Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Новые диагностикумы для оценки функции гемостаза
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.29
Оглавление диссертации Неведрова, Ольга Евгеньевна :: 2000 :: Москва
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. Новые подходы к диагностике функции гемостаза 10 (Обзор литературы)
1, Использование хромогенных субстратов в лабораторных П исследованиях свертывающей системы крови
2. Иммунологические методы в коагулологических исследованиях
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА III. Разработка новых методов диагностики функции 44 гемостаза.
1 .Скрининг хромогенных субстратов
2. Разработка набора для определения содержания плазминогена
3. Разработка набора для определения антитромбина III
4. Разработка набора для определения продуктов ^деградации фибриногена/фибрина
ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Введение диссертации по теме "Гематология и переливание крови", Неведрова, Ольга Евгеньевна, автореферат
Актуальность проблемы
Несмотря на определенные успехи в разработке вопросов, касающихся диагностики ДВС-синдрома, предтромботических и геморрагических состояний, проблема далека от своего разрешения [4, 10, 13, 15, 29, 109]. В нашей стране это положение усугубляется тем, что в широкой клинической практике применяются старые методики, многие из которых уже не используются в передовых странах, Одной из причин, тормозящих внедрение современных методик в клиническую коагулологию является, отсутствие современных отечественных реактивов (хромогенных субстратов, иммунодиагностикумов и др.). Между тем. появление хромогенных субстратов привело к широкому внедрению фотометрических тестов в гемостазиологию [15, 13, 47]. Синтетические хромогенные пептиды имеют последовательность аминокислот, аналогичную участкам естественных субстратов, расщепляемых тромбином, плазмином и другими ферментами системы гемостаза. Отщепление от хромогенного субстрата окрашивающего фрагмента, обычно п-нитроанилина (р№), позволяет по степени развивающейся окраски определить активность действующего фермента. Энзиматическое расщепление субстратов определяется с помощью спектрофотометрии при длине волны 405 нм. Величина изменения поглощения прямо пропорциональна концентрации фермента [8, 23]. Таким образом, хромогенные субстраты позволяют проводить прямые измерения биологической активности энзимов. Амидолитические методы характеризуются простотой выполнения, высокой точностью, воспроизводимостью результатов, возможностью кинетических измерений и автоматизации. Неслучайно Н.БШгтогкеп сказал, что с началом промышленного производства хромогенных субстратов в лабораторной коагулологии начинается новая эра, которая знаменует переход от секундомера к спектрофотометру, от ручных методов исследования к автоматическим [1 22].
Важную роль в современной экспресс-диагностике патологии гемостаза играют также иммунологические методы, в частности, латексные тесты [80, 100]. Латексный иммунодиагностикум представляет собой суспензию частиц полпстирольногс латекса, на поверхность которого иммобилизованы высокоспецифичные антитела к фибриногену и продуктам его ферментативного гидролиза. Иммобилизованные антитела способны избирательно взаимодействовать с определяемым белком, что приводит к агглютинации латексных частиц, которые видны невооруженным глазом. Нагруженный антителами носитель и исследуемый образец, содержащий определяемый антиген, смешивают на стекле и наблюдают агглютинацию при непрерывном покачивании стекла в течение нескольких минут. Таким образом, диагностикум предназначен для количественного экспресс-анализа ПДФ в сыворотке крови. Зная минимальную концентрацию белка, тестируемого по стандартной плазме, можно определить его содержание в исследуемом образце.
В связи с тем, что в нашей стране подобные реактивы не производятся,.;они дороги и покупка их недоступна широкой сети больничных учреждений. Кроме того, структура хромогенных субстратов защищена зарубежными патентами и для производства в нашей стране целесообразен поиск новых структур, которые бы не уступали по диагностической ценности лучшим зарубежным прототипам.
Цель работы
Цель работы - разработка новых оригинальных отечественных хромогенных субстратов, специфичных для плазмина и тромбина, а также создание зкспресс-диагностикума для определения продуктов деградации фибриногена/фибрина,
Основные задачи исследования
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
1. Разработка оптимальной структуры оригинального хромогенного субстрата для оценки действия плазмина.
2. Разработка оптимальной структуры оригинального хромогенного субстрата для оценки действия тромбина.
3. Разработка метода оценки содержания плазминогена с помощью отечественного хромогенного субстрата,
4. Разработка метода определения антитромбина III с помощью оригинального хромогенного субстрата.
5. Оценка возможности использования оригинального плазминового хромогенного субстрата для скрининга и контроля активности активаторов и и н гиб иторо в ф и б р и н ол и з а.
6. Оценка возможности использования оригинального тромбинового хромогенного субстрата для скрининга и контроля активности антикоагулянтов прямого действия.
7. Разработка иммунодиагностикума для определения продуктов деградации фибриногена/фибрина,
Научная новизна
Разработаны оригинальные отечественные хромогенные субстраты для определения активности плазмина, отвечающий формуле For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr, и тромбина, отвечающий формуле z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr. Показано, что указанные субстраты не уступают по своим свойствам зарубежным аналогам, производимыми фирмами "Kabi" и "Behring".
Созданы методики скрининга и контроля активности активаторов и ингибиторов фибринолиза на основании разработанных оригинальных отечественных хромогенных субстратов.
Разработана методика скрининга и контроля активности антикоагулянтов прямого действия.
Практическая ценность
Настоящая работа выполнена в рамках гранта РФФИ "Селективные пептидные ингибиторы громбообразования и фибринолиза. Разработка их фер м е н та т и в н о го си н тез а".
В результате проведенного исследования разработан оригинальный отечественный хромогенный субстрат для оценки активности плазмина, на основе которого создан набор для быстрого и точного определения активности плазминогена и а.2-антиплазмина. Набор может быть внедрен в производство и клинико-диагностическое исследование. Показана пригодность плазминового субстрата для скрининга активаторов и ингибиторов фибринолиза.
Разработан оригинальный отечественный хромогенный субстрат для определения активности тромбина. Показана пригодность тромбинового субстрата для скрининга антикоагулянтов прямого действия.
Разработан иммунодиагностикум для определения содержания продуктов деградации фибриногена/фибрина, который по своим свойствам не уступает диагностикуму Fibro-Tec фирмы "Behring".
Апробация работы состоялась 9 февраля 2000 года на заседании Проблемной комиссии '"Патология гемостаза" ГНЦ РАМН. Отдельные фрагменты работы были представлены на III (1996г.) и VI (1999г.) Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", а также на Международной школе-семинаре по проблемам гемостаза (Норвегия, 1995), на конгрессах, проводимых Международным обществом по проблемам тромбоза и гемостаза (Fibrinolysis; Haemostasis, 1996, 1997, 1998, 1999), а также на конгрессах и симпозиумах, проводимых Средиземноморской лигой по проблемам тромбоза и гемостаза (1997, 1998).
Объем и структура диссертации
Заключение диссертационного исследования на тему "Новые диагностикумы для оценки функции гемостаза"
ВЫВОДЫ:
1. Разработан оригинальный хромогенный субстрат For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr, обладающий селективностью по отношению к плаз ми ну. По своим свойствам он идентичен известному и широко применяемому субстрату H-D-Val-Leu-Lys-pNa,2HG.
2. Создан набор для определения содержания плазминогена, в состав которого включен оригинальный хромогенный субстрат For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr. Набор состоит исключительно из отечественных реактивов.
3. Показана возможность использования указанного набора для оценки специфической активности активаторов и ингибиторов фибринолиза.
4. Разработан оригинальный хромогенный субстрат z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr, обладающий селективностью по отношению к тромбину. По своим свойствам он идентичен известному и широко применяемому субстрату H-D-CHA-But-Arg-pNa.HBr.
5. Создан набор для определения активности антитромбина III, содержащий хромогенный субстрат z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr. Набор включает только отечественные реактивы.
6. Указанный набор пригоден для оценки специфической активности антикоагулянтов прямого действия.
7. Разработан латексный тест, позволяющий быстро установить содержание продуктов деградации фибриногена в сыворотке крови.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2000 года, Неведрова, Ольга Евгеньевна
1. Агафонова О,Г. Виноградов Д.В., Хаспекова С.Г, и др. / Иммунодиагностика дефицитов мембранных гликопротеинов тромбоцитов: тромбастении Глануманиа синдрома Бернара-Судье и дефицита белка GMP-140 БЭ БМ. // 1992.- 12,- с,635-637.
2. Андреенко Г.В. / Методы исследования фибринолитической системы крови, // М., Издат.Моск.Ун-та.-1981,
3. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. / Лабораторные методы исследования системы гемостаза. // М,, Москва.- 1980.
4. Балуда В.П., Деянов И.И., Балуда М.В. и соавт. / Профилактика тромбозов. // Издательство Саратовского университета.- 1992.- с.3*5;
5. Баркаган З.С. / Общие принципы исследования системы гемостаза и анализ новых методов выявления внутрисосудстого свертывания крови. // Тер.арх,- 1988,- 5,- с. 104-110.
6. Баркаган З.С, / Антикоагулянты волчаночного типа. Клиническое значение, диагностика, лечение, // Методические рекомендации.- Барнаул.-1993.
7. Баркаган З.С., Момот А.П. / Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза. //Барнаул.- 1998.
8. Березин И. Мартинек К, / Основы физической химии ферментативного катализа, // Мм Высшая школа,- 1977.
9. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. / Химическая и биологическая кинетика, // М.» Из-во Московского Университета,- 1983.
10. Ю.Гаффни Дж, /Фибринолнз. //М., Медицина,- 1982.
11. КГаффни Дж,/ Фибринолиз. // М., Медицина. -1992.
12. Головина О,Г., Папаян Л.П., Белезо О.Е. и др, // Особенности диагностики болезни Виллебранда, Терапевтический архив.// 1996.- 4.- с.58-61.
13. Исследование системы крови в клинической практике / под ред, КозинцаГ.И.и Макарова В,А. // М,, Триада-Х,- 1997.
14. М.Лычев В.Г, / Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, //М,, Медицина,- 1993.
15. Макаров В.А, / Лекарственные средства для лечения ДВС-синдрома. // Materia Medica.- 1997,- 1,- 13,-с, 37-43.
16. Меньшиков В.В., Гаранина Е.Н, / Контроль качества клинических лабораторных исследований. // М.- 1994.
17. Неведрова О.Е., Потетинова Ж.В., Воюшина Т.Д., Макаров В.А. / Использование первых отечественных хромогенных субстратов для скрининга лекарственных регуляторов функции гемостаза. // В кн.: Лекарства-человеку.-Харьков,- 1999,- 11.- 3,- с.236-241,
18. Петров Р.В. / Иммунология, // М., Медицина,- 1987.
19. Петров Р.В., Хаитов P.M., Манько В.М. / Контроль и регуляция иммунного ответа,// Л., Медицина,- 1981.- с,311,
20. Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови. / под.ред ГавриловО.К.//М,: Медицина, 1981
21. Семенов Н.Н, / О некоторых проблемах химической кинетики и реакционной способности, // М., Из-во АН СССР.- 1958.
22. Blomback M. Blomback B., Olsson P., Svencisen L, / The assay of antithrombin using a synthetic chromogenic substrat for thrombin. // Thronib. Res.-1984.- 5,- p.621-632.
23. Blomback M. / Synthetic peptide substrates Registry of trial. // Thromb, Haemost.- 1989,- 41,- 2.- p.452-458,
24. Bonner G., Marin-Grez M. / Measurement of kallikrein activity in urine of rats and man using a chromogenic tripeptide substrate. // J.Clin.Chem,CI in,Biochem,- 1981,- 19.-3,- p. 165-8.
25. Brandt J.T. Barna L.K., 'Triplet! D.A, / Laboratory identification of lupus anticoagulants; results of the second international workshop for identification of lupus anticoagulants, //Thromb. Haemost.- 1995,- 6.- 74,- p. 1389-1613.
26. Butenas S., DiLorenzo M.E., Mann Iv.G. / Ultrasensitive fluorogenic substrates for serine proteases. // Thromb.Haemost.- 1997,- 78,- 4,- p, 1193-201,
27. Carreras L.O. / Pathogenic role of antiprotein phospholipid antibodies. // Haemostasis, 14th International Congress on Thrombosis. Abstract.- 1996- 3,- L-232,-p,615.49.Chromogenix. / 1997.
28. Claeson G,, Friberger P., Knos M,, Eriksson E. / Methods for determination of prekallikrein in plasma glandular kallikrein and urokinase. // Haemost.- 1978,- 1.- 2-3.- p.76-78,
29. Coleman P,L,, Perry J,P., Wehrly J,A, / Optimization of enzyme-based assays in coagulation testing. II Clin,Chem,- 1983,- 29,- 4,- p,603-8,
30. Comp P.S. / Laboratory evalution of protein S status. // Thromb. Haemost.- 1990,- 16,- p. 177-181.
31. Coombs G.S, et,aL / Distinct mechanisms contribute to stringent substrate specificity of tissue-type plasminogen activator. // J,13iol,Vhem.- 1996,- 271.- 8,- p. 4461-7.
32. Cronlund A.L., Walsh P.N. I A low molecular weight platelet inhibitor of factor Xla: purification, characterization, and possible role in blood coagulation, // Biochemistry,- 1992,- 31,- 6,- p. 1685-94,
33. Dang Q.D. et.al. / Chromogenic substrates selective for activated protein C.- Blood.- 1997,- 89.- 6,- p.2220-2.
34. Exner TM Cotton B,, Howden M. / Detection of specific proenzyme activators in snake venoms by a new immunoabsorbant-chromogenic substrate method//Biochim.Biophys.Acta,- 1985,- 832,- 3,-p.351-6,
35. Fijalkowska 1., Jastrezebowska J., Cierniewski C.S. / Contribution of Pro212-Ile276 sequence of human protein C to its anticoagulant and profibrinolytic activity. //Yhromb,Res.- 1998,- 89,- 2,-p.65-71.
36. Friberger P., Knos M., Gustavsson S. et.al. / Methods for determination of plasmin, antiplasmin and plasminogen by means of substrate S-2251. // Haemostasis.- 1978,- 7,- 2-3,-p. 138-145.
37. Fukuda C., Iijima K., Nakamura K. / Blood coagulation-fibrinolysis tests by a biochemical method. // Rinsho Byori.- 1993.- 41,- 7,- p,743-9.
38. GafTney P.J, / Standartization of plasminogen assays, Haemostasis, // 1988,- 18,- 1,- p.47-60.
39. Gaffney P.J,, Edgell T.A., Creighton-Kempsford L.J. et all. / Fibrin degradation product (FnDP) assay. Analysis of standardisation issues and target antigens in plasma, // Br.J.Haemat.- 1995,- 90,- p.187-194.
40. Gallimore M.J,, Friberger P. / Chromogenic peptide substrate assay and their clinical application. // Blood Rev.- 1991.- 5,- 2.- p.l 17-27,
41. Gan Z.R., Connolly T.M., Sardana M.K. et.al, / Importance of the Arg-Gly-Asp triplet in human thrombin for maintenance of structure and function. // Arch.Biochem.Biophys,- 1993,- 301,- 2.- p.228-36.
42. Gar1oett E.A, et.al. / Proteolysis in human breast and colorectal cancer.-Br,J,Cancer.- 1999,- 81,- 2,- p.287-93.on
43. Guglielmone H.A., Vides M.A. / A hovel functional assay of protein C in human plasma and its comparison with amidolytic and anticoagulant assays. // Thromb, Haemost.- 1992.- 67,- 1,- p,46-49,
44. Hawiger J. et.al. / Methods for determination of plasma components by means of substrate. //J,Lab,Clin,Med.- 1970,- 75,- p.93-108.
45. Herrmann R,PM Bailey P.E. / Plasma thrombin assay using a chromogenic substrate in disseminated intravascular coagulation due to snake bite envenomation. //Thromb,Haemost, 1979,- 41,- 3,- p,544-552.
46. Holmdahl L. / Fibrinolysis in human peritoneum during operation. // Surgery.- 1996,- 119.- 6,- p.701-5.
47. Hopfner K.P. ei.al. / Coagulation factor IXa: the relaxed conformation of Tyr99 blocks substrate binding. // Structure Fold Des.- 1999,- 1 5,- 7,- 8,- p.989-96.
48. Hortin G.L., Trimpe B.L. / Allosteric changes in thrombin's activity produced by peptides corresponding to segments of natural inhibitors and substrates. //J.Biol.Chem.- 1991.- 266,- 11.- p,6866-71.
49. BOJovov B., Wills N.K., Donaldson P.J., Lewis S.A, / Vectorial secretion of a kallikrein-like enzyme by cultured renal cells. General properties, // Am.J.Physiol.-1990,- 259,- 6.- 1,- p.869-882.
50. Kimura K., Endo Y., Sasaki T. / Assay and detection methods for urokinase-type plasminogen activator and its related-factors. // 1999.- 26.-7,- p. 100917.
51. Kobayashi I., Amemiya N., Endo T. et.al. / Amidolytic kinetic assay of protein C by selective spectrophotometry in a centrefugal analyzer. // Clin.Chem.-1988,- 34,- 11,- p.2260-3,
52. Kroon M.E. Koolwijk P., van Goor H. et.all. / Role and localization of urokinase receptor in the formation of new microvascular structures in fibrin matrices. //Am J.Pathol.- 1999,- 154,- 6.- p. 1731-42,
53. Latallo Z.S., Teissereyre E., Lopac-iuk S. / Assessment of plasma fibrinolytic system with use of chromogenic substrate, // Haemost,- 1978.- 7,- 2-3.-p. 150-154.
54. Ledwozyw A., Jablonka S,, Tusinska E., Herbut M. / The estimation of factor VII in livestock plasma of domestic animals by the use of tripeptide chromogenic substrate,// Arch. Vet,Pol.- 1993,- 33,- 1-2,- p. 1 23-127.
55. Madison E.L. / Substrate specificity of tissue type plasminogen activator. // Adv.Exp.Med.Biol,- 1997.-425,-p. 109-21
56. Nalcaci M., Pekcelen V. / Antitrombin III. protein C and protein S plasma levels in patients with Behcet's disease. //J,Int.Med.Res.- 1998,- 26,- 4.-p.206-8.
57. Nicham F,, Guichaoua J.F., Com ant G,, Marti noli J.L. / Rapid determination of protein C activity, //Ann,Biol,Clin,- 1988,- 46,- 10,- p.805-9.
58. Peisach E, et.al. / Crystal structure of the proenzyme domain of plasminogen. // Biochemistry.- 1999.- 38.- 34.- p.l 1180-8.
59. Plasminogen, / Reagent for determination of plasminogen. // Behring E.-Berichrom,- 1990.
60. Rasky K. Patfalusi M., Vereczkey E. / Chromogen-substrate assay astool for monitoring a new thrombin inhibitor, // Acta Pharm. Hung.- 1993,- 63,- 1,-p.3-12,
61. Recllitz A. et.al, / Inducible carboxypeptidase activity, A role in clot lysis in vivo, //Circulation,- 1996,- 93,- 7,- p. 1328-30.
62. Reed G.L. et.al, / A catalytic switch and the conversion of streptokinase to a fibrin-targeied plasminogen activator. // Proc.Mat!,Acad.Sci, USA.- 1999,- 96,16,- p,8879-83.
63. Rock G„ Chauhan K., Jamieson G.A,, Tandon N.N. / Anti-CD36 antibodies in patients with lupus anticoagulant and thrombotic complications. // Br.J.Haematol.- 1994,- 88,- 4,- p.878-80.
64. Rodriguez J., Boulo V., Mislhe E., Bachere E. / Characterisation of shimp haemocytes and plasma components by monoclonal antibodies. // H.Cell Sci,- 1995.-108,-p. 1043-50,nn
65. OS.Rojkjaer R. et.al. / Activation of the plasma kallikrein/kinin system on endothelial cells. //Proc,Assoc.Am.Physicians.- 1999.- 111.- 3.- p.220-7.
66. Van de Werf F. / What do new lytics add to t-PA? // Am.Heart J.- 1999.138,- 2,- p. 115-20.
67. Vinazzer H. / Photometric assay of antitrombin III with a chromogenic substrate. // Haemost.- 1975,- 4,- 2,- p. 101-9.
68. Vinazzer H. / Gerinnugsphysiologie und methoden im Blutge gerinnugslaboratorium. //Stuttgsrt,, G.Fischer Yerlag.- 1979.
69. Vinazzer IT, Pangraz L". / Protein C: comparison of different assays in normal and abnormal plasma samples, //Thromb.Haemost.- 1987,- 46,- 1,- p. 1-8.
70. Vindigni A, / Energetic dissection of specificity in serine proteases. // Comb,Chem,High,Throughput Screen,- 1999,- 2,- 3,- p.139-53,
71. Voyushina T.L. Terenteva E.Yu., Stepanov V.M. / The synthesis of chromogenic peptide substrate containing p-nitroanilicles of arginine and lysine, catalyzed by proteinase adsorbed on support material. // Biomed.Biochim.Acta.-1991,- 50,- p.209-212.
72. Wadhwa M., Barrowcliffe T.W., Mire-Sluis A.R., Thorpe R. / Factor VIII concentrates and the immune system laboratory investigation. // Blood Coagul.Fibrinolysis.- 1995.- 6,- 2,- p.65-79.no
73. Wang C,, Tang C.Q. Zhou G.X., Chao L., Chao J. / Biochemical characterization and substrate specificity of rat prostate kallikrein: comparison with tissue kallikrein, tonin and T-kininogenase, // Biochim.Biophys.Acta.- 1992.- 1121.3.- p.309-16,
74. Wang J,, Mazar A., Quan N., Schneider A,, Henkin J. / Plasminogen activation by pro-urokinase in complex with its receptor-dependence on a tripeptide (Spectrozyme plasmin), // Eur.J.Biochem,- 1997,- 247,- 1,- p,256-261.
75. Wang X.L. et.al. / Crystal structure of the catalytic doman of human plasmin c-omplexed with streptokinase. //Science.- 1998.- 281,- 5383.- p. 1662-5.
76. Wang X,L, et.al, / Protease activity induced by nicotine in human cell, // Int.J.MoI.Med,- 1999,- 4,- 5.- p.537-40.
77. Wendel H.P., Heller W,. Gallimore MJ. / Aprotinin in therapeutic doses inhibits chromogenic peptide substrate assays for protein C. // Thromb.Res.- 1994,74.- 5.- p.543-8.
78. Witt I., Hasler H., Muschietti F. / Prothrombin and factor X estimation during dicoumaroi treatment,//J,Clin,Chem.- 1977.- 15,-p.197-202,
79. Witting J,I,, Miller T.M., Fenton J,W. / Human alfa- and gamma-thrombin specificity with tripeptide p-nitroanilide substrates under physiologically relevant conditions. //Thromb.Res.- 1987.- 46,- 4,- p.567-74,
80. Yebra M. / Urokinase-type plasminogen activator binding to its receptor stimulates tumor cell migration by enhancing integrin-mediated signal transduction. // Exp,Cell Res,- 1999,- 250,- 1,- p.231-40.
81. Young K,C. et.al, / Plasminogen activation by streptokinase via a unique mechanism. //J,Biol,Chem.- 1998,- 273,- 5,- p.31 10-6.
82. Zhabin S.G., Gorin V.S. / The effects of alpha 2-antiplasmin complex and alfa 2-antiplasmin on the secretion of JgG and IgM by cultured human mononuclear cells, //J,Clin,Lab,Immunol,- 1997,- 49,- 2,- p.77-82,