Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль свободнорадикального окисления и индукции белков семейства HSP в защитном эффекте адаптации к гипоксии и гипероксии при физических нагрузках

На правах рукописи

АНЧИШКИНА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЫЮГО ОКИСЛЕНИЯ И ИНДУКЦИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА ШР В ЗАЩИТНОМ ЭФФЕКТЕ АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ И ГИПЕРОКСИИ

ПРИ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗКАХ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003476797

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии кровообращения УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН и лаборатории адаптационной медицины Факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук Л. М. Белкина

доктор биологических наук Т.Г. Сазонтова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Б. Кошелев доктор биологических наук, профессор В.З. Ланкин

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова

заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва, улица Балтийская, дом 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Л.Н.Скуратовская

Автореферат разослан

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Участие типовых патологических процессов -стресса и гипоксии - в патогенезе различных заболеваний ставит перед современной медициной проблему повышения резистентности организма к таким повреждающим факторам. В основе действия этих факторов, реализующихся, в том числе, при истощающих острых физических нагрузках (ОФН) лежит активация свободнорадикальных процессов, поэтому актуальной проблемой является коррекция состояний организма, связанных с чрезмерным увеличением уровня активных форм кислорода (АФК). В качестве такой защиты нередко используют экзогенные антиоксиданты, однако их применение не всегда эффективно, поскольку вызывает подавление собственной, эндогенной антиоксидантной системы организма [Сазонтова Т.Г. и др., 1987; Mosconi С. et al„ 1988; Buckman T.D. et al. 1993; Barja G. et al„ 1994; Jaeschke H., 1995]. Поэтому перспективными являются методы, позволяющие ограничивать чрезмерную активацию свободнорадикальных процессов за счет индукции синтеза собственных защитных, в частности, антиоксидантных систем, путем периодического, ограниченного по интенсивности АФК-сигнала. К таким методам относятся адаптационные тренировки с помощью периодического изменения уровня кислорода при нормобарической или гипобарической гипоксии.

К настоящему времени показано, что помимо известной роли избыточного уровня АФК в развитии патологических состояний [Меньшикова Е.Б. и др., 2008] образование АФК и инициация свободнорадикальных процессов является естестественным, физиологическим процессом, постоянно протекающим в организме. При этом главными физиологическими функциями АФК являются: окисление поврежденных молекул с целью их дальнейшей утилизации [Ungemach F.R., 1985; Сазонтова Т.Г., 1989; Zolotarjova N. et al., 1994], синтез молекул мессенджерного типа, например, эйкозаноидов при свободнорадикальном окислении ПНЖК фосфолипидов [Hemler М.Е. et al., 1979; Roberts A.M. et al., 1981] и сигнальная роль АФК.

В последние годы активно изучается роль редокс-сигнализации и АФК-зависимой внутриклеточной системы передачи внешнего сигнала к клеточному ядру с последующей инициацией синтеза белков [Semenza G.L., 1999; Chandel N.S., et al., 2ООО]. Показано, что при физиологических условиях АФК участвуют в ключевых регуляторных механизмах клетки [Nanji A.A. et al., 1995; Lee P.J. et al., 1996; Suzuki Y.J. et al, 1997]. Благодаря АФК, инициирующих редокс-сигнализацию, в отсутствие специфических рецепторов развивается клеточный ответ на действие гипоксии, окислителей и восстановителей. Помимо этого, медиаторы, действие которых опосредовано специфическими рецепторами - гормональными, цитокиновыми, также активируют неспецифическую редокс-сигнализацию и участвуют в перекрестной активации и взаимодействии рецепторов, что является основой перекрестных эффектов адаптации, при которых тренировка к одному повреждающему фактору повышает резистентность организма к действию другого фактора.

Важнейшим следствием инициации редокс-сигнализации является активация факторов транскрипции: NF-kB [Flohe L. et al., 1997], AP-1 [Maulik N. et al., 1999], HIF-la, HIF-3a [Wiener C.M. et al., 1996; Semenza G.L., 1999; Сазонтова Т.Г. и др., 2007], индуцирующих защитные белки и способствующих адаптации и выживаемости организма. Так, к настоящему времени известно более 60 генов, активируемых HIF-la. Основными белками ответа на АФК-сигнал при стрессе, гипоксии, ишемии являются ферменты антиоксидантной защиты, белки семейства HSP, Fe-регулируюшие белки, ферменты репарации, пероксиредоксины [Graven K.K. et al., 1993; Maulik N. et al., 1999; Peng J. et al., 2000; Ryter S.W. et al., 2000; Zhukova A.G. et al., 2004]. В результате

редокс-сигнализация приводит к насыщению клетки молекулами, повышающими ее защиту от повреждающих воздействий, причем эндогенная, т.е. сформировавшаяся в самой клетке защита [Ни M.L., et al., 1989; Mosconi С., et al., 1988] эффективней внешней, с помощью экзогенных добавок. Причина этого лежит в кратности действия редокс-сигнализации, при которой АФК-индукция факторов транскрипции и протекторных белков, в том числе антиоксидантов, сменяется их ингибированием высоким уровнем тех же антиоксидантов, и синтез защитных белков прекращается. Для повторной индукции защитных систем необходим новый АФК-сигнал, поэтому с помощью поступления периодических АФК-сигналов и следующей за ними индукции протекторных систем реализуется основной принцип периодической адаптации. Так, повторяющаяся, ограниченная генерация АФК с последующим синтезом протекторных систем является механизмом повышения резистентности организма при адаптации к стрессу [Сазонтова Т.Г. и др., 1987], физическим нагрузкам [Сазонтова Т.Г., 1989; Powers S.K. et al., 1994], холоду [Spasic М.В. et al., 1993], гипоксии [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], пищевым адаптогенам [Sanz M.J. et al., 1994; Cai Y.N. et al., 1995], диете с ПНЖК n-3 класса [Hu M.L. et al., 1989; Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. 1995], на основе чего сформулирована концепция участия АФК в создании неспецифической компоненты повышения устойчивости организма [Sazontova T.G. et al., 2007] при периодически действующем факторе внешней среды.

Показано, что длительное применение адаптации к интервальной нормобарической гипоксии повышает резистентность мембран сердца, печени и коры головного мозга к действию АФК, однако формирование защитного эффекта за более короткое время требует углубления гипоксии, увеличения АФК-сигнала, что ведет к чрезмерному синтезу защитных белков и, тем не менее, отсутствию ограничения интенсивности АФК-процессов [Sazontova T.G. et al., 1994].

Для увеличения эффективности адаптации и усиления АФК-сигнала без побочных эффектов, периоды нормоксии при адаптации к гипоксии заменили периодами умеренной гипероксии, что усилило АФК-сигнал без углубления гипоксии. Новый вид адаптации к гипоксии и умеренной гипероксии (патент № 2289432 от 20.12.2006 г.), отличается более ранним, чем при гипоксии-нормоксии, повышением резистентности мембранных структур [Сазонтова Т.Г., 2004] и более быстрым достижением защитного эффекта у больных ИБС [Маев Э.З., и др., 2004], что важно для практики применения этого метода в терапии и профилактике.

Несмотря на то, что за последние 5 лет показана потенциальная способность нового метода адаптации в защите мембранных структур от АФК-индуцированных повреждений in vitro [Жукова А.Г., 2007], ничего не известно о возможности реализации подобного защитного эффекта адаптации к гипоксии-гипероксии на уровне организма. Отсутствуют исследования защитных эффектов нового вида адаптации при повреждениях, вызванных ограничением подвижности или, напротив, истощающей, острой физической нагрузкой (ОФН), хотя оба эти фактора реализуют свое действие посредством активации АФК-процессов, защита от которых показана in vitro при адаптации к гипоксии-гипероксии. Восполнить этот пробел было задачей настоящего исследования.

Кроме того, поскольку адаптация к комбинированному действию факторов внешней среды: физическим нагрузкам, холоду, и/или гипоксии зачастую обладает большей эффективностью, чем адаптация к каждому из них по отдельности, а истощающая ОФН, подобно соревновательной, обладает гипоксической и стрессорной компонентой, было основание полагать, что тренировка к физическим нагрузкам, в комбинации с адаптацией к гипоксии и/или гипероксии, может оказаться

более эффективной в отношении повышения физической выносливости организма. Однако, подобные исследования малочисленны, а в отношении адаптации к гипоксии-гипероксии вообще не проводились, поэтому вопрос об эффективности и перекрестных эффектах такой адаптации остается открытым. Поиск ответа на этот вопрос также явился предметом настоящего исследования.

Цель данного исследования состояла в комплексном изучении влияния адаптации к гипоксии и гипероксии на эффективность тренировок к физическим нагрузкам и роли свободнорадикальных процессов и индуцибельных и конститутивных белков семейства ГОР в повышении физической выносливости.

В рамках этой цели решали следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить интенсивность свободнорадикальных процессов и уровень индукции белков срочного ответа: ферментов антиоксидантной защиты, индуцибельных ГОР72 и НОх-1 и конститутивной - НОх-2 при гипокинезии разной длительности в сердце и печени.

2. Изучить возможность предупреждения с помощью предварительной адаптации к интервальной нормобарической гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии снижения устойчивости мембранных структур при гипокинезии.

3. Оценить влияние преварительного, однократного сеанса гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии на уровень компонентов редокс сигнализации -фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией - Н1Р-1а и белков семейства ГОР при острой физической нагрузке.

4. Выявить возможность ограничения с помощью адаптации к изменению уровня кислорода активации свободнорадикальных процессов и индукции синтеза стресс-белков - ГОР72, НОх-1 и железо-регулирующего белка ЖР при истощающей острой физической нагрузке.

5. Оценить влияние адаптации к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии на физическую выносливость, а также комбинации адаптации к изменению уровня кислорода с тренировками к физическим нагрузкам на эффективность таких тренировок.

6. Сравнить действие адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии при использовании их отдельно или совместно с тренировкой к физическим нагрузкам на уровень свободнорадикального окисления и синтез индуцибельных - ГОР72, НОх-1 и конститутивных белков - ГОС73, НОх-2, ЗЕЛСА 2.

Научная новизна определяется основными результатами работы.

Впервые изучено действие гипокинезии различной длительности на резистентность мембранных структур к действию АФК. Через 3 ч в сердце и печени резистентность снижена на фоне роста в сердце уровня защитных белков -антиоксидантных ферментов и конститутивной НОх-2 и, напротив, снижения в печени уровня СОД, конститутивной, и индуцибельной гемоксигеназы. Увеличение длительности гипокинезии до 72 ч приводит в сердце к массированному синтезу защитных белков, что стабилизирует резистентность мембран к действию АФК; в то же время, в печени интенсивность АФК-процессов нарастает при ингибировании протекторных белков.

Впервые показано, что предварительная адаптация к изменению уровня кислорода ограничивает повышенную активацию свободнорадикального окисления -при гипоксии-гипероксии на 81%, при гипоксии-нормоксии на 32% - и синтез индуцибельных стресс-белков семейства ГОР, вызванных гипокинезией в сердце, скелетной мышце и печени. При этом установлено, что адаптация к периодической

гипоксии-гипероксии обладает более выраженным, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, протекторным действием.

При сопоставлении изменения уровня компонентов редокс сигнализации -фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией ЮТ-1а и стресс-белков: НБР72 и НОх-1 - выявлена сходная динамика их индукции при истощающей ОФН до и после однократного сеанса гипоксии-нормоксии или гипоксии-гипероксии. Индукция ЮТ-1а в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени. Впервые обнаружено, что прекондиционирование с помощью однократного сеанса гипоксии-гипероксии, но не гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма в 1,4 раза и снижает синтез стресс-белков при истощающем ОФН.

Впервые выявлена возможность повышения выносливости при ОФН с помощью нового вида адаптации к периодической гипоксии-гипероксии. Установлено, что предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии обладает большей эффективностью, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, в повышении длительности и интенсивности плавания при истощающей ОФН.

Впервые проведено сравнение действия адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии при истощающей ОФН. Оба вида адаптации ограничивают свободнорадикальные процессы, восстанавливают до контроля сниженную при ОФН активность ферментов антиоксидантной защиты и предупреждают повышенную индукцию синтеза НБР72 в печени и в сердце. Адаптация к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии, также снижает в сердце и печени повышенный уровень НОх-1 и восстанавливает уровень 1ЯР.

Впервые проведена сравнительная оценка влияния двух видов адаптации к изменению уровня кислорода при использовании их отдельно или в комбинации с тренировками к физическим нагрузкам на длительность и интенсивность истощающего плавания. Совмещение тренировки к физическим нагрузкам с адаптацией к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии увеличивает длительность плавания в 2-3 раза. Комбинация физической тренировки с адаптацией к гипоксии-нормоксии не влияет на интенсивность плавания, а с адаптацией к гипоксии-гипероксии - повышает до 90% долю активного плавания от общего времени удержания на воде.

Впервые показано, что комбинация двух видов тренировок: к физическим нагрузкам и к изменению уровня кислорода, особенно эффективно в режиме гипоксии-гипероксии, ограничивает активацию свободнорадикальных процессов при ОФН при более экономном синтезе АФК-зависимых белков, что проявляется в снижении в сердце и печени повышенной при физической тренировке активности ферментов антиоксидантной защиты, НОх-1 и железорегулирующего белка ШР. Впервые при тренировке к физическим нагрузкам в сердце показано увеличение уровня конститутивных ШС73 и НОх-2 - в 1,8 раза и индуцибельной НОх-1, что в целом свидетельствует о наличии гипоксической компоненты такой тренировки. Совмещение физической тренировки с адаптацией к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии уменьшает гипоксическую компоненту.

Впервые выявлено антистрессорное и стимулирующее физическую активность действие нового вида адаптации к гипоксии-гипероксии. Комбинация такой адаптации с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективна, чем отдельные виды адаптации. Это явление выражается в наибольшем повышении выносливости организма, что связано с увеличением резистентности мембранных структур к свободнорадикальным процессам и нормализацией уровня АФК-индуцибельных и

конститутивных белков НБС73, НОх-2, 1ИР и БЕЯСА-г, ответственного за Са-гомеостаз сердца.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней благодаря проведенному комплексному исследованию впервые показано защитное действие адаптации к гипоксии-гипероксии от стрессорных и гипоксических нарушений, индуцированных гипокинезией и острой истощающей физической нагрузкой и изучена роль свободнорадикальных процессов и адаптационного синтеза индуцибельных и конститутивных белков в повышении физической выносливости организма.

Практическое значение работы определяется тем, что в ней на основе сравнительного изучения эффективности и цены адаптации к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии экспериментально обоснована возможность расширения спектра применения адаптации к периодическому изменению уровня кислорода, т.е. использования ее в тех случаях, при которых данная адаптация ранее не применялась или была малоэффективна - при защите от активации свободнорадикальных процессов в сердце и повышении физической выносливости и устойчивости к стрессогенным, соревновательным нагрузкам.

Положения, выносимые на защиту.

1. Кратковременная и длительная гипокинезия повышает интенсивность свободнорадикальных процессов с одновременным увеличением уровня защитных белков в сердце и снижением их в печени. Предварительная адаптация к периодической гипоксии-гипероксии в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии ограничивает вызванную гипокинезией активацию свободнорадикальных процессов и увеличение уровня индуцибельных стресс-белков НБР72 и НБР32 в сердце, скелетной мышце и печени.

2. Однократный сеанс гипоксии-гипероксии, но не гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма при истощающем плавании и предотвращает вызванное острой физической нагрузкой увеличение уровня стресс-белков семейства НБР. Изменение уровня стресс-белков - индуцибельных форм Н5Р72 и НОх-1 и фактора транскрипции Н1Р-1а имеет сходную динамику, причем индукция НИМ а в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени.

3. Предварительная адаптация к периодической гипоксии-гипероксии, в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии повышает физическую выносливость при истощающей физической нагрузке. Оба вида адаптации ограничивают повышенную интенсивность свободнорадикальных процессов, свойственную такой нагрузке, восстанавливают сниженный уровень активности ферментов антиоксидантной защиты и предупреждают чрезмерную индукцию стресс-белка НБР72, а в случае адаптации к гипоксии-гипероксии, также нормализуется уровень НОх-1 и железорегулирующего белка 1ЯР.

4. Сочетание адаптации к гипоксии-гипероксии с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективно, чем отдельные виды адаптации. Это выражается в повышении эффективности тренировок, увеличении резистентности мембран к свободнорадикальным процессам при более экономном функционировании - нормализации в сердце и печени повышенного Бри физической тренировке уровня антиоксидантных ферментов, НОх-1 и 1РР, а при адаптации к гипоксии-гипероксии, и синтеза конститутивных белков ШС73, НОх-2 и 8Е11СА-2, ответственного за Са-гомеостаз сердца.

Апробация работы: Апробация работы проведена на заседании межлабораторной конференции ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

14.04.2009г. (г. Москва). Основные положения работы были доложены и обсуждены на VIII Международном научном конгрессе по адаптационной медицине (Москва,

2006); V Международном конгрессе по патофизиологии (Beijing, China, 2006); на XIII конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006); VI Международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Milan, Italy, 2006); V Международном симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2007); XX Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва,

2007); Всероссийской научной конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы состоит из 233 источника. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками, 4 таблицами и 7 схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведена на 173 крысах-самцах линии Вистар массой 200-250 г. Содержание животных и постановка экспериментов проводились в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals».

Использовали следующие экспериментальные модели - повреждающие и адаптационные воздействия. В качестве острых воздействий применяли:

1) гипокинезию различной длительности - при антиортостатическом вывешивании по Morey-Holton ограничивали подвижность в течение 3 и 72 ч;

2) острую истощающую физическую нагрузку с грузом в 5% от веса тела (ОФН) - плавание до отказа при 20°С.

Предварительно, до проведения острых воздействий применяли различные модели адаптационных воздействий:

1) адаптацию к изменению уровня кислорода в 2-х режимах:

А) нормобарическая гипоксия - нормоксия: 10% 02 5 мин - 21% 02 3 мин, по 1 ч, 15 дней - Г/Н и Б) нормобарическая гипоксия - гипероксия: 10% 02 5 мин -30% 02 3 мин, 1 ч, 15 дней - Г/Г;

2) тренировку к физическим нагрузкам плаванием -:30 минутные сеансы, 8 дней, Лоды 22-23°С, 8Пл;

3) совмещение адаптации к изменению уровня кислорода с тренировкой к физической нагрузке, которую начинали на 8 день адаптации к гипоксии и/или гипероксии, Г/Н+8Пл, Г/Г+8Пл.

До гипокинезии проводили 1}; до ОФН - Ю, 2) и 3).

Изолированные сердца и скелетные мышцы бедра измельчали гомогенизатором Ultra-Turrax TP-18/10 ножом 25N-10 при 8000 об/мин в течение 20 сек (2 раза по 10) с интервалом 15 сек в среде, содержащей 20 мМ TRIS-HC1 и 100 мМ NaCl при соотношении ткань : среда, равном 1:8 для сердца или 1:10 для скелетных мышц. Ткань печени измельчали гомогенизатором тефлон-стекло при 800 об/мин в течение 1 мин в стандартной среде гомогенизирования при соотношении ткань: среда -1:12.

Для оценки устойчивости тканей к свободнорадикальному окислению изучали скорость накопления продуктов свободнорадикального окисления при его

индукции в системах окисления с аскорбатом (0,2-0,75 мМ) или совместно - с аскорбатом и FeS04 10Н20 (0,5-3 мкМ) в сердце и печени при 37°С и концентрации белка не выше 2,5 мг/мл. Уровень свободнорадикальных продуктов оценивали по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой по классическому методу [Ohkawa Н. et al., 1979] в модификации [Kikugawa К. et al., 1992] по протоколу, принятому в лаб. адаптациолнной медицины ФФМ МГУ им. М.В.Ломоносова.

Определяли активность основных ферментов антиоксидантной защиты, выражали ее в пересчете на мг белка. Активность каталазы определяли по потреблению Н202, регистрируемому при 240 нм [Luck Н., 1963], активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу Fridovich I. [1971] по степени ингибирования образования супероксидного анион-радикала в системе ксантин (0,1 мМ) - ксантиноксидаза (0,004 ед.). Концентрацию белка измеряли, используя подход [Padros Е. et al. 1984], по амплитуде 4-ой производной спектра поглощения в области 240-320 нм на спектрофотометре Hitachi-557 и Cintra lOe (GBC).

Определяли уровень компонентов редокс сигнальной цепи: фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией - HIF-la, индуцибельных форм белков семейства HSP - HSP72, НОх-1, а также определяли уровень конститутивных белков - HSC73, НОх-2, железорегулирующего белка IRP и SERCA-2 - Са-транспортирующей системы саркоплазматического ретикулума сердца. Для каждого из 7 определяемых белков были разработаны и применены собственные модификации стандартного метода Western-блот анализа в цитоплазматической фракции сердца, печени и скелетной мышцы. Белки разделяли в 8-10% полиакриламидном геле с помощью оборудования BioRad и переносили на PVDF мембрану с помощью электроэлюции. Использовали первые моноклональные антитела к белкам (Stressgen, Канада; Santa Cruz, США) (1:1000) и вторые антитела, конъюгированные с пероксидазной меткой (Jackson Immuno Research) (1:2000). Экспонирование белков осуществляли на пленку Kodak film с использованием реагентов для хемилюминесценции. Содержание белков оценивали по плотности окрашивания полосы связывания антител с белком. Количественная обработка полученных иммуноблотов проводилась путем сканирования и обработки с помощью компьютерной программы Adobe Photoshop 6.0. Результаты выражали в ОДЕ -относительных денситометрических единицах.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0 согласно рекомендациям по проведению биомедицинской статистики [Гланц С., 1999; Платонов А.Е., 2000]. Сравнение независимых выборок проводили по непараметрическому U Test Mann-Whitney, зависимых выборок - по Wilcoxon Matched Pairs Test. Различия между выборками считались достоверными при Р<0,05 или, в ряде случаев, Р<0,01. Результаты исследований в таблицах представлены в виде тройки цифр - нижний квартиль (25% персентиль) - медиана - верхний квартиль (75% персентиль), дающих представление о центральной тенденции, ширине и асимметрии распределения результатов. Результаты экспериментов на рисунках представлены в виде медианы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Защитный эффект адаптации к изменению уровня кислорода при гипокинезии: свободнорадикальное окисление и синтез белков семейства НвР.

1.1. Тканеспецифичность действия гипокинезии на интенсивность свободнорадикальных процессов и синтез белков семейства НБР.

Сердце. При изучении особенностей эффекта гипокинезии на ткани сердца и печени, оказалось, что через 3 ч воздействия скорость накопления продуктов свободнорадикального окисления в сердце значительно увеличена - в 1,2-2,2 раза, в зависимости от времени инкубации, что свидетельствует о повышении чувствительности ткани сердца к действию АФК (Рис.1а).

е ния, мин

Время окислеия, мин.

Рис.1. Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro в сердце (а) и в печени (б) при 3 ч гипокинезии (сплошная линия) относительно контроля (пунктирная). Примечание: достоверность отличий (Р<0,05) от контроля (Mann-Whitney U Test)

Для проверки этого эффекта был изучен уровень защитных белков срочного ответа: ферментов антиоксидантной защиты и белков семейства HSP. Через 3 ч гипокинезии в сердце достоверно увеличена активность каталазы на 27%, и конститутивной формы НОх-2 в 1,6 раз (Рис. 2а).

Сердце

120 100

СОД каталаза НОх-1 Нох-2 □ контроль ОЗч.гипокинезии

Печень

СОД каталаза НОх-1 НОх-2 □ контроль ПЗч.гипокинезии

Рис. 2 Уровень СОД, каталазы, индуцибельной формы гемоксигеназы НОх-1 и конститутивной-НОх-2 в сердце (а) и печени (б) крыс в контроле (светлые столбики), и после 3 ч гипокииезии (серые). Примечание: ОДЕ-относительные денситометрические единицы.

Печень. Ответ печени на гипокинезию полностью противоположен таковому в сердце. Активация свободнорадикальных процессов (Рис. 16) сопровождается снижением защитных компонентов (Рис.2б). Действительно, уровень конститутивной и индуцибельной гемоксигеназы не только не повышается, как в сердце, но существенно падает - на 29 и 33%, соответственно. Активность ферментов антиоксидантной защиты менялась аналогичным образом - уровень каталазы в печени, в отличие от сердца не увеличивается, СОД значительно снижается - на 27%.

При увеличении длительность гипокинезии с 3 ч до 72 ч различие между уровнем про- и антиоксидантов сердца и печени еще более выражено. В сердце (Рис.За) через 72 ч гипокинезии, по сравнению с Зч, отсутствует дополнительная активация свободнорадикального окисления, возможно благодаря формированию защиты от АФК-процессов, а именно 36-87% повышению уровня защитных систем: СОД, каталазы, индуцибельной и конститутивной формы гемоксигеназы.

Рис.3. Динамика накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro в cepdife (а) и в печена (б) при 72 ч гипокинезии (сплошная линия) относительно 3 ч гипокинезии (пунктирная).

Примечание: *- достоверность отличии (Р<0,05) от контроля (Mann-Whitney U Test)

180 1S0 140 120 asrlOO

Сердце

СОД каталаза НОх-1 Нох-2 □ контроль П72ч.гипокинезии

Печень

СОД каталаза НОх-1 НОх-2 □ контроль 0 72 ч.гипокинезии

Рис. 4 Уровень СОД, каталазы, индуцибельной формы гемоксигеназы НОх-1 и конститутивнои - НОх-2 в сердце (а) и в печени (б) крыс Вистар контрольной группы (светлые столбики), и после 72 ч гипокинезии (серые). Примечание: ОДЕ -относительные денситометрические единицы.

В печени ситуация полностью противоположна. В ответ на 72 ч гипокинезии дополнительно - на 33% активируются свободнорадикальные процессы и уровень продуктов окисления превышает контрольный в 3 раза (Рис. 36). Одновременно ингибируются защитные компоненты (Рис. 46) - конститутивная и индуцибельная формы НОх: в 1,7 и 2,6 раза. Это может свидетельствовать о значительной активации свободнорадикальных процессов, при которой избыточный уровень АФК повреждает компоненты клетки, в том числе защитные белки. Аналогичные результаты показаны для ферментов антиоксидантной защиты - уровень каталазы в печени, в отличие от сердца не увеличивается, а СОД продолжает, по сравнению с 3 ч, снижаться (Рис. 46).

Таким образом, при длительной гипокинезии в сердце отсутствует дополнительная активация свободнорадикального окисления на фоне роста уровня защитных белков. В печени - повышается чувствительность мембран к свободнорадикальным процессам на фоне снижения уровня защитных белков.

1.2. Предупреждение снижения устойчивости мембранных структур при гипокинезии с помощью предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии.

Предварительная адаптация к гипоксии-нормоксии обладает защитным действием от факторов стрессорной природы, повышая резистентность к свободнорадикальным повреждениям различной природы, и применяется в целях лечения и профилактики многих патологических состояний, однако, защитный эффект достигается не ранее чем через 3-4 недели [Меерсон Ф.З., 1986; Пшенникова М.Г., 1994; БагопЮуа Т.О., 2003].

В работе использовали краткий курс, 15 дней, адаптации к изменению уровня кислорода в 2-х режимах - к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии с целью предупреждения снижения устойчивости мембранных структур при 3 ч гипокинезии. Оказалось, что при гипокинезии увеличена интенсивность свободнорадикального окисления в печени в 1,5-2,5 раза (индукция аскорбатом), в 2,5-3 раза (Ре+2-аскорбат) Рис.5 (а и б), что свидетельствует о выраженной стрессорной компоненте.

Рис. 5. Влияние предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (1) и к гипоксии-гипероксии (2) на динамику накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro в печени (а - индуктор -аскорбат и б - индуктор - Fe -аскорбат). Указаны группы - после 3 ч гипокинезии без адаптации (3) и контроль (4). Примечание:*-достоверность отличий (Р<0,05) от контроля (Mann-Whitney U Test)

Сопоставление антистрессорного влияния двух видов адаптации к изменению уровня кислорода показало, что добавление гипероксической компоненты значительно повышает выраженность протекторного эффекта. Так, предварительная адаптация к гипоксии-нормоксии приводит к снижению интенсивности свободнорадикальных процессов, по сравнению с 3 ч гипокинезии, при индукции окисления в системе с Ре+2-аскорбатом, но не с аскорбатом. При гипокинезии после адаптации к гипоксии-гипероксии, резистентность мембран печени повысилась в 1,5-2 раза в обеих системах окисления - Рис.5.

Защита от повышенной при гипокинезии интенсивности свободнорадикальных процессов с помощью предварительной адаптации к изменению уровня кислорода была также показана по уровню индуцибельных форм белков семейства HSP Рис. 6.

Адаптация в 2-х режимах снижает уровень стресс белка HSP72 в сердце и в скелетной мышце при гипокинезии, а также индуцибельной формы гемоксигеназы -НОх-1 в скелетной мышце и в случае гипоксии-гипероксии - НОх-1 в сердце, что в целом свидетельствует об уменьшении интенсивности АФК-процессов. ,

Таким образом, предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии, по сравнению с адаптацией к гипоксии-нормоксии более эффективно ограничивает увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов и синтез белков, индуцированных АФК при гипокинезии.

2. Защитные эффекты периодической гипоксии и гипероксии в режиме адаптации и прекондиционирования при острой физической нагрузке (ОФН).

2.1. Уровень компонентов редокс сигнализации: фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией - HIF-la и белков семейства HSP в сердце и печени при ОФН, взятой отдельно и после однократного сеанса гипоксии-гипероксии.

Защитные эффекты однократных и многократных сеансов изменения уровня кислорода реализуются за счет активации редокс-сигнализации с последующей индукцией факторов транскрипции и синтеза защитных белков. Поскольку ОФН обладает стрессорной и гипоксической компонентами, было проанализировано изменение уровня синтеза стресс-белков и фактора транскрипции, индуцированного гипоксией - HIF-la. Несмотря на название, которое отражает историю обнаружения данного фактора транскрипции, т.е. индукцию его при гипоксических состояниях, HIF-la активируется и при действии в модельных системах или на клеточных структурах различных АФК-зависимых факторов: окислителей, гипероксических условий -100% кислорода в воздушных смесях.

Таким образом, активация HIF-la характерна как для гипоксических, так и стрессорных, АФК-опосредованных воздействий.

Протекторные эффекты прекондиционирования, или однократных сеансов острого воздействия - с помощью гипоксии, ишемии за 24 ч до основного воздействия, хорошо известны [Maulic N. et al., 1995; Das D. et al., 1997]. В последние годы полагают, что они связаны с активацией редокс-сигнализации, индукцией факторов транскрипции и синтезом защитных белков [Maulic N., 1999; Vina J., 2006].

Однако ничего не известно об особенностях действия однократных сеансов прекондиционирования с помощью гипоксии-нормоксии или гипоксии-гипероксии на уровень HIF-la в различных органах. Поэтому в сердце и печени были изучены особенности индукции фактора транскрипции HIF-la и белков семейства HSP при истощающей ОФН с 5% грузом, взятой отдельно или через 24 ч после однократного сеанса гипоксии-гипероксии - Г/Г+ОФН или гипоксии-нормоксии - Г/Н+ОФН.

На оригинальной фотографии блотов (Рис.7) видно, что в сердце и в печени Н1Р-1а активируется и при истощающей ОФН, и при однократном сеансе гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии, значительно превышая контроль.

Н1Р-1 а (Сердце)

— м

И

И щ

а 1 0

@

°ДЕ Н1Р-1 а (Печень)

Рис. 7. Влияние прекондиционирования к изменению уровня кислорода на содержание Н1Р-1а в сердце (а) и печени (б) крыс Вистар при ОФН.

3 - К - контроль

2 - иФН - острая физическая нагрузка плаванием с 5% грузом Ь - I 11-ОФП - однократный, 1 ч сеанс гипоксии-нормоксии за 24ч до ОФН > - I /I +ОФН - однократный, 1ч сеанс гипоксии-гипероксии за 24ч до ОФ||

4 - I / I (¿ч ) - однократный сеанс гипоксии-гипероксии, забор тканей через 6 ч 1-1/1 (¿4)- однократный сеанс гипоксии-гипероксии, через 24ч +К - положительный контроль. " единицы. Номера оригинальных (

контроль. Примечание: ОДЕ-относительные денситометрические шальных блотов соответствуют номерам столбцов.

При этом выявилась существенная разница по скорости индукции Н1Р-1а в сердце и печени после однократного сеанса гипоксии-гипероксии - Рис. 8. В сердце индукция Н1Р-1а происходит значительно раньше, чем в печени и уже через Зч превышает контроль (в 2,5 раза). В печени рост уровня Н1Р-1а происходит лишь через 24 ч. Подобная закономерность была обнаружена также на модели непрерывной 8% гипоксии без гипероксии, а именно ранняя активация Н1Р-1а в сердце, но не в печени.

а , МП (Печень.) а

НИ (Сердце)

□

Рис. 8. Динамика индукции Н1Р-1а в сердце (а) и печени (б) крыс Вистар через 3 и 24 ч после однократного сеанса гипоксии-гипероксии. К_- контроль, на блотах - пятно №2; 3 ч -1ч сеанс гипоксии-гипероксии, забор тканей через 3 ч, пятно №4. 2Т~ч - 1 ч сеанс гипоксии-гипероксии, забор тканей через 24 ч, пятно №3

Таким образом, при изменении уровня кислорода Н1Р-1а индуцируется в сердце значительно раньше, чем в печени.

Изучение физической выносливости показало, что через 24ч после однократного сеанса гипоксии-гипероксии длительность плавания при ОФН растет на 32%, чего не наблюдается после однократной гипоксии-нормоксии (Рис.9).

Рис. 9. Влияние однократного сеанса

гипоксии-нормоксии (2) и

гипоксии-гипероксии (3)

на длительность плавания крыс Вистар при

истощающей ОФН (1).

Примечание: * - достоверность отличий

(Р<0,05) от ОФН (Mann-Whitney U Test)

Был изучен эффект однократного сеанса гипоксии-гипероксии на индукцию Н1Р-1а, Н8Р72, НОх-1 в сердце при ОФН, взятой отдельно и после такого сеанса (Рис. 7 и 10). Оказалась, что ОФН, взятая отдельно, вызывает резкое увеличение (в 2,5 раза) уровня фактора транскрипции НИ7-1а в сердце и в печени (1,6 раза).

ОФН, проведенная после однократного сеанса гипоксии-гипероксии, по сравнению с ОФН, взятой отдельно, приводит в сердце к увеличению индукции НШ-1а и снижению уровня белков, зависимых от АФК (Н8Р72, НОх-1). Такое снижение стресс-белков при Г/Г+ОФН, происходит несмотря на то, что сам по себе сеанс гипоксии-гипероксии индуцирует эти белки (Рис.11).

HSP72 Cef >дце) а

Г/Г(24)

ОФН

Нох-1 (Сердце)

Г/ Г(24)

ОФН

|

Г/Г+ОФН

Рис. 10. Влияние ОФН, однократного сеанса гипоксии-гипероксии (через 24 ч после сеанса - Г/Г(24)) и ОФН на фоне гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН) на уров(

________ Г/Г(24)) и ОФН на фоне гипоксии-гипероксии (Г/Г+О'ФН) на уровень

индуцибельных стресс-белков HSP/2 (а) и гемоксигеназы HÖx-1 (б) в сердце крыс.

Эти данные свидетельствуют о том, что предварительный сеанс однократной гипоксии-гипероксии имеет выраженный защитный эффект при ОФН. Через 24ч после однократного сеанса гипоксии-гипероксии, который сам по себе активирует защитные системы, ОФН индуцирует значительно меньше стресс-белков семейства НБР. Однократная гипоксия-нормоксия не обладает подобным эффектом.

Таким образом, однократный сеанс гипоксии-гипероксии, при которой организм тренируется к действию АФК и гипоксии, приводит при ОФН к повышению физической выносливости организма, активирует фактор транскрипции Н1Г-1а и ограничивает синтез стресс-белков, зависимых от АФК.

2.2. Защитное действие адаптации к гипоксии и гипероксии при истощающей ОФН: роль индуцибельных форм белков семейства ИЪР.

В данной серии изучали эффект предварительной адаптации к изменению уровня кислорода, в режиме гипоксии-нормоксии (Г/Н+ОФН) и гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН) на физическую выносливость, свободнорадикальное окисление и синтез индуцибельных белков семейства НЭР при истощающей ОФН.

Предварительная адаптация к гипоксии-нормоксии (Г/Н+ОФН) и к гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН) не влияла на длительность плавания - среднее время в группах достоверно не увеличилось, по сравнению с контролем.

Однако, значительные различия между сериями выявились при сравнении не общего времени удерживания на воде, которое для групп близко, а соотношения активного и пассивного плавания (Рис. 11). Оказалось, что предварительная адаптация к гипоксии-нормоксии в 1,8 раза, а адаптация к гипоксии-гипероксии еще больше - в 3 раза увеличивает продолжительность активной фазы плавания при ОФН.

ОФН

Г/Н+ОФН б

Г/Г+ОФН в

Рис. 11. Соотношение активного и пассивного плавания крыс при ОФН с 5% грузом (а) и ОФН после адаптации к гипоксии-нормоксии (б-Г/Н+ОФН) или после гипоксии-гипероксии (в-Г/Г+ОФН). Примечание: штриховка- время активного плавания.

При изучении интенсивности свободнорадикальных процессов было показано, что истощающая ОФН у контрольных животных приводит к повышению интенсивности накопления ТБК-активных продуктов в печени от контроля на 67-85%.

Однако, при ОФН, проведенной после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии или к гипоксии-гипероксии, несмотря на увеличение времени активного плавания, т.е. более высокую стрессорную и гипоксическую компоненты, присущие такой ОФН, не наблюдается дополнительного роста чувствительности мембранных структур к индукции свободнорадикальных процессов (Рис. 12).

Рис. 12. Влияние адаптации к изменению уровня кислорода на динамику накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции m vitro (система окисления с аскорбатом - 0,25 мМ) в печени в контроле (4) и при однократной физической нагрузке плаванием до отказа с 5% грузом. (3), острая физическая нагрузка с 5% грузом после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (2); ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии (1). Примечание: D5«- в единицах оптической плотности при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<(Т.05), # - (Р<0,01) по сравнению с ОФН (Mann-Whitney U Test)

10 15 20

Время окисленя, мин

Более того, интенсивность накопления продуктов окисления в группах Г/Н+ОФН и Г/Г+ОФН достоверно снизилась, по сравнению с группой ОФН, что свидетельствует о способности предварительной адаптации к изменению уровня кислорода подавлять окислительный стресс, индуцируемый ОФН.

Наряду со снижением устойчивости мембранных структур к индукции свободнорадикального окисления, ОФН приводит к ингибированию ферментов антиоксидантной защиты - активность СОД и катапазы снижены от контроля на 21 и 11% (Таблица 1). Предварительная адаптация к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии предупреждает такое снижение, возвращая активность СОД на уровень контроля, а адаптация к гипоксии-нормоксии не только восстанавливает активность СОД после ОФН, но и приводит к активации каталазы.

Серия эксперимента СОД, усл. ед./мг белка Каталаза, мкМ Н202/мин./мг белка

К 5,9-6,8-7,9 9,6-12,5-14

ОФН 5,3-5,4-5,7* 6,2-11,3-17

Г/Н+ОФН 6,1-6,5-8,0Л 9,1-13,7-20"

Г/Г+ОФН 6,2-6,5-6,9 6,0-11,4-18*

Таблица 1.

Активность ферментов антиоксидантной защиты - каталазы и сид в печени крыс Ьистар в контроле (К), при истощающем плавании с 5% грузом (ОФН), при ОФН после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (Г/Н+ОФН) адаптации к гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН).

или ОФН после

Примечание: *- достоверность отличии от контроля л - по сравнению с ОФН (Wilcoxon Matched Fairs Test p<u,05). #- достоверное различие между Г/Н+ОФН и Г/Г+ОФН (Wilcoxon Matched Pairs Test p<0,05). Данные представлены: нижний квартиль (или 25% квантиль) - медиана - верхний квартиль (75% квантиль) согласно рекомендациям, принятым с 2000 г по проведению биомедицинской статистики [Платонов А.Е., 2000].

Таким образом, предварительная адаптация к изменению уровня кислорода снижает интенсивность свободнорадикальных процессов при ОФН и нормализует уровень антиоксидантных ферментов.

Подобная нормализация показана и для повышенного уровня стресс-белков. 1. Сердце

21 3

ОФН Г/Н+ОФН Г/Г+СФМ

ицЩ ¿¡ф

2. Печень

%

140 120 100 80 60 40 20

I

3

r/H+OW

140 120 100

—

2| 3 . 4

IRP, Печень

—

■

2 3

ЭФ г/н+о

Рис. 13. Влияние предварительной адаптации к изменению уровня кислорода на содержание индуцибельных стресс-белков: Н8Р72 (а), НОх-1 (б) и железорегулирующего белка ЖР (в) в сердце (1) и в печени (2) крыс Вистар при острой физическои нагрузке -истощающее плавание с 5% грузом (ОФН).

Примечание: Номера оригинальных блотов соответствуют номерам столбцов. 1 - контроль (100%); 2 -ОФН; 3 - ОФН после адаптации к гипоксии-нормоксии; 4 - ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии.

Действительно, в сердце ОФН повышает уровень стресс-белка Н8Р72 на 60%. Предварительная адаптация предупреждает такое повышение, причем адаптация к гипоксии-гипероксии более эффективна, что хорошо видно на оригинальных блотах (Рис.13). В печени защитный эффект проявляется только при предварительной адаптации к гипоксии-гипероксии для ШР72 НОх-1, а адаптация к гипоксии-нормоксии не обладает таким эффектом.

Таким образом, адаптация к гипоксии-гипероксии более эффективно, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, нормализует индукцию белков, зависимых от АФК, что свидетельствует о меньшей цене этой адаптации.

3. Роль свободнорадикального окисления, конститутивных и индуцибельных белков срочного ответа в повышении эффективности физических тренировок при их совмещении с адаптацией к изменению уровня кислорода.

3.1. Эффект совмещения тренировки к физическим нагрузкам с адаптацией к изменению уровня кислорода на изменение выносливости организма и соотношение активного и пассивного плавания при ОФН.

На Рис. 14 показана длительность плавания индивидуально для каждого животного в группах. При проведении ОФН после предварительной тренировки к плаванию (8Пл+ОФН) индивидуальное и среднее время истощающего плавания значительно и достоверно возрастает (на 65%).

ОФ Н

8ПЛ+ОФН

20 30 40

Время плавания, мин

ГД1 + 8ПЛ + ОФ н

Г/Г +8Пл + ОФ н

Время плавания, мин

20 30 40 50

Время плавания, мин

Рис. 14. Индивидуальное время плавания (в мин) крыс Вистар в каждой пэуппе. При острой истощающей физической нагрузке с 5% грузом (ОФН), при ОФН после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (Г/Н+ЦФН) или к гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН). при ОФН после предварительном тренировки к плаванию (8Пл+ОФН); при ЦФН после совмещения двух видов адаптации - адаптации к гипоксии-нормоксии и тренировки к физическим нагрузкам плаванием (Г/Н+8ПЛ+ОФН), ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии и тренировки к плаванию (1 /1 +811л+иФН). Примечание: индивидуальное время плавания животного отмечено цифрами - 1,2,. ...8.

При совмещении тренировки к плаванию с адаптацией к изменению уровня кислорода, максимальная длительность плавания еще больше увеличивается (в 3 раза

для гипоксии-нормоксии и в 2,3 раза для гипоксии-гипероксии) относительно контроля. При совмещении с восьмикратной тренировкой к плаванию все животные проплавали более 20 мин, в отличие от групп без данной тренировки (Рис. 14). Количество животных, проплывших более 30 мин, возрастает с 1 до 5, в сравнении с группой ОФН. Появляется новая группа животных, которой не было ни при ОФН, ни при Г/Н+ОФН или Г/Г+ОФН, а именно плавающих более 40 минут: при Г/Н+8Пл+ОФН таких животных 5 из 8, при Г/Г+8Пл+ОФН - 4 из 8.

Таким образом, совмещение адаптации к изменению уровня кислорода с физической нагрузкой оказывается значительно более эффективной, чем любой вид адаптации, взятой в отдельности.

Наиболее интересный результат был получен при выявлении доли активного плавания в общем времени удерживания животных на воде (Рис. 15). Несмотря на то, что группа с физической тренировкой, совмещенной с адаптацией к гипоксии-нормоксии (Г/Н+8Пл+ ОФН) показала более длительное время удерживания на воде, по сравнению с физической тренировкой, совмещенной с адаптацией к гипоксии-гипероксии (Г/Г+8Пл+ОФН) видно, что доля активного плавания после адаптации к гипоксии-нормоксии значительно ниже, чем после гипоксии-гипероксии.

60 50 40 -30 s20 10 О

ОФН

Г/Н+ОФН

Г/Г+ОФН

8ПЛ+0ФН Г/Н+ВПл+ОФН Г/Г+8Пл+0ФН

Рис. 15. Время активного и пассивного плавания (в мин) крыс Вистар при острой истощающей физической нагрузке с 5% грузом (ОФН). при ОФН после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (Г/Н+ОФН) или к гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН), при ОФН после предварительной тренировки к плаванию (8Пл+ОФН); при иФН после совмещения двух видов адаптации - адаптации к гипоксии-нормоксии и тренировки к физическим нагрузкам плаванием (Г/Н+8Г1.П+ОФНК при ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии и тренировки к плаванию (1 /1 +811л+ОФН).

Примечание: штриховка- время активного плавания; - - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с контролем (Mann-Whitney U Test)

На Рис. 15 видно, что время активного плавания в группе Г/Н+8Пл+ОФН в 2 раза меньше, чем при совмещении тренировки к физической нагрузкой с адаптацией к гипоксии-гипероксии (Г/Г+8Пл+ОФН), а доля активного плавания в общем времени удержания на воде составляет 90%, по сравнению с 30% при Г/Н+8Пл+ОФН. В результате, если предварительная физическая тренировка (8Пл+ОФН) увеличивает длительность активного плавания в 3 раза от контроля, то совмещении этой тренировки с адаптацией к гипоксии-нормоксии не меняет время активного плавания, а совмещение физической тренировки с адаптацией к гипоксии-гиперокси значительно его увеличивает и на порядок превышает уровень контроля.

Другими словами, совмещение физической тренировки с адаптацией к гипоксии-гиперокси, но не с адаптацией к гипоксии-нормоксии, оказывает выраженный стимулирующей эффект и многократно повышает долю и длительность активной фазы плавания.

3.2. Изменение интенсивности свободнорадикального окисления и уровня ферментов антиоксидантной защиты при совмещении тренировки к физическим нагрузкам с адаптацией к изменению уровня кислорода.

Проанализировали изменение интенсивности свободнорадикальных процессов в наиболее чувствительном к действию АФК органе - печени - при ОФН после тренировки к плаванию без и на фоне адаптации к изменению уровня кислорода.

О 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

Время окисленя, мин Время окисленя, мин

Рис. 16. Сопоставление влияния (а) адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии и (б) совместного применения адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии с тренировкой к физическим нагрузкам на уровень накопления ТБК-активных продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro в печени при ОФН. а-: 1 - ОФН; 2 - ОфН на фоне предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии; 3 -ОФН на фоне адаптации к гипоксии-гипероксии.

б- ОФН на фоне адаптации к изменению уровня кислолрода в сочетании с физической тренировкой; 4 - физическая тренировка плаванием + ОФН; 5 - физическая тренировка, совмещенная с адаптацией к гипоксии-нормоксии + ОФН; 6 - физическая тренировка, совмещенная с адаптацией к гипоксии-гипероксии +ОФН. Примечание: D532- в единицах оптической плотности при 532 нм; * - достоверность отличий (Р<0,05) по сравнению с ОФН (Mann-Whitney U Test)

Оказалось, что в отличие от повышения интенсивности накопления продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro в ткани печени после истощающего ОФН контрольных животных (1-ОФН) - Рис. 16-а, предварительная тренировка к физическим нагрузкам (4-8Пл+ОФН), т.е. прямая адаптация к ОФН, ограничивает снижение устойчивости мембран печени к индукции АФК. Действительно, скорость накопления продуктов окисления в группе 8Пл+ОФН не отличается от контрольного уровня и в 1,6-2,7 раз ниже, чем после ОФН - Рис. 16-6.

Совмещение тренировки к плаванию с адаптацией к изменению уровня кислорода - как к гипоксии-нормоксии, так и к гипоксии-гипероксии, приводило к еще большему повышению резистентности ткани печени к действию индукторов свободнорадикального окисления. Действительно, на Рис. 16-6 видно, что скорость накопления ТБК-активных продуктов снизилась при адаптации к гипоксии-нормоксии - в 1,4-2,9 раз, а при гипоксии-гипероксии в 2,2-4,6 раз.

Активность ферментов антиоксидантной защиты, в частности СОД в печени, при ОФН снижена. После 8-дневной тренировки к физическим нагрузкам регистрируется, напротив, индукция антиоксидантной системы: активность СОД не только восстанавливается до контрольного уровня, но продолжает расти, в результате в группе 8Пл+ОФН активность СОД в 1,5 раза выше, чем при ОФН и на 24% выше контроля (таблица 2). Аналогичная закономерность показана для другого фермента антиоксидантной защиты - каталазы - при ОФН после физической тренировки (8Пл+ОФН) ее уровень на 35% выше, чем при ОФН и на 22% выше, чем в контроле.

Таким образом, если истощающяя ОФН приводит к снижению активности ферментов антиоксидантной защиты, кратковременная тренировка к плаванию (8Пл+ОФН) вызывает, напротив, активацию этой защитной системы (Таблица 2). В обоих случаях видно изменение физиологического соотношения про- и антиоксидантов, причем при ОФН изменения носят повреждающий характер, снижая антиоксидантную защиту, а в случае кратковременного курса физической тренировки свидетельствуют о начальном этапе адаптации, при котором требуется значительный синтез защитных систем.

Таблица 2.

Серия эксперимента СОД, усл. ед./мг белка Каталаза, мкМ Н202/мин./мг белка

Контроль 5,9-6,8-9,0 9,6-12,5-14,0

ОФН 5,3-5,4-5,7 6,2-11,3-17,0

8Пл+ОФН 7,4- 8,4 -9,2* 9,9 -15,2- 25,2*

Г/Н+8Пл+ОФН 6,0- 7,3 -8,2* 13,4- 15,1 -17,2*

Г/Г+8Пл+ОФН 5,7- 7,0 -8,7 11,8- 12,4 -20,1

после совмещения двух видов адаптации - адаптации к гипоксии-нормоксии и тренировки к физическим нагрузкам плаванием (Г/Н+ННл+ОФЩ или ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии и тренировки к плаванию (1 /1 +Н11л+ОФ11).

Примечание: *- достоверность отличий от ОФН (Wiicoxon Matched Pairs Test p <0.05). Данные представлены в виде: нижний квартиль (или 25% квантиль) - медиана - верхний квартиль (75% квантиль) согласно рекомендациям, принятым с 2000 г по проведению биомедицинской статистики [Платонов А.Е., 2000].

При совмещении предварительной тренировки к физическим нагрузкам и адаптации к изменению уровня кислорода активность и СОД, и каталазы в группе Г/Н+8Пл+ОФН и особенно эффективно в группе Г/Г+8Пл+ОФН приближается к контрольному уровню. Иными словами, комбинация 2 видов адаптации - к изменению уровня кислорода и к физической тренировке, предупреждает чрезмерную активацию антиоксидантных ферментов при 8Пл+ОФН и их ингибирование при ОФН.

Наряду с данными о повышении устойчивости к свободнорадикальным повреждениям в группе Г/Н+8Пл+ОФН и Г/Г+8Пл+ОФН (Рис. 16) эти результаты свидетельствуют о протекторном эффекте совмещения предварительной адаптации к изменению уровня кислорода с тренировкой к физическим нагрузкам (Г/Н+8Пл+ОФН и Г/Г+8Пл+ОФН), при котором организм не только приобретает большую устойчивость к ОФН-индуцированным свободнорадикальным повреждениям, чем при взятой отдельно тренировке к физическим нагрузкам, но и тратит значительно меньше ресурсов - энергетических и структурных на защиту от повышенного АФК-сигнала.

Таким образом, комбинация двух видов тренировок - к физическим нагрузкам н к изменению уровня кислорода, особенно эффективно в режиме гипоксии-гипероксии. не только обладает значительным защитным эффектом при истощающих, стрессогенных физических нагрузках, но и осуществляет эту защиту за счет более экономного функционирования клетки, что ведет к повышению выносливости организма и выражается в увеличении длительности и интенсивности плавания.

3.3. Сравнение эффектов адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гиперокеии при использовании их отдельно или совместно с тренировкой к физическим нагрузкам на синтез индуцибельных - Н$Р 72, НОх-1 и конститутивных белков - НБС73, ШР и 8ЕЯСА 2.

Более экономный режим функционирования клетки при комбинации 2-х адаптационных воздействий подтверждается и для других стресс-белков, уровень которых нормализуется от повышенного до контрольного (Рис. 17). Действительно, при предварительной физической тренировке (8Пл+ОФН) параллельно со снижением интенсивности свободнорадикальных процессов при ОФН, снижается также уровень стресс-белка Н8Р72 в сердце и в печени.

А Б

Н$Р72,ПечеЪ%И

Ш-

Рис. 17. Содержание индуцибельного стресс-белка ШР72 в сердце (А) и печени (Б) крыс Вистар при острой истощающей физической нагрузке с 5% грузом (ОФЩ2), при е)ФН после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (Т/Н+ОФН; ■>) или к гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН; 4) при ОФН после предварительной тренировки к плаванию (8Пл+ОФН; 8); при ЦФН после совмещения двух видов адаптации - адаптации к гипоксии-нормоксии и тренировки к физическим нагрузкам плаванием (Г/Н+8Пл+ОФН; 6), при ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии и тренировки к плаванию П'/Г+8Пл+ОФН; 7).

11римечание: Контроль - 100% (1). Номера пятен на оригинальных блотах соответствуют номерам столбцов.

Тем не менее, цена тренировки к физическим нагрузкам существует. Помимо активации ферментов антиоксидантной защиты - табл. 2, другие системы также активируются, например, НОх-1 и ГОР (Рис. 18). Совмещение же двух тренировок к изменению уровня кислорода и к физическим нагрузкам снижает уровень этих белков, причем при гипоксии-гипероксии эти параметры больше приближены к норме.

8Пл+ОФН "О*-1 СеРАЧе

-офн-

— —1

7 3

140 120 100™"

1РР Сердце

ОФН

И

норма

Н

1®Н8Пл+ОФН ОФН Г/Н+ОФН Г/Г+ОФН

'

Б

Рис. 18. Содержание индуцибельной гемоксигеназы НОх-1 (А) и железсдеегулирующего белка 1ИР (Б) в сердг/е ¡фыс Вистар при острой истощающеи физическои нагрузке с 5% грузом (ОФН;2). при ОФН после предварительной адаптации к гипоксии-нормоксии (Г7Н+ОФН; 3) или к гипоксии-гипероксии (Г/Г+ОФН; 4), при ОФН после предварительной тренировки к плаванию (8Пл+ОФН; 8); при ОФН после совмещения двух видов адаптации - адаптации к гипоксии-нормоксии и тренировки к физическим нагрузкам плаванием (Г/Н+8Пл+ОФН; 6). при ОФН после адаптации к гипоксии-гипероксии и тренировки к плаванию (I /I +8Г1л+ОФН; 7). Примечание: Контроль - 100% (1). Номера пятен на оригинальных блотах соответствуют номерам столбцов.

Аналогично цена тренировки к физическим нагрузкам проявилась в отношении уровня белков, активация которых происходит в большей степени не АФК-опосредованно, а в результате действия гипоксии, а именно конститутивной формы белка семейства ШР - Н8С73. Видно, что ОФН на фоне тренировки к физическим нагрузкам по сравнению с ОФН без тренировки увеличивает уровень этого гипоксического белка, а предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии нормализует этот уровень. Адаптация к гипоксии-нормоксии, совмещенная с физической тренировкой не обладает таким эффектом. Подобная нормализация до контрольного уровня наблюдается и для Са-насоса саркоплазматического ретикулума сердца, который отвечает за поддержание гомеостаза ионов Са в сердце. Показано, что предварительная адаптация к изменению уровня кислорода предотвращает чрезмерный синтез 8Е11СА-2 после тренировки, при этом эффективность совмещения с физической тренировкой адаптации к гипоксии-гипероксии выше (Рис. 19).

8ПЛ+ОФН НБС73, СЕРДЦЕ

_

ОФН

16| й

5ЕИСА-2, СЕРДЦЕ £_

ОФН

А + К 6 7 8 1 2 5 4 3 Ц С

Рис. 19. Содержание конститутивной формы белка Н8С73 (А) и 8ЕИСА-2^(Б)- Са-насоса

___. , и 11/1 . .

ОФН после предварительной тренировки к плаванию (8Пл+ОФН; »); при ЦФН после совмещения двух видов адаптации - адаптации к гипоксии-нормоксии и тренировки к физическим нагрузкам плаванием (Г/Н+8Пл+ОФН: 6). при иФН после адаптации к гипоксии-гипероксии и тренировки к плаванию (1 /I +Шл+ОФН; 7). Примечание: Контроль - 100% (1). Номера пятен на оригинальных блотах соответствуют номерам столбцов.

Таким образом:

А. Совмещение двух видов адаптации - к физическим нагрузкам и к изменению уровня кислорода оказывается максимально эффективным и значительно превышает действие любого вида адаптации, взятой по отдельности.

Б. Адаптация к гипоксии-гипероксии более эффективно, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, повышает выносливость организма, нормализует увеличенный уровень индуцибельных и конститутивных белков и в целом является менее затратной для организма.

В. Добавление гипероксической компоненты в адаптацию к гипоксии расширяет спектр применения адаптации к изменению уровня кислорода, позволяя использовать ее не только при защите от гипоксических состояний, но и в тех случаях, при которых она ранее не применялась или была малоэффективна, т.е. при защите сердца от действия АФК и для предупреждения стрессогенных нарушений при истощающих физических нагрузках.

22

ВЫВОДЫ

1. Кратковременная гипокинезия повышает в сердце и печени интенсивность свободнорадикальных процессов с разнонаправленным изменением уровня защитных белков - увеличением в сердце и снижением в печени. Продление гипокинезии усиливает в печени интенсивность свободнорадикальных процессов при ингибировании супероксиддисмутазы, НОх-1 и НОх-2, а в сердце напротив, активирует эндогенные антиоксидантные системы и стабилизирует резистентность мембран к свободнорадикальному окислению.

2. Предварительная адаптация к периодическому изменению уровня кислорода предупреждает вызванное гипокинезией снижение устойчивости мембранных структур к действию АФК. Адаптация в режиме нормобарической гипоксии-гипероксии обладает более выраженным, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, защитным действием при гипокинезии, ограничивая активацию свободнорадикальных процессов и увеличение уровня стресс-белков ГОР72, ШР32 в сердце, скелетной мышце и печени.

3. Однократный сеанс гипоксии-гипероксии, в отличие от гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма при истощающем плавании и в большей степени ограничивает вызванное острой физической нагрузкой увеличение уровня стресс-белков семейства ГОР. Изменение уровня стресс-белков -индуцибельных ГОР72 и НОх-1 и фактора транскрипции НИМ а имеет сходную динамику, причем индукция НИ7-1а в ответ на изменение уровня кислорода в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени.

4. Выявлена возможность повышения физической выносливости организма с помощью нового вида адаптации к гипоксии-гипероксии. Предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, увеличивает длительность и интенсивность плавания, ограничивает активацию свободнорадикальных процессов, вызванную истощающей физической нагрузкой, восстанавливает сниженную активность ферментов антиоксидантной защиты. Адаптация к гипоксии-гипероксии также нормализует уровень железорегулирующего белка ЖР и снижает в сердце и печени повышенный уровень ГОР72 и НОх-1.

5. Сочетание тренировок к физическим нагрузкам с адаптацией к гипоксии-гипероксии в большей степени, чем с адаптацией к гипоксии-нормоксии повышает эффективность таких тренировок. Это выражается как в увеличении длительности удержания на воде при истощающем плавании, что характерно для обоих видов адаптации, так и - в случае адаптации к гипоксии-гипероксии - в 2-х кратном увеличении длительности активного плавания.

6. Комбинация двух видов адаптации: к физическим нагрузкам и к изменению уровня кислорода предупреждает активацию свободнорадикальных процессов при истощающей физической нагрузке и нормализует в сердце и печени повышенный при физической тренировке уровень супероксиддисмутазы и индуцибельной НОх-1, а при адаптации к гипоксии-гипероксии - и уровень ЖР и каталазы.

7. Новый вид адаптации к гипоксии-гипероксии обладает антистрессорным и стимулирующим физическую активность действием: комбинация такой адаптации с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективна, чем отдельные виды адаптации. Это явление выражается в наибольшем повышении выносливости организма, что связано с увеличением резистентности мембранных структур к

свободнорадикальным процессам и нормализацией уровня АФК-индуцибельных и конститутивных белков HSC73, НОх-2, IRP, а также SERCA-2, ответственного за Са-гомеостаз сердца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sazontova T.G., Zhukova A.G., Anchishkina N.A., Arkhipenko Yu.V. HIF-lalfa Transcription Factor, HSPs and resistance of membrane structures to ROS in acute hypoxia and adaptation. // Abstracts of the VIII Congress of the International Society for Adaptive Medicine. Moscow - 2006.- June 21-24,- P.42-43.

2. Sazontova T.G., Anchishkina N.A., Arkhipenko Yu.V. HSPs in heart and skeletal muscle during acute and long-term hypokinesia. // Abstracts of the VIII Congress of the Intern. Society for Adaptive Medicine. Moscow - 2006,- June 21-24.- P.96-97.

3. Usacheva M.A., Zhukova A.G., Anchishkina N.A., Popkova E.V., Sazontova T.G., Smirnova E.A., Belkina L.M. Peculiarity of autonomic regulation and adaptation to postinfarction cardiosclerosis in rats of Wistar population and August strain. // Abstracts of the VIII Congress Internat. Society Adaptive Medicine. Moscow-2006.-June 21-24.- P.171.

4. Ehrenburg I.V., Anchishkina N.A., Tkachouk E.N., Sazontova T.G. Effect of intermittent normobaric hypoxia on pro- and antioxidant status of heart and skeletal muscle. // The 6th International Conference "Hypoxia in medicine", Milan, Italy. - 2006. - Sept 21-23. - P.25.

5. Sazontova T.G., Anchishkina N.A., Arkhipenko Yu.V. Hypoxia inducible factor (IIIF-la), HSPs and membrane Resistance in Acute and Adaptative Hypoxia. // The 6(h International Conference "Hypoxia in medicine", Milan, Italy - 2006.- Sept 21-23,- P.24.

6. Sazontova T.G., Zhukova A.G., Anchishkina N.A., Arkhipenko Yu.V. HIF-la Transcription Factor and Urgent Response Proteins in Acute Hypoxia and Adaptation. // Abstracts of the 5th International Congress of Pathophysiology, Beijing, China. - 2006. -June 28-July 1. Chinese Journal of Pathophysiology, 2006,- V.22.- №13 (Suppl.).- P.l 14.

7. Sazontova T.G., Anchishkina N.A., Nemirovskaya T.L., Arkhipenko Yu.V. Heat Shock Proteins (HSPs) in Muscle Tissues in Hypokinesia. // Abstracts of the 5th International Congress of Pathophysiology, Beijing, China. - 2006. - June 28-July 1. - Chinese Journal of Pathophysiology. - 2006,- V.22.- №13 (Suppl.).- P.399-400.

8. Сазонтова Т.Г., Анчишкина H.A., Немировская Т.Л., Архипенко Ю.В.. Белки теплового шока (HSPs) в мышечных тканях при гипокинезии.(Неа1 shock proteins in heart and skeletal muscle in hypokinesia). // Материалы XIII конференции: «Космическая биология и авиакосмическая медицина», Государственный научный центр РФ -Институт медико-биологических проблем - Москва - 2006.- июнь 13-16,- С. 186.

9. Анчишкина Н.А., Сазонтова Т.Г. Антистрессорное действие адаптации к гипоксии и гипероксии. V Международный симпозиум «Актуальные проблемы биофизической медицины».- Киев - 2007.- май 17-19,- С.6.

10. Сазонтова Т.Г., Жукова А.Г., Анчишкина Н.А., Архипенко Ю.В.. Фактор транскрипции HIF-la, белки срочного ответа и резистентность мембранных структур в динамике после острой гипоксии // Вестник РАМН,- 2007.- №2,- С. 17-25.

11. Sazontova T.G., Anchishkina N.A., Zhukova A.G., Tkachouk E.N., Archipenko Yu.V. Increase in Resistance of Membrane Structures in Adaptation to Changing Oxigen Level. // In "Adaptation Biol. Med.", (Eds. L.D. Lukyanova, N. Takeda et al.) New Delhi, Narosa Publ. House.- 2008,- V.5 (Health Potentials).- P. 307-317

12.Сазонтова Т.Г., Жукова А.Г., Анчишкина H.A., Архипенко Ю.В. HIF-la, HSPS и резистентность мембранных структур при гипоксии. // XX съезд Физиологического общества им. И. П. Павлова,- Москва.- 2007.- июнь 4-8,- С.83.

13. Анчишкина Н.А., Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В, Лукьянова Л.Д. Переодическое изменение уровня кислорода и индукция HIF-la в мозге и сердце. // XX съезд Физиологического общества им. И. П. Павлова.- Москва.- 2007, июнь 4-8.- С. 127

14.Сазонтова Т.Г., Анчишкина H.A., Архипенко Ю.В. Индукция HSPs и ферментов антиоксидантной защиты при активации свободнорадикального окисления на ранних этапах гипокинезии. // Бюл. эксперим. биол. и мед.- 2007.- Т. 143, №¡4 - С.378-382.

15.Сазонтова Т.Г., Анчишкина H.A., Жукова А.Г., Бедарева И.В., Пылаева Е.А., Кривенцова H.A., Полянская A.A., Юрасов А.Р., Архипенко Ю.В. Роль активных форм кислорода и редокс сигнализации в защитных эффектах адаптации к изменению уровня кислорода.// Ф1зюлопчний журнал- 2008- Т.54,- №2,- С.12-29.

16. Анчишкина H.A., Сазонтова Т.Г. Кардиопротекторный эффект адаптации к гипоксии и гипероксии при однократных и многократных физических нагрузках. // Пятая Российская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва,-2008,- октябрь 9-11.- С.44.

17. Белкина JI.M., Усачева М.А., Попкова Е.В., Смирнова Е.А., Мациевский Д.Д., Сазонтова Т.Г., Анчишкина H.A., Круглов C.B., Терехина O.JI. Особенности адренергической регуляции и функция сердечно-сосудистой системы в отдаленные сроки после инфаркта миокарда у крыс разных линий. // Рос. Физиол. ж. им. И.М. Сеченова,- 2009,- Т.95.- №1.- С.38-48.

ROLE OF FREE RADICAL OXIDATION AND INDUCTION OF HSP FAMILY PROTEIN IN PROTECTIVE EFFECT OF ADAPTATION TO HYPOXIA AND HYPEROXIA DURING PHYSICAL LOAD.

Anchishkina Natalya Aleksandrovna

The purpose of the given research consisted in complex studying the influence of hypoxia-hyperoxia on efficiency of trainings to physical activities and roles free radical processes and HSP family proteins in increase of physical endurance. It was shown, that preliminary adaptation to periodic change of oxygen level of warns caused hyporinesia decrease in stability of membrane structures to action ROS. Adaptation in a mode normobaric hypoxia- hyperoxia possesses more expressed, than adaptation to hypoxia-normoxia protects from hypokinesia-indusible damages, limiting activation of free radical processes and decrease in a level stress- proteins HSP72, HSP32 in heart, skeletal muscle and liver. The single séance of hypoxia and hyperoxia, but not hypoxia and normoxia, raises physical endurance of an organism and prevents the increase in a level caused by sharp physical activity stress- protein s of family HSP. Change of a level stress-proteins HSP72 and HOx-1 and the factor of transcription H1F-1 a has similar dynamics, and induction HIF-1 a in heart occurs much more quickly, than in a liver. The opportunity of increase of physical endurance of an organism by means of a new kind of adaptation to hypoxia and hyperoxia is revealed. Preliminary adaptation to hypoxia and hyperoxia raises duration and intensity of swimming, limits activation of free radical processes at exhausting physical load, restores the lowered activity of antioxidant enzymes. Adaptation to hypoxia-hyperoxia, unlike hypoxia-normoxia, normalizes a level of IRP and reduces in heart and a liver the raised level stress-fibers HSP72 and HOx-1. A combination of two kinds of adaptation: to physical activities and change of oxygen level warns activation of free radical processes at exhausting physical load and normalizes in heart and a liver the raised level of SOD, HOx-1, and in case of adaptation to hypoxia-hyperoxia - level IRP and catalase. The new kind of adaptation to hypoxia and hyperoxia possesses antistressive and stimulating physical activity effect: complete of such adaptation with training to physical load is much more effective, than separateness kinds of adaptation. It is expressed in the greatest increase of endurance of an organism, increase in resistance of membrane structures to free radical processes and normalization of infringements of synthesis ROS-inducible and constitutive proteins -HSC73, HOx-2, IRP and SERCA-2 - responsible for heart Ca-homeostasis.

Заказ №119/05/09 Подписано в печать 22.05.2009 Тираж115 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 \v ^ www.cfr.m; e-mail:info@cfr.ru

Актуальность исследования. Участие типовых патологических процессов — стресса и гипоксии - в патогенезе различных заболеваний ставит перед современной медициной проблему повышения резистентности организма к таким повреждающим факторам. В основе действия этих факторов, реализующихся, в том числе, при истощающих острых физических нагрузках (ОФН) лежит активация свободнорадикальных процессов, поэтому актуальной проблемой является коррекция состояний организма, связанных с чрезмерным увеличением уровня активных форм кислорода (АФК). В качестве такой защиты нередко используют экзогенные антиоксиданты, однако их применение не всегда эффективно, поскольку вызывает подавление собственной, эндогенной антиоксидантной системы организма [Сазонтова Т.Г. и др., 1987; Mosconi С. et al., 1988; Buckman T.D. et al. 1993; Barja G. et al., 1994; Jaeschke H., 1995]. Поэтому перспективными являются методы, позволяющие ограничивать чрезмерную активацию свободнорадикальных процессов за счет индукции синтеза собственных защитных, в частности, антиоксидантных систем, путем периодического, ограниченного по интенсивности АФК-сигнала. К таким методам относятся адаптационные тренировки с помощью периодического изменения уровня кислорода при нормобарической или гипобарической гипоксии.

К настоящему времени показано, что помимо известной роли избыточного уровня АФК в развитии патологических состояний, образование АФК и инициация свободнорадикальных процессов является естественным, физиологическим процессом, постоянно протекающим в организме. При этом главными физиологическими функциями АФК являются: окисление поврежденных молекул с целью их дальнейшей утилизации [Сазонтова, Т.Г., 1989; Ungemach F.R., 1985; Zolotarjova N. et al., 1994], синтез молекул мессенджерного типа, например, эйкозаноидов при свободнорадикальном окислении ПНЖК фосфолипидов [Hemler М.Е. et al., 1979; Roberts A.M. et al., 1981] и сигнальная роль АФК.

В последние годы активно изучается роль редокс-сигнализации и АФК-зависимой внутриклеточной системы передачи внешнего сигнала к клеточному ядру с последующей инициацией синтеза белков [Semenza G.L., 1999; Chandel N.S., et al., 2000]. Показано, что при физиологических условиях АФК участвуют в ключевых регуляторных хмеханизмах клетки [Nanji A.A. et al., 1995; Lee P.J. et al., 1996; Suzuki YJ. et al., 1997]. Благодаря АФК, инициирующих редокс-сигнализацию, в отсутствие специфических рецепторов развивается клеточный ответ на действие гипоксии, окислителей и восстановителей. Помимо этого, медиаторы, действие которых опосредовано специфическими рецепторами -гормональными, цитокиновыми, также активируют неспецифическую редокс-сигнализацию и участвуют в перекрестной активации и взаимодействии рецепторов, что является основой перекрестных эффектов адаптации, при которых тренировка к одному повреждающему фактору повышает резистентность организма к действию другого фактора.

Важнейшим следствием инициации редокс-сигнализации является активация факторов транскрипции: NF-kB. [Flohe L. et al., 1997], AP-1 [Maulik N. et al., 1999], HIF-la, HIF-3a [Wiener C.M. et al., 1996; Semenza G.L., 1999; Сазонтова Т.Г. и др., 2007], индуцирующих защитные белки и способствующих адаптации и выживаемости организма. Так, к настоящему времени известно более 60 генов, активируемых HIF-la. Основными белками ответа на АФК-сигнал при стрессе, гипоксии, ишемии являются ферменты антиоксидантной защиты, белки семейства HSP, Fe-регулируюшие белки, ферменты репарации, пероксиредоксины [Graven К.К. et al., 1993; Maulik N. et al., 1999; Peng J. et al., 2000; Ryter S.W. et al., 2000; Zhukova A.G. et al., 2004]. В результате редокс-сигнализация приводит к насыщению клетки молекулами, повышающими ее защиту от повреждающих воздействий, причем эндогенная, т.е. сформировавшаяся в самой клетке защита [Flu M.L., et al., 1989; Mosconi С., et al., 1988] эффективней внешней, с помощью экзогенных добавок. Причина этого лежит в кратности действия редокс-сигнализации, при которой АФК-индукция факторов транскрипции и протекторных белков, в том числе антиоксидантов, сменяется их ингибированием высоким уровнем тех же антиоксидантов, и синтез защитных белков прекращается. Для повторной индукции защитных систем необходим новый АФК-сигнал, поэтому с помощью поступления периодических АФК-сигналов и следующей за ними индукции протекторных систем реализуется основной принцип периодической адаптации. Так, повторяющаяся, ограниченная генерация АФК с последующим синтезом протекторных систем является механизмом повышения резистентности организма при адаптации к стрессу [Сазонтова Т.Г. и др., 1987], физическим нагрузкам [Сазонтова Т.Г., 1989; Powers S.K. et al., 1994], холоду [Spasie М.В. et al., 1993], гипоксии [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], пищевым адаптогенам [Sanz M.J. et al., 1994; Cai Y.N. et al., 1995], диете с ПНЖК n-3 класса [Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. 1995; Ни M.L. ct al., 1989], на основе чего сформулирована концепция участия АФК в создании неспецифической компоненты повышения устойчивости организма [Sazontova T.G. et al., 2007] при периодически действующем факторе внешней среды.

Показано, что длительное применение адаптации к интервальной нормобарической гипоксии повышает резистентность мембран сердца, печени- и коры головного мозга к действию АФК, однако формирование защитного эффекта за более короткое время требует углубления гипоксии, увеличения АФК-сигнала, что ведет к чрезмерному синтезу защитных белков и, тем не менее, отсутствию ограничения интенсивности АФК-процессов [Sazontova T.G. et al., 1994].

Для увеличения эффективности адаптации и усиления АФК-сигнала без побочных эффектов, периоды нормоксии при адаптации к гипоксии, заменили периодами умеренной гипероксии, что усилило АФК-сигнал без углубления гипоксии. Новый вид адаптации к гипоксии и умеренной гипероксии (патент № 2289432 от 20.12.2006т.) отличается более ранним, чем при гипоксии-нормоксии, повышением резистентности мембранных структур [Сазонтова Т.Г., 2004] и более быстрым достижением защитного эффекта у больных ИБС [Маев Э.З., и др., 2004], что важно для практики применения этого метода в терапии и профилактике.

Несмотря на то, что за последние 5 лет показана потенциальная способность нового метода адаптации в защите мембранных структур от АФК-индуцированных повреждений in vitro [Жукова А.Г., 2007], ничего не известно о возможности реализации подобного защитного эффекта адаптации к гипоксии-гипероксии на уровне организма. Отсутствуют исследования защитных эффектов нового вида адаптации при повреждениях, вызванных ограничением подвижности или, напротив, истощающей, острой физической нагрузкой (ОФН), хотя оба эти фактора реализуют свое действие посредством активации АФК-процессов, защита от которых показана in vitro при адаптации к гипоксии-гипероксии. Восполнить этот пробел было задачей настоящего исследования.

Кроме того, поскольку адаптация к комбинированному действию факторов внешней среды: физическим нагрузкам, холоду и/или гипоксии зачастую обладает большей эффективностью, чем адаптация к каждому из них по-отдельности, а истощающая ОФН, подобно соревновательной, имеет гипоксическую и стрессорную компоненты, было основание полагать, что тренировка к физическим нагрузкам, в комбинации с адаптацией к гипоксии и/или гипероксии, может оказаться более эффективной в отношении повышения физической выносливости организма. Однако, подобные исследования малочисленны, а в отношении адаптации к гипоксии-гипероксии вообще не проводились, поэтому вопрос об эффективности и перекрестных эффектах такой адаптации остается открытым. Поиск ответа на этот вопрос также явился предметом настоящего исследования.

Цель данного исследования состояла в комплексном изучении влияния адаптации к гипоксии, и гипероксии на эффективность тренировок к физическим нагрузкам и роли свободнорадикальных процессов и индуцибельных и-конститутивных белков семейства Н8Р в повышении физической выносливости.

В рамках этой цели решали следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить при гипокинезии разной длительности в сердце и печени, интенсивность свободнорадикальных процессов и уровень индукции белков срочного ответа: ферментов антиоксидантной защиты, индуцибельных Н8Р72 и НОх-1 и конститутивной — НОх-2 при гипокинезии.

2. Изучить возможность предупреждения с помощью предварительной адаптации к интервальной нормобарической гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии снижения устойчивости мембранных структур при гипокинезии.

3. Оценить влияние предварительного, однократного сеанса гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии на изменение уровня компонентов редокс сигнализации - фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией - НПМа и белков семейства Н8Р при острой физической нагрузки.

4. Выявить возможность ограничения с помощью адаптации к изменению уровня кислорода активации свободнорадикальных процессов и индукции синтеза стресс-белков - Н8Р72, НОх-1 и железо-регулирующего белка ШР при истощающей острой физической нагрузке.

5. Оценить влияние адаптации к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии на физическую выносливость, а также комбинации адаптации к изменению уровня кислорода с тренировками к физическим нагрузкам на эффективность таких тренировок.

6. Сравнить эффекты адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии при использовании их отдельно или совместно с тренировкой к физическим нагрузкам на уровень свободнорадикального окисления и синтез индуцибельных: ШР72, НОх-1 и конститутивных белков:Н8С73, НОх-2, БЕЯСА 2.

Научная новизна определяется основными результатами работы.

Впервые изучено действие гипокинезии различной длительности - через 3 ч в сердце и печени снижена резистентность мембранных структур на фоне роста уровня защитных систем в сердце: антиоксидантных ферментов и конститутивной НОх-2 и, напротив, снижения в печени уровня СОД, конститутивной, и индуцибельной гемоксигеназы. Увеличение длительности гипокинезии до 72 ч приводит в сердце к массированному синтезу защитных белков, что стабилизирует резистентность мембран к действию АФК; в.печени нарастает интенсивность АФК-процессов при ингибировании протекторных систем.

Впервые показано, что предварительная адаптация к изменению уровня кислорода ограничивает повышенную активацию свободнорадикального окисления - при гипоксии-гипероксии на 81%, при гипоксии-нормоксии на 32% и синтез индуцибельных стресс-белков семейства НБР, вызванных гипокинезией в» сердце, скелетной мышце и печени. Впервые установлено, что адаптация к периодической гипоксии-гипероксии обладает более выраженным, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, протекторным действием.

Впервые проведено сопоставление изменения уровня компонентов редокс-сигнализации - фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией ЮТ-1а и стресс-белков: Н8Р72 и НОх-1 - выявлена сходная динамика их индукции при истощающей острой физической нагрузке (ОФН), до и после однократного сеанса гипоксии-нормоксии или гипоксии-гипероксии. Индукция НШ-1а в сердце значительно опережает печень. Впервые обнаружено, что прекондиционирование за сутки до ОФН с помощью однократного сеанса гипоксии-гипероксии, но не гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма в 1,4 раза и ограничивает синтез стресс-белков при истощающем ОФН.

Впервые выявлена возможность повышения выносливости при ОФН с помощью нового вида адаптации к периодической гипоксии-гипероксии. Установлено, что предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии обладает большей эффективностью, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, в повышении длительности и интенсивности плавания при истощающей ОФН. N

V Впервые проведено сравнение эффектов адаптации к гипоксии-нормоксии и гипоксии-гипероксии при истощающей ОФН. Оба вида адаптации ограничивают свободнорадикальные процессы, восстанавливают до контроля сниженную при

ОФН активность ферментов антиоксидантной защиты и предупреждают индукцию синтеза Н8Р72 в печени и в сердце. Адаптация к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии, обладает защитным эффектом также в сердце и печени, спижая повышенный уровень НОх-1 и восстанавливая уровень 1КР.

Впервые проведена сравнительная оценка влияние двух видов адаптации к изменению уровня кислорода при использовании их отдельно или совместно с тренировками к физическим нагрузкам на изменение длительности и интенсивности истощающего плавания. Совмещение тренировки к физическим нагрузкам с адаптацией к гипоксии-нормоксии увеличивает длительность плавания в 3 раза, к гипоксии-гипероксии - в 2,3 раза. Комбинация физической тренировки с адаптацией к гипоксии-нормоксии не влияет на интенсивность плавания, с адаптацией к гипоксии-гипероксии повышает до 90% долю активного плавания,от общего времени удержания на воде.

Впервые показано, что комбинация двух видов тренировок: к физическим нагрузкам и к изменению уровня, кислорода, особенно эффективно в режиме гипоксии-гипероксии, ограничивает активацию свободнорадикальных процессов при ОФН при более экономном синтезе АФК-зависимых белков, что проявляется в снижении в сердце и печени повышенной при физической тренировке активности ферментов антиоксидантной защиты, НОх-1 и железорегулирующего белка 1ЯР. Впервые при тренировке к физическим нагрузкам в сердце показано увеличение уровня конститутивных Н8С73 и НОх-2 в 1,8 раза и индуцибельной НОх-1, что в целом свидетельствует о наличии гипоксической компоненты такой тренировки. Совмещение физической,тренировки с адаптацией к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии снижает гипоксическую компоненту.

Впервые выявлен антистрессорный и стимулирующий физическую активность эффект нового вида адаптации к гипоксии-гипероксии. Комбинация такой адаптации с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективна, чем отдельности виды адаптация. Это явление выражается в наибольшем повышении выносливости организма, что связано с увеличением резистентности мембранных структур к свободнорадикальным процессам и нормализация нарушений синтеза АФК-индуцибельных и конститутивных белков Н8С73, НОх-2,1КР и 8ЕЯСА-2, ответственного за Са-гомеостаз сердца.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней благодаря проведенному комплексному исследованию впервые показано защитное действие адаптации к гипоксии-гипероксии от стрессорных и гипоксических нарушений, индуцированных гипокинезией и острой истощающей физической нагрузкой и изучена роль свободнорадикальных процессов и адаптационного синтеза индуцибельных и конститутивных защитных белков в повышении физической выносливости организма.

Практическое значение работы определяется тем, что в ней на основе сравнительного изучения эффективности и цены адаптации к гипоксии-нормоксии и к гипоксии-гипероксии экспериментально обоснована возможность расширения спектра применения адаптации к периодическому изменению уровня кислорода, т.е. использования ее в тех случаях, при которых данная^ адаптация ранее не применялась или была малоэффективна - при защите от активации свободнорадикальных процессов в сердце и повышении устойчивости к стрессогенным, соревновательным нагрузкам.

Положения, выносимые на защиту.

1. Кратковременная и длительная гипокинезия повышает интенсивность свободнорадикальных процессов-с одновременным увеличением уровня защитных белков в сердце и снижением их в печени. Предварительная адаптация к периодической гипоксии-гипероксии в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии ограничивает вызванную гипокинезией активацию свободнорадикальных процессов и увеличение уровня индуцибельных стресс-белков Н8Р72 и ШР32 в сердце, скелетной мышце и печени.

2. Однократный сеанс гипоксии-гипероксии, но не гипоксии-иормоксии, повышает физическую выносливость организма при истощающем плавании и предотвращает вызванное острой физической нагрузкой увеличение уровня стресс-белков семейства НЭР. Изменение уровня стресс-белков - индуцибельных форм Н8Р72 и НОх-1 и фактора транскрипции ЮТ-1а имеет сходную динамику, причем индукция ЮТ-1а в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени.

3. Предварительная адаптация к периодической гипоксии-гипероксии, 15 сеансов, в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии повышает физическую выносливость при истощающей ОФН. Оба вида адаптации ограничивают высокую интенсивность свободпорадикальных процессов, свойственных ОФН, восстанавливают сниженный уровень активности ферментов антиоксидантной защиты и предупреждают чрезмерную индукцию стресс-белка HSP72, а в случае адаптации к гипоксии-гипероксии, но не к гипоксии-нормоксии также нормализует уровень НОх-1 и железорегулирующего белка ГОР.

4. Совмещение адаптации к гипоксии-гипероксии с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективна, чем отдельности виды адаптация. Это явление выражается в повышении эффективности тренировок, увеличении резистентности мембран к свободнорадикальным процессам при более экономном функционировании - нормализации в сердце и печени повышенного при физической тренировке уровня антиоксидантных ферментов, НОх-1 и ГОР, а при адаптации к гипоксии-гипероксии, и синтеза конститутивных белков HSC73, НОх-2 и SERCA-2, ответственного за Са-гомеостаз.

Апробация работы: Апробация работы проведена на заседании межлабораторной конференции ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН 14.04.2009г. (г. Москва). Основные положения работы были доложены и обсуждены на VIII Международном научном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006); V Международном конгрессе по патофизиологии (Beijing, China, 2006); на XIII конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006); VI Международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Milan, Italy, 2006); V Международном симпозиуме «Актуальные проблехмы биофизической медицины» (Киев, 2007); XX Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007); Всероссийской научной конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008). Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры патофизиологии и биохимии Оренбургской государственной медицинской академии.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы состоит из 233 источника. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками, 4 таблицами и 7 схемами.

ВЫВОДЫ

1. Кратковременная гипокинезия повышает в сердце и печени интенсивность свободнорадикальных процессов с разнонаправленным изменением уровня защитных белков - увеличением в сердце и снижением в печени. Продление гипокинезии усиливает в печени интенсивность свободнорадикальных процессов при ингибировании супероксиддисмутазы, НОх-1 и НОх-2, а в сердце напротив, активирует эндогенные антиоксидантные системы и стабилизирует резистентность мембран к свободнорадикальному окислению.

2. Предварительная адаптация к периодическому изменению уровня кислорода предупреждает вызванное гипокинезией снижение устойчивости мембранных структур к действию АФК. Адаптация в режиме нормобарической гипоксии-гипероксии обладает более выраженным, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, защитным эффектом при гипокинезии, ограничивая активацию свободнорадикальных процессов и увеличение уровня стресс-белков Н8Р72, Н8Р32 в сердце, скелетной мышце и печени.

3. Однократный сеанс гипоксии-гипероксии, в отличие от гипоксии-нормоксии, повышает физическую выносливость организма при истощающем плавании и в большей степени ограничивает вызванное острой физической нагрузкой увеличение уровня стресс-белков семейства НБР. Изменение уровня стресс-белков - индуцибельных Н8Р72 и НОх-1 и фактора транскрипции ЮТ-1а имеет сходную динамику, причем индукция ЮТ-1а в ответ на изменение уровня кислорода в сердце происходит значительно быстрее, чем в печени.

4. Выявлена возможность повышения физической выносливости организма с помощью нового вида адаптации к гипоксии-гипероксии. Предварительная адаптация к гипоксии-гипероксии в большей степени, чем адаптация к гипоксии-нормоксии, увеличивает длительность и интенсивность плавания, ограничивает активацию свободнорадикальных процессов, вызванную истощающей физической нагрузкой, восстанавливает сниженную активность ферментов антиоксидантной защиты. Адаптация к гипоксии-гипероксии также нормализует уровень железорегулирующего белка ШР и снижает в сердце и печени повышенный уровень стресс-белков ШР72иНОх-1.

5. Сочетание тренировок к физическим нагрузкам с адаптацией к гипоксии-гипероксии в большей степени, чем с адаптацией к гипоксии-нормоксии повышает эффективность таких тренировок. Это выражается как в увеличении длительности удержания на воде при истощающем плавании, что характерно для обоих видов адаптации, так и в случае адаптации к гипоксии-гипероксии в 2-х кратном увеличении длительности активного плавания.

6. Комбинация двух видов адаптации: к физическим нагрузкам и изменению уровня кислорода предупреждает активацию свободнорадикальных процессов при истощающей физической нагрузке и нормализует в сердце и печени повышенный при физической тренировке уровень супероксиддисмутазы и индуцибельной НОх-1, а при адаптации к гипоксии-гипероксии - и уровень ШР и каталазы.

7. Новый вид адаптации к гипоксии-гипероксии обладает антистрессорным и стимулирующим физическую активность действием: комбинация такой адаптации с тренировкой к физическим нагрузкам значительно более эффективна, чем отдельности виды адаптация. Это явление выражается в наибольшем повышении выносливости организма, что связано с увеличением резистентности мембранных структур к свободнорадикальным процессам и нормализация нарушений синтеза АФК-индуцибельных и конститутивных белков Н8С73, НОх-2, ШР и 8ЕЯСА-2, ответственного за Са-гомеостаз сердца.