Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Новозеландские мыши как модель иммунодефицитов

Р Г Б од

- 2 AHR 1995

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ШЩИШШСКОЙ ДОХШЕНКОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ПЛЕСКОВСКАЯ ГАЛИНА НИКОЛАЕВНА

НОВОЗЕЛАНДСКИЕ ГШ КАК МОДЕЛЬ ИШУНОДВЫЩИТОВ 14.00.36 - аллергология в иммунология

Автореферат диссерташш на соискание ученой степени доктора биологических наук

¿Москва - 1994

Работа выполнена в Институте ревматологии РАМН

Научные консультанты: академик РАМН, доктор ыедащщских наук, профессор Б.Л.Насонова

академик АЕН РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Р.Н.Хаитов

Официальные оппоненты: академик АЕН РФ, доктор медицинских наук, профессор А.А.Яридан,

доктор биологических наук, профессор К.Л.Шаханина,

доктор медицинских наук, профессор Г.Т.Сухих

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт

вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Защита состоится 1995 года в

•Ж-

часов

ва заседании диссертационного совета Д 074.09.01. при Институте иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промшлен-ности РФ по адресу: 115476, Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ищунологии Министерства здравоохранения и медицинской протдаленности РФ.

Автореферат разослан " "_ 1994 г.

Учений секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Д.С.Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Б лаборатории биологических моделей Института ревматологии РАМН с 1975 года для изучения аутоиммунных заболеваний биологическим объектом исследования служили инб-редные линии новозеландских мшей и их гибрида первого поколения, у которых "спонтанно" (баз вмешательства экспериментатора) развиваются аутоиммунные нарушения.

Ретроспективный анализ литературных дакнше яо возникновения в развитию заболевания у этих животных, а такав собственный фактический материал выявил сходство с возникновением и развитием синдрома амфколефпдага при лентивлрусных инфекциях, в частности, в некоторой степени сходство было выявлено с развитием синдрома приобретенного иммунодефицита у человека. Б пернув очередь это касается передачи заболевания по "вертикали", т.е. от родителей потомству, а таксе горизонтальным путем при спаривании с мышами других инбреднкх линий. Установлено, что тяхесть заболевания при иехлинейном скрещивании зависит от генотипа исходных инбреднкх линий, пола я возраста хиеотных. Во-вторых, дискутируется роль ретровирусной инфекции как этиологического агента патолопш новозеландских мыпей. Вероятным этиологическим агентом является вирус относящийся к семейству ретровирусов - Retroviridae, напоми-яшцвй вирус мышной лейкемии Гросса (ШЬ7 ). Последний по морфологической характеристике был отнесен к онховирусу С-типа (Mei-loro, 1966; Hollora et al., 1971). В более поздних работах, после открытия медленных ("Slow virus Infection") вирусов, природное заболейашге новозеландских мышей стали относить к медленным, лента вирусным инфекциям (Talal et al., 1974; Simpson, 1976).

Что касается иммунорегуляторных нарушений, то одъида автора- • ыи высказывается предполонение о том, что у новозеландских мышей

снижена сусрессорная функция Т-лимфощтов, необходимая для подавления Г-хелперов я контроля за да|ференциациеа аутореактивных В-лямфоцвтов а приводящей к развития аутоаьмуниого процесса. И развитие аутоЕыкчгнитеха у новозеландских мышей объясняется воздействием вирусных антигенов, влияющих как антигенные стимулк на ги-перреактнвную В-клеточнуп систему пра ослаблении Т-клеточкого контроля ( Taial, IS75). Результаты других авторов свидетельствуют о снхшзгаш функции Т-хелперов (Connolly К. et el., 1992; Haild. И. et el., 1992).

Учитывая визе сказанное, модно заключить, что вопроо о возникновении и развитии аутоиммунного процесса у новозеландских ишей нуждается в тщательном изучении с целью уточнения роли вирусных, иммунологических к генетических факторов в развитии патологического процесса у данных животных.

Б настоящее время в игровой литературе публикуется много сообщений, посвященных изучения тсцунодеф:ццтов, вызываемых вирусами, относящимися к семейству ретроварусов, подсемейству лентиш-русоэ. Ероблема синдрош приобретенного иммунодефицита стала глобальной и пока что данное заболевание вщуздает признать себя болезнь» со смертельный всходом в 100& случаев. Естественным встает вопрос о подборке эффективных методов лечения и профилактики ВИЧ-инфекции. Из-за отсутствия адекватной модели ВИЧ-инфицированные выступает в роли экспериментальных объектов. Поэтому поиски модели заболевания на животных являшся актуальными.

Однако заболевания, вызываемые лентивирусами у сельскохозяйственные а домашних животных недостаточно изучены, к тому ве использование крупных животных в экспериментальных исследованиях является дорогостоящим И неудобный ( Gelderblom et el., 1989). Экспериментальное моделирование иммунодефщитов на макаках, кро-

- з -

лаках, ыорскгх свалках и швах, используемых до настоящего времени, не дает удовлетворительных результатов в связи с тем, что искусственное инфицирование животных по механизму развития и течению заболевания весьма приблизительно напоминает течение ВИЧ-инфекция в естественных условиях.

При всех различиях между С1ОД н патологией новозеландских папой очевидно и определенное сходство, касавшееся некоторых проявлений ищ>иопатологии, заслуживающих детального сравнительного анализа, Болезнь новозеландских шлей может слугигь модель» для лентявируоннх инфекций, либо рассматриваться как самостоятельное лентивярусное заболевание. В доступной литературе мы не встретили исследований по проблеме синдрома приобретенного иммунодефицита проведенных на инбредных линиях новозеландских шязей.

Нам представляетоя, что для биологического моделирования ретро игру с ной инфекции использование новозеландских шягзй является зэлзсообразнш и очень перспективный.

Цель работы - обосновать возможность и целесообразность кс-юльзования новозеландских линий мьжей как природную бнолотичес-суп модель иммуноде^ицитов, вызываемых ретровирусашс дум апроба-саи новых лекарственных: средств з долях икмунокоррекцки патологи-:еского процесса, а также при создании и исследовании основ про-ялактика ишдуноде^ицитов.

Для достиеония поставленной цели необходимо было решить- слэ-увдие задачд:

1. Изучить белки сыворотки, реагирующие о ДНК-РНК гибридом, вусииральной РНК и нативной ДНК у милей разных линий и разного эзраста.

• 2. Определить наличие антител к эпителиальной ткани тимуса и >жи у мышей п2в/п а гибридов П нгв/гтт линий.

3, Изучать уровень хромосомных аберраций спонтанных и индуцированию: митомиидном С у новозеландских мышей.

.4. Исследовать процессы ылграши и дифферекцировки кроветворных стволовых клеток, миграции и кооперативного взаимодействия Ти В-лимфоцитов, функционатьной активности клеток - регуляторов иммунного ответа.

5. Исследовать выработку имиуиосупрессорных и стимула^ юцшс факторов лимфоцитами мшей разных линий.

6. Провести изучение полипапгздного состава и электронно-микроскопическое исследование ядерного матрикса клеток печени новозеландских мшей.

Научная новизна.

Данная работа является первым научным обоснованием возможности и целесообразности использования новозеландских ииией в качестве природной биологической модели для изучения иммунодефяцнтов, вызываемых ретровирусами.

£ процессе исследования впервые установлены следующие ранее неизвестные факты: обнаружено, что у молодых новозеландских мышей, еще до появления клинико-лабораторных признаков заболевания иммунная система претерпевает ряд изменений. Обнаружены антитела, реагирующие с эпителием базального слоя кожи, а тагшз с эпителием корковой и медуллярной зон тиыуса, вызывая атрофии эпителия тимуса на первом месяце постнагального развития, нарушение созревания и торможение даффереяцвровки Т-лнмфоцатов.

С развитием заболевания, начиная о 5-го месяце янзни, наблюдаемся сникение пролифератнвной и миграционной активности стволовых кроветворных клеток с преимущественным сдвигом в сторону ари-троидаого ряда, вплоть до полного отсутствия способности формирования колония гранулоидного ряда в терминальной стадии аутоиммун-

того заболевания.

Установлено, что с развитием патологического процесса снижается способность Т- и В-лимфэцитов к кооперации: нарушается хел-перная функция Т-яимфоцатов с функциональный дефицитом Т-хв ливров при сохранности пула В-клеток - предшественников актителооб-разующих клеток а набладаетоя усиление супрессорной активности Т-супрессоров.

Получены новые данные, характеризующие динамику развитая рат-ровирусной инфекции в процессе заболевания у новозеландских мшей на основе изучения уровня антител к ДЕК-РНК гибриду и двуспираль-ноа рнк.

Практическая ценность работы

Рассмотрение иммунодефицита новозеландских мшей как природной биологической модели ретров^устк ишунодефщитов и использование данных животных как модель позволит более детально изучать вопросы этиологии, уточнить'патогенетические механизмы течения заболевания и .что в практическом плане является самым главным - осуществлять поиск средств эффективного лечения регровирус-ных имцунодефзцитов человека. Данные, подученные в результате проведенных исследований, требую? избирательной коррекции иммунных нарушений с учетом дефектов клеточного эвена иммуногенеза на разных стадиях развития патологического процесса. Наличие мода ли им-«уводефщя?а цокет способствовать разработке средств профилактики иммунологической недостаточности при ВИЧ-инфекции и их апробавди, сак как в этом случае сходство механизмов развития ишунодофшзта шзет решающее значение.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Антитела, реагирующие с эпителием базального слоя кожи, а •акже с эпителием корковой и медуллярной зон тимуса ка первом ш-

сяце постнатального развития, вызывают народещо созревания и торможение дифференцировки Т-лимфоцитов.

2. Патологические изменения в иммунной системе мшей наблюдаются уде на уровне кроветворных стволовых клеток - обнаруживается хромосомная нестабильность (повыаенный уровень хромосомных аберраций) , а также нарушение процессов репарации ДНК, которые на 1-2 месяца предшествуют появлению антител к нДИК.

3. В процессе развитая заболевания происходит сниленне миграции и истинное скикегше кроветворных стволовых клеток, нарушение дифференцкроЕки кроветворных стеоловых клеток по гранулоидному пути развития со смещением в сторону эритролдного ряда, а такте ониаение миграции Т-япмфоцктов и истинное снижение количества Т-лнкфоцатов.

4. Параллельно увеличении возраста мшей и нарастанию патологического процесса нарушается процесс кооперации ишуноксмпетент-ннх клеток за счет снижения функциональной активности Т-хелперов п повышения функциональной активности Т-супрессороэ.

5. Обнаружение антител к ДНК-РНК-гибриду является показателем верслотенции ретровярусной инфекции у данных яивотных. Наличие антител к дауспиральной РНК и повшение их уровня в 4-х месячном возрасте свидетельствует об усилении репликации ретровируса я переходе персистирувдей инфекции в продуктивную.

6. Заболевание новозеландских мшей. следует рассматривать как модель иммунодефяцдтов с преимущественной недостаточностью Г-хел-перов, вызываемых ретровирусаыи, что позволяет рекомендовать использование ее для изучения проблем, связанных с ретровирусной инфекцией человека (включая СПИД).

7. В результате проведенной работы разработано новое научное направление по сопоставлении шшунопатогенеза экспериментальной

аутоиммунной патолопш новозеландских мышей и синдрома приобретенного иммунодефицита.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на I съезде геронтологов л гериатров Украинской ССР (Днепропетровск, октябрь 1988); X ре тонально« симпозиуме соц.стран по интерферону, Рига (1988); Республиканской конференции "Проблемы глстофизиологаи соединительной ткани" (Новосибирск, 1989);I Всесоюзном иммунологическом съезда (Сочи, 1989); 17 Всесоюзном съезде гастроэнтерологов (Ленинград, 1990); Научной конференции Института ревматологии А!Ш СССР (Москва, 1990); Республиканской научной конференции "Реализация научных достижений в практической фармации" (Харьков, октябрь 1991); Т7 Всесоюзном съезде ревматологов (Минск, 1991).

Внедрение результатов в практику.

Полученные результаты используются в Институте фармакологии РАМН, Харьковской фармацевтической акадеши, лаборатории клинической фармакологии Института ревматологии РАМН, Донецком медицинском институте, Одесской медицинском институте, Ярославском медицинском институте, Оренбургском медицинском институте.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, в т.ч. щучено I авторское свидетельство.

Обьем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 216 страшцах машинописного текста, 'остоит из введения, обзора литературы, 3 глаз,.выводов, практи-еских рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 80 источников, из них 87 отечественных, 193 зарубояиух авторов, нссартапдя иллюстрирована 19 таблицами, 4 рисунками, 15 фотогра-зяш.

- е -

Ш.ТЕРШ И 1.ЕТ0ДН ИССЛЕДОВАНИЯ

Новозеландские шп линии ыгв/н и мгя/н в 1975 году била подучены из Национального института здоровья (Бетезда, Мерялэнд, США). С этого периода в лаборатории биологических моделей Института ревматологии РАМН велось инбредное разведение нгв/н, ют/н линий и в результате скрещивания этих исходных родительских линий получали гибриды первого поколения - Р1 нгв/ют линий. В настоящей работе эксперименты проведены на мшах линии нгв/н ,

Р1 пгв/игя , а также иа мшах линий СБА, 057В1/6, ВАЬВ/о, у1 (сеа/с57еь/6) обоего пола, использованных в качестве контроля. Всего в эксперименте использовано около 10 ООО мышей разных линий в возрасте 1-2, 4-5, 8-9, Ю-П месяцев.

Методы исследования. Определение антител к дсРНК, ДНК-РНК гибриду и нДНК в сыворотке ¡срок! проводила радиоиммунологическии методом фиксации иммунных комплексов на натроцеллшгозных фильтрах (А.М.Поверенный, 1575). Метод основан на. осаждении комплекса /=Я/ дсРНК, ДНК-РНК гибрида и цДНК и антител к дсРНК, ДНК-РНК гибриду и нДНК, соответстБенно на нитроцеллшозных фильтрах. Высушенный фильтр помещали в сцинтилллционный счетчик 8Ь -30, который давал показания связанного антителами меченого антигена. Отношение полученного показателя связанного меченого антигена к внесенному, выраженному в процентах, считали показателем сачзывания.

Определение антител в сыворотках крови к эпителию тицуса и ком проведено непрямым методом иммунофлуоресценпии на нефиксированных криостатных среаах тканей тимуса мышей линии нгв/н и Л ив/нйкг линий, влив/о , морских свинок, человека.

Для кручения индуцированного митомицаном С уровня хромосомных аберраций штошщеш С вводили внутрибршинно в дозе 3 мг/кг массы тела. Клетки костного мозга фиксировались через 24 часа после вве

Дания препарата. Костный мозг вымывали из бедренных костей и получали препараты кетафазных пластинок методом высушивания по общепринятой методике. Аберрации хромосом анализировали на залакированных препаратах. Значимость различий в уровне хромосомных аберраций оценивали по неларамзтрическому критерию Вилкинсона-Манна-Уитни.

фи изучении клеточного звена иммунитета число кроветворных колоний в селезенке подсчитывали по методу (Till, Mo cullooh, 1961). Миграцию стволовых кроветворных клеток оценивали по методу (Петров Р.В., Хаитов P.M., 1976). Миграцию Т-лш^оцнтов -из ти-цуса оценивала по методу Хаитова P.M. (1975). Число антителообразующих клеток к эрлтроцптаа барана определяли прямым методом Ер-яо (Гете, Hordln, 1968). Эф|ект взаимодействия Т- и В-лимфощгов при индукции иммунного ответа к ЭБ моделировали по методу (Miller, Uithell, 1968). Еьщеление супрассорных и стимулируэдах факторов лимфоцитами мышей разных линий определяли по методу (Лесков В.Л. и соавт., 1977). Полученные материалы обрабатывали статистически с вычислением средней геометрической и доверительным интер, валом (1р) с вероятностью 992 (р< 0,СП), а также средней арифметической ее стандартной ошибки и доверительного интервала с вероятностью 95J5 (р< 0,05) (Адаарин, Воробьев, 1962).

Препараты ядер и ядерного матршсса из клеток печени получали по методу (Kaztnina et al., 1981). Для электронно-микроскопического исследования суспензии изолированных структур фиксировали 2,5% р-роы глутарового&тьдегвда на 0,1 !.{ фосфатном буфере рН 7,4 а течекие 4-5 часов, а затем 2 часа в 1% р-ре осмиевой кислоты. После обезводившая материал заливали в смесь эпона и арадвдта. Среза окрашивали ацетатом уранила и цитратом свинца. Образцы просматривали я фотографировали на электронном ышфоскопо JEH - 100 В..

-галдя электрофореза по молекулярной массе, -материал переосаяда-ли тркхдоруксусной кислотой. Электрофорез проводили при комнатной температура в течение 6 часов. Молекулярные массы определяли по маркерам: фзрритин, сывороточный альбумин, каталаза, лактатдегид-рогеназа, и вторая субъеданица ферритина (РЬахтао1а, Швавдя).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нарушение ишунорегуляторных механизмов при аутоиммунном заболевании новозеландских мышей является результатом сложных комплексных процессов и проявляется на различных уровнях иммунной системы. Для детального анализа особенностей ищунологической реактивности при аутоиммунной патологии у данных яивотных необходимо бачо проведение основательного исследования различных звеньев иммуногенеза.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К ДНК-РНК ГИБРИДУ, ДсРНК, «ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У НОВОЗЕЛАНДСКИХ МШЕЙ РАЗНОГО ВОЗРАСТА

Установлено, что патогенез заболевания новозеландских мышей линии И2В и гибридов Р1(ягв/Кй«) линий тесно связан о генетическими, имцунологичесюшн факторами, вирусной инфекцией. Наличие антител к ДНК-РНК-гибриду, дс-РНК в сыворотке крови является косвенным показателем вирусной инфекции. Целью настоящего исследования является изучение гуморального иммунного ответа нь вирусную инфекцию в динамике развития патологического процесса. Провести сравнительный анализ результатов исследования уровня антител к ДКК-РНК-гибриду, дс-РНК и кДНК радаоиммунологическим методом.

Использованы мыши линии Н2Б , иг» и самки и

самцы в возрасте от 1 до 11 месяцев. Исследованы сыворотки крови в количестве 270 проб на наличие антител к ДНК-РНК-габриду радаоиммунологическим методом. Метод основан на том, что ДНК-РНК гиб-

ряд проходит сквозь нитроцеллюлоз кие фильтры, а все комплексы антител в ДНХ-РШ-габрида задерживается. Используя меченый радиоактивным изотопом (ЭН)ДНК-РНК-гибрид определяли количество иетки, задержанной на фильтре, вырвхевцув в процентах к количеству внесенного в реекцяонкуи смесь (3Н) ДНК-РЕК-гибрида, то есть оценивали степень комшгексообразования ДНК-РНК-гябрида с антителами к ДНК-РНК-гибриду.

Результаты исследования свидетельствуют, что статистически достоверных различий в содержании антител к ДНК-РНК-гибриду у животных раз-ргчного возраста выявить не удалось (Р » 0,05)

Сыворотки самок шлей линии и® , нгв и Жив/на«) в возрасте 5-6 ыоо. связывали в среднем II,5*1,50, 11,7+1,35, 9,8» 0.46% (3Н) ДКК-РНК-гябрида.

В возрасте 10-11 месяцев у мылей линии гаг.игв, я ягв/кш средний уровень связывания (8Н) ДНК-РНК-гибрида составил 9,51-1,83, 9,9*1,16, 11,1+2,Щ соответственно.

Такха не удалось выявить различий в содержании антител у ответных одного возраста разных линий Я тъ/жя и ии , Я нгз/нгвг и нгв (р > 0,05).

Аналогичные результата получены при сопоставления средних показателей связывания (3Н) ДЕК-РЕК-гибрида сыворотками самцов этих га ланий (Р > 0,05). Следует, однако отметить, что эта показатели вше, чем у ншей контрольной группы СБА - 6,0*0,87 (Р < 0,05).

На основании полученных данных мокао предполоаить, что у новозеландских мышей шш , нгв , Я мв/гая линий разного возраста а пола персистируот вирусы, следствием чем является увели-гекие содершшя антител к ДНК-РНК-гибрвду.

Результаты определения аутоантител к двуошральной РНК в сы~ юротка крови у мышей Я игв/нг* представлены в табл. 1.

Таблица 1

Линия !" 1 { Возраст мышей

% связывания дс РНК (Ц+т)

| 3 мес | 4-5 мес | 6 мес ] 7,5 мео | 9 мео

якв/м* 8,56+0,51 11,9+0,76 13,8+1,7 18,9+3,0 13,9+0,9

Данные по определении антител к ддуспиральной РНК в сыворотке крови у милей нгв/нг* в динамике развития заболевания свидетельствуют о перси станции вируса на протяжении всей жизни аиБогных. Однако следует отметить, что в возрасте 3-4 месяцев происходит увеличение аутоантител к дс РНК, что свидетельствует об активизации вирусной инфекции в атом возрасте.

У новозеландских ышей ДО? , нав , ?1 (кгв/иг^) линий разного возраста и пола, вами бино изучено распространение антител к натявной ДНК (табл. 2) и белков, взаимодействующих не только о ДНК, но и с пояианионаш. Установлено, что у самок изученных возрастных групп линий ягв , игв/ягяг с возрастом достоверно увеличивается количество балков реагирующих с нативной ДНК и по-лиашон&ма (рис. 1, 2), также установлено, что эти белки чувствительны к действие меркалтгоэтанола и при иммуноэлектрофоретичвскои исследовании близки вд-макроглобулинам.

Таким образом при изучении сывороток крови у новозеландских мыщей установлено:

• I, у мшей линии пав , нанг , тл нгв/нгш обоего пола всех возрастных грушх присутствуют аутоантитела я ДНК-РНК-гибриду, подаверадаюадае наличие вирусной инфекции в организме, такие же антитела определимся и у контрольных мшей СЕВА, но в достоверно меньшем количестве.

Таблица 2

Взаимодействие сывороток новозеландских мшей о (SH) ДНК

i {К-во{X - 2 мес.|К-во!4 - 5 uec.j ¡K-Boje - 9 мес.}к-во{ 12 ыес. S

Линия ¡Пол \ш~ I !»- < ! Р i ! и стаРше ' Р

линия ¡иод 'вот--ВОТ"}' »' 1 }EOT-i-|вот-1-

} jHHX I и + в }шк { i ,:шх i ы + м ¡них } м + ш {

самка 13 I&,9+2,98 13 5,2+1,05 <0,05 II 12,0+1,18 12 22,6+5,03 < 0,05

самцы 16 18,2+2,19 12 11,6+1,06 <0,05 7 12,2+1,72 14 18,2+2,62 < 0,05 __________

самки 13 9,3+1,32 II 11,4+2,5 » 0,05 6 19,4+1,59 6 43,3+0,83?« 0,05

самцы 16 8,1+1,12 16 6,7+0,47 > 0,05 6 15,6+2,57 6 12.4+0,82*> 0,05

»2В/Я

NZB/STZW

0

1

szw/h

самки 15 15,5+2,27 II 9,45+0,71 >0,05 8 9,85^,79 13 13,1+1,80 > 0,05 самцы 14 14,0+1,80 И. 10,2+1,21 >0,05 7 11,7+2,3 13 S.S2+I.I6> 0,05

И + а - средний процент связывания ДНК

Р -. достоверность различий между возрастными группами

* - возраст 4-й возрастной группы HZB/HZW - 11 иве.

СВЯЗЫВАНИЕ 1*И)-ДНК АНТИТЕЛАМИ СЫВОРОТКИ КРОВИ САМОК

1-2 месяца

ЙШ

4-5 месяцев 8-8 месяцев

N

12 месяцев

Рнс.1.

СВЯЗЫВАНИЕ $Н1-ДКК АНТИТЕПАМИ СЫВОРОТКИ КРОВИ САМЦОВ

Рмс.2,

ыгв/ы

1-я месяца

Ш

4-5 месяцев 6-9 месяцев

ш

12 месяцев

И Ы2В/Ы2Ж

2) У шшй Р1 тъ/Ш'Я в сыворотке крова обнаружены аутоаи-титола к дауспирольной РЕК во всех возрастных группах, однако в возрасте 3-4 месяцев количество втнх антител увеличено, что говорит об активизации персистирующей вирусной инфекции в данном возрасте.

3) У новозеландских мшей всех обследовании, линий обоего пола имеются в наличии аутоанглтела к цДНК, однако о возрастом наблюдается увеличение количества антител к нДКК только у самок линии 1г2в и, особенно, у самок р1 нгв/ягя в терминальной стадии заболевания.

Таким образом, результаты проведенных исследований, направленных на изучение гуморального звена тгаунитета в динашке развития патологического процесса позволили проследить датами^ образования антител к ДНК-РНК-гзбриду, дсРНК, нДНК по мера развитая' заболевания у новозеландских мышей. Отмечено, что аутоантитела к ДНК-РЖ-гибриду присутствуют в организме обследованных животных на протяжении всей лизни нтоотша и даот основание полагать, что они отряжает персистенцип вирус того антигена. Уровень антител к дсРНК с 3-х месячного возраста имел тенденцию к нарастании. И если допустить, что антитела к дауешгральной РНК обусловлены присутствием вируса, содержащего дсРНК, то полученные результаты являются свидетельством персзстенциа вируса в органазш новозеландских мнгей. Кроме того, повышение уровня антител к дсРНК на определенной этапе развития заболевания монет служить показателем усиления репликации вируса. Установлено, что уровень аутоантлтел к яДОС увеличивается у самок яга ликш и особенно, у самок ?1 пгв/ягтг гашей в терминальной стадии заболевания, что сввдетзяьстнует о половом диморфизме при развитии аутоиммунной патологии у данных ягоотнызс, а также о том, что повшенне уровня антител к дсРНК на.

ноокодько месяцев предшествует повшеншэ уровня антител к цДНК.

II. ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ СПОНТАННЫХ И ИНДУЦИРОВАННЫХ ЩГОШЦШЗШ С У НОБОЗШВДСШ ¡МЕЙ

В предыдущем разделе наших исследований было установлено, что у новозеландских шлей с возрастом повидается уровень ауто-антитед к ядерным компонентам клотод. Известно, что продуцярова-' 1шо антител к ДНК, развитие глошрулоне§рнта я гемолитической анешш у мышей гггв и Н2И линий находятся под контролем нескольких доминантных или кодошианткнх генов. Поэтому в качества биологической модели аутоишущшх заболеваний наиболее часто используют гибридов П (игв/нгя), у которых признаки заболевания выра-кояи значительно сильнее в в более ранние сроки, чей у исходных родительских линий. Полагают, что генетические факторы играют существенную роль в этиологии и пагогеназе атой группы заболеваний (Кп1£М ал. et ей., 1978). Одной из характерных черт при заболевании у новозеландских шдай является повышенная ломкость хромосом (хромосомная нестабшгьнооть) (М-вДкоя кь., 1973; ЫаЪаг с.ь. е^ в1. Д987). В некоторых случаях нестабильность хромосоы выявляется только' после цутагенных воздействий, тогда как спонтанный уровень хромосомных аберраций не отличается от нормы. Чувствительность хромосом при мутагенных воздействиях у «шей П (кгв/гтш) изучена недостаточно, а данные о спонтанной уровне хромосомных аберраций противоречивы,

Делью настоящего исследования явилось изучение спонтанного ц индуцированного митожцином с уровня хромосомных аберраций.

Результаты исследований хромосомных аберраций представлены л табл. 3.

Уровень как спонтанных, так и индуцированных митомнцином С

Таблица 3

Спонтанные и индуцированные мнтомтдаюм С аберрации хрошсои в клетках костного мозга мкзей

pl ('ÍZBxUST?) и контрольной линии c57bV6J

" ■ I ■' I--- -Т""1""' " - 1 ....................— ■

[Возраст 1 ^сдо i Дола клеток, f._____

I и н п я, п о л ! | ля- I !„ „Л™™,я„,„„ !__„т,,™«^»,«™?

'месяцы jвот- клеток с поЕрааденнявд jсо структурными',с ьшоааственны-.месящ» |вот | клеток! оц!{ аберрдаи ¡ми аберршояш

I I' | ( хромосом {хромосом322*

pi (NZB х HZW) 3-4 ' 10 1000 2 gK (2,0-4,0)®г 0,6 (0-2,0) ,0

(Н2В * гш) 9-10 10 1000 3,2 (0-7,0) 1,5 (0-3,0) 0

C57B1/6J 3 12 1200 (0-3.0) 0,4 (0-1,0) 0

Митомавдн С

? 1 (SZB х N2(7) 3-4 9 450 38,4 (24,0-70,0) 32 7 (16,0-56,0) 7,6 (0-12,0)

г 1 (sza х нет) Э-10 XI 550 50,4 (38,0-60,0) 46,4 (32,0-56,0) 5,6 (2,0-12,0)

057BI>/&J 3 7 350 26,6 (12,0-36,0) 21,7 (8,0-26,0) 1,4 (0-6,0)

м

4J

Пржзчание: а побежденными считаются клетки со структурными аберрациями и (или) ахромаяи-ковыми пробелами; xs - минимальные и максимальные значения; заег - клетки, иневдае более 10 разрывов хроцосои

хромосомных аберраций в клетках костного ыозга 9-10-маоячкых са» мок Р1 (!fzb хЮТ) достоверно вьше, чем у 3-4 месячных самцов того ве генотипа и мышей линии c57ui/6J (р < 0,005). В то Ее время имеются различия в уровнях клеток с аберрациями хромосом ыезду гибридами (niZBxX'iä) и мышами линии 057BI/6J (р < 0,005).

Основная масса спонтанных повреждений хромосом представлена фрагментами (одиночны?« или парными). Прз воздействии MC наблв-дали в основном структурные аберрации хроматидного типа: одиночные фрашенты, хроыатидные дацентрики, обмены, кольца, центро-мзрные слишшя акроцентрических хромосом,ахромзтиновыз пробелы (хроматидные и изохроматидные). Природа этих повреждений пока но яона. Однако существует предположение, что некоторые из них обусловлены поврекдешем ДНК, другие - нарушениями белковой компоненты хромосомы, ответственной за упаковку хромосомных нитей в мз-тафазной хроматаде.

При воздействии митомицина С ка хромосомы модельных мщвй зарегистрированы клетки с мноЕастБенныки аберрациями хромосом. Хотя к классу "множественные аберрации" относили клетки, имеющие более '10 разрывов хромосом, е основном этот класс составляли клетки с трудноиде инфицируемыми повреждениями хромосом вплоть до сильной фрагментации. Процент таких клеток дан в табл. 3; из нее видно, ч?о доля клеток о мнояественнши аберрациями хромосом у гибридов (NZBxHZ®) в несколько раз выше, чем у контрольной линии o57sb/5J

Таким образом, Э-Ю-масячные самки я (nzbxüzs?) , у которых ранее найден наиболее высокий уровень AT к ДНК, отличается и большей настабильностью хромосом. У мышей линии g57bx/6j наиболее низкий уровень клеток с хромосомными аберрациями, а 3-4-мзсячнае сашда (ffzbxnzü) занимают промежуточное положение как

по уровню аугоантител в ДНК, так а по кутабильности хромосом.

Ш. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АУТОАНГЙТЕЛ К ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ТКАНИ ГШУСА И КОИ У МЫШЕЯ ЛИНИИ Я2В И У ГИБРИДОВ п{жвАт) линий

В настоящее время установлено, что эпителий корковой зоны тимуса млекопитающих составляет микроокрухение, в котором происходят созревание и даффэренцяровка Т-лимфопитов. Основой микро-окруаания является так называемые "клетка-няни" эпителия тимуса, содергавдз на поверхности 1а-артигены. Известно, что у мышей Я2В и ?1(кгв/пг*) гибридов еще до качала проявления аутоиммунного процесса (на первом месяце гизни) происходит резкоо утгань-вэгаге числа эпителиальных клеток тю^са. Показано также, что в течение первых месяцев после рождения у глыпей к?в скитается в крови уровень тинусяого гормона и происходи? укекшение особой популяции апителиальшк клеток тзшуса, продуцирующих этот гормон (Вагдоо Р. ot а!., 1982; ЬеЪгааоки 1. et а1., 1982).

В связи о этим целы) настоящего исследования являлись поиски у мышей N23 и Р1(кгв/!тг',т) первых месяцев аизни аутоентитея, реагирующих с эпителиальными .клетками тимуса,. При поисках аутоан-тител к эпиталюз тамуса у 'ггв я £1(1г2в/ггат) шгтей исследования проведены одновременно, на срезах ткани тимуса и'ложа.

Испытана сыворотки крова, полученные на Г-2 я 4-5 месяце после роядеттая от мквей шъ а Я (пгв/няя) , а таккз от шлей контрольной лзнш вахв/о . Исследования проведены нелрямкм методом такунофяуоресцейции на нетаксированных краостатннх срезах тканей тицуса указания лгязй ншвй, морских свинок и человека (ткани тшлуса эмбрионов 18 недель к взрослнх явдай погибши от травмк. Использованы также срезн кожи мышей к морских свинок (кода губы) и человека (колса плодов). В ряде опытов исследования проведены в

сингенной к аутологичной системах (на тканях мшей К&в шш (нгв/нгт?) , от которых подучены сыворотки).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сыворотки мшей линии в возрасте 1-2 месяца при испытании на срезах кода мшей линии вив/а в 11 случаях из 13 реагировали с Назальным слоем эшгтелия коля. Сыворотки полученные в те де возрастные сроки от мшей р1 (ыгв/нгя) , в 13 случаях из 17 такяе реагировали с указанными структурами, В более поздние сроки (возраст 4-5 месяцев) реакции с базальным слоем эпителия коза отмечены при испытании всех сывороток мышей я2в (8 сывороток) и Р1 (нгв/'нз'д) (13 сывороток). Реакции наблюдались при разведениях сывороток ог 1:8 до 1:128. Все испытанные сыворотки мышей ВАиз/с, взятые в те же возрастные сроки, с базалышм слоем эпителия кожи при разведении от 1:8 и вше не реагировали. Полоаителько реагирующие сыворотки мышей нгв и р1 (игв/гт?) параллельно испытаны на срезах кода в аутологичной, сикгенкой и гетерологичной (коаа человека и морской свинки) системах. Во всех случаях отмечено свечение базального слоя эпителия.

Дальнейшие исследования проведены на срезах тканей тимуса. При этом обнаружена положительные реакции о эпителием тимуса во всех указанных системах в результате испытания сывороток, поло-гштельно реагирующих с эпителием кожи, в том числе в сингенной и аутологичной системах. На срезах тканей тимуса ыышей всех использованных, линий а аутологичной и сингенной системах, на срезах имуса шжей ваьв/с , а также на тканях тимуса человека положительные реакции с эпителием обнаруяенн в медуллярной зоне вокруг телец Гассадя и корковой зоне тимуса. На срезах тимуса ыорскюс овинок сыворотка реагируют с эпителием только в медуллярной зоне* В контрольных опытах, проведенных с сыворотками мшей

влхв/о на срезах тимуса человека, морских свинок и мышей разных линий, получены отрицательные результаты.

В опытах по ингибяции установлено, что препарат ДНК тимуса теленка ингибкрует реакции с ядрами клеток, обнаруженные при испытании некоторых сыворотон нгъ н у ЛОмв/яги) на срезах кохи. В то же время реактив этих сывороток с эпителием коаи и ти-ыуса целиком сохраняются.

Таким образом, у мшей линии Н2В и у ?1 (кгв/нгл) в течение первых месяцсв после рождения установлено наличие антятэл, реагирующих о эпителием корковой и медуллярной зон тимуса, а тагсгэ о эпителием базального слоя кожи. Подобные антитела не найдены у иншей ваьв/о. Антитела, обнаруженные у мшей ив и у П (нгз/мж), следует считать оутоантителами. Во-первых, положительные реакции обнаружены в аутологичной и сннгенной системах. Во-вторых, антиген, с которым реагируют эти антитела, содержится во всех испытанных образцах тканей тимуса и кожи человека, морской свинки и иышей разных линий. Последнее свидетельствует о том, что этот антиген относится к тканеспевдфпескш ангягенаи, общим для разных видов, по отношению к которым обычно возникают аутоштитела. Следует отметить, что аутоантитела, реагирующие с эпителием тимуса и кожи, отличаются от аутоантлтел, реагирующих с ядрами клеток. В дальнейшем необходимо сопоставить антитела к эпителию тимуса с антителами я гимоцигаы, которые обычно обнаруживаются у иншей язв и у ГI (тев/нгя) . Представляют также интерес поиски аутоантлтел к эпителию у новозеландских майей разного возраста и, в частности, у нсгороаденных мьигей, чтобы решить вопрос о передаче этих аутоантител от матеря плоду.

Необходимо подчеркнуть, что аутоантитаяа, реагирующие с эпителием тимуса, обнаруживаются еще до начала аутоиммунного процео-

са, который, как известно, начинает проявляться у мшей лгв и у р1(ягв/лгя) на 4-5 месяце жизни. При этом необходимо выяснить рота этих аутоантктел в повреждения эпителия тшдуса и в возникновении иммуноретудяторных нарушений, характерных для аутоиммунного процесса. Основываясь на том, что повревдение эпителиальной ткани тимуса на 2-3 месяца опережает другие проявления патологического процесса в организме этих тавотных, модно предположить о первичном поражении твдуса новорожденных мышей Еирусом о преждевременной утратой функций данного органа, наруиениеи процессов созревания и дяфферекцировки иммунокомпетентных клеток и развитием дефицита Т-сястеш иммунитета.

1У. ИСОЩОВАЕЖ МИГРАЦИИ И ДИИЕРЕЩ1Р0БКИ КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВНХ КЛЕТОК

Проведение исследований по установлению механизмов реализации игаунных процессов, играющих в организма решающую роль в защите против различных патологических факторов внеиней и внутренней среды дает возможность использовать раскрытые закономерности для коррекции различных патологических состояний, ври которых нарушения в иммунной системе определяют патогенез заболевания.

Изучению миграции и дафференцировки кроветворных стволовых клеток посвящен данный раздел. Опыты проведены на мшах Р1 Шъ/яъу линий разного возраста.

Известно, что у шаей Я игв/ная линий начало заболевания проявляэтся в 4-5 месячном возрасте, достигая максимума манифестации в Ю-11 месячном возрасте. Исходя из этого во всех опытах были использованы швотные 3-х возрастных груш: 1 группа - шли в возрасте 2-х месяцев, то есть без клинических признаков; 2 груи-

па - 4-5-месотныа аивотвыэ (о ранними проявлениями аутоиммунного процесса); 3 группа - 10-11 месячные мши в терминальной стрдав аутоиммунного процесса.

Работа проведена на модели летально облученных мышей о экранировкой 1/2 голени о подсчетом на 7-8 день числа кроветворных колоний в селезенка, образовавшееся в результата миграции стволовых клеток из экранированного участка костного мозга.

Из представленных в табл. 4 результатов исследований видно, что у мшей пгь/шя 2~квсячнолз возраста при экранирования участка костного козга задней конечности до уровня 1/2 голзяи при летальном облучении в селезенку мигрирует в среднем 15,4 КОЕ.'

Таблица 4

Миграция стволовых ялоток у тлей ?1 Т12В/й2!7 с аутоимидгннкми

забояевавдяма

' " ......■"■ 1 ' ' "■ ■ " ......... ) "' 1 ' Т ' ■ ........... ■ ...... ' 1

; Число К-во КОВ на селе-Бозраст шшей в месяцах ^^.'зенку м < 0,05

2 (норма) . 10 15,4+1,5

(начало аутоиммунного . процесса) 9 ' 13,0£2,1

(терминальная стадия аутоиммунного процесса) 8 2,8±1,0

у кшей Я з:гв/я2тг 4-5-мэсячного возраста (табл. 4), у. которых выявляются симптомы аутоиммунной патологии, Ш1р8щаонная активность стволовнх кроветворных клеток приобретает тенденции к снижению. Выраженное угнетенно миграционной активности стволо-" внх клеток из костного мозга отмечается в терминальной стадии

аутодощтогого процесса у 10-11-месячных яивотных (табл. 4). Определенна относительного (в раочото на Ю5 клеток) и абсолютдо-го (в расчете на клвточнооть кости) числа стволовых клеток в костном мозге экранированной конечности 2-шсячных (соотвототвза-но 38,1+3,2 и 3560 КОЕ) и 10-ыесячкнх (21,б£2,7 и 2000 КОЕ) нишей показало, что их число о возрастом слетается в 1,5-2 рааа. Следовательно, наряду с уибнывеннеи числа мигрировавшие из костного козга КОЕ имеет место истшшоз сшшеяие шграпдп стволовых клеток,

В настоящее время известно, что при различных Т-пмуунодэфа-цнтннх состояниях: происходит торкогенкз днффвренцаровш стволо-ешс клеток по гранулоидноьог пути (Р,В.Петров о соавт., 1976; В.М.Мявько, 1978). Предполагается, что тицус-зависпмка лтгфоцдтц оказывает влияние на да^ференцировку стволовых клеток в огссз направлении.

В табл. 5 приведены данные гистологического анализа кроветворных колоний у мщэй Я кгв/ют различного возраста, то есть о различной тяжестью аутоиммунного порадеют. Из табл. 5 видно, что у ышвЁ Я нгв/гга^ с возрастом число колоний, образующихся в селезенке за счет матрпрованшп из защищенного участка костного мозга стволовых клеток, значительно сниаается. Однако в 4-х месячном возраста в начале заболевания оно резко усилено.

Гистологический анализ колоний в селезенке показывает, что развитие аутоиммунного процаооа приводит к торможению диг^ерен-дировки стволовых клеток по гранулоцитарному пути, вплоть до полного отсутствия гранулоидннх колоний. Вместе с тем, увеличивается относительное число еритровдннх колоний, то есть кодониеобра-вовагаю происходит по врзтроидному пути.

В дальнейших исследованиях изучали дифференцировку стволовых

Таблица 5

Миграция и гистологический анализ колоний кроветворных клеток у шеэЙ 51 нгв/начг различного возраста, облученных э летальной дозе с экранировании 1/2 годеш задней конечности

Число колоний! Тип кроветворных колоний, м + п, р < 0,05 {Отношение

^ ,в селезенке |-1-г-г--)—-{числа эрит-

мышей в ¡при микроско-! эратро- ; лзануло- ; магакарио-} надаффервн-| «роидных ко-

месяцах!5^еском У48"! идные ! яднш Чщтарнш Iдарованные! вешанные ,лонзй к чис-

I ь» I I I \ [ {иных "

2 16,7+3,3 11,8+2,1 1.54р.7 2,8+0,8 0,2+0,51 0,2+0,2 7,8:2

4 29,%2,7 23,75+4,2 2,5+1,1 1,65+0,65 0,73*0,3 0.65+0,4 9,5:1

5-6 4,4+1,5 4,0+1,1 0,2 0,2 . 0 0 20 : I

8-10 3,8+2,3 1,4+0,2 ■ 0 2,4+1,1 с 0 0 -

I

£

I

кдаток при экзогенной клонировании КОВ костного мозга. В экспериментах этой серии клетки костного мозга от исследуемых мшей р1 тъ/нш (в различных стадиях аутоиммунного процесса) переносили легально облученным (8,5 Гр) сингенным реципиентам. Через 8 суток после облучения и трансплантации клеток определяли чнсяо я гистологический тип колоний в селезенке реципиентов.

Результаты показала, что у мышей в возрасте 4-5 месяцев п особенно у 8-10-месячных аивотных, число кояониеобразующих клеток в костном мозге существенно ниже, чем у милой в возрасте 2-х месяцев. К тому ее у мышей Р1 нгв/ют наблюдается превалирование числа эрптроидных колоний над 1$акулоидныщ.

И, наконец, в последней серии исследований изучали число и тип эндогенных колоний в селезенке субдетэльно облученных (6,0 Гр) мышей. Полученные в этой серии исследований данные свидетельствую? о том, что у шшей hzb/kzw во всех возрастных группах наблюдается угнетение или полное отсутствие транулоидной диффе-ренщровка стволовых клеток. Таким образом, на основании полученных данных могшо предполагать, что у шшей вч nzb/nzw с аутоиммунной патологией, независимо от возраста, наблюдается торможение дафферекцировкя стволовых клеток по гранулоидному пути развития. Усе высказывалась точка зрения, согласно которой, дифференцировка стволовых клеток по грануловдному пути обеспечивается в определенной степени Елиянием Т-лимфоцитов. С другой стороны, нельзя таксе исключить возмоанооть того, что у ыыаей Р1 kzb/hz'í? существует генетический дефект на уровне предшественников гранулоцнтарногр ряда кроветворения. Кроме того, обнаруженные изменения типов колоний могут иметь рад других объяснений: изменение шкроокрухе-ння, подавление штозовв гранулоцитарном ряду, сниженная подвижность гралулоцитарных клеток.

У. МИГРАЦИЯ И КООПЕРАТИВНОЕ ВЗАИШДЕЙСТВИЕ Т- и Б~ ЛШЗОВДТОВ У ШЕЙ п ягв/вгя лший

Изучение процессов миграции Т-лзшфоштов проводили по методу Р.М.Хаптова (1975). Полученные результаты исследований прадстаз-•хапы з табл. 6.

Таблица 6

Миграционная активность Т-лим£оцитов у мшей Я пгв/няя

-1—;-г--—--•

Возраст мшей! Число ! Количество АОК на селезенку, в месяцах |гивотшгг{ и±В> (р < о,01)

2 8 - 2111,0 (1799,2 «- 2422,8)

5 7 1610,0 (1228,9 4- 1991,1)

10-11 8 1147,5 ( 902,7 * 1399,3)

Как видно, у мкзей ягв/ют с возрастом снпзается миграция Тчяимфоцнтов. Наиболее сильно икградая Т-лиифовдтов яэ тимуса снизана у Ю-П-кесячных мшей Я игв/нгтг . Таким обращен, в отадни выраженного аутоиммунного процесса наблюдается значительно« угнетение миграционной активности Т-лимфоцятов.

В другой серил исследований изучена миграционная способность В-лямфопитов у мызей Я ггяв/ягзг различного возраста. Полученные данные представлены в табл. 7, нз которой видно, что у детально облученных мшей Я кгв/шн 2-месячного возраста с экранированным участксгл костного мозга задних конечностей, которш через 2 суток после облучения вводили сингешше Г-клетки и ЭБ, в селезенке образуется 2764 АОК за счет мигрировавших из костного мозга В-ликфоцитов, кооперирующихся с трансплантированными Т-клетками, В селезенке шгей 5-месячного и 10-11-месячного возраста в аналогичных случаях образовывалось соответственно 2559 АОК и 3083

АОК. Эй данные овддетедьствуют о том, тго при аутоиммунном поражении процессы миграции В-лим$оцитов из костного мозга практически не нарушены. Таблица 7 Миграционная активность В-лимфоцитов у мшей У Н2в/м21я

-1-,-

Возраст шлей! Число I Количество АОК на селезенку в ыосяцах |вшотннх{ ы±1р (р<0,01)

2 9 2764,0 ( 2116,7 3401,3)

5 9 2459,0 (1907,6 * 3010,4)

Ю-Н 9 3083,0 ( 2597,1 «■ 3518,9)

Кооперативное взаимодействие Т- и В-лигд$юцитов

В настоящей разделе работы иы исследовали особенности взаимодействия Тчшкфоцнтов с В->шиф01Штаьщ у кигей Р1 Н£В/ЮТ разного возраста. Эффект взаимодействия Г- и В-лимфоцнтоа в пмуун-ном ответе определяли по методу ш.11ог,-ШЛоЬоН (1968).

Из табл. 8 видно (вариант I), что перенос клеток только костного мозга ила только лимфатических узлов летально об лучен-пш рецппиечтаи, соцровогдается образованием сравнительно небольшого числа АОК в селезенке (гругпш 1-1У). Перенос смеси клеток костного мозга и лимфатических узлов приводит к резкому повышению числа АОК, накапливающихся в селезенке (группы У-УШ), что отражает процесс кооперации мезду Т- и В-лии$оцитами. Однако эффект кооперации клеток костного мозга и лимфатических узлов при их совместном переносе проявляется в различной степени в зависимости от возраста доноров.

Из приведенных в табл. 8 (вариант I) данных видно, что аффект Т- и В-кооперавди при использовании клеток 4-5-месячных мы-

Твйяица 8

Эффект взаимодействия т- а В-лпшфоцзггов 1-2 месячных допоров и 4-5 косячных (вариант I) и 1-2 месячных доноров а 10-11 месячных (вариант 2) ¡.щей в культура лафндшд клеток

Ч

группы

-■ ............-—•■ I ' I

Возраст доноров, месяцы | Число ,

клетки костно-1 клетки го мозга ¡тячзскшс ужка; ентоз |

!

10 х Ю6 j I х KP !

Количество АОК на селезенку I + 1р (р < 0,05)

!

В а р а а н

I 1-2 8

п 4-5 •о 8

ш — 1-2 8

1У — 4-5 8

У 1-2 1-2 8

У1 4-5 4-5 8

УЛ 1-2 4-5 8

уш 4-5 1-2 8

В а р а а а

I 1-2' 8

п 10-11 - 8

ш . —. . 1-2 8

1У — 10-11 6

У 1-2 1-2 9

У1 10-11 10-И 6

УП 1-2 10-11 8

УШ 10-11 1-2. 8

1365,5

507.1 868,3

174.2 5675,0 1514,5 1582,0 4414,0

390,0 104,7 434,0 168,4 5005,0 812,2 891,2 4927,0

1125,4 * 1659,9) 462.4 + 655.7) 670,6 1124.3)

144,6 6376,7 1324,3

1527.6

4045.7

304,7 68,8

357.2 120,7

4405,5 663.7

864.3 4970,0

209.4) 6820,0) 1729,8) 1636,4) 4797,1)

493.8, 159,5,

509.3,

234.4. 5677,0$

950,6 918,6

5296,6

I I

2

-засей доноров значительно ниже (группа У1), чем при переносе клеток 1-2-месячкых доноров (группа У).г3а снижение аффекта кооперации у 4-5 месячных мышей ответственны клетка лимфатических узлов. Действительно, клетка лимфатических узлов 1-2 месячных мышей аффективно кооперируют с клетками костного мозга 4-5-месячных животных (группа УШ), но клетка лимфатических узлов 4-5 месячных аивоткых плохо кооперируют как с клетками костного мозга 4-5-ыесячных доноров (груша У1), так и с клетками 1-2-месячных доноров (группа УП). Клетки лимфатических узлов и костного мозга старых (10-11-месячных) шлпей практически не вступавт в кооперацию при ответе на ЭБ (табл. 8, вариант 2, группа У1). Использование рецнпрокных сочетаний доноров костного шзга и доноров лимфатических узлов разного возраста показало, что неспособность к кооперативному Т- и В-взаинодайствшэ у старых «щей нгв/нет опосредуется на уровне клеток лимфатических узлов (табл. 8, вариант 2, группы УI, УП, УШ).

Таким образом, полученные данные позволяют еде тать зывод о том, что с развитием аутоиммунной патологии у ыыней Р1 игв/кгя нарушается хедперная функция Т-ламфодцтов, однако В-клетки-пред-пественники АОК при этом сохраняют свою активность. Данные литературы (СеЕеог е* а1., 1978) подтверядают наличие Т-дефздага у аутоиммунных мышей. Однако, нельзя было исклвчнгь возмояность того, что неспособность Т-клзток старых мышей Р1 нгв/ида к кооперации с В-кязткаш связана с появлением в лимфатических узлах при старении супрессорннх клеток. Показано (йойог еЪ а1., 1977), что в селезенке старых мшей ягв/гш? появляются шнонуклзар-ные радаорззистентные клетка, устойчивые к действию анти-тиисцн-тарной сыворотки и комплемента, обладаздие способностью супрзсси-ровать имцунный ответ и продукцию АОК клетками селезенки молодых

umeä tf uzb/nzrr s культуре in vitro.

В этой связи возник вопрос, не является ли снааесте хелпер-пой функции клеток лимфатических узлов старых тгаой Я itzb/nzw следствием появления ют повышения супрессорной активности. Дяя ответа на зтот вопрос в смесь эффективно юаякодействуш^ях Г- и В-клетск молодых mmtt Fl kzb/kzk добавляла разше дозы клеток лимфатических узлов старых ишай JPi 'JZB/uz'.r.

Из табл. 9 видно, что клерки лшй^вткческих узлов старых мн-пэй, добавление к клеткам лимфатических узлов молодых шшй в соотношении 1:1 (группа Iii), но влияют на Т- и В-хооперацию у молодых доноров. Однако, повнпение дозы клеток лимфатических узлов старых доноров (соотношение 5:1 и, особенно 10:1 группы 1У--У) приводит к супрессии кооперации Т- и B-клеток молодых доноров.

Таким образом, снижение кооперативной способности Т- и В-лпмфоцатов у мыией У kzb/iizü? о появление« аутоиммунного процоо-са, по-ввдвшцу, объясняется на только количественным или функциональный дефицитом Т-хелперов, по н повышением супрессорной активности клеток лимфатических узлов.

Костномозговые супрессора у мыаей gl xssb/kzbt . регулирующий антителогенез а клеточную проднфарациа

Большое внимание уделяется рзгуляторкой роли костного мозга s иммунных реакциях организма. С одной стороны, это - стимуяя-цдя антителогеяеза как в индуктивнуо, так и в продуктивнуо фазы (А.А.Михайлова о соавт., 1971; Petrov ot al., 1977). С другой стороны, клетки костного мозга, способны угнетать шя^нннй ответ клеток селезенки ia vivo (р.в.Петров о соавт., 1976), а при добавлении их в культуру клеток лимфатических узлов in vitro наб-

Таблица 9

Анализ супрессионнах свойств клеток лимфатических узлов старых ишзй Я игв/нг*

№

группы}

Трансплантированные клетки (х 10б)

I Число !

костный мозг } лимфатические узлы ;регяшонтов 1-2 мес } 10-11 мео | 1-2 мае {ю-И мое |

Количество АОК на селезенку

М ± 1р (р < 0,05)

I П

ш

1У У

10 10 10 10 10

I 10 I I I

I 5 10

8 8 6 8 8

1626 (1305 * 2025) 1368 (1185 «■ 1578) 1233 (1013 * 1501) 533,4 ( 370 «- 749,9) 301,7 (265,4 * 344)

I

8

.подается оупрессия продукция антител и пролиферации диыфоидннх юиток (Р.Ы.Хаитов, Р.В.Пвтров, 1978; Petrwr e-t ей., 1977). Иными словами, имэшся основания полагать, что клетки костномозгового происхождения могут выступать в роли клеток - регуляторов иммунного ответа.

1!ы иооледовали способность клеток костного мэзга и оэлбзенки шлей Pi H2B/H2W разного возраста подавлять иммунный ответ и пролиферацию клеток сэлезенга шлодых сннгенных аявот/шг в культура япфзидяых клеток in vitro . Клетки костного мозга п селезенки культивировали in vitro шесте или раздельно. В качестве антигена использовали стерильные ЗБ. Число АОК определяли на 4 сутки культивирования по методу Еркэ. Пролиферации клеток оценивали по включении {?-тимидина в ДНК дедящхая клеток.

Из полученных данных видно, что способность клеток костного коэга цызей Я iizb/ют супрессировать автитедогенеэ и пролифе-рацигз в культуре клеток селезенки вырааена во всех возрастных группах, однако, необходимо отметить, что к 4-5 месяцам супрессивная активнооть значительно скитается (супрессия АОК п включение |?-тимидина). К старости (10-1i-месячных иьпэх) супрессивная активность клеток костного мозга повышается вновь, достигая уровня активности у молодых зивотннх. Рассматривая изменения супрессивной активности клеток костного мозга у мышей Я nzb/uz? , мод~ ео отметить, что снижение супрессивной активности "совпадает о началом развития аутоиммунного процесса. Следовательно, полученные данные позволяй? говорить о там, что при аутоиммунных юра-вениях имеет ыеото изменение регуяяторной функции клеток костномозгового проасхоадения (В-сулрессоров) и селезеночных клеток в зависимости от стадии развития аутоиммунного процесса.

При контакте клеток селезенки иммунизированных мышей с сии-

генными эритроцитами выделяются факторы, угнетающие иммунный ответ. Факторы антигеннеспецифичны и секретируются, вероятно, Т-лиьфцитами (В.П.Лесков и соавт., 1977). Исследовали способность к внделени» факторов кышей линия К2Б и тъ/игъ линий в возрасте 1-2 и 4-6 месяцев. Результаты показали, что иммунный ответ у новозеландских мышей в возрасте 4-6 месяцев снижен по сравнении с величиной иммунного ответа у маязй 1-2 месячного возраста, то есть с возрастом происходит супрессия иммунного ответа,

У1. ИЗУЧЕНИЕ ГОДШШГИДЮГО СОСТАВА И ЭЛЕКГРОНШ-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЯДЕРНОГО МАТРИКСА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ШВОШАЩСШ ИШЕЙ

По дакни.! ряда авторов петла ДНК хроматина прикреплены сбоями концами к скелетный структурам ядра - ядерному матраксу. В точках прикрепления к ядерному шгрнксу локализованы репликатив-ныо комплексы, которые обеспечивал? репликацию ДНК и, по-Елдала-ыу, регулируют этот процесс. Поскольку ядерный метрике выполняет ваднейияе функции в организации генома, инициации репликации ДНК и транскрипции, особенности его ультраструктуры и солипептидного состава могут играть существенную роль в патогенезе заболевания новозеландских мышей.

В ядерном матриксе различает трн вида структурных элементов: I - штатный слой, ограничивающий периферию ядерного магрикса, называемый фиброз нш моем-или ламкной; 2 - фибриллярно-глобулярная сеть внутриядерного махрккса; 3 - фибриллярный остаток яд-ршжа или остаточное ядрышко.

В исследовании использовала печень самок гибридов Р) нгв/ют линий ьамей. Изучение проводилось в динамике развития патологического процэоса у данных животных в возрасте 1-2 месяца, 4-5 ые-

ояцвв, 8-9 месяца в и 12-13 месяцев. Для контроля бала использована печень мышей линии 2аьв/с соответствующего возраста.

Исследование ядерного матрикоа клеток печени шдей Р1 П2в/нгт? ланий показало, что ядерный катриис всех четырех групп содеряат такие аэ структурные элементы, что п ядерный матрако контрольных гааай. Вместе о тем, у них проявляются вновь приобретенные черты, которые ткно видеть как в первой возрастной груп-цо, так к на более поздних стадиях разЕлтая заболевания. К таким изменениям «окно отнести увеличение толидаы фиброзного слоя ядерного матрикса, достигающей наабольаей величины к 8-9 месячному возрасту. В той се возрастной группе имеет место зачетное увеличение числа норовых комплексов. Внутриядерный матркко часто более плотный по сравнению с внутриядерным матршссом коктролышх талей. В нем иозко видеть двойные тяги, которыэ по своей структуре похога на структуру фяброзного слоя. Во внутриядерном мат-раксе появляются фибриллы дааметром около 5 ни я более. Подобных структур в ядерном матриксэ контрольных ыыаей не отмечалось. В большинстве остаточных ядрышек наблвдается сегрегация с последую-цоя фрагментацией. Зачетно снижается число паровые комплексов.

Электронно-шкроскопическое исследование изолированных ядер печени мылей Р1 ягв/ягя линий выявило начинавднйся распад ядер (инвагинащю ядерной оболочки, фрагментацию нуклеопяазкы), соп-,оовоядаемие утолщением фиброзного слоя узе в возрасте 1-2 месяцев. У 7-8 месячных сток эти явления резко нарастала. Наблюдались глубокие инвагинации оболочка ядра и распад часта ядер наряду о увеличением числа ядршек и толщины фиброзного слоя. Распад ядер резко усиливался в .терминальной стадии заболевания (в возрасте 12-13 месяцев), причем наблюдались многочисленные тяжи, простирающиеся от фиброзного слоя до внутрь разреженной гуклеоплазш.

При изучении полипептидного состава ядерного матрикса клеток печени шлей ?1 нгы/кгя линий выяаъшгся 30-35 полипептидных полоо с молекулярной массой от 200 до 10 кД. Для всех четырех возрастных групп опытных мшей характерно появление нескольких полос в высоко молекулярной 80на 200-150 кД» У контрольных животных эти полипептиды выражены значительно слабее. Четко выражон триплет белков с молекулярной массой 70-60 кД, так называемых ла-шнов. У 1-2 месячных опытных мышей наиболее выражен латан В, у 4-5 месячных - лашк А, в то вреш как у 7-8 и 12-13 месячных, также как и в контроле, интенсивность всех трех ламинов одинакова. Обращают на себя внимание три мажорных полипептида с молекулярной массой от 45 до 36 кД, которые особенно четко выявляются ь ядерном ыатршссе 4-5 месячных шлей вав/нгя линий, а с развитием болезни и возрастом у 8-9 к 12-13 месячных ишей интенсивность их снижается. В отличие от полипептидного состава ядерного ыатрикса клеток печени контрольных мшей, у опитых мышей наблюдаются интенсивные полосы полипептадов в зоне 13-10 кД.

Проведенные исследования показали, что структура ядерного матрикса клеток печени новозелавдских мышей характеризуется существенными морфологическими и биохимическими особенностями по сравнению с ядерным катриксом контрольных животных. Полученные результаты вполне соответствуют представлению о ядерном ыатриксе как о весьма лабильной и реактивной структуре, играющей важнейшую роль в регуляции метаболизма и аизнедеятельноста клетки.

Результаты проведенного наш элекгрофоретического анализа показывают, что у аутоиммунных мышей в ядерном ыатриксе увеличена доля главным образом высокомолекулярных 150-200 кД и, отчасти, шзкоыолэкулярннх полипептидов от 45 до 36 кД и от 13 до 10 кД. С другой стороны, доля характерных для фиброзного слоя белков с

иояекудярной массой 60-70 кД - лашнов не претерпевает существенных изменений. Это обстоятельство указывает на то, что наблюдае-пнэ изменения толщины фиброзного слоя обязаны, вероятно, не столько дшланаи, как другиы белкам, по-вадимому, вирусный. Возможно, что эти га белки образуют и фибриллярные структуры, развивавшиеся па поздних стадиях болезни.

Таюш образом, характерные изменения ядерного иатрикса и ядра в целом при развитии патологического процесса у миней, состоят в деградации этих структур, описываемых как кариорекслс л хроматолиз в пагологогястологаческой картине. Выяеошсштые яз-глэнения такого рода и наблюдалась в настоящем исследовании у мн-сзй 71 в возрасте 12-13 месяцев. Однако на более ранних

стадиях отмечалось прогрессивное утолщение фиброзного слоя. Увеличение числа поровнх ко?шлексов и развитие внутриядерного мат-ракса.что в целом мозно трактовать как усиление активности метаболизма происходящего в ядре гепатощков. Накопление в ядерном штриксе опытных мышей еысоломэлекуллрних компонентов, а таюхе выявление фпбрялл я утолщение фиброзного слоя, наблюдаемое при электронной иикроскопил, возможно, обязаны накоа. ^гао в ядерном иатрлксе вирусных белков, идентификация которых может представлять существенный интерес. Кроме того, явления деградации в ядерном матриксе и ядре в целом, описываемых в патогастологических исследованиях как кариораксис я хроматолиз напоминают феномен апошгозиса, которому придается большое значение в патогенезе В1П-ппфекдаи.

Таким образом, исследованиями установлено, что с возрастом у новозеландских мшей отмечается снижение иммунологической реактивности. Наиболее четкие изменения были отмечены, начиная о 4-го месяца аизни животных. При это« наблюдается снижение пролифератив-

ной н миграционной активности стволовых кроветворных клеток. Следует отметить, что с развитием аутоиммунного процесса у шшей М kzb/kzv? меняется и кинетика дилеренхдаровкп стволовых кроветворных клеток с преимущественным сдвигом в сторону эритроидногО ряда, вплоть до полного отсутствия способности формировать коло* пня гранулоидного ряда к концу 10-го месяца сиз на шшей, то еотЬ в терминальной стации заболевания. Результаты этих опытов показывают, что с.жжение кооперативной способности Т- и В-лим$оцитов мшей hzb/nzw с развитием аутоиммунной патологии, по-видшдэ4» ну, связано не только с количественным и функциональвш дефицитом Т-хелперов, но'и с повышением супрессорной активности Т-лшд-фоцитов.

Схема развития патологического процесса у новозеландских ць'1-сай представлена в табл. 10.

Насколько интересны эти клвотные для медико-биологических исследователей говорит множество работ по изуче:аа тех или иных, проявлений патологического процесса в различных органах н тканяй.

Исследования по изучению заболевания у шшей наяей колонии начиная с 1975 года позволили наи обнаружить патологические процессы, развивающиеся у новозеландских мышей в сердце, легких, печени, тимусе, почках, крови, кояе, молочной железе. У данных аивотных нами определялись хромосомная нестабильность, нарушенне функции ферментов, антитела к ДНК-РНК-гибрвду, н-ДНК, ДсРНК, вел** телию тимуса, базельнсму слов кожи, коллагену I типа, ЦИК, изменение функции рехулягорных клеток тадунной. системы.

Следствием вшеописанной тяжелой патологии, по-видимому, является низкий уровень воспроизводительной функции данных жявотньК: и сравнительно короткая продолжительность «изни. Начало проявления патологического процесса по времени совпадает с периодом раз-

Таблица Ю

Схезд .развитая иммунодефицита у новозеландских шаей

(ткана шов РНКгрешрацион-j .тнцуса aj ,ных вродес-Í

{КОЛЕ I J сов ДНК I

1 ! ! ! ill !

¡взаяш- «тивности я} iдейстайЯ;количества; jT- н В- ¡Т-хелпароВ)

}ЛПфЭЦИ-| )

jtob , ,

9 - Ю мэсяцев

( г( «И

8

оГд В Ф И ц И т

иноленая, отсюда я трудаооть в воспроизводстве в сохранении »тих линий мшей.

Таким образом у новозеландских мшей в постнатальный период развивается заболевание о поражением практически всех органов я систем, в терминальной стадии наблюдается коматозное состояние я резко выраженная кахексия. Однако необходимо отметить, что степень вцзааенносги патологического процесса зависит от генетических особенностей каждой, линии. Одним из таких показателей hobst служить средняя продолжительность жизни, которая у мшей линии я£в в 3 раза, у мышей линии uz* в 1,6 раза, а у 71 hzb/hzw линий в 3,6 раза короче обычных линейных мышей.

Вышеописанные признаки заболевания новозеландских ишей в определенной степени подобны описанию проявления ВИЧ-инфекции к завершающей ее стадии СПВД. Обище признаки иммунодефицита, характерные для ретровирусной инфекции человека в новозеландских шпеР тхрсдставлены в табл. 11.

Полученные результаты ставят нас перед тем фактом, что аутоиммунные болезни следует рассматривать не как резутьтат повышенной активности иммунной системы, а как проявление иммунодефицита. В этой связи интересна гипотеза iudoaterg H.H. (I97I), которая основана на достижениях в области изучения генетического контроля иммунного ответа. Использовано главное положение »той области таадуногенетики - наличие генов высокого и низкого иммунного ответа на те или иные конкретные антигены: если организм гомозиготен по генам, определяющим низку» иммунологическую реактивность по отношению к антигенам некоего микроорганизма, то он не может осуществлять полноценную иммунную защиту от этого микроорганизма. В отношении других антигенов организм способен развивать нормальный иммунный ответ. Иммунодефицит такого типа

Таблица II

Общие признаки иммунодефицита, характерные для ретровирусной инфекция человека

я новозеландских швей

Основные проявления С1Щ г ■ ! Их наличие у новозеландских иызей

1 1 " 1 по данным литературы | со собственным данный

I 1 2 ! 3

Ретрошрус как этиологический фактор

Наличие горизонтального и вертикального путей развития инфекция

Дефицит Т-хедперов, угнетение продукции Ш-2, ивтер-ферона-

Нарушенне моноцитарно-макро-фагальной системы, усиление продукции ИЛ-1, ИЛ-6

" Ошюртуш стнче ские" янфек-цеи, как основная причина смерти

Развитие опухолей (жмфомы, саркома Капоан)

ретровирус обнаружен в лимфоид-них органах, печени, почках. Транскрипты 8,4 кб йрппг РНК эндогенного ретрогируса обнаружены в ядре тимоцитов, особенно незрелых

Наличие антител к ДНК/РНК габриду, и антитела к дс РНК предшествую? развитию заболевшая

I

■с»

Проявляются ода пути передачи иафекют

Обнаружен функциональный дефицит Т-хедиеров

Угнетение продукции ИЛ-2, ян-терферона-

Измененжз моноцнтарно-ыакрофа-гадьной системы, усиление продукции ИЛ-1, ИЛ-6

Новозеландским мшаы свойственна высокая чувсгыггелзность к различного рода инфекциям, в том числе тек, к которым устойчивы мши большинства других линий

Характерно развитие лимфой Обнаруяены аутоантэтела к

базальному слою эпитедяя кохи

Окончание та&апш Я

Оораззше нервной системы

Усиление функции Т-супрессо-ров

Аутоантитела к апиталив корковой в медуллярной зон тицуса

Аутоантитела к аДНК Гкпокомплементемия Гипергаммаглобулинешя ЦИК, АНФ

Снижение сывороточного типического фактора

Снижение продукции цростаглавдина Е

Лейкопения Лимфэцйтопения

Угнетение реакции гипер-чувстштельности ьамздяен-ного типа

Аутоиммунная гемолитическая анемия

Пневмония

Гломерулонефрит

Миокардит

Гепатосплекомегалия Системный васкулит Тромбоцитопения Диаррея, кахексия Короткая продолжительность

2СИ8Н&

Для новозеландских мшгей характера! нарушения поведенческих реакций и морфологические каиэнения в тканях нервной сжстеии

Усиление функции Т-супрессоров

Аутоаятитвж к впигелзш корковой а медуллярной зон тимуса

Аутоантитела к дЦНК

Гяпокомплементемия Гипергаммаглобулияекия

ЦИК, А1Й

Снижение сывороточного тнютеского фактора

Снижение продукшш простагяандета £

Обнаруживается лейкопения Обнаруживается .пшфовдтопвния

Угнетение реакции гипер-чувствита льностя замедленного типа

Наличие аутошгцунной гемолитической анении

'Наличие пневмония Наличие гломерулонефрита Наличие меовардита Наличие ге пато силе номе галии Наличие снотемного васкулита

N I

яарроя, кахексия Продолжительность низки мнзей линии нгв в 2 раза, а шаей У нгв/пгя лшшй в 3 раза короче, чей у обычных ккнзй

обеспечивает достаточно длктельноо безнаказанное паразитированге данного микроорганизма, в данном случае ретровируса, в тканях организма. Вызванная т деструкция тканей приводит к высвобозде-нию окрытых в обычных условиях тканевых антигенов, которые в норме никогда в кровоток не поступают. Поскольку генетический дефект иммунной систзцы обусловливает ео неполноценность только в отношении указанный антигенов, она полноценно реагирует на выово-боздвшшв вследствие инфекционной деструкидя тк&навыа аутоаитиге-нн. Вырабатываются аутоантитела - организм пытается защититься ев«, если не от самого инфекционного агента, то хотя бы от продуктов тканевой деструкции.

Рассматривая заболевания о аутоиммунными нарушениями о втой точка зрения, во-первых, мояно объяснить пагогегаэ аутоиглмуштх болезней н связь ах с инфекциями. То есть, да!шая концепция иоает внести определенную ясность и объяснить факт наличия воспршш-чавых индивидуумов среда популяции лвдей, а у каютных натачие восприимчивых янбрэдных линий. Другими словами, у человека или ейвотного, организм которого гомозиготен по генам, онредэлящим высокий иммунный ответ, инфекционный агент, в данном случав рет-ровирус, нейтрализуется опецисСическима антителами, а также возможны другие механизмы заадты. У индивидуумов, гомозиготных по генам низкого иглунного ответа развивается инфекционный процесо. Кроме того, данная гипотеза может явиться обоснованием теоретического предположения о СПИД как о собственно оппортунистической инфекции (Леш Д.А., 1988). Вероятность'развития продуктивной стадии ВИЧ-инфекции зависит от степени годазиготностл индивидуума по генам определяющим силу иммунного ответа на данный, антиген, в частности, вирус ВИЧ. Во-вторых, при этом ставится под сомнение целесообразность зшмунодепркгссявной терапии, шроко приметаемой

спид

Jl9jrrHB3pyejtmi инфе:

Антитела Шрагеяие Поражена к разру- тимуса,повеете СД4- ражекие и клеток ■ разрушение СД47СД8

тимоцитов

к вирусным белкам

Дефицит Т-хелперов

Оппортунистические инбэкции

Срыв аутотоле-рантности

Возникновение аутоиммунного процесса

Аутоантитела и клеточнне аутоиммунные реакции к другим антигенам ткани

Jopase кие 1йрвной ткани

Поликло- ' нальная В-клеточная активация

Снижение клеточного •ищунатета/

Опухоли

Пэраяекие ШС

ПАТОЛОГИЯ НОВОЗЕЛАНДСКИХ МЫШЕЙ Иентивирусная инфе!

Антитела к дсРНК и ДНК/ТНК гибриду

Cunéeme шэо-лиферативной и миграционной активности стволовых клеток

Нарушеню ди$фереп-цировки Т-клетоя, особенно Т-хелперов

Дефицэт Срыв

Т-хелперов аутотоле-рантности

Оппортунистические инфекида

Поражение тимуса,и поражение и разруше-нив

СД4/СД8 оцятов

Порёлениэ не ротос клеток

Поликло-натьная В-клеточная активация

Возникновение аутоиммунного процесса

Аутоантитела и клеточные аутоЕвяыуннна реакции к другом антигенам ткани

Снижение клеточного иммунитета

Опухоли

«ь

Поражение ЦНС

Рис. 3 Схема

патогошэа

прз лечения ряда аутоиммунных болезней. В-третьих, эта кондепция подчеркивает важность проблемы поиска способов превращения генетически низкореагирующих на данный антиген особей в высокороага-рувднх.-Иначе говоря, ставятся вопрос о том, что для леченая аутошядунннх расстройств необходимо целенаправленно стицуларовать лкмуннуп систему а не подавлять ео иммунодепрассивнымн средствами.

Для объяснения аутоимцунязащш и утраты иммунологической толерантности при аутоиммунных процессах большой янтерьо предотав-ляет гипотеза роли перекрасткораагирувдах антигенов (И.М.Ляшерт ц соавт., 1973, 1988). Речь идет о перекрестной реактивности ряда опятопов, в данном случае ретровирусных белков, о белками организма хозяина.

Схема патогенеза лентивирусной ихфкции представлена на рзс.З.

Итак, разностороннее нэучекпе иммунного стазу са у новозеландских мышей позволило установить и расшифровать отдельныо механизмы нарушения иммунной системы.

Установлено, что при развития заболевания происходят слокныэ взаимосвязанные нарушения как клеточных звеньев иммуногенеза гак п гуморальной системы иммунитета.

У мшей Р1 нгвЛш линий при развития патологического процесса сниаается миграционная способность кроветворных стволовых клеток и Г-лимфоцитов, уменьшается суммарное количество стволовых клеток в костном мозге, возиояной причиной тому является нарушение стабильности хромосом (повьаеняый уровень хромосомных аберраций). Путем воздействия мутагена митомицина С установлено, что у новозеландских ишвй в клетках костного мозга процэссы образования повреждений хромосом, преобладают над процессами репарации, что может слулшть причиной возникновения хромосомных аберраций, т.е. наблюдается нарушение нормального протекания внутри-

клеточных репарационных процессов. Нарушается состояние репарационных систем, основным назначением которых является ликвидация повреждений ДНК, возникающих в клетках, и поддержание стабильности генетических структур. Отсюда следует, что нарушения в системе иммунитета происходят ухе на уровне кроветворных стволовых клеток.

У мышей р1 нгв/кг* подавлены процессы кооперативного взаимодействия ,р- и В-лимфоцитов, что связано, по всей вероятности, с количественны?.! н функциональным дефицитом Т-хеллеров о одной стороны п с усилением супрессивной активности хслеток лнмфетичео-кнх Т-супрессоров с другой стороны, функциональная активность В-клеток предшественников АОХ в процессе развития заболевания новозеландских щшей но изменяется: не снижается способность к миграции из костного мозга и способность превращаться в АОК в присутствия нормальных Т-хелперов.

Наряду с нарушениями отдельных звеньев клеточного иммунитета установлены патологические изменения гуморальной системы иммунитета, выражающиеся в выработке, аутоантптел к эпителиальной ткани тимуса и коки, аутоантител к нДКК, ДНК-РНК-шбриду, дсРНК, последние в свою очередь являются косвенным подтверждением наличия вирусной инфекцаи в организма новозеландских шлей.

Следовательно, аутоиммунная патология у данных гивотных является суммарным результатом икмунодефзднтвого состоя!гая в процессе нарушения разных звеньев клеточного иммуногенеза, нарушения функциональной активности клеток-регуляторов иммунного ответа и извращения гуморального иммунного ответа под воздействием ретро-вирусной инфекции.

Нам представляется, что заболевание новозеландских мышей следует рассматривать как оппортунистическую ретроварусную инфекцию

о длительной клинически незаметной персястекдией вируса в организма. Под влиянием кофакторов (ннне неизвестных) латентная вирусная инфекция переходит в продуктивную стадию и вшивает развитие заболевания. Степень выраженности и сроки проямения патологического процесса зависят от генотипа и совершенства методов используемых для исследования.

Следует отметить, что просматриваются четкие причинно-следственные признаки заболевания. Показатель, подтверждающий наличие вирусной инфекции в организма - ДНК-РНК-гибрнд определяется во всех возрастных группах и нет достоверных различий в зависимости от генотипа, возраста и пола новозеландских мьшей, а также определяется у контрольных мышей линии СВА, но достоверно ниже (р < 0,05). Однако же те признаки, которые характеризуют степень выраженности патологического процесса - аутоактитсла к эпителию тимуса в кожа, наличие хромосомных аберрацай, аутоантигела к и-ДНКо возрастом динамично нарастают. Показатели клеточного иммунитета - миграция, расселение и даффзренцаровка кроветворных стволовых клеток, функцнона-аное и количественное состояние Г-хелпе-ров, кооперация Т- и В-лшфэцитов с возрастом стшаэтся, состояние Т-супрессоров остается или без существенных изменений или в конце заболевания активизируется. В результате у новозеландских шагай габлвдяется цммунодефншг Т-хелперов при неизмененном или повиданном количестве Т-супрессоров в терминальной стадии заболевания.

Таким образом, анализ собственных результатов и данных литературы позволяют считать обоснованной возможность и целесообразность использования новозеландских мышей как адекватную природную биологическую модель иммунодедкцитов, вызываемых регровируса-ми.в частности. ВИЧ-инфекцш человека и завершающей ее стадии СПИД.

вывода

1. Результаты проведенных исследований, направленных на изучение меточного и гуморального звена иммунитета в динамике, позволили установить, что заболевание новозеландских мышей характеризуется глубокими нарупекаями иммунитета в зависимости от стадии заболевания, а также разнообразными изменениями гуморального звена иммунитета, о чем свидетельствует выработка противовирусных антител, таких как антитела к ДНК-РНК-гибриду, дсРНК и нДНК.

2. У мышей рч ягв/ягиг и ягв линий с первого месяца кизнн обнаруживаются аутоактигела, реагирующие с эпителием базального слоя кони, а также с эпителием корковой и медуллярной зон тимуса, что объясняет атрофоэ эпителия тимуса на первом месяце постнаталь-ного развития.

3. У молодых милей У игв/нгя (1-2 мес) клеточное звено иммунной системы в целом не изменено по сравнению с мшами других линий. У них наблодается высокий шатунный ответ на тимусзависнмый антиген (ЭБ), нормальные процессы миграции стволовых кроветворных клеток, Т- и В-лимфоцитов, Т-В-кооперации, нормальная активность Т-хелперов и Т-супрессоров.

4. с развитием заболевания, начиная с 5-го месяца лизни, у мышей Я2в/Н2|» наблюдается снижение пролафератквной и миграционной активности стволовых кроветворных клеток, а также меняется кинетика дифференцировки стволовых кроветворных клеток с преиыу- . щественным сдвигом в сторону эритролдного ряда, вплоть до полного отсутствия способности формировать колонии гранулоидкого ряда в терминальной стадии аутоиммунного процесса.

5. С развитием патологического процесса, в возрасте 5 месяцев а старше, у мышей нгв/ют снижение кооперативной способности Т- и В-лимфоцитов в иммунном ответе сопровождается функциональным и количественным дефицитом Г-хелперов, а также повшением оупрес-сорной активности Т-супрессоров, угнетающих Т- и В-кооперацшо, с сохранением активности В-клеток - предшественников антитеяообразую-цих клеток.

6. Обнаружение антител к ДНК-РШГ-гибриду у мышей нгв, ти, р1 нгв/ш? линий, любого возраста и пола на одном уровне (9-11%) является показателем персисгенции ретровнрусной инфекции у данных животных.

7. Наличие антител к дсРНК н повышение уровня данных антител в 4-х месячном возрасте свидетельствует об усилении решшкатнвных процессов ретровируса и перехода персистирующей инфекции в продук-

тивную, которая клинически выражается в неуклонно к стремительно развивающемся натолошческом процессе и в возрасте 10-11 месяцев заканчивающимся летальным исходом»

8. б сыворотке крови самок гибридов я kzb/kz* линий обнаружен высокий уровень антител к нгтивной ДНК, который в возрасте 10—II мес достигает 43% связывания меченой ДНК сыворотками по сравнении с 12% у самцов, что дает основание говорить о половой диморфизме.

9. У нозозелавдских мышей с возрастом сильно увеличен по сравнению с контрольной линией мыле8 c57Bii/6 , в клетках костного мозга спонтанный уровень хромосомных аберраций, представленных в основном аберрациями хроматидного типа, а такяе скиязны репарационные процессы ДНК под воздействием мутагена иитомицина С.

10. Полученные результаты позволяют считать обоснованной возможность и целесообразность использования новозеландских мышей как природную биологическую модель иммунодефицита. Использование данных гивотных, имевдах характеристику патологического процесса по генотипу, полу и возрасту позволит продолжить изучение вопрооов этиологии, патогенеза, поиск средств эффективного лечения и профилактики для предотвращения распространения заболевания и легальных исходов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты позволяют использовать новозеландских ышей как адекватную модель иммунодефицита.

Новозеландских мшей можно использовать для изучения заболевании с вертикальной трансмиссией вируса (инбредноа разведение мшей itzb и nzw линий), а также для изучения горизонтальной трансмиссии, скрещивая животных данных линий меаду собой и с другими линиями шшей, получая таким образом заболевание с разной степенью выра-Еенности в зависимости от генотипа исходных линий, пола и возраста. Возможна передача заболевания путем переноса вируса с кровью, тканями и трансплантацией яйцеклетки другим линиям мшей.

В зависимости от цели исследования данных животных можно рас-бматривать как уникальную модель для разработки и испытания новых методов лечения и профилактика лентивирусной инфекции. Основываясь на полученных: результатах о том, что у ?1 tfZB/irzw линий заболевание развивается на более ранних сроках и сильнее выражено в сравнении с исходными линиями считаемделесообразным использование именно их для получения более быстрых результатов при использовании тех или иных препаратов.

С целью изучения эффективности профилактических средств против

ретровирусной инфекши, данных животных лучше использовать в valine ранние сроки постнатольного развития либо в разные сроки беременности, возможна обработка одного или обоих родителей непосредственно перед спаривание«.

Необходимо обратить внимание на наличие полового диморфизма в сроках проявления и степени выраженности патологического процесса у животных одного генотипа - сачки заболевают раньше и заболевание протекает намного тяаалее, чем у самцов.

При изучении эффективности лекарственных препаратов и влияния икмуномодулируюадсх средств на развитие иммунных нарушений необходимо строго учитывать существуюдае изменения в различных звеньях иммуногенеза у интактных животных в рамках определенного генотипа, пола и возраста (возраст в данном случае соотносится с длительностью .заболевания человека).

При планировании и проведении экспериментальной работы с использованием новозеландских мшей научный работник обязан соблюдать ветерикарно-санитарные правила и учитывать эпизоотическое благополучие в экспериментально-биологической клинике, а также обеспечить соблюдение правил личной безопасности для всего обслуживающего персонала и лиц участвующих в проведении эксперимента.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕЖ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние фактора питания на воспроизводство новозеландских мшей - природной биологической модели аутоиммунных заболеваний // Тез. докл. конф. "Использование лабораторных животных а разработке, производстве и контроле биологических медицинских препаратов / соавт. И.В.Кусельтан.

2. Влияние фактора питания на гематологические показатели новозеландских KZB/N, NZff/N мшей я их габрцдов // Тез. докл. конф. "Морфологический контроль биомедацвнских экспериментов на животных? - ¡а.,1978. - С.51-53. / Соавт. И.В.Кусельтан, С.С.Туголукова.

3. Регуяятотаые клетки иммунной системы (помощники и супрессоры) у мышей NZB/NZW с аутоиммунными расстройствами // Доклад Академии наук СССР, 1979, т.245, № 5. - C.I269-I27I. / Соавт. Р.В.Петров, В.А.Насонова, Р.М.Хаитов, А.М.Нажмегдинов, С.Ю.Пчелинцев.

4. Влияние противовирусных препаратов ремантадина и метисазона на развитие патологического процесса у мьщей nzb/nzw п // Тез.докл. конф. "Актуальные вопросы ревматологии и реабилитации больных ревматическими заболеваниями".- Вильнюс, 1979. - С.172-174. / Соавт. А.А.Матулис, В.И.Астарускас, Р.С.Пташекас, В.Н.Златкувене,Г.И.Нукене.

5. Белки сыворотки: реагирующие с ДНК и ДНК-РНК гибридами у но- -возеландских мшей разного возраста.// Доклады Академии наук СССР, 1980. -1 5. - С.251, 1278-1280. / Соавт. A.M.Доверенны-Св.А.Насонова, Л.Е.Брыкснна, В.К.Подгородниченко.

6. Моделирование условий воспроизводства иммунодефицитных пгв/я, N2W/H мышей. П Бшл. экспер. биологии и медицины. - М., 1980. - № II. - С.638. /Соавт. И.В.Кусельтан, А.Н.Юнин.

7. Миграция и дифференвдровка кроветворных стволовых клеток у . аутоиммунных мыпей разного возраста // Бюлл. экспер. биологии и медицины. - М., 1980. - & 2. - С.224-226. / Соавт. Р.М.Хаитов, И.Н.

Шатмова, А.М.Нагметяинов, Т .В .Дикая, С.Ю.Пчелиицав, В.А.Насонова.

8. Изменение почэк у новозеландских мьаей и их гибридов, воспроизведенных в Институте реъматологгш А?Я? СССР // Библиограф, указ. Б^ШТИ "Депонированные рукописи", ГЕ80, & 3, библ. описание, 21. / Соавт. Н.Н.Гоицман. Е.О.Дрейер, Й.В.Кусельтан.

9. Разработка условий воспроизводства новозеландских мышей я определение наличия аутоиммунного процесса у выведенных популяций. /Г Автореф. дне. ... канд. биол. наук. - М., 1980.

10. Влияние экзогенного интерферона на течение аутоиммунного заболевания мшей линии яг в/:/ // И-.глунологдя,1981.- И 5.- С.50-52. / Соавт. В.А.Саганов, З.С.Алекборова, Д.В.Корогодан, П.3.Филипс.

11. Ввделенне супрессорных и стимулир/ших факторов Л1Г/4»цитата иммунных ашей разных линий ..¿ж контакте с сингенкьм эритроцитами. и Иммунология, 1982.- .4 2. - С.27-23. / Соавт. В.П.Лесков, А.Н. Чередеев, В.В.Соловьев, Л.Е.Костюк.

12. Нарушение регекерационных процессов молочных аел^з при аутоиммунных заболеваниях лактирувдих мыаей. // Онтогенез, 7.585. -

Т.16, У» 5. - С.513-517. / Соавт. И.А.Суетина, В.В.Ахобадзе.

13. Хромосомные аберрации и сестринские хро^агидкыэ обмены у мышей ?1 (нгвхнгя) экспериментальной модели системной красной волчанки. // Сб. "Медицинская генетика. Итога и перспективы".1983.

- С.170-179. / Соавт. О.Я.Скаэкина, И.Г.Дильп, С.С.Туголукова.

14. Влияние интерферона на морфологические изменения в почках мывей. // Ь!блиограашческий указатель ВИНИТИ "Депонирование рукописи". - 1983. С.181. / Соавт. Н.Н.Грипман, З.С.Алокберо-ва, В.А.Савинов.

15. Хромосомные аберрацют у мыаей Р1(н,2!Вх!?2») - экспериментальной модели системой красной волчанки. // Цитология и генетика, 1984. - Т.18, Н 6. - С.458-460. / Соавт. О.Я.Скаэкина, И.Т.Дильп, С.С.Туголукова, Ю.В.Корогодика.

16. Мифологическая картина а сердце мыаей я2в/яг\т с вол-чаночно-подобннм сивдроуом и ее изменения в зависимости от лечения. // ;<1атер. ¡3 Всесовэн. съезда ревматологов. - Вильнюс, £85.

- С.137. / Соавт. Н.Н.Грицман, С.Г.2уков.

17. Влияние индукторов эндогенного интерферона на аутонгялунный процесс у новозеландских мьшей. // Там же. - С.2а9. / Соавт. Р.М. Балабанова, М.С.Веникова, В.К.Подгородюпенко, С.С.Туголукова.

18. Влияние преднизолона и делагала на морфологические изменения в легких у новозеландских мьшей (модель (ЖВ). // Там кз. -

С.124. / Соавт. О.Г.Во,1нова.

19. Генетические аспекты реакций гуморального иммунитета к коллагену у человека и животных. Сообщение I. Анатаз полш.гар<Тнзма уровней аутоантител к коллагену I типа у шшзй ?1 // Гене-тика.1985,- XXI,- № 5.- С.868-871./ Соавт.Нсовиаский Е.В..ПанасюяА.Ф.

20. Влиянлэ индуктора интерферона полиИ, полиЦ, вк.тачеиного в лп-посомы, на выживаемость новозеландских милей.// мат ер .Все с. конф. "Итоги и перспективы теоретических и практических (клинических) исследований по проблеме интерферона.- Тбилиси, нояб. 1985.- С.56. / Соавт. Р.ЗД.Балабанова, А.М.Поверенный, В.К.Подговодниченко.Г.В.ГЬшв.

..21. Микросомальная окислительная система мышей линии М2в и и* // Вопр. мед. химии. - 1985. -Й2. - С.87-90. / Соавт. А.В.Тихомиров, Т.В.Замараева. Д.А.Лебедев, С.С.Туголукова.

22. Особенности морфогенеза молочных желез у аутоиммунных мьшей П тшг« // Онтогенез, 1985. - Т.16, «5. - С.513-517. / Соавт. И.А.Суетина, В.В.Ахобадзе.

23. Аутоантитела к эпителиальной ткана тимуса и кожи у мшей

и гибридов Р1 {тътслгя,/ Билл. зкеп. биол. и мед. - 1986.-Л 9.-С.321-324. / Соавт. И.М.Лямперт, Е.В.Ршшкова, В.А.Насонова.

24. Электронно-микроскопическая характеристика и полипептидный состав ядерного матрикса клеток печени мышей с аутоикуккым заболе-

вашем. // Цитология, 1987. - Я II. - C.I226-I232. / Соавт. Л,П. Троицкая, Л.С.Силатова, Б.С.Попова, В.А.Насонова, И.Б.Марекиä.

25. Влияние длительной терашш предназолоном и делагалом на водчаночноподобный кярдит. // Б кн. "Актуальные вопросы патологии кровообращения". Tes. докл. конф. молодых ученых и специалистов. -Оренбург, 1987. - С.48-49. / Соавт. С.Г.Хуков, В.А.Еукова.

26. Способ }г.иуиохорргкции при аутогослунном процессе. // Изоо-эетение .4 4I382Q9/28I4U4S988) в Гос. реестре изобретений СССР от 30.12.1957 г. / Ссавт. А.В.Цкпин, Б.А.Насонова, Л.А.Ведерникова, Л.В.Белецкая, Т.А.Рязанцева.

27. Влияние тималина на психометрические показатели поведенческих реакций при аутоимлуяных процессах. Роль пептидных биорегуляторов (щ'.томединов) в 1кгуляцхй го:.'.еостаза. // Тез. докл. нарт, конференции. 24-25 ноя'б. 1987, ЦВ.'ЛУ УД СССР, В.МеД. А.-Л., 1937. -С.63. / Созбт. Б.Д.Мелехин, Г.Я.Лящекко, В.В.Синяченко, Е.А.Редизо, А.Г.Долканко, ИЛ.Самойлэшч, E.K.Королева.

28. 2аьксшэсть выраженности дасгро^аческих изменений миокарда при СКВ в эксперименте от дозы и длительности лечения иреднязолоисы П Сб.: Некоторые аспекты клиники, диагностики и лечения ревматических болезней. - Куйбшев, 1988. - С.120-124. / Соавт. Грвддан H.H.. Ьков С.Г.

29. Изменения дермы при экспериментальной системной красной волчанке. // Тез. докл. респ. конф. "Проблемы гистофнзлологил соединительной ткана". - Новосибирск, 1989. - C.I48-I50. / Соавт. Назарова O.A., Полтырев A.C.

30. Влкякиэ селезеночных факторов на теч ние аутоиммунного процесса у новозеландских мышей. // д. "Патологическая физиология и экспериментальная терапия". - 1989. 6. - С.32-34. / Соавт. Цыган A.B., Насонова В.А., Ведерникова Л.А., Белецкая Л.В., Рязанцева Т.А.

31. Природные биологические модели аутоиммунных заболеваний. (Обзор . лтературы). // К. "Ревматология'1. - 1991. - .H. - С.38-44.

32. Биологически активные вецесгва и микрососудистое русло у мышей Я H2E/!<Ziï с экспериментальной красной волчанкой. // Тез. докл. Респ. науч. конф. "Реализация научных достижений в практической фармации". - Харьков, 1991. - С.240-241. / Соавт. Арашноз А.Б.Назарова O.A., Полтырев A.C.

33. Варианты сосудистых поражений при экспериментальной системной красной волчанке в зависимости от генотипа // Тез. докл. 1У Всесоюзного съезда ревматологов. - Минск, 1991. - С.181. / Соавт. Назарова O.A., Аршнов A.B., Насонова Б.А., Полтырев A.C.

34. МоМо- тнкдаональная характеристика экспериментального вас-кулита. П Ревматология". - I92Z. - № 2-4. - C.37-3S. / Соавт. Насонова В.А., йалкина Н.П., Полтырав A.C., Назарова O.A., Аршинов A.B., Бородин А.Г.

Участок мцожнтеяькоп техники вонц дик ссс?

годл. X печати'

3akaj 19 9 тираж (оо гх: