Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Идентификация потенциальных клеточных субстратов для различных изоформ онкогена V-src
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.14
Автореферат диссертации по медицине на тему Идентификация потенциальных клеточных субстратов для различных изоформ онкогена V-src
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
На правах рукописи УДК 618.14-006-092.9
Р Г Б ОД
1 8 ОКТ 1333
и
Родина Анна Анатольевна
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ СУБСТРАТОВ ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФОРМ ОНКОГЕНА У-ЯКС
(Специальность 14.00.14 - Онкология)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА-1999
Работа выполнена в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов (руководитель - доктор биологических наук А.Г.Татосян) НИИ Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра РАМН (директор НИИ Канцерогенеза - профессор Д.Г. Заридзе, директор РОНЦ РАМН - академик РАН H.H. Трапезников).
Научный руководитель: доктор биологических наук А.Г. Татосян.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук - П.М. Чумаков.
доктор биологических наук - М.А. Красильников.
Ведущая организация: Институт Медицинской генетики РАМН.
Защита диссертации состоится Ш^тф^Г 1999г.
на заседании специализированного Ученого совета (К.001.17.01) Российского
Онкологического Научного Центра РАМН (115478, Москва, Каширское ш., 24).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ РАМН.
Автореферат разослан 1999г.
Ученый секретарь специализированного Ученого совета
доктор медицинских наук, профессор B.C. Турусов.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
1.1. Актуальность проблемы.
Вирус саркомы Рауса (RSV) способен трансформировать клетки некоторых позвоночных т vitro и вызывать опухоли у некоторых видов лабораторных животных. Трансформирующая активность RSV связана с наличием в его геноме онкогена v-src, кодирующего тирозин-зависимую протеин-киназу. В геноме нормальных [^трансформированных клеток находится протоонкоген c-src, гомологичный гену v-src, но не обладающий трансформирующей активностью (D.Stehelin et al.. 1976). Продукт гена src является одним из ключевых белков системы передачи сигналов в клетке, и взаимодействует при этом со многими другими клеточными белками. Поиск субстратов src необходим для идентификации путей передачи сигналов в клетке, а также для понимания механизма трансформации, осуществляемой продуктом v-src.
Ранее в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН для изучения механизмов метастатической активности опухолевых клеток была создана экспериментальная модельная система клеток сирийского хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса. Было получено несколько линий фибробластов сирийского хомяка, независимо трансформированных in vitro RSV штаммом Шмидт-Руппин D. Все линии хотя и обладали типичным трансформированным фенотипом и были высокотуморогенными для сингенных животных, различались по способности к спонтанному метастазированию (Deichman et al., 1989).
Путем молекулярного клонирования были получены новые изоформы онкогена v-src (v-src-HM и v-src-LM), выделенные соответственно из высоко- и ннзкометастазирующих линий клеток. При этом было показано, что метастатический статус клеточных линий связан с изменениями С-концевой области НМ- и LM-вариантов онкогена v-src (A.Tatosyan et al., 1996).
Методом двойных гибридов был осуществлен скрининг экспрессирующейся библиотеки к-ДНК, полученной из низкометастазирующей линии RSV-трансформированных фибробластов хомяков HET-SR, для обнаружения потенциальных партнеров онкогена v-src. В результате было получено несколько
клонов, кодирующих белки, взаимодействующие с фрагментом белка у-бгс-НМ в системе двойных гибридов (М1гемпа е1 а!., 1998). К ним относятся продукт гена узеар 1 (белок, ассоциироваш!ый с концевым фрагментом белка у-вгс) и РЬА21г5а1 (ген, кодирующий фосфолипазу А2 клеток хомяка, ассоциированную с белком бгс). Продукт гена узеар1 является аналогом белка gadd7/adaptl5, синтез которого индуцируется при воздействии перекиси водорода и УФ на клетки хомяка. Белок РЬА2Ьза1, предположительно, относится к группе секреторных фосфолипаз воспалительного типа. УБеар I и РЬА2115а1 являются новыми генами. Эти последовательности не были известны ранее.
Дальнейшие исследования продуктов полученных клонов и их взаимодействия с различными изоформами белка у-бгс должны пролить свет на механизмы метастазирования, связанные с этим онкогеном. Попытка подобного исследования является целью данной работы.
Ранее при изучении описанной выше модельной системы, состоящей из набора трансформированных ЯБУ линий фибробластов сирийского хомяка, отличающихся по способности к спонтанному метастазированию, было обнаружено, что в низкометастазирующих клетках сохраняется структура сети фибронектина -основного компонента внеклеточного матрикса; в то время как во всех высокометастазирующих линиях упорядоченный внеклеточный фибронектин отсутствует (А.ТаШзуап е1 а1., 1996). В связи с этим в данной работе были исследованы некоторые биохимические характеристики двух ключевых белков системы передачи сигнала от интегринов, основным активирующим лигандом которой является фибронектин: киназы фокальной адгезии (РАК) и адапторного белка паксшшна. Белки БАК и паксилин известны как партнеры белка бгс.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование потенциальных клеточных субстратов продукта онкогена v-src Н сравнительный анализ взаимодействия одного из обнаруженных белков с различными изоформами v-src.
В соответствии с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Исследовать взаимодействие продукта гена PLA2hsal, обнаруженного в результате скрининга библиотеки к-ДНК,
- с С-концевым фрагментом белка v-src-HM и С-концевым фрагментом белка v-src-LM в системе двойных гибридов.
- с полноразмерными белками v-src-HM, v-src-LM, а также с c-src белком при помощи системы гибридных белков глутатион-Б-трансферазы (GST).
2. Анализ обнаруженного взаимодействия путем прямой ко-иммунопреципитации продукта PLA2hsal с белком v-src из белкового лизата клеток линии RSV-трансформированных фибробластов хомяков.
3. Изучение локализации и возможности фосфорилирования белка PLA2hsal в клетках трансформированных линий фибробластов хомяков.
4. Анализ уровня синтеза и степени фосфорилирования по тирозину следующих белков: киназы фокальной адгезии (ppl25FAK) и адапторного белка паксилина в RSV-трансформированных линиях фибробластов хомяков, обладающих различной метастатической активностью и уровнем продукции онкобелка v-src.
1.3. Научная новизна и научно-практическая значимость работы. В данной работе впервые показан белок фосфошшаза А2 группы НА из клеток хомяка (PLA2hsal) в качестве потенциального партнера онкогена v-src в системах от vivo и in vitro. Методами двойных гибридов и гибридных белков глутатион-S-трансферазы (GST) продемонстрировано различное сродство этого белка к изоформам v-src, полученным из клеточных линий, обладающих различной метастатической активностью. Выявлено взаимодействие PLA2hsal с белком c-src при помощи метода GST. Исследована степень продукции белка PLA2hsal в трансформированных линиях
фибробластов сирийского хомяка, имеющих различные биологические свойстг Изучена локализация и показана возможность фосфорилирования по тирозину бел PLA2hsal в трансформированных клетках хомяка. Впервые методом двоит гибридов также показано взаимодействие продукта гена vseap 1 с фрагментом белка sic. Исследован уровень экспрессии и степень фосфорилирования по тирозину таю компонентов передачи сигнала, как белки FAK и паксилин, в лини трансформированных фибробластов хомяков. Обнаружена корреляция меж, степенью фосфорилирования нсследовашшх белков и метастатическим потенциале использованных линий клеток.
Работа имеет теоретическое значение для понимания детал трансформирующего механизма продукта v-src, в частности ассоциации онкобелкл различными белками, вовлеченными в процесс передачи сигнала в опухолев1 клетках.
1.4. Апробацпя работы.
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 10 июня 1999 года совместной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогене молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, противоопухолевс иммунитета, иммунологии онкогенных вирусов, методов скрининга канцерогенов цитогенетики НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН.
Материалы работы представлялись на 24-й конференции 1SOBM (Сан-Дие! США, 1996), 1 -м Съезде онкологов стран СНГ (Москва, Россия, 1996) и Ежегодном конгрессе вирусологов (Регенсбург, ФРГ, 199В).
По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.
1.5. Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит таблиц и 22 рисунка. Состоит из следующих разделов: введение, обзор литератур описание использованных материалов и методов, результаты, обсужден полученных результатов и выводы. Список литературы содержит 127 источников.
2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
2.1. Обзор литературы.
В обзоре литературы детально описан метод двойных гибридов, ею преимущества и недостатки, а также другие методы идентификации белок-белковых, ДНК-белковых и РНК-белковых взаимодействий, использующие принципы системы двойных гибридов.
2.2. Материалы и методы.
В работе были использованы следующие методы исследования: получение препаратов тотального белка из клеток млекшшгаюншх, электрофорез белком, нммуноблоттинг. система двойных гибридов, метод гибридных белков rjiyiamoii-S-трансферазы (GST), молекулярное клонирование, выделение плазмидной ДНК. электрофорез нуклеиновых кислот, иммунопреципшация, иммунофлуоресценция.
В работе были использованы клетки сирийских хомяков, трансформированные RSV, полученные в лаборатйрин противоопухолевого иммунитета РОПЦ РАМН, отличающиеся по уровню метастатической активности.
2.3. Результаты.
2.3.1. Специфичность «заимодействия потенциальных партнеров белка v-src, обнаруженных при скрининге библиотеки к-ДНК фрагментом белка v-src-UM, методом двойных гибридов.
Поиск потенциальных субстратов онкогена v-src проводился с использованием метода двойных гибридов. Метод двойных гибридов является относительно новой генетической системой для выявления белок-белковых взаимодействий в клетках дрожжей (Рис. 1). Он основан на свойствах белка GAL4 - транскрипционного фактора дрожжей Saccharomyccs cerevisiae (S. Fields and О. Song, 1989). GAL4 cocioht из двух доменов, раздельных по функциям и действующих независимо: N-концсвого домена, взаимодействующего со специфическими последовательностями ДНК, и С-концёвого домена, содержащего районы, необходимые для активации транскрипции
б
(L. Keegan et al., 1986; J. Ma et al., 1987). Активация транскрипции с помощью та! транскрипционного фактора может происходить только при наличии у него об доменов, отдельные домены GAL4 не способны выполнять данную функцию (R. В et al., 1985).
При использовании системы двойных гибридов конструируют два гибрид белка, содержащих части GAL4: ДНК-связывающий домен GAL4, слитный с бел X, и активирующий домен GAL4, слитный с белком Y (Рис. 1). В случае, если бе X и Y образовывают комплекс и таким образом восстанавливают целостное! активность фактора GAL4, происходит транскрипция гена, содержащее промоторной зоне сайты взаимодействия с этим фактором транскрипции. В каче! таких репортерных генов обычно используются гены-маркеры питания, экспрес которых позволяет отбирать клоны, содержащие взаимодействующие белки на cj без соответствующих аминокислот; либо ген lacZ, кодирующий р-галактозид продукцию которой определяют X-gal тестом (S. Fields and О. Song, 1989).
Рис. 1: Система двойных гибридов.
а) Гибрид ДНК-связывающего домена С с белком X не активирует транскрипци! репортерного гена, т. к. он не содержит активирующего домена.
б) Гибрид активирующего домена СА14 с белком У не активирует трансхрипцш репортерного гена, поскольку он
не может взаимодействовать с сайтам! связывания ОМ4.
в) Взаимодействие между белками X и восстанавливает целостность и активность фактора транскрипции в/ и вызывает экспрессию репортерного г
Ранее в результате скрининга библиотеки к-ДНК описаш1ым выше мето было получено несколько клонов, кодирующих белки, предположите^
ДНК-связывающий домен
Сайты взаимодействия Репортерный ген
с ДНК-связывающим доменом GAL4
Активирующий к Домен
лен
<3
Сайты взаимодеиствия Репортерный ген
с ДНК-связывающим доменом QAL4
Активирующий домен
ДНК-связыва^ ющий доме
Сайты взаимодействия Репортерный ген
с ДНК-связывающим доменом QAL4
взаимодействующие с С-концевым фрагментом белка у-бго-НМ (у-бгс-НМ-С) п системе двойных гибридов (М1гепша е1 а1., 1998). К ним относятся белок уяеар! н РЬА21т1. Невозможность использования полноразмерного белка у-бгс в системе двойных гибридов связана с токсичностью у-йгс для дрожжевых клеток (М. Попо е( а1., 1994).
На начальном этапе этой работы была проведена проверка на специфичность обнаруженных взаимодействий методом двойных гибридов. Она необходима для исключения фоновых взаимодействий и выявления ложных субстратов белка-"наживки" (в данном случае - белка у-бгс). Проверка на специфичность заключается в исследовании реакции обнаруженного при проведении первичного скрининга белка-партнера с заведомо не взаимодействующим с ним белком. Для этой цели использовался белок внутренней поверхности ядерной мембраны - ламин. Мишени белка у-бгс находятся в цитоплазме, поэтому клоны, продукты которых взаимодействовали с ламином, считались неспецифичными.
Таблица 1. Специфичность клонов, полученных при первичном скрпнипгс библиотеки к-ДНК, методом двойных гибридов. _
плазмиды. содержащиеся в тестир}емых дрожжах Количество колоний, выросших на среде DO-2,"' Количество колоний, выросших на среде DO-5.r" % КОЛОНИИ, содержащих пзаимодсистмо ише белки
рЬсх-лампп +рСА0-РЬЛ2Ь*а1 (контроль) 60 13 21.5%
рЬех-НМ-С +рОАО-Р1-А21иа1 (опыт) 180 115 61%
р1.ех-ламии+рОАО-гзсар! (кош роль) 53 10 19%
рЬех-НМ-С+рОАО-У8сар1(оныт) 50 25 50"/.
11 00-2 - среда для отбора трансформантов, содержащих обе плазмиды, колирующие гибридные белки.
й| 00-5 - среда для отбора колоний, содержащих взаимодействующие гибридные белки. /¡¿ех-лииии - плазмнда, кодирующая гибридный белок, содержащий ДНК-связыпакчимм домен фактора транскрипции и белок ламим.
рСЛВ-И - плазмида, кодирующая гибридный белок, содержащий активирующий чо'-'он фактора транскрипции и последовательность из к-ДНК библиотеки.
рЬЕХ-НМ-С - плазмида, кодирующая гибридный белок, содержащий ДНК-свян.шаюшии домен фактора транскрипции и белок у-бгс-НМ-С.
Специфически взаимодействующими с v-src-HM-C считались клоны, если они (опыте) давали более 50% колоний, выросших на среде DO-5 (по сравнению с общи количеством трансформантов), а в (контроле) - менее 50% колоний.
В результате проведенных исследований было показано, что продукты vseaj и PLA2hsal специфически взаимодействуют с С-концевьш фрагментом белка v-sr HM в системе двойных гибриден П>бл. I).
2.3.2. Сравнение взаимодействия PLA2hsal с фрагментами различных изоформ онкогена v-sre в системе двойных гибридов.
Было проведено сравнение взаимодействия обнаруженного белка PLA2hsa1 С-концевыми фрагментами вариантов ИМ и LM онкобелка v-sre (v-src-HM-(аминокислоты-522-546) и v-src.-LM-C (аминокислоты-500-545), соответственнс Использование именно С-концов этих белков вызвано тем фактом, что различия метастатической активности линий клеток, содержащих данные варианты v-sr связанны с отличиями в структуре С-концевых фрагментов этих белков (Tatosyan al„ 1996).
В результате было показано, что белок PLA2hsal не взаимодействует с белке v-src-LM-C в системе двойных гибридов.
Полученные в системе двойных гибридов данные говорят о различно сродстве белка PLA2hsal к изоформам онкобелка v-sre, выделенным i трансформированных RSV клеток, обладающих различной метастатическс активностью.
2.3.3. Исследование взаимодействия PLA2hsal с различными вариантами src-белка при помощи метода гибридных белков, содержащих глутатион-Я-трансферазу.
В данной работе для проверки взаимодействия белков, обнаруженных системе двойных гибридов, был использован метод гибридных белков, содержали глутатион-Б-трансферазу (GST). Метод GST позволяет получать из Е. coli очищеннь гибридные белки в препаративных количествах. Эти белки содержат на N-kohl
последовательность глутатион-Б-трансферазы, а на С-конце - последовательности любых исследуемых белков. Подобным образом был получен и очищен из бактериального лизата ОБТ-гибридный белок, содержащий последовательность РЬА2Ь$а1 (05Т-РЬА2Ьза1), выявленную в качестве потенциального партнера белка х-бгс-НМ в системе двойных гибридов.
Полученный гибридный белок 08Т-РЬА2Ьза1 был использован в преципитации белков из тотальных лизатов клеток высокометастазиругощей линии ЯБУ-трансформированных фибробластов сирийского хомяка НЕТ-БШ и низкометастазирующей линии ЯБУ-трансформированных фибробластов НЕТ-БЯ. В результате было показано, что фрагмент белка РЬА2Ьза1, входящий в состав СБТ-гибридного белка, преципитирует белки у-бгс-НМ (Рис. 2, линия 5) и у-эгс-ЬМ (Рис. 2, линия 6) из лизатов тотального белка клеток линий НЕТ-БРИ и НЕТ-БЯ, соответственно. Полученные данные говорят о взаимодействии белка РЬА2Ьза1 с НМ- и ЬМ- вариантами онкобелка у-бгс. Количественная оценка показала, что продукт Р1А2ЬБа1 имеет различное сродство к нзоформам белка у-эгс: количество преципитируемого белком РЬА211за1 белка у-бгс-НМ было в 1,5 раза выше, чем количество преципитируемого белка \'-5гс-ЬМ. Примечательно, что в преципитатах белка РЬА2Ь$а1 не бьшо обнаружено белка с-бгс (Рис. 2, линии 5,6), хотя этот белок синтезируется в достаточных количествах в исследованных линиях клеток (Рис. 2, линии 1,2). Мы не знаем насколько значимым (в конкретных цифрах) является различие в сродстве РЬА211на1 к НМ- и ЬМ-нзоформам онкобелка у-йгс. Можно предполагать, что выявленная разница может оказывать влияние на некоторые \'-5гс-ассоциированные клеточные функции. Например, влиять на тип метастатического поведения клеточных линий, содержащих НМ и ЬМ варианты онкогена у-бгс.
ю
1 2 3 4 5 6
бОкРает^ЛШ! : ,; ^
Рис. 2: Взаимодействие фрагмента белка Р1А2Ьва1 в составе СЭТ-гибридного белка с изоформами онкобелка у-бгс-НМ и у-вгс-1.М.
1. НЕТ-ЗЯ1 - тотальный белковый лизат - ЮО^д белка.
2. НЕТ-ЭЯ - тотальный белковый лизат - ЮОцд белка.
3. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии НЕТ-БРИ белком глутатион-З-трансферазой.
4. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии НЕТ-ЭЙ белком глутатион-З-трансферазой.
5. Иммунопреципитация беЬков из лизата клеток линии НЕТ-БЯ1 белком вЗТ-Р1А2Ьза1.
6. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии НЕТ-ЭЯ белком в5Т-Р1А2Ь$а1.
Белок глутатион-З-трансфераза был использован в качестве отрицательного контроля на отсутствие взаимодействия между белками v-src и частью глутатион-Э-трансферазы белка С5Т-Р1А2Н$а1.
Блот инкубирован с антителами, специфичными к v/c-sгc.
На следующем этапе было изучено взаимодействие фрагмента РЬА21т1
составе СБТ-гибридного белка с белком с-бгс. Для этого была проведе»
преципитация белков из тотальных штатов линий БТНЕ (линия споиташ
трансформированных фибробластов хомяка) и ЫШ-с-бгс (линия иммортализованнь
мышиных фибробластов, гиперпродуцирующая экзогенный куриный белок с-вг
белком 08Т-РЬА2Ьза1 (Рис. 3). В результате опыта было выявлено взаимодейств!
фрагмента РЬА2Ьза1 с белком с-бгс, происходящим как из клеток хомяка, так и
куриных клеток (Рис. 3, линии б и 3, соответственно).
1 2 3 4 5 6
60 кРа (с-згс)-»-Д .. ,
Рис. 3: Взаимодействие.фрагмента белка РЦ\2115а1 в составе ввТ-гибридного белка с белком с-вгс.
1. Ы1Н-с-8гс - тотальный белковый лизат - ЮО^д белка.
2. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии ЫИЧ-с-эгс белком глутатион-З-трансферазой.
3. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии ЛШ-с-вгс белком вЗТ-Р1А2Ьза1.
4. ЗТНЕ - тотальный белковый лизат - 100\хд белка.
5. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии ЭТНЕ белком алутатион'З-трансфврвзой.
6. Иммунопреципитация белков из лизата клеток линии ЗТНЕ белком вЗТ-РЦ\2Ьза1.
Блот инкубирован с антителами, специфичными к с-5гс белку.
Из проведенных экспериментов можно заключить, что фрагмент PLA2hsal в составе гибридного GST-белка взаимодействует с обеими изоформами белка v-src, а также с белком c-src. Но взаимодействие этого белка с c-src выявляется только при использовании линий клеток не синтезирующих белок v-src. Вероятно, это связано с повышенной продукцией белка c-src в этих линиях клеток (Т. David-Pfeuty and Y. Nouvian-Dooghe, 1990; L. Topól et al., 1993). Данные приведенных опытов позволяют предположить, что сила связывания фрагмента PLA2hsal с разновидностями мс-белка в GST-системе уменьшается в ряду: v-srcHM>v-srcLM> c-src.
2.3.4. Исследование уровня продукции белка PLA2hsal в трансформированных клетках хомяка, отличающихся по своим биологическим свойствам. К уникальной С-концевой последовательности аминокислот (131-145) белка PLA2hsal была получена кроличья антисыворотка. Она была протестирована на способность идентифицировать белок PLA**usal в нммуноблоттипге и, затем использована для исследования уровня продукции белка PLA2hsal в RSV трансформированных линиях фибробластов хомяка (Табл. 2), отличающихся по таким параметрам, как: степень продукции белка v-src; метастатический потенциал in vivo-, секреция простагландинов (PGE). В эксперименте были использованы следующие линии клеток: STHE - линия спонтанно трансформированных фибробластов; HET-SR, HET-SR1 и HET-SR8 - линии RSV трансформированных фибробластов, полученные путем независимой инфекции первичных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка различными стоками вируса саркомы Рауса штамма Шмидт-Руппин D (Deiclmian et al., 1989) и содержащие но одной копии провируса; HET-SR-2SC - отобранный на животных вариант линии HET-SR, содержащий дне копии провируса; HET-SR-N-ras кл.6 и HET-SR-2SC-N-ras кл.34 - варианты линий HET-SR и HET-SR-2SC, соответственно, трансфицированные активированным геном N-ras (Deichman et al., 1992).
Было показано, что белок PLA21isal в трансформированных клетках хомяка имеет молекулярную массу -15 kDa, что соответствует предсказанной по нуклеотидной последовательности мол. массе этого белка. Была обнаружена
повышенная экспрессия РЬА2Ьза1 в линии НЕТ-БЯв, средний уровень экспрессии РЬА2Ьза1 в линиях НЕТ-БЯ и НЕТ-8К-28С, низкая экспрессия - в линиях БТНЕ, НЕТ-8а1, НЕТ-БЯ-Ы-гаэ кл.6 и НЕТ-ЗЯ-гБС-Ы-гаБ кл.34 (Табл. 2). Примечательно, что подобное распределение по степени экспрессии гена РЬА2Ьза1 в этих линиях клеток также было выявлено на уровне РНК (Е. Мусаткина, персональное сообщение). Таблица 2. Продукция белка Р1_,А2Ьза1 в 118У трансформированных линиях
Спонтанная Уровень Сравнительная Секреция
метастатичес продукции продукция простагланди
Линии клеток кая V-src белка нов
активность (Deichman et PLA2hsal (G. Deichman
(вМА), ■> al„ 1996) etat., 1992)
HET-SR низкая 1.00. 1.00 +
HET-SR1 высокая 1.50 0.63 +
HET-SR8 высокая 1.37 1.67 +
HET-SR-2SC высокая 1.30 1.00 +
HET-SR-N-ras кл.6 низкая 0.22 0.61 -
HET-SR-2SC-N-ras низкая 0.00 0.47 -
кл.34
STHE низкая 0.00 0.56 -
низкая SMA - метастатические узлы обычно не обнаруживаюсь после введения клеток этих линий хомякам; высокая SMA - 70-200 метастатических узлов обнаруживалось через 2 месяца в легких хомяков, которым были введены клетки этих линий.
Известно, что фосфолипаза А2 принимает участие в процессах метаболизма простагландинов (К. Glaser, 1995). Повышенный уровень синтеза бежа PLA2hsal был обнаружен в линиях клеток, секретирующих простагландины и продуцирующих повышенные количества белка v-src (за исключением линии HET-SR1). Не обнаружено корреляций между метастатической активностью клеточных линий и уровнем синтеза PLA2lisa 1 (Табл. 2).
2.3.5. Ко-илшупопреципитация белков PLA2/isaI и v-src из тотального белкового лизата линии RSV-трансформировашшх фибробластов хомяка.
Методы двойных гибридов и GST имеют определенные ограничения,
!
связанные с использованием гибридных белков. Наиболее приемлемым доказательством наличия взаимодействия между исследуемыми белками является ко-иммунопреципитация этих белков из соответствующего клеточного лизата.
Линия RSV трансформированных фибробластов хомяков HET-SR была использована для ко-иммунопренипиташш белков PLA2hsal и v-src (Рис. 4). D результате опыта было показано, что очищенные v-src-комплексы из тотального белкового лизата этой линии клеток содержат белок PFA2hsal (Pitc. 4, линия 3). Данные этого эксперимента подтг.ерждают м.ттпчие специфического птшмодойепшя между белками v-src и PLA2hsal.
1 2 3
15 kDa (PLA2hsa1)—► % ' I
/ i < I „.< '
Рис. 4: Ко-иммунопреципитация белков PLA2hsa1 и v-src из тотального белкового лизата линии клеток HET-SR.
1. HET-SR - тотальный белковый лизат-ЮОцд белка.
2. Иммунолреципитация белков из тотального белкового лизата линии клеток HET-SR неиммунной кроличьей сывороткой (отрицательный контроль).
3. Иммунолреципитация белков из тотального белкового лизата линии клеток HET-SR антителами к v-src белку.
Блот инкубирован с антисывороткой, специфичной к PLA2hsa1.
2.3.6. Локализация белка PLA2hsal в трансформированных клетках хомяков. Для определения местонахождения белка PLA2hsal в клетках хомяка был использован метод непрямой иммунофлуоресценции. Исходя из полученных данных белок PLA2hsal в трансформированных клетках хомяков локализуется в околоядерной зоне н скорее всего ассоциирован с компонентами эндоплазматнческой сети, что вполне согласуется с информацией, полученной в результате компьютерного анализа нуклебтидной последовательности выявленного гена
I
PLA2hsal о том, что этот белок является секреторным. Некоторое количество белка PLA2hsal также было обнаружено по всей цитоплазме исследованных клеток.
Картины флуоресцентного окрашивания клеток различных линий хомяка существенно не отличались.
Известно, что белок у-бгс помимо локализации в области фокальных и межклеточных контактов, располагается также в цитоплазме клеток (Е. Nigg е1 а1., 1982). Последний факт наводит на мысль о том, что местом взаимодействия белков РЬА2Ь5а1 и у-бгс может быть цитоплазма трансформированных клеток.
2.3.7. Анализ возможности фосфорилировапия по тирозину белка Р1А2/ма1.
Поскольку у-бгс является тирозин-зависимой протеин киназой, возникает вопрос о возможности фосфорилирования белка РЬА2Ьза1 по тирозину. Эта возможность была исследована путем преципитации белков из тотального белкового лизата клеток линии НЕТ-БИ. антителами, специфически распознающими фосфотирозин. В результате был обнаружен белок размером -14 кОа, преципитируемый антителами к фосфотирозину и определяемый путем иммуноблоттинга антисывороткой к Р1^А2Ьза1 (Рис. 5, линия 2). Исходя из полученных данных можно предположить возможность фосфирилирования белка 1^А211ва1 по тирозину.
1
52 кОа (тяжелые цепи
иммуноглобулинов)
23 кйа (легкие цепи
иммуноглобулинов)
14 кРа
Рис. 5: Анализ возможности фосфорилирования по тирозину белка Р1-А2Иза1.
1. Иммунопреципитация белков из лизата тотального клеточного белка
линии НЕТ-БЙ нормальными мышиными антителами (отрицательный контроль).
2. Иммунопреципитация балков из лизата тотального клеточного белка пинии НЕТ-БЯ антителами, специфичными к фосфотирозину.
Блот инкубирован с антисывороткой, специфичной к Р1А2Ь$а1.
2.3.8. Анализ уровня синтеза и степени фосфорипированчя по тирозину белков рр125РЛК и паксилина в RSVтрансформированных линиях клеток, отличающихся по своим биологическим свойствам.
Вторым направлением работы было изучение некоторых биохимических характеристик двух белков фокальных контактов, принимающих участие в процессе передачи сигналов от интегринов - киназы фокальной адгезии (рр125РЛК) и адапторного белка паксилина.
FAK и паксилин были впервые обнаружены в качестве белков, содержащих повышенные количества фосфотирозина в клетках, трансформированных онкогеном v-src (Glenney and Zokas, 1989; S. Kanner et al., 1990). Для обоих белков показано взаимодействие с белком src (Z. Weng et al., 1993; В. Cobb et al, 1994; Schaller et al, 1994). FAK является тирозин-зависимой протеин киназой Ч.Л. Schaller et al., 1992; S. Hanks et al., 1992). Он фосфорилируется белком src по ряду тирозиновых остатков. Фосфорилированне FAK по тирозину приводит к усилению его киназной активности (Calalb et al., 1995). Для белка паксилина точно не установлена киназа, фосфорилирующая этот белок по тирозину. В качестве возможных кандидатов называют три протеин-киназы: FAK, sic и Csk (M. Schaller and T. Parsons, 1995).
В приведенной работе исследовался уровень синтеза и степень фосфорилирования по тирозину белков FAK и паксилина в линиях RSV трансформированных клеток хомяков, отличающихся по уровню продукции белка v-si'c и метастатической активности.
2.3.8.1. Анализ уровня синтеза и степени фосфорилирования по тирозину ppl2SFÂK.
Предполагают, что белок FAK принимает участие в процессах движения клеток (Owens et al., 1995; Сагу et al., 1996). В связи с этим была изучена экспрессия FAK в ряде RSV трансформированных линий фибробластов хомяка, обладающих различной метастатической активностью (Табл. 3). Было установлено, что исследованные линии клеток продуцируют различные количества FAK-белка, и не обнаружено корреляций между количеством FAK в клетках и метастати .¿ским потенциалом клеточных линий (Табл. 3).
Затем был проведен анализ степени фосфорилирования РАК белка по тирозину. В результате была обнаружена определенная корреляция между метастатическим фенотипом клеток и уровнем фосфорилирования белка РАК: в высокометастазирующих линиях клеток степень фосфорилирования данного белка была в 1.6-2.2 раза выше, чем в низкометастазирующих клетках (Табл. 3).
Корреляций между степенью фосфорилирования белка РАК по тирозину и уровнем продукции белка v-src не обнаружено: в клетках, не синтезирующих у-бгс (5ТНЕ и НЕТ-8К-25С-Ы-га5 34 кл.) или синтезирующих пониженные количества этого белка (НЕТ-БЯ^-гая 6 кл.), уровень фосфорилирования белка РАК практически не снижен, а в некоторых случаях и слегка повышен, по сравнению с уровнем фосфорилирования РАК в линиях клеток, продуцирующих достаточные количества белка у-бгс (НЕТ-БЯ) (Табл. 3).
Таблица 3. Уровень синтеза н степень фосфорплнривання но тирозину белков РАК и пакенлина в ¡^^трансформированных линиях фибробластов хомяков,
Лншщ клеток Спонтанная метастатнческ ая активность, БМА Уровень продукции белка \ -src (ОасКшаи с! а!.. 1996) Сравнителен ая продукция белка РАК Степень фосфоршшро вания по тирозину белка РАК," Сравнительн ая продукция белка паксилина Степень фосфоршшро вания по тирочнну белка паксилина,
НЕТ-БЯ низкая 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
НЕТ-ЗЯ 1 высокая 1.50 0.85 1.77 0.90 3.08
НЕТ-БЫ 8 высокая 1.37 1.13 2.28 1.10 6.30
НЕТ-БЯ-гБС высокая 1.30 1.35 1.60 1.39 3.25
НЕТ-БИ-Ы-газ бкл. низкая 0.22 1.47 1.29 1.36 1.43
НЕТ-5К-25С-Ы-гаэ 34кл. низкая 0.00 1.57 1.17 1.39 0.00
ЭТНЕ низкая ' 0.00 0.74 0.84 0.55 0.00
Сравнительная степень фосфорилирования белков РАК или паксилина по тирозину отнесенная к уровню продукции этих белков в данной линии клеток.
2.3.8.2. Анализ уровня продукции и степени фосфорилирования по тирозину белка паксилииа.
При исследовании уровня синтеза белка паксилииа, примерно одинаковое его количество было обнаружено во всех линиях клеток. В линии спонтанно трансформированных фибробластов STHE количество паксилина было снижено. Каких либо связей между продукцией паксилина и метастатическим потенциалом данных клеток обнаружено не было (Табл. 3).
При изучении степени фосфорилирования паксилииа по тирозину была найдена значительная корреляция между уровнем фосфотирозипа в паксилине и биологическими свойствами исследованных линий клегок (Табл. 3). В высокометастазируюших клетках степень фосфорнлирошшня ппксилшп была в 3-6 раз выше, чем в низкометастазнрующих.
Представленные в работе данные позволяют предположить, что именно белок v-src фосфорилирует паксилин, поскольку в линиях клеток, не продуцирующих v-src, фосфорнлированный по тирозину паксилин не обнаружен (Табл. 3). Линии клеток STHE и HET-SR-2SC-N -ras 34кл. содержат значительные количества белка РАК, и этот белок имеет достаточный уровень фосфотирозипа, что предполагает, что FAK в этих клеточных линиях является активной киназой. Но судя по отсутствию фосфорилированного по тирозину паксилина в линиях STHE и HET-SR-2SC-N-ras 34кл. (Табл. 3), такой уровень фосфорилирования белка FAK не достаточен для того, чтобы FAK фосфорилировал паксилин.
Итак, был обнаружен повышенный уровень фосфотирозипа в таких компонентах путей передачи сигнала, как FAK и паксилин, в высокометастазирующих линиях клеток по сравнению с ннзкометастазирующими. Исходя из этого можно предположить, что различный уровень фосфорилирования сигнальных белков может модулировать процессы передачи сигнала и таким образом влиять на многие биологические свойства клеток, в том числе и на метастатическую активность.
выводы.
1. Методом двойных гибридов показано специфичное взаимодействие продукта неизвестного ранее гена узеар! (белок, ассоциированный с концевой последовательностью белка у-вгс) клеток хомяков с С-концом НМ-варианта онкобелка у-эгс.
2. Методами 1) двойных гибридов, 2) преципитации ОБТ-гибридных белков и 3) ко-иммунопреципитации, обнаружено специфичное взаимодействие неизвестного ранее белка РЬА21т1 (фосфолипаза А2 хомяков, ассоциированная с белком бгс) с продуктом онкогена у-бгс.
3. Методом преципитации ОБТ-гибридных белков установлено, что сродство белка РЬА2Ьза1 к белку у-бгс-НМ выше, чем к у-бгс-ЬМ. Выявлена также потенциальная способность белка РЬА2Ьза1 взаимодействовать с белком с-бгс, происходящим из клеток кур и хомяков.
4. Исследована локализация РЬА21иа1 в трансформированных клетках хомяков. Полученные данные позволяют предположить ассоциацию белка РЬА2Ъза1 с компонентами эндоплазматической сети и присутствие некоторого количества этого белка в цитоплазме клеток.
5. Вьивлено повышенное количество . фосфотирозина в ключевых белках, участвующих в процессе передачи сигнала от интегринов - киназе фокальной адгезии (РАК) и адапторном белке паксилине в высокометастазирующих линиях трансформированных фибробластов хомяка по сравнению с содержанием фосфотирозина в данных белках в низкометастазирующих линиях.
6. Обнаружена корреляция между степенью фосфорилирования паксилина по тирозину и уровнем продукции белка у-бгс в трансформированных линиях фибробластов хомяков. Подобная корреляция не выявлена при исследовании фосфорилирования по тирозину белка РАК.
7. Установлено, что белок РАК не способен фосфорилировать паксилин по тирозину в линиях клеток, не экспрессирующих онкоген \-src.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. O.Mizcnma, Y.Yanushevich, A.Rodina, J.C.amonis, A.Taviiian, A.Tatosyan. Cellular proteins binding to the C-terminal pait of tvvo variants of v-src oncoprotein from low and high metastatic RSV-transformed hamster cells. Tes. The XXIV Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 1996, p. 181.
2. О. Мизешма, Ю. Янушевич, А. Родина, Э. Зуева, А. Татосян. Поиск белковых партнеров двух изоформ онкобелка v-src, выявленных в клетках, различающихся по своим метастатическим свойствам. Тез. д. I Съезд Онкологов стран СНГ., 1996, 1ч., с.95.
3. O.Mizcnma, Y.Yanushevich, E.Musatkina, A.Rodina, J.Camonis, A.Taviiian, A.Tatosyan. C-terminal end of v-src protein interacts with peptide coded by gadd/adaptl5-like RNA in two-hybrid system. FEBS Letters, 1998, v.422, p. 79-84.
4. A. Rodina, K. Schramm, E. Musatkina, E.-D. Kreuscr, A. Tavitian, A. Tatosyan. Phosphorylation of pl25, AK and paxillin focal adhesion proteins in src-transfonned cells with different metastatic capacity. FEBS Letters, 1999, v. 455, p. 145-148.
Родима Анна Анатольевна
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ СУБСТРАТОВ ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФОРМ ОНКОГЕНА У-81*С
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Лицензия Л Р. N9 020359 от 29.12.91 г. Подписано в печать 25.05.99 г.' Формат 60x90/16. ' Уч.изд.листов 1,6 Тираж 60 экз. № заказа 582
Подготовлено к юдишю я отпечатало в;ТРИНЮ"И. 142092, г.Тронцк. Моск. обл.
Оглавление диссертации Родина, Анна Анатольевна :: 1999 :: Москва
1. Введение.
2. Обзор литературы. 14 Методы идентификации белок-белковых взаимодействий. Система двойных гибридов.
2.1. Введение.
2.2. Система двойных гибридов, разработанная Fields и Song.
2.3. Развитие системы двойных гибридов.
2.3.1. Транскрипционные факторы.
2.3.2. Векторы.
2.3.3. Репортерные штаммы дрожжей. . ••.
2.3.4. Трансформация дрожжей. .
2.3.5. Конъюгация дрожжей.
2.4. Скрининг библиотек.
2.5. Элиминация ложноположительных результатов.
2.6. Проблемы, возникающие при использовании системы двойных гибридов.
2.7. Преимущества системы двойных гибридов.
2.8. Возможности использования системы двойных гибридов.
2.9. Изучение ДНК-белковых взаимодействий.
2.9.1. Обнаружение активирующих последовательностей ДНК.
2.9.2. Идентификация ДНК-связывающих белков.
2.9.3. Метод обнаружения ДНК-связывающих доменов.
2.10. Обратная система двойных гибридов, определяющая диссоциацию белок-белковых взаимодействий.
2.11. Система трех гибридов. 48 2.11.1. Обнаружение РНК-белковых взаимодействий при помощи системы трех гибридов.
2.12. Обнаружение белок-белковых взаимодействий в клетках животных. 51 2.12.1. Метод количественной репликации.
2.12.2. Стратегия отбора взаимодействующих белков в ядре.
2.13. Бактериальная система двойных гибридов.
Введение диссертации по теме "Онкология", Родина, Анна Анатольевна, автореферат
Вирус саркомы Рауса (RSV) способен трансформировать клетки некоторых позвоночных in vitro и вызывать опухоли у некоторых видов лабораторных животных. Трансформирующая активность RSV связана с наличием в его геноме онкогена v-src, кодирующего тирозин-зависимую протеинкиназу (R. Jove and Н. Hanafusa, 1987). В геноме нормальных ^трансформированных клеток находится протоонкоген c-src, гомологичный гену v-src, но не обладающий трансформирующей активностью (D.Stehelin et al., 1976).
Продукт гена src принимает участие в передаче различного рода сигналов в клетке, взаимодействуя при этом с другими клеточными белками. Поиск субстратов src необходим для идентификации путей передачи сигналов, а также для понимания механизма трансформации, осуществляемой продуктом гена v-src.
Непермиссивные клетки, трансформированные RSV, являются хорошей моделью для исследования процесса опухолевой трансформации, а также такой важной стадии прогрессии опухоли как метастазирование.
Ранее в НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН была создана экспериментальная модельная система для изучения метастатического эффекта вируса саркомы Рауса (Deichman et al., 1989). Было получено несколько линий фибробластов сирийского хомяка, независимо трансформированных in vitro штаммом Шмидт-Руппин D вируса саркомы Рауса. Все линии хотя и обладали типичным трансформированным фенотипом и были высокотуморогенны для сингенных животных, различались по способности к спонтанному метастазированию (Deichman et al., 1989).
Различия в метастатической активности этих линий коррелируют с определенными структурными изменениями в гене v-src из высоко и низкометастазирующих клеток. Путем молекулярного клонирования были получены новые изоформы онкогена v-src из данных линий: v-src-HM из высокометастазирующей линии и v-src-LM из низкометастазирующей линии (A.Tatosyan et al., 1996).
Ранее методом двойных гибридов был осуществлен скрининг библиотеки к-ДНК, полученной из низкометастазирующей линии RSV-трансформированных фибробластов хомяков НЕТ-БЯ, для обнаружения потенциальных партнеров онкогена у-эгс. В результате бьшо получено несколько клонов, кодирующих белки, взаимодействующие с фрагментом белка у-вгс в системе двойных гибридов (М1гешпа & а!., 1998). К ним относятся белок узеар1 (белок, ассоциированный с концевым фрагментом белка у-вгс) и РЬА2Ьза1 (ген, кодирующий фосфолипазу А2 клеток хомяка, ассоциированную с белком бгс). УБеар1 и РЬА2Ьза1 являются новыми генами. Эти последовательности не были известны ранее.
Целью данной работы является исследование потенциальных клеточных субстратов продукта онкогена у-йгс и сравнительный анализ взаимодействия одного из обнаруженных белков с различными изоформами у-бгс. Исследования велись по двум направлениям:
1) Анализ потенциальных партнеров онкогена у-бгс.
2) Изучение определенных биохимических характеристик некоторых белков фокальной адгезии, известных в качестве партнеров белка вгс.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать взаимодействие продукта гена РЬА2Ьза1, обнаруженного в результате скрининга библиотеки к-ДНК,
- с С-концевым фрагментом белка у-эгс-НМ и С-концевым фрагментом белка у-вгс-ЬМ в системе двойных гибридов.
- с полноразмерными белками у-вгс-НМ, у-эгс-ЬМ, а также с с-эгс белком при помощи системы гибридных белков глутатион-Б-трансферазы.
2. Анализ обнаруженного взаимодействия путем прямой ко-иммунопреципитации продукта РЬА2118а1 с белком у-бгс из белкового лизата клеток линии ЯБУ-трансформированных фибробластов хомяков.
3. Изучение локализации и возможности фосфорилирования белка РЬА2Ьза1 в клетках трансформированных линий фибробластов хомяков.
4. Анализ уровня синтеза и степени фосфорилирования следующих белков: киназы фокальной адгезии (рр125гдк) и адапторного белка паксилина в трансформированных линиях фибробластов хомяков, обладающих различной метастатической активностью и уровнем продукции онкобелка v-src.
Работа имеет теоретическое значение для понимания деталей трансформирующего механизма продукта v-src, в частности ассоциации онкобелка src с различными белками, вовлеченными в процесс передачи сигнала в опухолевых клетках.
В результате проведенных исследований было показано, что продукт гена vseapl специфично взаимодействует с С-концевым фрагментом белка v-src-HM в системе двойных гибридов. Было также убедительно доказано взаимодействие белков PLA2hsal и v-src при помощи ряда методов in vivo и in vitro. Методами двойных гибридов и гибридных белков, содержащих глитатион-Б-трансферазу (GST), было впервые обнаружено различное сродство белка PLA2hsal к изоформам белка v-src, полученным из линий с различной метастатической активностью. Методом GST-гибридных белков была показана возможность взаимодействия белков PLA2hsal и с-src. Как уже говорилось, белок src является одним из основных белков системы передачи сигнала в клетке. Он входит в различные сигнальные пути. В следствие приведенных особенностей белка src, поиск его партнеров является очень актуальной проблемой на данный момент. В настоящее время выявлено около 50 белков, которые потенциально могут являться субстратами pp60src, т.е. белками, у которых изменяется уровень фосфорилирования по тирозину под действием pp60src ( G.Gillet et al., 1995 ). Оригинальность полученных в этой работе данных заключается в том, что исследуемые белки vseapl и PLA2hsal являются новыми, не известными ранее партнерами белка src. Результаты по сродству белка PLA2hsal к разновидностям белка v-src из клеточных линий с различной метастатической активностью дают возможность делать предположения о роли этого взаимодействия в процессах src-ассоциированного метастазирования.
Была исследована степень продукции белка PLA2hsal в линиях трансформированных фибробластов хомяка, отличающихся по ряду параметров, обнаружены определенные корреляции. Исследована локализация и возможность фосфорилирования белка PLA2hsal в трансформированных клетках хомяка.
Одним из путей передачи сигнала, в котором принимает участие белок src, является сигнальный путь через интегрины. Он активируется при взаимодействии белков экстраклеточноо матрикса со своими трансмембранными клеточными рецепторами - интегринами. Это взаимодействие приводит к аутофосфорилированию подмембранной киназы фокальной адгезии (FAK). Затем FAK взаимодействует с белком Src. Последствием этого взаимодействия является фосфорилирование FAK по ряду тирозиновых остатков. FAK и Src взаимодействуют с адапторным белком паксилином, локализованным в области фокальных контактов, и какая-то из этих тирозин-киназ фосфорилирует паксилин. Затем белки FAK и паксилин через промежуточные адапторные белки (GRB2 и Crk) взаимодействуют с белками, регулирующими активностью белка ras (такими как Sos) и далее этот сигнальный путь идет через МАР-киназы в ядро клетки (М. Schaller and Т. Parsons, 1995; E.Clark and J.Brugge, 1995)(см. схему).
Схема пути передачи сигнала через интегрины. Белки экстраклеточного матрикса (фибронектин) е грины щшсилин экспрессия генов
В работе бьша использована модель, полученная и охарактеризованная ранее в НИИ Канцерогенеза и состоящая из набора трансформированных линий фибробластов сирийского хомяка, отличающихся по ряду биологических свойств, таких как метастатическая активность in vivo, уровень продукции онкобелка v-src, секреция простагландинов (G. Deichman et al., 1989; G. Deichman et al., 1992; G. Deichman et al., 1996). Линии клеток отличались также по структуре сети фибронектина - основного компонента внеклеточного матрикса у данных клеток (А. Tatosyan et al., 1996). В связи с этим, вторым направлением работы было изучение уровня синтеза и степени фосфорилирования по тирозину двух белков фокальных контактов: киназы фокальной адгезии (FAK) и адапторного белка паксилина. Эти белки являются ключевыми компонентами цепи передачи сигнала от интегринов (см. схему) и известны в качестве партнеров белка src. Была обнаружена прямая корреляция между метастатической активностью исследованных клеточных линий и уровнем фосфорилирования по тирозину белков FAK и паксилина.
2. Обзор литературы.
Методы идентификации белок-белковых взаимодействий.
Система двойных гибридов.
2.1. Введение.
Специфические взаимодействия между белками формируют основу многих важнейших биологических процессов. Например, биологические "машины", такие как рибосомы, сплайсосомы или полимеразы содержат много различных белков и играют фундаментальную роль в синтезе макромолекул. Сети взаимодействующих факторов передачи сигналов регулируют экспрессию генов, контролирующих клеточный рост и дифференцировку (L. Guarente, 1993).
Взаимодействия между белками в основном изучаются с использованием биохимических методов: таких как кроссшивка белков, ко-иммунопреципитация и хроматографическое кофракционирование.
При проведении экспериментов по ко-иммунопреципитации, в продуцируемые клеткой белки вводят радиоактивную метку. Затем при помощи антител к известному белку путем преципитации получают иммунокомплексы, содержащие белки, ассоциированные с данным известным белком. Полученные иммунокомплексы разделяют в полиакриламидном геле и по наличию радиоактивной метки выявляют белки, ассоциированные с данным белком. Таким методом, однако, можно определить только примерную молекулярную массу ассоциированных белков. Получение клонированных генов, кодирующих эти белки, часто затруднено (С. Chien et al., 1991). Эту проблему можно обойти, используя очищенные белки в качестве проб при скрининге экспрессирующих библиотек бактерий. При таком подходе, при выявлении взаимодействующего белка, доступен и кодирующий его ген (P. Nelbock et al., 1990).
Недавно был описан еще один подход к обнаружению взаимодействующих белков. Метод основан на фиксации синтезированного белка на твердой подложке и на детекции белков-мишеней, кодируемых библиотекой к-ДНК, взаимодействующих с этим белком. Белок, используемый в качестве "наживки" для обнаружения взаимодействующих с ним белков, получают в Е. coli в виде гибридного белка с белком-носителем биотин карбоксилазы (ВССР) (S. Li and J. Cronan, 1992). Фрагмент BCCP подвергается биотинилированию в клетках Е. coli (J. Cronan, 1990). За счет этого, гибридный белок может быть фиксирован на носителе, содержащем авидин или стрептавидин. Клетки, продуцирующие этот гибридный белок, инфицируют рекомбинантным фагом 1, кодирующим химерную конструкцию гена Ь-галактозидазы с последовательностью из библиотеки к-ДНК на С-конце. Образованный с химерной конструкции гибридный белок сохраняет свою Ь-галактозидазную активность. При переносе фаговых бляшек на фильтры, покрытые авидином, происходит фиксация ВССР-гибридных белков. В случае, если белок-"наживка" и белок, кодируемый фрагментом к-ДНК, взаимодействуют, гибрид Ь-галактозидазы также сохраняется на фильтре. Окраска хромогенным субстратом b-галактозидазы выявляет позитивные бляшки (F. Germino et al., 1993).
Представленные выше подходы к обнаружению взаимодействующих белков являются системами in vitro. Использование методов in vivo более предпочтительно, поскольку данные условия проведения опытов считаются приближенными к естественным.
Заключение диссертационного исследования на тему "Идентификация потенциальных клеточных субстратов для различных изоформ онкогена V-src"
6. Выводы.
1. Методом двойных гибридов показано специфичное взаимодействие продукта неизвестного ранее гена УБеар 1 (белок, ассоциированный с концевой последовательностью белка у-вгс) клеток хомяков с С-концом НМ-варианта онкобелка у-вгс.
2. Методами 1) двойных гибридов, 2) преципитации ОБТ-гибридных белков и 3) ко-иммунопреципитации, обнаружено специфичное взаимодействие неизвестного ранее белка РЬА2Ьза1 (фосфолипаза А2 хомяков, ассоциированная с белком вгс) с продуктом онкогена у-бгс.
3. Методом преципитации ОБТ-гибридных белков установлено, что сродство белка РЬА2Ьва1 к белку у-вгс-НМ вьппе, чем к у-вгс-ЬМ. Выявлена также потенциальная способность белка РЬА21т1 взаимодействовать с белком с-вгс, происходящим из клеток кур и хомяков .
4. Исследована локализация Р1А2118а1 в трансформированных клетках хомяков. Полученные данные позволяют предположить ассоциацию белка РЬА2Ьва1 с компонентами эндоплазматической сети и присутствие некоторого количества этого белка в цитоплазме клеток.
5. Выявлено повышенное количество фосфотирозина в ключевых белках, участвующих в процессе передачи сигнала от интегринов - киназе фокальной адгезии (БАК) и адапторном белке паксилине в высокометастазирующих линиях трансформированных фибробластов хомяка по сравнению с содержанием фосфотирозина в данных белках в низкометастазирующих линиях.
6. Обнаружена корреляция между степенью фосфорилирования паксилина по тирозину и уровнем продукции белка у-бгс в трансформированных линиях фибробластов хомяков. Подобная корреляция не выявлена при исследовании фосфорилирования по тирозину белка БАК.
7. Установлено, что белок РАК не способен фосфорилировать паксилин по тирозину в линиях клеток ЭТНЕ и НЕТ-8Я-28С-Ы-газ 34 кл.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 1999 года, Родина, Анна Анатольевна
1. Aarsman, A., de Jong, J., Arnoldussen, E., Neys, F., van Wassenaar, P. and Van den Bosch, H. (1989). Immunoaffinity purification, partial sequence, and subcellular localization of rat liver phospholipase A2. J. Biol. Chem. 264(17), 10008-10014.
2. Acheson, N. (1980). DNA Tumor Viruses, ed. Tooze. J. (Cold Spring Harbor Lab., NY), 151-160.
3. Van Aelst L., Barr M., Marcus S., Polverino A., Wigler M. (1993). Complex formation between RAS and RAF and other protein kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 62136217.
4. Axelrod, J., Burch, R. and Jelsema, C. (1988). Receptor-mediated activation of phospholipase A2 via GTP-binding proteins: arachidonic acid and its metabolites as second messengers Trends Neurosci 11, 117-123.
5. Barbour, S. and Dennis E. (1993). Antisense inhibition of group II phospholipase A2 expression blocks the production of prostaglandin E2 by P388D1 cells. J. Biol. Chem. 268(29), 21875-21882.
6. Bartel, P., Chien, C., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993). Elimination of false positives that arise in using the two-hybrid system. BioTechniques 14, 920-924.
7. Bartel, P., Chien, C., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993a) in "Cellular interactions in development: a practical approach" (D.A. Hartley, ed.) Oxford University Press, Oxford, 153-179.
8. Bartel P. and Fields S. (1995). Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 254, 241-263.
9. Bendixen, S. Gangloff and R. Rothstein (1994). A yeast mating-selection scheme for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research 22(9), 1778-1779.
10. Boeke, J., LaCroute, F. and Fink, G. (1984). A positive selection for mutants lacking orotidine-5-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol. Gen. Genet. 197, 345-346.
11. Bogerd, H., Fridell, R„ Blair, W., Cullen B. (1993). Genetic evidence that the Tat proteins of human immunodeficiency virus types 1 and 2 can multimerize in the eukaryotic cell nucleus. J. Virol 67,5030-5034.
12. Brent, R. and Ptashne, M. (1985). A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43, 729-736.
13. Brown, N., Costanzo, M. and Fox, T. (1994). Interaction among three proteins that specifically activate translation of the mitochondrial COX3 mRNA in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 14, 1045-1053.
14. Brunton, V., Ozanne, B., Paraskeva, G. and Frame, M. (1997). A role for epidermal growth factor receptor, c-src and focal adhesion kinase in an in vitro model for the progression of colon cancer. Oncogene 14, 283-293.
15. Burridge, K., Turner, C. and Romer, L. (1992). Tyrosine phosphorylation of paxillin and ppl25FAK accompanies cell adhesion to extracellular matrix: a role in cytoskeletal assembly. J. Cell Biol. 119(4), 893-903.
16. Calalb, M.B., Polte, T.R. and Hanks, S.K. (1995). Tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase at sites in the catalytic domain regulates kinase activity: a role for src family kinases. Mol and Cell Biol 15(2), 954-963.
17. Cary, L.A., Chang, J.F. and Guan, J. (1996). Stimulation of cell migration by overexpression of focal adhesion kinase and its association with Src and Fyn. J. Cell Sci. 109, 1787-1794.
18. Chan, P., Kanner, S., Whitney, G. and Aruffo, A. (1994). A transmembrane-anchored chimeric focal adhesion kinase is constitutively activated and phosphorylated at tyrosine residues identical to ppl25FAK J. Biol. Chem. 269, 20567-20574.
19. Chardin, P., Camonis, J., Gale, N., van Aelst, L., Schlessinger, J., Wigler, M. and Bar-Sagi, D. (1993). Human Sosl: a guanine nucleotide exchange factor for Ras that binds to GRB2. Science 260, 1338-1343.
20. Chevray, E. and Nathans, D. (1992). Protein interaction cloning in yeast: identification of mammalian proteins that react with the leucine zipper of Jim. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793.
21. Chien, C-T., Bartel, P., Sternglanz, R., Fields, S. (1991). The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582.
22. Clark, E. and Brugge, J. (1995). Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science 268, 233-239.
23. Cobb, B.S., Schaller, M.D., Leu, T. and Parsons, J.T. (1994). Stable association of pp60src and pp59fyn with the focal adhesion-associated protein tyrosine kinase, ppl25FAK. Mol. Cell. Biol. 14(1), 147-155.
24. Crawford D., Shools, G., Salmon, S. and Davies, K. (1996). adapt33, a novel oxidant-inducible RNA from hamster HA-1 cells. Arch. Biochem. Biophys. 332(2), 255-260.
25. Cronan, J. (1990). Biotination of proteins in vivo. A post-translational modification to label, purify, and study proteins. J. Biol. Chem. 265, 10327-10333.
26. David-Pfeuty, T. and Nouvian-Dooghe, Y. (1990). Immunolocalization of the cellular src protein in interphase and mitotic NIH c-src overexpresser cells. J. Cell Biol. Ill, 30973116.
27. Deichman, G.I., Kashkina, L.M., Mizenina, O.A., Gorojanskaya, E.G., Nikiforov, M.A., Gudkov, A.V., Dyakova, N.A., Komelkov, A.V., Prilutskaya, M.O., Kushlinsky, N.E. and Tatosyan, A.G. (1996). Mechanisms of unusually high antioxidant activity of RSV
28. SR-transformed cells and of its suppression by activated p21ras. Int. J. Cancer 66, 747752.
29. Dennis, E. (1983) in The Enzymes (Boyer, P., ed). Academic Press, NY 16, 307-353.
30. Dennis, E. (1994). Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A2. J. Biol. Chem. 269(18), 13057-13060.
31. Douglas, H. and Hawthorne, D. (1966). Regulation of genes controlling synthesis of the galactose pathway enzymes in yeast. Genetics 54(3), 911-916.
32. Durfee, T., Becherer, K., Chen, P-L., Yeh, S-H., Yang, Y., Kilburn, A., Lee, W-H., Elledge, S. (1993). The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic subunit. Genes Dev. 7, 555-569.
33. Dutta, A., Wang, L., Hanafusa, T. and Hanafusa, H. (1985). Partial nucleotide sequence of Rous sarcoma virus-29 provides evidence that the original Rous sarcoma virus was replication-defective. J. Virol. 55, 728-735.
34. Eide, B., Turck, C. and Escobedo, J. (1995). Identification of Tyr-397 as the primary site of tyrosine phosphorylation and pp60src association in the focal adhesion kinase, ppl25FAK. Mol. Celt. Biol. 15(5), 2819-2827.
35. Feilotter, H., Hannon, G., Ruddel, C., Beach, D. (1994). Construction of an improved yeast strain for two hybrid screening. Nucleic Acids Res. 22, 1502-1503.
36. Fields,S. and Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246.
37. Fields, S. (1993). The two-hybrid system to detect protein-protein interactions. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 5, 116-124.
38. Fields, S. and Sternglanz, R. (1994). The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. Trends in Genetics 10(8), 286-292.
39. Fincham, V.J., Wyke, J.A. and Frame, M.C. (1995). v-src induced degradation of focal adhesion kinase during morphological transformation of chicken embryo fibroblasts. Oncogene 10, 2247-2252.
40. Flick J. and M. Johnston (1990). Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 10(9), 4757-4769.
41. Germino, F., Wang, Z. and Weissman, S. (1993). Screening for in vivo protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad Sei. USA 90, 933-937.
42. Gillet, G., Guerin, M., Trembleau, A. and Brun, G. (1995). A £c/-2-related gene is activated in avian cells transformed by the Rous sarcoma virus. The EMBO Journal 14(7), 1372-1381.
43. Glaser, K. (1995). Regulation of phospholipase A2 enzymes: selective inhibitors and their pharmacological potential. Adv. Pharmacol. 32, 31-66.
44. Glenney, J.R. and Zokas, L. (1989). Novel tyrosine kinase substrates from Rous sarcoma virus-transformed cells are present in the membrane skeleton. J. Cell Biol. 108, 24012408.
45. Guarente, L. (1993). Strategies for the identification of interacting proteins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 1639-1641.
46. Hanks, S.K., Calalb, M.B., Harper, M.C. and Patel, S.K. (1992). Focal adhesion protein-tyrosine kinase phosphorylated in response to cell attachment to fibronectin. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8487-8491.
47. Hannon, G., Demetrick, D. and Beach, D. (1993). Isolation of the Rb-related pl30 through its interaction with CDK2 and cyclins. Genes Dev. 7, 2378-2391.
48. Hardy, C., Sussel, L., Shore, D. (1992). A RAP-1-interacting protein involved in transcriptional silencing and telomere length regulation. Genes Dev. 6, 801-814.
49. Harper, J., Adami, G., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. (1993). The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of Gl cyclin-dependent kinases. Cell 75, 805-816.
50. Hieter, P., Mann, C., Snyder, M. and Davis, R. (1985). Mitotic stability of yeast chromosomes: a colony color assay that measures nondisjunction and chromosome loss. Cell 40, 381-392.
51. Hofer, F., Fields, S., Schneider, C. and Martin, S. (1994). Activated Ras interacts with the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1108911093.
52. Hollander, M., Alamo, I. and Fornace, J. (1996). A novel DNA damage-inducible transcript, gadd7, inhibits cell growth, but lacks a protein product. Nucleic Acids Res. 24, 1589-1593.
53. Hollenberg, S., Sternglanz, R., Cheng, P. and Weintraub, H. (1995). Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15(7), 3813-3822.
54. Holt, K., Olson, A., Moye-Rowley, W. andPessin, J. (1994). Phosphatylinositol 3-kinase activation is mediated by high-affinity interactions between distinct domains within the pi 10 and p85 subunits. Mol. Cell. Biol. 14, 42-49.
55. Johnston, M. (1987). A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiaq. Microbiol. Rev. 51, 458-476.
56. Johnston, M. and Davis, R. (1984). Sequences that regulate the divergent GAL1-GAL10 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 4, 1440-1448.
57. Jove, R. and Hanafusa, H. (1987). Cell transformation by the viral Src oncogene. Annu. Rev. Cell Biol. 3,31-56.
58. Kanner, S.B., Reynolds, A.B., Vines, R.R. and Parsons, J.T. (1990). Monoclonal antibodies to individual tyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-encoded tyrosine-kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3328-3332.
59. Karimova, G., Pidoux, J., Ullmann, A. and Ladant, D. (1998). A bacterial two-hybrid system based on a reconstituted signal transduction pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,5752-5756.
60. Keegan, L., Gill, G. and Ptashne, M. (1986). Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein. Science 231, 699-704.
61. Kikuchi, A., Demo, S., Ye, Z., Chen, Y. and Williams, L. (1994). ral GDH family members interact with the effector loop of ras p21. Molecular and cellular biology 14, 7483-7491.
62. Krueger, J., Wang, E., Garber, E. and Goldberg, A. (1980). Difference in intracellular location of pp60src in rat and chicken, cells transformed by Rous sarcoma virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4142-4146.
63. Ladant, D. (1988). Interaction of Bordetella pertussis adenylate cyclase with calmodulin. Identification of two separated calmodulin-binding domains. J. Biol. Chem. 263, 26122618.
64. Ladant, D., Michelson, S., Sarfati, R., Gilles, A., Predeleanu, R. and Barzu., O. (1989). Characterization of the calmodulin-binding and of the catalytic domains of Bordetella pertussis adenylate cyclase. J. Biol. Chem. 264,4015-4020.
65. Li, S. and Cronan, J. (1992). The gene encoding the biotin carboxylase subunit of Escherichia coli acetyl-CoA carboxylase. J. Biol. Chem. 267, 855-863.
66. Li, B. and Fields, S. (1993). Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two-hybrid system. FASEB J. 7, 957-963.
67. Li, J. and Herskowitz, I. (1993). Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science 262, 1870-1874.
68. Liu, F. and Green, M. (1990). A specific member of the ATF transcription factor family can mediate transcription activation by the adenovirus Ela protein. Cell 61, 1217-1224.
69. Liu, J., Wilson, T., Milbrandt, J. and Johnston, M. (1993). Identifying DNA-binding sites and analyzing DNA-binding domains using a yeast selection system. METHODS: A Companion to Methods inEnzymology 5, 125-137.
70. Luban, J., Bossolt, K., Franke, E., Kalpana, G. and Goff, S. (1993). Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds to cyclophilins A and B. Cell 73, 10671078.
71. J.Luban and S.Goff (1995). The yeast two-hybrid system for studying protein-protein interactions. Current opinion in biotechnology 6, 59-64.
72. Luo, Y., Yu, H., Peterlin, B. (1994). Cellular protein modulates effects of human immunodeficiency virus type 1 Rev. J. Virol. 68, 3850-3856.
73. Ma, J. and Ptashne, M. (1987). Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments. Cell 48, 847-853.
74. Mizenina, O., Yanushevich, Y., Musatkina, E., Rodina, A., Camonis, J., Tavitian, A. and Tatosyan, A. (1998). C-terminal end of v-src protein interacts with peptide coded by gadd7/adapt 15-like RNA in two-hybrid system. FEBS Letters 422, 79-84.
75. Nelbock, P., Dillon, P., Perkins, A. and Rosen, C. (1990). A cDNA for a protein that interacts with the human immunodeficiency vims Tat transactivator. Science 248, 16501653.
76. Nigg, E., Sefton, B., Hunter, T., Walter, G. and Singer, S. (1982). Immunofluorescence localization of the transforming protein of Rous sarcoma virus with antibodies against a synthetic src peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5322-5326.
77. Owens, L.V., Xu, L., Craven, R.J., Dent, G.A., Weiner, T.M., Kornberg, L., Liu, E.T. and Cance, W.G. (1995). Overexpression of the focal adhesion kinase(pl25(FAK)) in invasive human tumours. Cancer Res. 55, 2752-2755.
78. Peden, W, Pipas, J., Pearson-White, S. and Nathans. D. (1980). Isolation of mutants of an animal virus in bacteria. Science 209, 1392-1396.
79. Petermann, R., Mossier, B., Aryee, D. and Kovar, H. (1998). A recombination based method to rapidly assess specificity of two-hybrid clones in yeast. Nucleic Acids Research 26(9), 2252-2253.
80. Ptashne, M. and Gann, A. (1990). Activators and targets. Nature (London) 346, 329-331.
81. Rohrschneider, L. (1979). Immunofluorescence on avian sarcoma virus-transformed cells: localization of the src gene product. Cell 16, 11-24.
82. Rusconi, S., Severne, Y., Georgiev, O., Galli, I. and Wieland, S. (1990). A novel expression assay to study transcriptional activators. Gene 89, 211-221.
83. Sathe, G., O'Brian, S., McLaughlin, M., Watson, F. and Livi, G. (1991). Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells. Nucleic Acids Research 19, 4775.
84. Schaller, M.D., Borgman, C.A., Cobb, B.S., Vines, R.R., Reynolds, A.B. and Parsons, J.T. (1992). ppl25FAK, a structurally distinctive protein-tyrosine kinase associated with focal adhesions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5192-5196.
85. Schaller, M.D., Hildebrand, J.D., Shannon, J.D., Fox, J.W., Vines, R.R. and Parsons, J.T. (1994). Autophosphorylation of the focal adhesion kinase, ppl25FAK, directs SH2-dependent binding of pp60src. Mol. and Cell. Biol. 14(3), 1680-1688.
86. SenGupta, D., Zhang, B., Kraemer, B., Pochart, P., Fields, S. and Wickens, M. (1996). A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8496-8501.
87. Shalloway, D., P.M. Coussens and P. Yaciuk (1984). Overexpression of the c-src protein does not induce transformation of NIH 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7071-7075.
88. Shrivastava, A., Saleque, S., Kalpana, G., Artandi, S., Goff, S. and Calame, K. (1993). Inhibition of transcriptional regulator Yin-Yang-1 by association with c-Myc. Science 262, 1889-1892.
89. Staudinger, J., Perry, M., Elledge, S. and Olson, E. (1993). Interactions among vertebtate helix-loop-helix proteins in yeast using the two-hybrid system. J. Biol. Chem. 268,4608-4611.
90. Stehelin,D., Varmus, H., Bishop, J. and Vogt, P. (1976). DNA related to the transforming gene(s) of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA. Nature 260, 170-173.
91. Turner, C. and Miller, J. (1994). Primary sequence of paxillin contains putative SH2 and SH3 domain binding motifs and multiple LIM domains: identification of a vinculin and pp 125FAK-binding region. J. Cell Sci. 107, 1583-1591.
92. Uhlenbeck, O., Carey, J., Romaniuk, P., Lowary, P. and Beckett, D. (1983). Interaction of R17 coat protein with its RNA binding site for translational repression. J. Biomol. Struct. Dyn. 1, 539-552.
93. Ullmann, A. and Danchin, A. (1983) in Advances in Cyclic Nucleotide Research (Raven, NY) 15, 1-53.
94. Van den Bosch, H. (1980). Intracellular phospholipases A Biochim. Biophys. Acta 604, 191-246.
95. Vasavada, H., Ganguly, S., Settleman, J., DiMaio, D. and Weissman, S. (1988). A model system for the rescue of cDNA encoding transacting transcription activator by contingent replication assay. Indian J. Boichem. Biophys. 25, 488-494.
96. Vasavada, H., Ganguly, S., Germino, F., Wang, Z. and Weissman, S. (1991). A contingent replication assay for the detection of protein-protein interactions in animal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10686-10690.
97. Verheij, H., Slotboom, A. and de Haas, G. (1981). Structure and function of phospholipase A2. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 91, 91-203.
98. Vidal, M., Brachmann, R., Fattaey, A., Harlow, E. and Boeke, J. (1996). Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10315-10320.
99. Vojtek, A., Hollenberg, S. and Cooper, J. (1993). Mammalian ras interacts directly with the serine/threonine kinase raf. Cell, 74, 205-214.
100. Waite, M. (1987). in Phospholipases (Hanahan, D., ed) Plenum Publishing Corp., NY.
101. Wang, M. and Reed, R. (1993), Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature 364, 121-126.
102. Weng, Z., Taylor, J., Turner, C., Brugge, J. and Seidel-Dugan, C. (1993). Detection of Src homology 3-binding proteins, including paxillin, in normal and v-src-transformed Balb/c 3T3 cells. J. Biol. Chem. 268(20), 14956-14963.
103. Wilson, T., Fahrner, T., Johnston, M. and Milbrandt, J. (1991). Identification of the DNA binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. Science 252, 1296-1300.
104. Wolfiier, M., Yep, D., Messenguy, F. and Fink, G. (1975). Integration of amino acid biosynthesis into the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Biol. 96, 273-290.
105. Wood, C., Turner, C., Jackson, P. and Critchley, D. (1994). Characterization of the paxillin-binding site and the C-terminal focal adhesion targeting sequence in vinculin. J. Cell Sci. 107,709-717.
106. Xing, Z., Chen, H., Nowlen, J., Taylor, S., Shalloway, D. and Guan, J. (1994). Direct interaction of v-src with the focal adhesion kinase mediated by the Src SH2 domain. Mol. Biol, of the Cell 5, 413-421.
107. Zhang, J. and Lautar, S. (1996). A yeast three-hybrid method to clone ternary protein complex components. Anal. Biochemistry 242, 68-72.