Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль оксида азота в прямых и перекрестных эффектах адаптации к физической нагрузке

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

АЙМАШЕВА НАДЕЖДА ПЕТРОВНА

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ФОРМИРОВАНИИ ПРЯМЫХ И ПЕРЕКРЕСТНЫХ ЗАЩИТНЫХ ЭФФЕКТОВ АДАПТАЦИИ К

ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ

14.00.16 - патологическая физиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор медицинских наук И.Ю. Малышев.

Ч\ \

Москва -1999

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

АФН - адаптация к физической нагрузке

АТФ - аденозинтрифосфат

АКТГ - аденокортикотропный гормон

ДНК - дизоксирибонуклеиновая кислота

ДНКЖ - динитразильный комплекс железа

ДЭТК - диэтилдетиокарбомат

ЖЕ Л - жизненная емкость легких

ИСФ -интенсивность сократительной функций

ИФС - интенсивность функционирования структур

КА - катехоламины

КОС -кислотно-основные свойства крови МВД -максимальная вентиляция легких МНКЖ -мононитразильный комплекс железа МОД - минутный обьем дыхания МОК - минутный обьем крови МПК - максимальное потребление кислорода М-РНК - матричная рибонуклеиновая кислота ПОЛ - перекисное окисление липидов РНК - рибонуклеиновая кислота СОЭ - скорость оседания эритроцитов СПР - саркоплазматический ретикулум ОФН - острая физическая нагрузка ц-АМФ - циклический аденозинмонофосфат ЧСС - частота сердечных сокращений ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

СаМ - кальмодулин

EDRF - эндотелий-зависимый фактор расслабления

HSP70 - белки теплового шока

IFN-y - интерферон-у

IL - интерлейкин

GC - гуанилатциклаза

cGMF - циклический аденозинмонофосфат

L-NNA -L-нитроаргенин

LPS - липополисахариды

NFkB - фактор транскрипции

NO - оксид азота

NOS - NO-синтаза

RS-NO - S-нитрозотиолы

FAD - флавинадениндинуклеотид

FMN - флавинмононуклеотид

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ................................................................................6

ГЛАВА 1. ЫО-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К

ФИЗИЧЕСКИМ НАГРУЗКАМ. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Молекулярные механизмы адаптации к физическим нагрузкам... 11

1.2. Прямые и перекрестные защитные эффекты адаптации к физическим нагрузкам...................................................................18

1.3. Механизмы биосинтеза N0 и его роль в регуляции физиологических систем организма..........................................................................23

1.4. N0 и адаптация к физическим нагрузкам....................................29

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........36

2.1. Методика проведения адаптации к физической нагрузки...............37

2.2. Методика проведения острой физической нагрузки......................38

2.3. Методика проведения острого иммобилизационного стресса........38

2.4. Методика проведения острой гипоксии.......................................39

2.5. Методика измерения продукции N0 в организме крыс..................39

2.6. Методика оценки содержания НвР70 в органах крыс. Электрофорез и иммуноблотинг...........................................................................41

2.7. Методика введения донора N0, ДНКЖ и блокатора ЫО-синтазы, ЬЫЫА...........................................................................................43

2.8. Методика исследования экспрессии генов Са2+АТФ-азы СПР.........44

2.9. Статистическая обработка результатов.......................................46

ГЛАВА 3. ВЫБОР СХЕМЫ АДАПТАЦИИ К ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ И ТЕСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ОСТРОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ..................................................47

ГЛАВА 4. ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДУКЦИИ N0 В РАЗНЫХ ОРГАНАХ

КРЫС ПРИ ОСТРОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ И В ПРОЦЕССЕ АДАПТАЦИИ К ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ...........51

4.1. Влияние острой физической нагрузки и адаптации к физической нагрузке на продукцию N0 в органах крыс.........................................51

4.2. Обсуждение............................................................................53

ГЛАВА 5. РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ПРЯМОМ ЗАЩИТНОМ ЭФФЕКТЕ АДАПТАЦИИ К ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ.............57

5.1. Влияние донора N0 и блокатора КЮ-синтазы на устойчивость животных к острой физической нагрузке и на формирование адаптации к физической нагрузке....................................................59

5.2 Воспроизведение донором N0 прямого защитного эффекта адаптации к физической нагрузке....................................................61

5.3 Влияние блокатора ЫО-синтазы на накопление белков НЭР70 в скелетной мышце при адаптации к физической нагрузке.....................62

5.4. Влияние донора N0 на экспрессию гена скелетной Са2+АТФ-азы СПР.............................................................................................64

5.5. Обсуждение............................................................................67

ГЛАВА 6. РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ПЕРЕКРЕСТНЫХ ЗАЩИТНЫХ ЭФФЕКТАХ АДАПТАЦИИ К ФИЗИЧЕСКИМ НАГРУЗКАМ.....................................................................70

6.1. Влияние донора N0 и блокатора ЬЮ-синтазы на антигипоксический эффект адаптации к физической нагрузке.........................................70

6.2. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на антистрессорный эффект адаптации к физической нагрузке.........................................72

6.3. Обсуждение............................................................................76

ВЫВОДЫ..........................................................................81

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................83

ВВЕДЕНИЕ

Адаптация к физическим нагрузкам составляет один из главных компонентов подготовки спортсменов, военных и людей других специальностей, связанных с необходимостью выполнять тяжелую физическую нагрузку в нормальных и стрессорных условиях. Различные аспекты адаптации к физическим нагрузкам широко изучает спортивная медицина. Это связано с бурным ростом современного спортивного мастерства, увеличением объема и интенсивности тренировочных нагрузок (З.С.Миронова, Р.И.Миркулова, 1982).

Кроме того, благодаря формированию целого спектра защитных перекрестных эффектов, адаптация к физическим нагрузкам используется как весьма эффективный способ профилактики и лечения различных заболеваний (М.Г.Пшенникова, 1994). Так, например, известно, что такая адаптация увеличивает резистентность организма к недостатку кислорода, защищает органы от стрессорных повреждений, повышает устойчивость сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям, активирует локальные механизмы защиты внутриклеточных структур и т.д (Ф.З.Меерсон, 1993).

Известно, что в образовании защитных эффектов адаптации к физическим нагрузкам вовлечены практически все основные системы организма: нервная, эндокринная, сердечно-сосудистая, дыхательная, мышечная т.д.(А.С.Чинкин, 1995). Поэтому при анализе защитных эффектов такой адаптации необходимо обратить особое внимание на наиболее общие звенья регуляции этих систем.

Согласно современным представлениям, таким универсальным регулятором является оксид азота (N0) (5.Мопсас1а,1994). Доказано,

что N0 вовлечен в образование внутриклеточных защитных механизмов при разных типах адаптации. Например, в последнее время стало известным, что N0 участвует в активации протекторных стресс-белков из семейства Н8Р70 (1.У.Ма1у51пеу е1а1., 1995, 1996) и в регуляции внутриклеточного транспорта Са2+. Соответственно, можно предположить, что ЫО-зависимая активация протекторных стресс-белков из семейства НЭР70 и увеличение мощности систем транспорта Са2+ играет важную роль в адаптации к физической нагрузке.

Актуальность данной работы определяется тем, что она посвящена исследованию роли N0 в развитии защитных эффектов адаптации к физической нагрузке.

Сопоставление физиологических эффектов адаптации к физической нагрузке и N0 наводит на мысль о вовлечённости N0 в структурные и функциональные изменения, происходящие в организме в процессе адаптации. Тем не менее, вопрос об участии систем генерации N0 в развитии адаптационных изменений организма до сих пор не изучался.

В соответствии с этим, цель настоящей работы состояла в изучении роли N0 в формировании прямых и перекрёстных эффектов адаптации к физической нагрузке.

В рамках этой цели решались следующие основные задачи:

1. Выбор модели адаптации к физической нагрузке.

2. Измерение продукции N0 в органах крыс при острой физической нагрузке и в процессе адаптации к физической нагрузки.

3. Оценка влияния донора N0 и блокатора МО-синтазы на устой-

чивость к острой физической нагрузке и формирование адаптации к физической нагрузке.

4. Изучение возможности воспроизведения донором N0 прямого защитного эффекта адаптации к физической нагрузке.

5. Исследование влияния блокатора ЫО-синтазы на накопление белков Н8Р70 в скелетной мышце при адаптации к физической нагрузке.

6. Оценка влияния донора N0 на экспрессию Са2+-АТФазы СПР в скелетной мышце.

7. Изучение влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на анти-гипоксический эффект адаптации к физической нагрузке.

8. Исследование влияние донора N0 и блокатора ГМО-синтазы на антистрессорный эффект адаптации к физической нагрузке.

Научная новизна исследования заключается в следующем:

Установлено, что острая физическая нагрузка в стрессорных условиях вызывает падение продукции N0 как в печени, так и в мозге. Впервые показано, что уже на ранних этапах адаптации к физическим нагрузкам происходит увеличение продукции N0 в печени, без изменений в мозге. Однако при острой физической нагрузке мозг оказался наиболее защищен от резкого падения продукции N0, как это наблюдалось в печени.

Кроме того, впервые показано, что донор N0 повышает, а блока-тор ЫО-синтазы предупреждает развитие прямого и перекрестных (антистрессорного и антигипоксического) защитных эффектов адаптации к физическим нагрузкам. Установлено также, что курсовое введение донора N0 само по себе, без адаптации, воспроизводит как прямой, так и перекрёстные защитные эффекты адаптации к физической

нагрузке.

Вместе с тем, продемонстрировано, что адаптация к физической нагрузке сопровождается накоплением Н8Р70 в скелетной мышце. Блокатор синтеза N0 ограничивал как накопление Н8Р70, так и развитие защитных эффектов адаптации. Также, впервые установлено, что N0 может усиливать экспрессию гена Са2+-АТФазы СПР скелетных мышц.

Теоретическое значение работы заключается в доказательстве участия N0 в формировании адаптационной защиты от повреждений, вызванных острой физической нагрузкой, острой гипоксией и стрессом. Продемонстрирована важная роль МО-зависимой активации синтеза НЭР70 в формировании прямых и перекрестных эффектов адаптации к физической нагрузке и ЫО-зависимой активации экспрессии Са2+-АТФазы СПР .

Практическое значение работы состоит в том, что ее результаты открывают перспективы создания нового класса фармацевтических препаратов, на основе доноров N0. В перспективе эти препараты могут использоваться для повышения спортивной работоспособности, устойчивости к тяжелой физической работе в стрессорных ситуациях и при недостатке кислорода. Кроме того, результаты работы создают основу для поиска новых подходов к управлению адаптацией, с помощью направленного воздействия на системы генерации N0, в профилактической медицине и оздоровительной физической культуре.

Положения, выносимые на защиту:

1. Адаптация к физической нагрузке увеличивает активность систем генерации N0 и предупреждает падение продукции N0 при острой физической нагрузке . На ранних этапах это особенно выражено в

мозге. Это свидетельствует о нормализующем влиянии адаптации к физической нагрузке на системы генерации N0.

2. NO-зависимые механизмы участвуют в формировании прямого и перекрёстных антистрессорного и антигипоксического эффектов адаптации к физической нагрузке.

3. NO-зависимая активация синтеза защитных стресс-белков HSP70 у адаптированных крыс может составлять важный механизм защиты клеток при формировании прямых и перекрестных эффектов адаптации к физической нагрузке.

4. N0 контролирует транспорт Са2+ в клетке посредством влияния на экспрессию гена SERCA1 скелетной мышцы. Этот механизм может лежать в основе защитных эффектов доноров N0 и NO-зависимых механизмов адаптации к физическим нагрузкам.

Апробация работы:

Основные результаты проведенных исследований были представлены на Международном Симпозиуме «Biological Chemistry and Cellular Targets of nitric oxide» (Грац, Австрия, 1998); на 5 Всемирном конгрессе по адаптационной медицине (Фрамингам, США, 1997); на 6-м международном конгрессе «Biology of Nitric Oxide» (Стокгольм, Швеция, 1999); на международном конгрессе «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (Минск, Белоруссия, 1999). На кафедре медико-биологических наук филиала Волгоградской академии физической культуры и спорта в Набережных Челнах (Набережные Челны, Россия, 1999) и на межлабораторной конференции в НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (Москва, 1999).

ГЛАВА 1. МО-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ФИЗИЧЕСКИМ НАГРУЗКАМ.(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Молекулярные механизмы адаптации к физическим нагрузкам.

Адаптацию в целом, как процесс приспособления организма к внешней среде и к внутренним изменениям организма подразделяют на два типа: генотипическую и фенотипическую (Ф.З.Меерсон, 1986). В процессе адаптации к любому фактору среды выделяют два основных этапа: начальный этап - срочная, но не совершенная адаптация и последующий этап - долговременная, устойчивая адаптация (Ф.З.Меерсон, М.Г.Пшенникова, 1988). Срочная адаптация реализуется мгновенно, но реакция организма протекает с утратой резервов, с кратковременным результатом и сопровождается выраженной стресс-реакцией. Развитие адаптации к любому фактору сопровождается повышением способности ограничивать стресс-реакцию, увеличением мощности стресс-реализующих и стресс-лимитирующих систем (Ф.З.Меерсон, 1986). Долговременная, устойчивая адаптация характеризуется более своевременной, экономной реакцией организма на данный фактор среды, отсутствием выраженной стресс-реакции и возможностью нормальной жизнедеятельности в условиях действия этого фактора. В основе перехода срочной адаптации в долговременную лежит обеспечиваемое активацией синтеза нуклеиновых кислот и белков формирование разветвленного структурного "следа" в функциональной системе, ответственной за адаптацию к данному фактору среды (Ф.З.Меерсон, 1993).

Установлено, что адаптация ко многим повторным воздействиям

среды имеет прямые и перекрестные защитные эффекты, формирующиеся как на системном, органном и внутриклеточном уровне (Ф.З.Меерсон, М.Г.Пшенникова, 1988). Прямой защитный эффект -ситуация, когда адаптация к умеренному действию определенного фактора предупреждает повреждения организма большой дозой того же фактора. Перекрестный защитный эффект адаптации - ситуация, когда адаптация к действию определенного фактора повышает резистентность организма к повреждающему действию совершенно других факторов. Образование защитных эффектов легло в основу развития адаптационной медицины. В современной адаптационной медицине используют различные факторы внешней среды.

Применительно к физическим нагрузкам, общим признаком долговременной адаптации является изменения структуры и массы органов и увеличение физиологической мощности функциональных систем, ответственных за адаптацию. При повторных воздействиях раздражителя структурный след закрепляется. Этому способствует увеличение синтеза нуклеиновых кислот и белка в активно функционирующей клетке (Ф.З.Меерсон, 1993).

Известно также, что уже на ранних этапах адаптации к физическим нагрузкам, на клеточном уровне, происходит интенсивный биосинтез по цепочке ДНК-РНК-белок. Начинает увеличиваться биомасса органа, активируется система передачи регуляторных сигналов через аденилатциклазу. Под действием сигнала извне концентрация АМФ возрастает в 10-20 раз (Н.А.Фомин, В.П.Филин, 1986).

Первоначально, достижение адаптивного эффекта на ранних стадиях адаптации обеспечивается усиленной продукцией гормонов системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники (САЭ^аИз, 1996). На срочном этапе адаптации в ответ на нагрузку происходит интенсив-

ное, избыточное по своему пространственному распространению (ир-радиирующее) возбуждение корковых, подкорковых и нижележащих двигательных центров, которому соответствует генерализированное, с мобилизацией "излишних мышц", но недостаточно координированная двигательная реакция (Н.В.Зимкин, 1969, 1984). При этом нейро-генно детерминированная активация гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и адренергической стресс-реализующих систем, носит интенсивный нередко избыточный характер и сопровождается ярко выраженной стресс-реакцией. Это проявляется в значительном по величине и длительности высвобождении стресс гормонов и медиаторов, в т.ч. кортиколиберина, АКТГ, соматолиберина, соматотро-пина и других тропных гормонов (R.Shephard, 1975; А.А.Виру, 1983), катехоламинов и кортикостероидов, что приводит к изменению секреции гормонов следующей линии регуляции. Катехоламины через аль-фа-адреноцепторы и бетта-рецептор-аденилациклический комплекс стимулируют ключевые ферменты гликолиза, гликогенолиза, липоли-за и приводят к мобилизации углеводных и жировых депо (А.А.Виру, 1983; K.Carlson, 1985). Кроме того, через те же механизмы катехоламины стимулируют сократительную функцию сердца (М.Г.Пшенникова, 1979), облегчают нервно-мышечную передачу и увеличивают силу сок�