе здоровых разница составила 2,£ 0,73, а сигма (С) - (+2,9), для анализа применили "правило трех сигм", в соответствии с которым была выделен» верхние критически интервалы при получении результатов (по аналогии с PACT - uacct

0 класс - увеличение числа лимфоцитов, несущих И12Р не белее.2;]

1 класс - от 2.1% до 5>;

2 класс - от % до 7.9Î. Охватывает 95,% здоровы*; } класс - от 7.9% до lù,b%. 99,52 доноров;

k клвсс - евнве 10,6,».

Исходя мз таких условий, распределение обследованных приведем в Табл. 1,2. fie икеюцие кдинжческх достоверное сенсибилизации попадает преимущественно s классы 0 и I. О верифицированной сенсибилизации свидетельствует ""попадание^ результатов обследов

>

X Л-КЛ2Р

Puf.3 Гррд]ше к>л>ппшы активировмтых лимфоцитов при стимуляции культуры Аллергеном лмсашнся пыля

Е.О.П.

Рис. i Оодгрхахне ал.»'генсмздифмчесхнх 1дЕъ сыворотке кроем овглсдошишп групп бальных

» !

гр. ,

I

1А. 2А. ЗА. 4А.

Таблица I.

Выявление активированных лимфоцитов под влиянием специфического аллергена в разных группах болышх

! Распределение больных по классам, п. /*

10 масс <11 класс.! 2 класс! 3 класс ! 4 класс „ до 2.И l2.I-5.ol 15To-7.9jl7.9-IQ.8j'свыше 10.81

14 10(71.4) 1(7,1) 3(21,4)

42 0 . 7(16,6) 15(35,7)

18 8(44,4) 10(55,5) О

10 8(60) 2(20) О

О О

11(26.2) 9(21,4) О О

. О О

1»

гр.

. Таблица 2.

Среднее содержание активированных лимфоцитов у разных * . групп больных .

.! Содержание активированных лимфоцитов. %_¡Сроднее

!0 класс. .11

!0 uacc .il класс ! 2 класс 1 3 класс* 4 класс |рлк'°

•ДО гТй 12.1-5.0* !5,0-7.3* 17,9-10.8*'свыше ^

> I ' ! ! 10.8» !

ТХ. 0,6±0,21 .3,0* 7,0^,"29 О 0 2,1±0.73

24. : 0 '¡-Э,г*рД% 6.0*0.18 8,740.22 14,8*1,03 5.5±0.**

• ЗА. 0.4*9,2$ 3,«*6»Э7'.,' О 0 ; 0 1,910,43

4А. 1,3*0.58 4,0(4,5)** О О О 2,4*1.14

Примечание: * таков результат ним только I больной; «я. > («сок результат шелк 2 больных.

вия в классы 2,3 и 4 поскольку лиц с'достоверным отсутствием гипврчувствительности к АДП там нет. Максимальное количество больных АБА сосредоточено во 2-ом классе. 16,6% обследованных группы попадает в I класс, когда говорить о достоверной сенсибилизации трудно.

При сопоставлении результатов кожного тестирования и данных по активации лимфоцитов АДП оказалось» что чем более выражены пробы, тем ниже активация клеток. Больве половив» больных АБА, которые имели кожные пробы до. (+++) попадав? в классы 3 и а . среди тех, у кого пробы были от (+++) до (++++) только 3 пациента находились в 3-ем классе, остальные - в 1-ом - 2-ом.

Коэффициент корреляции между активацией лимфоцитов и кожными пробами а группе больных АБА составил г »-0,19 (р>0,05). Коэффициент ранговой корреляции оказался вниз - г =»(-0,61, р<.0,05). Коэффициент корреляции знаков составил 0,55, что указывает на высокую сопряаеннооть обоих теотов.

При сравнении результатов метода и теста деструкции тучных клеток (ТДТК) уровень дегрануляцни тучных клеток э 1,2,3 классах (по активации лимфоцитов) был одинаковым. И лиаь в ^ом деграну-ляция была значительно снижена (20,9^6,32, р <0,001). Среди больных попаввих в 4-ый класс меньше половины (452) имели сенсибилизации к АДП по данным ТДТК, а з 1-3 классах этот процент колебался от 80 до 100. Корреляционный анализ указывает на положительнув связь между содержанием свободноциркулируввнх реагинов и фиксированными на метках (кожные пробы) - г «+0,57 (р<0,05), а отрицательную связь между ТДТК а специфической активацией ЛЕМфоця— ' тов ( г —0,56, р <0,05). -

Гельхроматография конызгата, полученного глатеральдегкдннм синтезом аффинноочяценных антител и пенициллиназы подтвердила наличие антител, связанных с ферментом. Оптимальное разведёнке пен лученного препарата составило 1:200; Антисыворотка к ИгЕ человека обладала перекрестной реактиваостьв к иммуноглобулинам А, М, С. , которая исчезала при разведении ее 1:4000. Для определения чувствительности тест-системы к твердой фазе, сенсибилизированной человеческими сывороточными иммуноглобулинами, добавляли смесь аа-тисыворотки и соответствующих ей иммуноглобулинов известное концентрации. Чувствительность метода находилась в пределах 1-5 нг, с пропорциональным участком 5-10 иг- Из-за отсутствия очищенных ыгЕ человека определить-чувствительность метода в режиме определи-

'..ш ИгБ не удалось. Uoaao предполагать, что ова таив находятся в этих пределах. •

Попытки использовать классический метод, сенсибилизации плаа-ает (в мелочном карбонатном буфере) коммерческим препаратом до-мааней пылиоказалась безусаевнним, что связано с присутствием в нем неиопшх детергентов. Eux использован способ ковалентной сакв? к* аллергена о твердой фазой (Новиков £.К. с соавт., 1990). При сопоставлении разработанной тест-системы с иммунофарментным набо-. рок для определения аллергенспецифических ИгВ производства Ставропольского НИИ вакцин и сывороток, была найдена сильная положительная связь между результатами, получоннымк с применением коммерческого коньвгата и синтезированного нами г- »+0,9, р<0,05. С помоаьо пенициддиказкого коньвгата вам удавалось обнаруживать референс^позитивнуо сыворотку в разведении 1:500, что на порядок выне, чем с перокождазным.

Средние величины содержания аллергенспецифаческих ИгЕ в группе с дсстоверноВ.сенсибилизацией к АДП bues по сравнение с друге-ми (0,169*0,0129, р <0,001, Рис. Ч), В донорской группе ОП составила 0,021*0,0050.е.о.п. (С * 0,022). У пациентов J группы эта - величина была - 0,042*0,0112 (р<0,1), В группе больных без сенса-билизации ОП составяла 0,087*0,0163 о.о.п. (р<0,05). Выделены следувжие классы данных (по празилу "трех сигм): О класс - ОП сывороток не превапает 0,053 е.с.п.; I,класс - ОП сывороток находится а интервале 0,053- 0,035 е.о.п.;

2 класс - , 0,065 - 0,117 е.о.п..

3 класс - 0,117 - 0,149 е.о.п.

4 класс - ОП свывэ 0,149 е.о.п.

При таком разделении результатов диагностически значимыми являются классы 1-4, а попадание данных в класс 0 не исклвчает сенсибилизации, Волее 97f здоровых доноров "попадает" в классы 0-?1 (Табл. 3,4), в то время как больные АЕА сосредоточены преи-Ууаествевно во 2-ом - 4-ом (около 85Х), что свидетельствует о' циркуляции в периферической крови ИгВ. специфичных к домавнзй пали. У больных с хроническими заболеваниями легких, у которых доказано отсутствие гиперчувствительвости к А£Л, в сиворетсзх 77% ее обнаруживается антитела; только жесть больных попали в диагностические классы. В группе больных аллергическими заболеваниями, но .без сенсибилизации к АДП, сравнительно велико число пацк-оитов, которые находятся в диагностических классах, что снижает

Таблица 3.

Распредехекиз оболедсзаиннх больных по классам при имкунсфзрментном обследовании

К . ! Распределен« е по классам п{%)

гр. п. • 0 класс •<0.053 ! I класс !0,053-!0,0Ь5 • 2 класс 10,06510.117 ! 3 класс ! 0,117-!0,149 i 4 класс ! >0,149

1Б 43 34(79.1) 6(16,6) 0 0 1(2,3)

2Б 77 7(9.0) 4(5,2) 16(20.&) 12(15,6) 36(45,4)

ЗБ 22 16(72,5) Ю.5) 4(16,5) 0 1С*.5)

4Б 31 13(41.9) 1(12,9) 7(22,6) 2(6,5) 5(16,1)

Таблица

Уровни оптической плотности в сыворотках обследованных групп больных з ИМ

К

го.

Распределение по классам

ж

О класс !1 класс !2 класс.! 3 класс ! 4 класс <0,053 !0,053- !0,0Ь>. 10.117- ' ! >0,149 _!0.0Ь5 10*117 -0.149 '

i

1Б 43

2Б 77

ЗБ 22

4Б 31

0,007* 0,0019

а,023± 0,0057

0,016± 0,0061

0,012± 0,0035

0,06**4 0.0037

0.067* 0.0051

0,055й

0,075± 0.0032

0,100* 0,0027

0,034« 0,0055

0,108± 0,0041

0,13Э±. 0,0036

О

ó, 134

0,155*

0.25&* 0,0163

0,171я-

0,I9I±„ 0,0194

йримечанизя * - таксЯ результат шел I больвоЗ;

к* - такой результат кхело 2 больных.

ценность метода, поскольку увеличивает число ложнопололитель-ных результатов.

Сравнение результатов ИФЛ.с кожными пробами показало, что имеется тенденция к прямой зависимости между интенсивностью кожных проб и уровнем ИгЕ. Так, все 5-больных АБА с кожными пробами на (++++) находятся в 4-ом классе. Из 58 больных, у которых кожные пробы были высе (++), у 53 выявлены диагностически значимые уровни аллергенспецифеческих ИгЕ.Коэффициент корреляции составил .Г =+0,72 (р <0,05). При сопоставлении результатов ИФА и ТДТК обнаружена прямая зависимость. Максимальная дегранудяция (55,5^4,41, р<0,05)„ была в ом классе по И»А; тест был положителен у всех больных. Различия по 0-3 классам невелики. Коэффициент корреляции (между И§А и ТДТК) в обследуеяоЯ группе составил ' г =+0,60 (р <0,05).

При комплексном применении разработанных методов специфической индукции лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 и определения алзергенспецифвческах ИгЕ в иммуноферментзом анализе с пеницизлиназным коиьЕгатои оказалось, что по активации лимфоцитов в диагностически недостоверный 1-ыЯ класс попадает 7 больных АБА (16,7*), однако у шести-из них обнаружены ьысокке урззни аялергенспецифнческкх ИгЕ. С другой стороны, у б болькых АЕА ОП находится в недостоверном 0-ок классе К1А; у пях» из нкх имеотея специфическая индукция ИЛ2Р-поз!!тнвных лимфоцитов. Следовательно, ■ совместное применение обоих методов позволяет подтвердить сенсибилизацию у 97,.6* больных АЕА. С учетом определенного числа хох-еопозитивных результатов, получаемые результаты необходимо трактовать в комплекса с данными клиника. ' '

выводи.

Г) Разработан диагностику«, который позволяет обнаруживать лимфоциты, несущие рецепторы к интерлейкину 2.

2) У больных бронхиальной астмой в период ремиссии уровень ИЛ2-позитавных. лимфоцитов не отличается от такового у здоровых доноров; а период обострения их число достоверно возрастает и снижается при улучшении состояния. У больных хроническим дкмфолейкозом число лимфоцитов, несущих ИЛ2Р в периферической крови резко увеличено.

3) При стимуляции культуры лимфоцитов периферической крови ФГА, количество позитивных клеток через 24 часа инкубации значимо

коррелирует с числом лнкфобластсв и включением 3Б-тинидина через 120 часов культивирования.

h) Аллерген домашней пыли индуцирует эксрресои» ЙД2Р в 2^х часовой культуре лимфоцитов у больных атонической бронхиальной • астмой; такая индукция отсутствует jr здоровых доноров, больных бронхообструктивными и аллергическими заболеваниями, без сенсибилизации к аллергену домааней пнли.

5) Индукция аллергеном домашней пыла Ш12Р-позитивных лимфоцитов позволяет выявить сенсибилизации к н§му у больных АБА.

6) Разработанный И?А позволяет выявлять аллергенспецифические ИгБ-аататела у 91? больных АБА, число ложнопозитивных результатов повыаено у больных аллергией без сенсибилизации к до-мавнай пыли. - t •

ï) Методы специфической индукции ¡ПНР-позитивных лимфоцитов и определения аллергенспецизических ИгЕ в ИгА-скстеме с пени-циллиназным коньвгатом дополняют друг друга и позволяет оценить клзточнуо и гуморальнуп сенсибилизации.

Список работ, опубликованных по тема диссертации

1. Доценко Э.А. 1'шмуноферментный "дэсЯпой сэедвич" па основе пе-ницидлиназы / Зкологня и аллергия. - Минск. - 1990. - 0.28-09.

2. Доценко Э.А. Определение рецепторов % пнтерлейкину 2 при некоторых патологических состояниях / ИнтерлеЯкиня я другие медиаторы в клинической ккнунологии. - H. - 1989. - C.I&-23.

3. Доценко З.А. Ускоренный метод изучения пршиферирупяей активности лимфоцитов /. 1 Есесоиэ. икмунол. съезд. - М. - 1989. -

' 70 с.

¿оценке Э.А., Новиков д.К., Капустин C.B. Клиническое значение определения активйроввнных лимфоцитов / Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. - Челябинск. - 1990. - с.

5. Новиков ¿.К., Доценко Э.А., Колосова .Т.С., Сансоноз Н.М. Принципы лабораторной диагностики аллергических заболеваний. -Минск. - 1991. - 16 с.

6. Новиков Д.К., Доценко З.А. Способ выявления лимфоцитов периферической крови, несущих рецепторы к интерлейкину 2. Авт. сеид. .V 1607571).

7. Доценко У.А., Новиков Д.К. Специфическая активация лимфоцитов К-к способ этиологической диагностики аллергии / Новые методы диагностики лечения, реабилитации заболеваний и оценки лекар.

ственных форм. - Витебск. - 1991. - С. 15-20.

й, доценко Э.А., Новиков Д.К..Имкунофорызитная тест-система определения антител класса 3 у больных атонической бронхиальной астмой / Эндокринные и иммунные механизмы регуляции го-меостаза, - Смоленск. - 1991. - С.&6-90. 9. Ь/оуССОУ Ъ.К., йоЬаепко Е. А. Ъгхутг. ¡ттшгоалнау

Е

(ДпссаХ ¿¡¿ды/ьссигы о^ /рд . -/сазсоу^.- г. чэ.