Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Нормотермическая перфузия печени озонированным раствором при операциях, сопровождающихся временным выключением органа из кровообращения

ОЛ

На правах рукописи

НОВОМЛИНСКИЙ ВАЛЕРИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

НОРМОТЕРМИЧЕСКАЯ ПЕРФУЗИЯ ПЕЧЕНЯ ОЗОНИРОВАННЫМ РАСТВОРОМ ПРИ ОПЕРАЦИЯХ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ . ВРЕМЕННЫМ ВЫКЛЮЧЕНИЕМ ОРГАНА ИЗ КРОВООБРАЩЕНИЯ (эксперхтенталъное исследование)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.00.27 - хирургия

ВОРОНЕЖ - 1996

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ВОРОНЕЖСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ ИМ. Н.Н.БУРДЕНКО

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор В.И.Булынин,

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Э.Г.Быков

Официальные оппоненты:' доктор медицинских наук, профессор П.И.Кошелев, доктор медицинских наук, профессор П.М.Назаренко

Ведущее учреждение: Институт хирургии им. А.В.Вишневского

Защита состоится "_"_1996 г. в "_" часов на

заседании специализированного совета Д.084.62.02

при Воронежской Государственной медицинской академии 11

им.Н.Н.Бурденко (394622, г.Воронеж, ул.Студенческая , 10).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Воронежской Государственной медицинской академии им.Н.Н.Бурденко.

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор

А.Ф.Неретина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Последние десятилетия отмечены значительным прогрессом в развитии хирургии печени. Этому способствовали крупные работы ряда отечественных и зарубежных ученых (Боровков С.А.,1968; Петровский Б.В.,1972; Дедерер Ю.М., 1974; Затолокин В.Д.,1974; Шапкин B.C.,1967,1977; Журавлев В.А., 1986; Гальперин Э.И., 1987; Булынин В.И.,1995; Аль-перович Б.И.,1996, Веронский Г.И.,1972,1996; Вишневский В.А.,1996; Couinaud С.,1966; Tung Т.Т.,1963; Mc.Dermott,1983; Lougmire W.P.,1974; Starzl Т.Е.,1973; Reiffersheid K.,1957; Quattelbaum Т.К.1953). Прочно вошла в клиническую практику трансплантация печени (Starzl Т.Е.,1975; Шумаков В.И.,1981; Готье С.Е.,1995; Ерамишанцев А.К., 1995 и др.).

Несмотря на большой практический опыт, накопленный в хирургической гепатологии, совершенствование анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии, внедрение нового хирургического оборудования и инструментария для рассечения ткани печени и гемостаза, в этом разделе хирургии еще остается много нерешенных проблем. К их числу относится прежде всего интрао-перационная кровопотеря при обширных резекциях печени и связанные с ней осложнения . Кровотечения во время операции продолжают оставаться одной из наиболее частых причин послеоперационной летальности (Материалы II-1II-IV конференций хи-рургов-гепатологов, 1994,1995,1996).

Разработка вопросов гемостаза в печеночной хирургии предусматривает создание новых приемов и методов остановки печеночного кровотечения, а также дальнейшее совершенствование уже известных.

До настоящего времени не уменьшается интерес хирургов к способу временной остановки кровотечения из афферентных сосудов при операциях на печени, заключающемся во временном сдав-лении печеночно-двенадцати-перстной связки. Однако до сих пор остается не ясным вопрос о допустимых сроках прекращения афферентного кровотока к печени. Данные экспериментальных и клинических исследований противоречивы. Некоторые авторы не

рекомендуют пережимать ПДС более 20 минут (Иупск! Р.V.,1965; Шапкин В.С.,1971; Журавлев В.Н.,1986; Вишневский В.А.,1995), другие - приводят сообщения о благоприятном исходе лечения больных, перенесших операции на фоне выключения печени из кровообращения до 90-120 минут ( ТСаИ;иск >1.1.. et а11.,1991 ).

Состояние гипо-аноксии может возникать не только в резекционной хирургии печени при необходимости пережать пече-ночно-двенадцатиперстную связку, но и в клинической трансплантологии, когда острая тотальная ишемия является неизбежной, а также при интенсивной терапии острой печеночной недостаточности в случае использования экстракорпорального подключения изолированной печени и других клинических ситуациях.

Потребность практики в более надежных и безопасных методах гемостаза, доступных и эффективных способах защиты печени от гипоксического повреждения при операциях, сопровождающихся временным выключением органа из кровообращения, позволяет считать исследования, посвященные этой проблеме актуальными.

Цель исследования: разработать способ профилактики гипоксического и реп^рфузионного повреждения печени, основанный на парентеральном-внутрипортальном введении озонированного физиологического раствора, при операциях, связаных с временным нарушением или прекращением печеночного кровотока.

Для достижения поставленной цели требовалось решение следующих зздач:

1. Определить роль и значение гипоксического повреждения печени и реперфузионного фактора в структуре патофизиологических нарушений, развивающихся при пережатии печеночно-двенадцатиперстной связки (ПДС) и в послеишемическом периоде;

2. Разработать методики получения озонированных растворов со стандартизованными свойствами.

3. Разработать методику введения озонированного раствора в портальную вену,выполнимую при операциях на печени в момент пережатия печеночно-двенадцатиперстной связки.

4. На основании сравнительной оценки результатов исследований выяснить эффективность и обосновать целесообразность применения нормотермической перфузии печени озонированным раствором при ее ишемии.

Научная новизна исследования: Проведен комплексный анализ биохимических, метаболических и морфологических изменений в печеночной паренхиме при различных сроках сосудистой изоляции печени с построением "метаболических профилей" активности дегидрогеназ для каждого временного интервала.

Изучены изменения биохимических печеночных маркеров, перекисного окисления липидов, а также метаболических и морфологических показателей при внутрилортальном введении озонированного раствора.

Проведена оценка эффективности нормотермической перфузии печени озонированным раствором при ее ишемии и реперфу-зии.

Научно-практическая ценность: Результаты работы имеют значение при резекциях печени в условиях пережатия ПДС, использовании компрессии ПДС в качестве метода временного гемостаза, в клинической трансплантологии и интенсивной терапии острой печеночной недостаточности.

Разработан способ нормотермической перфузии печени озонированным раствором, предупреждающий гипоксическое повреждение печени при операциях в условиях временного выключением органа из кровообращения. Полученные в работе данные раскрывают механизмы гипоксических и постгипоксических изменений в печени и их коррекции.

Внедрение а практику: Результаты научной работы внедрены в практику отделений: хирургии печени, хирургической гастроэнтерологии Воронежской областной клинической больницы. Полученные данные используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н.Бурденко.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Применение нормотермической перфузии печени озонированным физиологическим раствором снижает степень гипоксиче-ского и реперфузионного повреждения, способствует быстрой нормализации специфических функций печени при восстановления кровотока.

2. Степень нарушения основных печеночных функций при ишемии и в период реперфузии соответствует морфо-энзимологическим изменениям паренхимы и коррелирует с длительностью перенесенной ишемии.

3. Морфо-энзимологические показатели позволяют определить степень обратимости структурно-функциональных изменений ишемизированной печени и прогнозировать возможность восстановления ее функций.

4. Биохимические параметры основных печеночных синдромов характеризуют степень повреждения гепатоцитов во время ишемии и в период реперфузии.

5. Внутрипортальное введение озонированного физиологического раствора безопасно при экспериментальном и клиническом применении.

6. Способ ^ профилактики гипоксического повреждения, основанный на использовании нормотермической перфузии печени озонированным физиологическим раствором, может быть рекомендован к применению в клинических условиях при операциях, сопровождающихся временным прекращением афферентного печеночного кровотока.

Ахтробааня работы: Основные положения работы обсуждены на совместном заседании кафедры госпитальной хирургии и кафедры анестезиологии и реаниматологии ВГМА им. Н.Н.Бурденко; на I и II Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием "Озон в биологии и медицине" (июнь 1992 года - г.Н-Новгород, сентябрь 1995 года - г.Н-Новгород); на Всероссийской научной конференции "Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе" (1993 год -г.Санкт-Петербург); на юбилейной научной сессии ВГМА (1993 год - г.Воронеж}; на ежегодных научных сессиях молодых ученых

ВГМА (1992,1993,1994 год -г.Воронеж); на II Республиканском симпозиуме гепатологов (1996 год - г.Гродно).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Утверждено 4 рационализаторских предложения. Получены приоритетные справки на 2 заявки на изобретения.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из "Введения", IV глав ("Обзор литературы", "Материал и методики исследования", "Материалы собственного исследования", "Обсуждение полученных результатов"), "Выводов" , "Указателя Литературы". Отпечатана на 172 страницах машинописи. Содержит 11 таблиц, 33 рисунка. Список литературы включает 437 источников, из них 291 отечественных и 146 иностранных авторов.

Работа выполнена на кафедре госпитальной хирургии (зав. кафедрой - заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор В.И.Булынин) и в Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНКЛ) Воронежской медицинской академии (зав. лабораторией - доктор медицинских наук, профессор Э.Г.Быков). Эксперименты поставлены при участии группы патофизиологии и экспериментальной хирургии ЦНИЛ (руководитель - н.с. Г.И.Мещеряков) на базе экспериментальной лаборатории Воронежской областной клинической больницы (гл. врач - проф. П.И.Кошелев). Биохимические исследования проведены в лаборатории клинической биохимии Воронежской областной клинической больницы и на базе группы биохимии ЦНИЛ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методики исследования В опытах на 80 беспородных собак обоего пола массой тела 10-14 кг изучались:

-исходы ишемии печени после наложения зажима на печеноч-но-двенадцатилерстную связку под наркозом в сроки от 15 до 60 минут;

-результаты восстановления кровотока после ишемии различной длительности, возможности коррекции изменений паренхи-

мы печени после реперфузии с помощью кислорода и озона введением озонированного раствора в портальную систему (См. Табл.1) .

Таблица 1.

Количественное распределение экспериментальных животных.

№№ Экспериментальная группа Количес тво

1 Контрольная группа (изучение параметров исходного состояния экспериментальных животных) 13

2 Ишемия печени (после наложения зажима на ПДС);длительность15 мин.,30 мин., 60 мин. 15

3 Реперфузия после 30-минутной ишемии без использования протектора; длительность наблюдения 5 мин.,60 мин. 10

4 Реперфузия после 30-минутной ишемии на фоне введения оксигенированного раствора; длительность наблюдения 5 мин.,60 мин после восстановления кровотока . 10

5 Реперфузия после 30-минутной ишемии на фоне внутри-портального введения озонированного раствора - изучение ПОЛ и антиоксидантной защиты; длительность наблюдения 5 мин., 60 мин после восстановления кровотока 10

6 Реперфузия после 30-минутной ишемии на фоне внутри-портального введения озонированного раствора - метаболическая и морфологичекая характеристика; длительность наблюдения 5 мин., 60 мин после восстановления кровотока 14

7 Животные, выжившие после 30-минутной ишемии печени и реперфузии на фоне внутрипортального введения озонированного раствора (40 суток после операции). 8

Отдаленные результаты прослежены в хронической серии экспериментов до 40 суток включительно.

Эксперименты проведены под общим обезболиванием внутривенным капельным введением 20% раствора оксибутирата натрия. Премедикация включала подкожное введение смеси 1% раствора промедола (из расчета 2 мл/кг массы тела), 1-2 мл 1% раствора атропина и 1 мл 0,25% раствора димедрола. Вводный наркоз осуществлялся внутрибрюшинным введением 5% раствора этаминала натрия из расчета 0,5 мл/кг массы тела животного. При манипуляциях на элементах ПДС дополнительно вводили через каждые 30 минут по 1 мл 0,005% раствора фентанила.

Брюшную полость вскрывали послойно верхне-срединным доступом, после чего вйделяли элементы печеночно-двенадцатиперстной связки. Последний приток портального ствола - поджелудочно-двенадцатиперстную вену - катетеризировали и дистальнее места ее впадения накладывали атравматический зажим.' Для получения крови для биохимических исследований катетеризировали поверхностные бедренные вены с обеих сторон, при этом через один катетер осуществляли введение наркозных препаратов, другой проводили в заднюю полую вену до уровня впадения в нее печеночных вен. Величина инфузии растворов во время эксперимента определялась значениями центрального венозного давления. Перед реперфузией внутривенно вводили ла- . зикс из расчета 1 мл/кг массы тела животного.

В экспериментах с перфузией озонированным изотоническим раствором хлорида натрия концентрация озона в растворе не превышала 1000 мкг/л, а общая суммарная доза при однократном введении составила 250-4 00 мкг.

Озонированный раствор готовили непосредственно перед инфузией. Для получения озона использовалась озонаторная установка, спроектированная и изготовленная в Конструкторском бюро химавтоматики г.Воронежа. Озон получали при пропускании чистого медицинского кислорода через ионизационную камеру озонатора. При ионизации использовался стандартный режим: напряжение на электродах озонатора составляло 2800 Вольт при стабильном потоке кислорода через камеру в 130 л/ч. На выходе озонатора получали озоно-кислородную смесь с содержанием озона 15 г/мЗ . Это означало, что требуемое колличество озона на один эксперимент содержалось в 25 мл озоно-кислородной воздушной смеси. Этим объемом газа обрабатывалось 400 мл физиологического раствора методикой борбатажа (активным перемешиванием) . Концентрация озона в растворе контролировалась методом иодометрического титрования. Нами разработана методика, основанная на получении насыщенного озонированного раствора, из которого посредством разведения готовится озонированный раствор с требуемыми характеристиками

(приоритетная справка на изобретение № 97012465/14 (002793) от 15.01.96). Приготовленный озонированный раствор использовался в течение первых 30 минут с момента получения.

Проведен анализ содержания в ' сыворотке крови метаболитов, связанных с функцией печени: глюкозы, общих липидов, протромбинового индекса, содержание фракций билирубина, а также ферментативные маркеры процессов цитолиза и изменений ферментативного спектра паренхимы печени, проницаемости мембран - активность аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартата-минотрансферазы (АсАт), лейцинамнопептидазы (ЛАП), общей ЛДГ, гаммаглутаминтранспептидазы (ГГТП), неспецифической холинэ-стеразы (ХЭ), щелочной фосфатазы (ЩФ) (Меньшиков В.В.,1987, Хазанов А.И., 1988) .

В связи с использованием в экспериментах озонированных растворов анализированы процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности систем антиоксидантной защиты (АО) путем определения двух фракций диеновых конъюгатов и малонового диальдегида одновременно с анализом общей АО активности в крови и гомогенате печени (Стальная И.Д., 1977).

Для морфологического и гистохимического исследования

и

иссекали фрагменты левой доли размером 10x15x5 мм перед наложением зажима на ПДС и в сроки 15, 30, 60 минут после прекращения афферентного кровотока, спустя 5 и 60 минут после начала перфузии. Отдельную группу составили блоки печеночной ткани, полученные у животных через 40 суток в экспериментах с перфузией озонированным раствором.

Препараты для обзорной микроскопии готовили после фиксации в 10% забуференном формалине, окрашивая срезы гематоксилином Караци-эозином. Коллагеновые волокна выявляли окрашиванием по Ван-Гизон, ретикулиновые - импрегнацией азотнокислым серебром по Футу, эластические волокна - окрашиванием фуксе-лином по Харту.

Для гистоэнзимологических исследований из замороженных в летролейном эфире при -80°С блоков ткани печени готовили криостатные срезы толщиной 7 мкм. Используя гель-среды с НСТ

на основе поливинилового спирта (Э.Г.Быков, 1985), выявляли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), глютаматдегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), изоцитратдегидрогеназы (и-ЦДГ) , моноаминооксидазы (МАО), альдолазы, 3-

фосфоглицерофосфатальдегиддегидрогеназы (3-ФГДГ) , лактатде-гидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-б-ФДГ), p-оксибутиратдегидро-геназы (р-ОБДГ) , алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АлДГ). Активность щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ) и неспецифической эсте-разы (ЭКЮ определяли методом одновременного азосочетания после стабилизации мембран в охлажденной смеси хлороформа и ацетона (Э.Г.Быков, 1985) . Гликоген выявляли после фиксаций материала по Россману шик-реакцией с димедоном, РНК после фиксации срезов в пропаноле Азуром В по E.Shea (1971), суммарный белок окрашиванием рективом сулема-бромфе-ноловый синий, фосфолипиды после фиксации в Са-формоле кислым гематином по Бекеру, насыщенные липиды идентифицировали окрашиванием срезов жировым красным "О".

Микроденситометрические исследования проведены на установке "БИОЛАМ-УИ" плаг-методом. Получены цифровые значения экстинций, характеризующих содержание метаболитов и активность ферментов печеночной паренхимы на протяжении портальная триада-центральная вена. Результаты биохимических и микроден-ситометрических исследований по получении репрезентативных выборок распределения статистически обработаны на ПЭВМ IBMPentium Рго-200 на основе программы STX (Э.Г.Быков с со-авт.,1987,1990) . Получены значения центральных моментов выборок, коэффициент вариации Пирсона. Достоверность различий определена ма.тричным способом на основе модифицированного критерия Вилкоксона (М. Мельник, 1983, С.Р.Рао, 1968, М.ДЖ.Кендалл, А.Стьюарт, 1973) . Тенденции временного развития процессов изменений ферментативной активности и содержания метаболитов изучены на основе компьютерных программ сплайно-вых аппроксимаций функцией линейного уровнения третьего порядка .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимические исследования функции печени животных, рассматриваемые как исходные данные для последующих сопоставлений, позволяют считать, что основные из них близки к клиническим: активность Алат составляет -168,4±23,24 нмоль/с.л., Асат-97,71±22, 0 нмоль/с.л., ЛАП-153,4±19,6 нмоль/с.л., общей ЛДГ-1,3±0,2 нмоль/с.л., ЩФ-1,43±0,27 нмоль/с.л., ГГТП-0,634±0,15 нмоль/с.л., ХЭ-0,97±0,11 нмоль/с.л.. Содержание метаболитов, относящихся к углеводному и пигментному обмену, составило: ПВК-0,07±0,01 мкмоль/л, глкжозы-9,31±1,11 мкмоль/л, МК-2,1+0,3 мкмоль/л, общего билирубина и его связанной и свободной фракций соответственно-5,5±0,9 , 0,б±0,13 , 4,9±0,8 мкмоль/л . Содержание средних молекул, характери---- зующее процессы интоксикации в интактной группе составило в '"периферической крови-0,21±0,05 мкмоль/л. , в портальной-0,41±0,14 мкмоль/л. Показатели ПОЛ и ОАА представлены в Табл.2.

При гистологическом исследовании определяется стандартная гистоархитектоника печеночных долек и элементов триад соединительнотканного каркаса паренхимы, образованного ретикулиновыми волокнами.

По данным микроденситометрического анализа содержание в гепатоцитах метаболитов у животных контрольной группы составило величины: гликогена- 0,3989±0,06, рРНК- 0,1743±0,01, реакционноспособных групп белка- 0.2433±0,01, фосфолипидов-0,3159±0,04.

После инкубации криостатных срезов в гель-средах с НСТ дегидрогеназная активность определялась во всех гепатоцитах. Уровень активности ферментов в виде "метаболического профиля" представлен на Рис.1. Активность ЩФ и КФ топохимически связана с желчными капиллярами, синусоидами, перилобулярными хо-лангионами, эпителием желчных протоков. Активность ЭКК различна в центральной и перипортальной зонах печеночных долек.

Прекращение афферентного кровотока при наложении зажима на ПДС в условиях нормотермии приводит к быстро развивающемуся комплексу структурных и обменных изменений. Формируются многокомпонентные дистрофические изменения - гидропическая, углеводная, белковая дистрофия. На фоне прогрессирующих расстройств микроциркуляции наблюдается дезинтеграция межклеточных контактов и диссоциация гепатоцитов в печеночных балках. Первичные изменения касаются лишь отдельных гепатоцитов - на 15 минуте ишемии формируется гидропический отек их ядер. Наиболее выражены изменения ретикулинового каркаса - огрубление анастомозов, накопление в соединительной ткани фрагментов волокон и их гранулярного аргирофильного материала. Развива-.. ется деструкция эластических компонентов соединительной ткани в зоне портальных триад. Глубина дистрофических изменений, уровень формирования некрозов гепатоцитов, определяются длительностью ишемии

и являются наиболее значительными через час после наложения зажима на ПДС.

В паренхиме печени происходит быстрая редукция внутриклеточного гликогена . Снижение уровня базофилии цитоплазмы сопровождается потерей фосфолипидного компонента мембран в сочетании с изменениями топохимии белка плазмолеммы. Нормо-термическая ишемия приводит к быстро развивающимся изменениям уровня активности и ее соотношений митохондриально связанных дегидрогеназ и ферментов гликолиза. Изменения физиологической внутридольковой топохимии сочетаются с формированием аггломе-ратов гранул диформазана, их полиморфизмом и смещением под плазмолемму, редукцией фракции дегидрогеназ и альдолазы, связанной со структурами эндоплазматического ретикулума. Прекращение портального кровотока приводит к снижению активности СДГ, и-ЦДГ, МДГ и МАО при стимуляции активности ЛДГ. Наиболее выражено снижение активности 3-ФГДГ, Г-б-ФДГ и р-ОБДГ,.что приводит к дискооперации дегидрогеназ гликолиза и биосинтеза СоА. Устойчивой к ишемии является активность дегидрогеназ обмена этанола -АДГ и АлДГ ( см. Рис. 1.). В ишемизированной

печени актизность ЩФ связана с перипортальными желчными капиллярами, синусоидами и перилобулярными холангионами. Увеличение активности лизосомально-связанной КФ (0,1921±0,03) в первые минуты ишемии связано с активацией лизосом и формированием дистрофических изменений, снижается уровень КФ в желчных полюсах, появляются аутофагосомы. Длительность ишемии приводит к потере КФ на больших площадях за исключением пери

Рис.1. "Метаболические профили" паренхимы печени - исходные и после прекращения афферентного кровотока спустя 15; 30 и 60 минут.

Обозначения: по оси абсцисс - ферменты, по оси ординат - величина активности ..

портальной и центральной зон долек, где определяется также редуцированная активность ЭКК.

Восстановление портального кровотока после 30-минутной ишемии печени приводит к прогрессированию и отягощению ранее сложившихся изменений паренхимы. При биохимическом исследовании возрастает активность Асат, Алат, ГГТП и ЛАП, что отражает отягощение процессов цитолиза и холестаза ( см. Рис. 2А.). Показатель ОАА снижается уже на 5-й минуте реперфузии, быстро

КГ1 ю2

7.5

60 мин. „с*.

А

5 мин.

60 мин.

» АлАТ —О— ГТП —X —АсАТ —л—ЛАП —А— ЩФ

- Лактэт

-Глюкоээ

-Пируват

10"1 10'

7.5

Б

60 мин.

-ЛАП

-АЛАТ

-ГТП

-АсАТ

-ЩФ

-ЛактаТ

-Глюкоза

-Пируаат

Рис.2 Биохимические показатели функции печени после 30-минутной ишемии при реперфузии неоксигенированной (А) и окси-генированной портальной кровью (Б). Обозначения: по оси абсцисс - время в значениях Ьп, по оси ординат - значения тестов .

нарастает содержание первичных продуктов ПОЛ. Восстановление портального кровотока приводит к отягощению расстройств микроциркуляции, расширению территорий дистрофических и некро-

биотических изменений паренхимы, дальнейшей дезинтеграции соединительнотканного каркаса паренхимы печени, происходит дальнейшая потеря фосфолипидов структур плазмолеммы и ядра. Базофилия цитоплазмы сохраняется только в гепатоцитах по периферии центральных вен, прогрессирует углеводная дистрофия гепатоцитов. Реперфузия существенно отягощает ишемические изменения активности дегидрогеназ - наиболее значительно маркерных ферментов процессов гликолиза, пентозо-фосфатного пути превращения глюкозы и биосинтеза СоА. В этих условиях продол-жа-ется снижение числа структур с активностью ЩФ, снижается КФ за счет потери лизосом. Активность ЭКК определяется лишь в гепатоцитах перипортальной и центральной зоны. Все животные этой серии погибли в ближайшем послеоперационном периоде.

Перфузия печени оксигенированным физиологическим ратво-ром на фоне 30-минутной ишемии способствует прогрессированию процессов цитолиэиса, на что указывают возрастающие значения Алат, Асат, ГГТП (См. Рис.2Б.). Уровень ЛАП в два раза превышал показатели в опытах без оксигенации . Вместе с тем не происходит столь значительного увеличения концентрации лакта-та, как это имело место в опытах без применения защитных мероприятий (См.Рис.2Б.). Значения ОАА в этих экспериментах высоки (75,83±6,32 ЕД) . Показатели ДК крови спустя час после восстановления кровотока соответствовали для гептановой фракции 3,6+1,1, изопропиловой - 22,182±5,140, что выше исходного уровня на 20-80%, повышены значения гептановой фракции ДК гомогената печени (9,87±3,61). Содержание МДА на протяжении часа реперфузии снижалось (8,б42±1,2). Уменьшение содержания вторичных продуктов ПОЛ происходит и в гомогенате печени (12189,8±1000,5). На фоне резко выраженных процессов дезинтеграции структуры печеночной паренхимы и потери метаболически важных, веществ при перфузии оксигенированным раствором получены результаты, указывающие на частичную коррекцию уровня ишемических изменений активности альдолазы, 3-ФГДГ и Г-6-ФДГ при сохранении физиологических соотношений уровня АДГ и АлДГ.

Не происходит коррекции изменений активности митохондриально связанных дегидрогеназ и МАО. Такие результаты позволяют считать , что корректировка изменений в ишемизированной печени после реперфузии оксигенированным раствором возможна, однако полученный эффект незначителен. Все животные этой серии также погибли через несколько часов после операции.

Оптимальный эффект, обеспечивший 80% выживаемость подопытных животных после 30-минутной ишемии, получен при перфузии печени озонированным раствором., Инфузии озона в портальную вену начинали с 16 минуты от начала сдавления ПДС и продолжали в течение 30 минут.

Использование озона способствует быстрой нормализации . величин маркеров цитолизиса паренхимы печени уже к исходу первого часа после восстановления кровотока (См. Рис.3). Зна-

10

7,5--

5 -

-ГТП

-АлАТ

-ЛАП

-АсАТ

-ЩФ

-Лактат

-Глюкоза

-ЛДГ

-Пируват

Рис.3. Биохимические показатели функции печени после 30-минутной ишемии на фоне внутрипортального введения озонированного физиологического раствора. Обозначения: по оси абсцисс - время в значениях Ьп, по оси ординат - значения тестов.

чение ЛАП составило 452,3±98,9 нмоль/с.л., не изменился уровень ЩФ сыворотки крови. На фоне незначительной гилергликемии снижено содержание пирувата (0,048910,0077 мкмоль/л), несколько повышено содержание лактата (3,858±0,655 мкмоль/л ). Увеличение ЛДГ происходит только на 5-й минуте реперфузии, через час его значение составило- 1,093+0,223 нмоль/с.л. (См. Рис.3.).

Не происходит каких-либо существенных изменений показателей пигментного обмена печени. В экспериментах с озоном получены результаты однозначно указывающие на снижение, в первую очередь, показателей ПОЛ сыворотки крови. Уменьшается содержание гептановой и изопропиловой фракций ДК в сыворотке крови и гомогенате печени. Уровень МДА существенно не изменя

Га блица 2.

Показатели ПОЛ и ОАА после 30-минутной ишемии печени на фоне внутрипортального введения озонированного раствора

Показат ' ели Первичные продукты ПОЛ Диеновые кошюгаты Малоновый ди-альдегид ОАА

гспгаяовая фракция изопропял. Фрлкаяя

0 минут

хронь 4, 63± 0,39 27,71+ 3,62 5, 82±1,23 52,32±6,08

n&vcttu 8,08+ 1,27 26, 76± 2,96 1324,8± 1865,5 40,2±8,4

5 микуг

кровь 4,23+ 0,9 35,23± 3,53 8,08±1,89 76,64± 3,96

nevejji 8,62+ 1,27 27,39± 3,29 10709,7± 1639,1 35,04±8,54

60 минут

грош* 3,69+ 0,8* 26,89+ 2,39 6,25±1,45 68г68± 4,34

nevejtt 6,36+ 1,01« 24,76+ 3,73* 957 8,3±1408,9** 32,56± 7,54

Примечание: 1} Все данные представленные в таблице статистически

достоверны.

2) * - данные статистически недостоверны р>0,1 ** - данные достоверны с р<0,1.

ется. ОАА крови возрастает на 4 6% к 5 минуте реперфузии и остается на достаточно высоком уровне до часового интерзала наблюдения (См. Табл.2).

Получены результаты, указывающие на снижение величины территорий дистрофических -и некробиотических изменений функциональной паренхимы печени, а также выраженное торможение процессов дезинтеграции ретикулинового каркаса печени. Особенностью паренхимы печени после реперфузии на фоне внутри-портального введения озонированного раствора является обилие двуядерных гепатоцитов с умеренно ацидофильной гомогенной цитоплазмой и круглым ядром, содержащим равномерно распределенный хроматин. Одновременно в таких зонах определяуказываю-щая на высокое содержание рРНК, отмечается восстановление топохимии мембранных фосфолипидов (содержание которых составляет 0, 4088+0, 03, что выше чем в опытах без перфузии и с внутрипортальным введением оксигенированного раствора). Нормализуется содержание (0,19б5±0,Об) и внутридольковая топохи-мия гликогена. После реперфузии ишемизированной печени на фоне внутрипортального введения озонированного раствора определяются признаки коррекции ишемического повреяздения дегидро-геназных систем, в первую очередь связанных с мембранами митохондрий. Уменьшена величина территорий падения активности. Заметно снижается активность ЛДГ, стимуляция которой обычно связана с глубокой ишемией органа. Устанавливаются иные, по сравнению с исходными, соотношения активности альдолазы - 3-ФГДГ, ЛДГ и Г-б-ФДГ, что связано с изменением относительных значений активности дегидрогеназ, остается сниженной активность р-ОБДГ. Соотношения активности маркеров обмена этанола остаются физиологическими. В опытах с озоном получены показатели ЩФ, близкие к физиологическим, сохраняются большие территории паренхимы с КФ в билиарных полюсах печеночных долек при относительно низком уровне лизосомальной активности..'

Спустя 4 0 суток у подопытных животных, перенесших получасовую ишемию и портальную перфузию озонированным раствором, определяются близкие к физиологическим показатели функции

печени и антиоксидантной активности крови. Отмечаются следы микроциркуляторных расстройств и ограниченные дистрофические мелкоочаговые изменения паренхимы. Характерно большое содержание двуядерных гепатоцитов, высокий уровень базофилии цитоплазмы и ядрышек, физиологическая топохимия мембранных фосфо-липидов и внутриклеточного гликогена. Соотношения величин митохондриально связанных дегидрогеназ устанавливаются близкими к физиологической норме, активность ЛДГ и ее относительный уровень с величиной альдолазы, 3-ФГДГ и Г-6-ФДГ также аналогичны норме. Нормализуются соотношения уровня р-ОБДГ с ферментами обмена этанола (См. Рис.4).

т

Рис. 4."Метаболический профиль" паренхимы печени через 40 суток после перфузии озонированным раствором на фоне 30-минутной ишемии.

Обозначения: по оси абсцисс - ферменты, по оси ординат -величины активности.

Полученные в работе положительные, коррегирующие ишеми-ческое повреждение печени эффекты,- можно объяснить нормализацией белково-липидного компонента плазмолеммы, ядерной оболочки и внутриклеточных мембран, нормализацией микроциркуля-торного режима в процессе реперфузии, а также сохранением соединительнотканного каркаса печени. Вследствие этого проис-

ходит торможение дистрофических изменений, стимулируются регенераторные процессы, нормализуется активность дегидрогеназ-ных систем на внутриклеточном уровне. В определенной степени играет роль прямое окислительное действие озона на токсины портальной крови, а также ликвидация кислородного дефицита во время- перфузии.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальная модель пережатия печеночно-двенад-цатиперстной связки на различные сроки является оптимальной моделью для изучения процессов ишемического повреждения печени и развивающихся в период реперфузии нарушений.

2. Степень нарушения гистоэнзимологических, гистохимических, морфологических показателей, характеризующих функциональное состояние и структурную целостность печени, находящейся в условиях ишемии , коррелирует со сроками ишемии и проявляется в угнетении аэробных и стимуляции анаэробных процессов, активации лизосомальных реакций, усилению процессов перекисного окисления липидов. Эти изменения носят необратимый характер и приводят к острой печеночной недостаточности при восстановлении кровотока по афферентным сосудам печени.

3. Развивающиеся а период реперфузии биохимические сдвиги коррелируют со сроками перенесенной ишемии и проявляются при длительности сосудистой изоляции печени более 15 минут в резком повышении в крови активности ферментов-маркеров цитолитического синдрома, снижению уровня протромби-нового индекса и неспецифической холинэстеразы как показателей белковообразовательной функции печени. Отмечается значительное нарастание пула средних молекул в портальной крови и системной циркуляции. Происходит накопление недоокисленных продуктов обмена - молочной и пировиноградной кислот на фоне дальнейшей активации анаэробных ферметов. Наблюдается угнетение активности системы антиоксидантной защиты при нарастании первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов в крови и печеночном гомогенате. Восстановление кровотока после 30-60 минутной ишемии приводит к прогрессирующе-

му ухудшению показателей печеночных функций и в итоге к 100 % летальности оперированных животных.

4. Увеличение сроков сосудистой изоляции сверх 15 минутного интервала необходимо сопровождать комплексом защитных мероприятий. Внутрипортальное введение оксигенированного раствора не предотвращает развитие печеночной недостаточности и не повышает выживаемости экспериментальных животных.

5. Внутрипортальное введение физиологического раствор,^. с содержанием озона 250 - 400 мкг и концентрации до 1000 мкг/л раствора и скорости инфузии 10 - 15 мл/мин безопасно при воздействии на ишемизированную печень. При таком режиме отмечается активизация системы антиоксидантной защиты и не происходит резкого усиления процессов ПОЛ. Применение нормотермической перфузии печени озонированным физиологическим раствором снижает степень гипоксического повреждения, способствует быстрому восстановлению специфических функций печени в период реперфузии.

6. Применение озонированного физиологического раствора на фоне 30-минутной ишемии не приводит к развитию в отдаленном периоде дистрофических и фиброзно-склеротических изменений в печеночной ткани и выраженным изменениям показателей гомеостаза.

7. Способ профилактики гипоксического повреждения, основанный на использовании нормотермической перфузии печени озонированным физиологическим раствором, оказывает положительный эффект (приоритетная справка на изобретение № 96100226/14 (000593) от 4.01.96) и может быть рекомендован к применению в клинических условиях при операциях, сопровождающихся временной сосудистой изоляцией печени.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Изобретения: '

1. Способ защиты печени от гипоксического повреждения (в соавт.с В.И.Булыниным, А.А.Глуховым). Приоритетная справка № 96100226/14 (000593) от 4.01.96 г.

2. Устройство для озонирования медицинских растворов (в соавт. с В.И.Булыниным, Г.И.Мещеряковым) . Приоритетная справка № 97012465/14 (002793) от 15.01.96 г.

Рационализаторские предложения:

1. Способ получения растворов заранее заданной концентрации.- Удостоверение на рацпредложение № 2094 от 7.12.95 г., выдано Воронежской Гос.мед. академией./ Соавт. Г.И.Мещеряков, А.А.Глухов.

2. Способ защиты печени от гипоксического повреждения.-Удостоверение на рац.предложение В 2095 от 7.12.95 г., выдано Воронежской Гос.мед. академией./ Соавт. В.И.Булынин, A.A.Глухов.

3. Способ пережатия печеночно-двенадцатиперстной связки в условиях транспортальной гепатоперфузии и устройство для его осуществления.- Удостоверение на рац.предложение 2121 от 5.01.96 г., выдано Воронежской Гос.мед. академией./ Соавт. А.А.Глухов.

4. Портативная установка для' получения озонированных растворов.- Удостоверение на рац.предложение № 2122 от 7.12.95 г., выдано Воронежской Гос.мед. академией./ Соавт. Г.И.Мещеряков, А.А.Глухов.

Печатные работы:

1. Защита печени озоном от гипоксического повреждения.// Озон в биологии и медицине: Тезисы докл. I Всерос. научн.-практ. конф.- Нижний Новгород, 1992.- с.23-24/ в соавт. с Ю.А.Пархисенко, К.В.Боевым, Н.А.Лебедянцевым/.

2. Некоторые показатели ПОЛ и АОС при нормотермической перфузии печени озонированным раствором в эксперименте.// Актуальные вопросы современной медицины: сборник науч.работ.-Воронеж, 1993.- с.17.

3. К проблеме гипоксического повреждения печени в хирургической гепатологии.// Актуальные вопросы современной медицины: сборник науч.работ.- Воронеж, 1993.- с.23/ в соавт. с А. В.Фоновым/.