Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:NO-зависимые механизмы прямых и перекрестных эффектов адаптации к стрессу

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ ВЛАДИМИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи МАЛЕНЮК ЕВГЕНИЙ БОРИСОВИЧ

Ш-ЗАьИСИМЫь МьХАНИЗМЫ ПниМЫХ И ПЕРЕКРЕСТНЫХ ЭФФЕКТОВ АДАПТАЦИИ К СТРЕССУ.

14.00.16. - патологическая физиология 03.00.04- биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г\

ч \ VI м

Научные руководители: доктор медицинских наук Малышев И. Ю. доктор медицинских наук, профессор Ларионов Н. П.

Москва -1999

Список сокращений.

АДФ - аденозиндифосфат

Г-ЗФДГ - глицеральдегид-Зфосфатдегидрогеназа

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДНКЖ- динитрозильные комплексы железа

ДЭТК - диэтилдитиокарбамат

Fvlg-ГТФ - Мд-гуанозин 5'-фосфат

МНКЖ- мононитрозильные комплексы железа

Н4В - тетрагидробиоптерин

СаМ - кальмодулин

СПР - саркоплазматический ретикулум

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

EDRF - эндотелиальный фактор расслабления

HSP70 - белки теплового шока

IFN-y - интерферон-у

IL - интерлейкин

L-NAME - метиловый эфир L-аргинина

L-NMMA - L-метиларгинин

L-NNA - L-нитроаргинин

LPS - липополисахариды

NFkB - фактор транскрипции

N0 - оксид азота

NOS - NO-синтаза

RS-NO - S-нитрозотиолы

SH - сульфгидрильные группы

TNF-a - фактор некроза опухоли

Оглавление. .

Стр.

Введение................................................................6

Глава 1. Прямые и перекрёстные защитные эффекты адаптации к стрессу. (Обзор литературы).... 10

1.1. Определения и основные понятия адаптационной медицины.....10

1.2. Адаптация к стрессорным ситуациям и её молекулярные механизмы.............................................................................12

1.3. Прямой защитный эффект адаптации к стрессорным ситуациям..................................................................................14

1.4. Перекрёстные защитные эффекты адаптации к стрессорным ситуациям...............................................................................15

Глава 2. Оксид азота: физиология и патофизиология. (Обзор литературы).................................................18

2.1. Общая химия оксида азота. Продукция и регуляция синтеза

N0 в организме.........................................................................19

2.1.1. Общая химия оксида азота.........................................................19

2.1.2. Биосинтез оксида азота........................................................21

2.1.3. Регуляция активности Ми-синтазы в организме..................•......24

2.2. Молекулярные мишени N0........................................................27

2.2.1. N0 и сердечно-сосудистая система.........................................28

2.2.2. N0 в центральной и периферической нервной системе...............30

2. 2. 3. N0 и иммунная система.........................................................32

2.2.4. Патологические эффекты N0................................................32

2.3.Оксид азота как важный фактор активации эндогенных защитных систем организма........................................................35

2.4. Роль N0 в образовании стресорных язв желудка и ишемическсм

повреждении сердца....................................................................36

Глава 3. Материалы и методы исследования..................40

3.1. Методика проведения адаптации к стрессу...............................42

3.2. Методика проведения острого иммобилизационного стресса......42

3.3. Методика измерения продукции N0 в организме крыс................43

3.4. Методика перфузии изолированного сердца и оценки

его сократительной и электрической функции.................................43

3.5. Методика создания ишемических и реперфузионных повреждений сердца...................................................................45

3.6. Методика введения донора N0 и блокатора ЫО-синтазы............46

3.7. Методика исследования экспрессии генов Са2+-АТФ-азы СПР.....47

3.8. Статистическая обработка результатов....................................49

Глава 4. Выбор новой схемы адаптации к стрессу...........50

Глава 5. Измерение продукции N0 в разных органах крыс при остром стрессе и адаптации к стрессу......................57

5.1. Влияние острого иммобилизационного стресса

на продукцию N0 в органах крыс...................................................57

5.2. Динамика продукции N0 в органах крыс в ходе

адаптации к стрессу....................................................................59

5.3. Обсуждение..........................................................................61

Глава 6. Роль оксида азота в адаптационной

защите желудка от стресс-индуцированных язв..............65

6.1. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на устойчивость желудка к стресс-индуцируемым язвам.....................66

6.2. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на противоязвенный эффект адаптации к стрессу...............................68

6.3. Воспроизведение донором N0 прямого противоязвенного защитного эффекта адаптации к стрессу.......................................70

6.4. Обсуждение..........................................................................72

Глава 7. Роль оксида азота в кардиопротекторном эффекте адаптации к стрессу.....................................74

7.1. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на устойчивость изолированного сердца к тотальной ишемии

и реперфузии............................................................................75

7.2. Влияние донора N0 и блокатора ЫО-синтазы на кардиопротекторный эффект адаптации к стрессу.........................80

7.3. Воспроизведение донором N0 перекрёстного кардиопротекторного эффекта адаптации к стрессу.......................82

7.3.1. Донор N0 ДНКЖ воспроизводит кардиопротекторный эффект адаптации к стрессу..................................................................82

7.3.2. Донор NО ДНКЖ обладает дозо- и времязависимым кардиопротекторным эффектом................................................84

7.3.3. Кардиопротекторный эффект донора N0 ДНКЖ осуществляется за счёт N0......................................................88

7.4. Влияние донора N0 на экспрессию генов

миокардиальной Са2+-АТФ-азы СПР.............................................89

7.5. Обсуждение.........................................................................92

Выводы.....................................................................

Литература................................................................97

Введение

Стрессорные ситуации, являющиеся постоянными спутниками человека в современном мире, составляют одну из важных причин заболеваний органов сердечно-сосудистой, пищеварительной и многих других систем организма.

Исследования последних десятилетий показали, что устойчивость организма к повреждающим факторам среды можно существенно увеличить с помощью адаптации к кратковременным стрессорным воздействиям (7).

Актуальность данной работы определяется тем, что она посвящена изучению роли оксида азота (N0) в формировании прямых и перекрёстных защитных эффектов адаптации к стрессу.

Показано, что в основе защитных эффектов адаптации лежит активация ГАМК-ергической, опиоидергической, антиоксидантной и других центральных и локальных стресс-лимитирующих систем (18). Адаптация к стрессу обладает прямым и перекрёстным защитными эффектами, которые в частности выражаются увеличением резистентности слизистой желудка к язвенным поражениям и сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям, соответственно (8,18). Анализируя механизмы защитных эффектов адаптации к стрессу необходимо учитывать современные данные о том, что универсальным мессенджером, участвующим в большом количестве физиологических и патофизиологических процессов, является N0 (80). Имеются многочисленные факты о том, что N0 является вазодилятатором (58,81,82,133,), уменьшает адгезию и агрегацию тромбоцитов (169,141), стимулирует синтез антиоксидантных ферментов (28,143), белков теплового шока (105,106), ограничивает выброс катехоламинов (148) и т.д.

Дальнейшее сопоставление физиологических эффектов адаптации к стрессу и N0 наводит на мысль о вовлечённости N0 в структурные и функциональные изменения, происходящие в организме в процессе адаптации.

Тем не менее, вопрос об участии систем генерации N0 в формировании адаптационных изменений организма до сих пор не изучался.

В соответствии с этим, цель настоящей работы состояла в изучении роли N0 в формировании прямых и перекрёстных эффектов адаптации к стрессу.

В рамках этой цели решались следующие основные задачи:

1. Оценить влияние острого иммобилизационного стресса на продукцию N0 в органах крыс. .

2. Оценить влияние адаптации к стрессу на продукцию МО в органах

крыс.

3. Оценить влияние донора N0 и блокатора МО-синтазы на устойчивость к язвам при остром стрессе.

4. Оценить влияние донора N0 и блокатора МО-синтазы на противоязвенный эффект адаптации к стрессу.

5. Оценить влияние донора N0 и блокатора МО-синтазы на устойчивость изолированного сердца к тотальной ишемии и реперфузии.

6. Оценить влияние донора N0 и блокатора МО-синтазы на кардио-протекторный эффект адаптации к стрессу.

7. Оценить влияние донора МО на экспрессию гена миокардиальной Са2+-А.ТФ-азы С ПР.

8. Оценить возможность воспроизведения донором N0 прямого противоязвенного и перекрёстного кардиопротекторного эффектов адаптации к

ЛТ'ИЧ Л Л/Ч1 (

О! ¡лгооу.

Научная новизна исследования заключается в следующем: Впервые показано, что длительный иммобилизационный стресс вызывает падение продукции N0 как в печени, так и в мозге.

Установлено, что адаптация к стрессу ограничивает стресс-индуцированное падение продукции N0 в печени, а в мозге - нет. Таким образом, влияние адаптации к стрессу на системы генерации N0 является органоспецифичным.

Установлено, что блокатор МО-синтазы предупреждает развитие как прямого противоязвенного, так и перекрёстного кардиопротекторного защитных эффектов адаптации к стрессу.

Показано., что курсовое введение донора N0 само по себе, без адаптации, воспроизводит как прямой, так и перекрёстный защитные эффекты адаптации к стрессу.

Впервые установлено, что N0 может усиливать экспрессию гена Са2+-АТФ-азы СПР миокарда.

Теоретическое значение работы заключается в доказательстве важной роли N0 в адаптационной защите органов от стрессорных и ишеми-ческих повреждений.

Практическое значение работы состоит в том, что ее результаты открывают перспективы создания нового класса лекарственных препаратов на основе динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), в качестве факторов профилактики и терапии стрессорных и ишемических повреждений органов. Кроме того, результаты работы создают основу для поиска новых подходов к управлению процессом адаптации организма к стрессу с помощью направленного воздействия на системы генерации N0.

Положения, выносимые на защиту:

1. Адаптация к иммобилизационному стрессу увеличивает активность систем генерации N0 и уменьшает степень падения продукции N0 при остром стрессе.

2. Ш-зависимые механизмы участвуют в формировании прямого противоязвенного и перекрестного кардиопротекторного эффектов адаптации к стрессу.

3. N0 контролирует транспорт Са2+ в клетке посредством влияния на экспрессию гена Са2+-АТФ-азы СПР миокарда. Этот механизм может лежать в основе кардиопротекторных эффектов доноров N0 и МО-зависимых механизмов ад а пта ции.

Апробация работы: Основные результаты проведенных исследований были представлены на 2-й международной конференции «Гипоксия в медицине» (Москва, 1996); на 4-м (Чандигар, Индия 1995) и 5-м (Фрамингам, США 1997) международных конгрессах по адаптационной медицине; на международной конференции "Биохимия и молекулярная биология оксида азота" (Лос-Анджелес, США 1996); на 3-м международном

симпозиуме /'Свободные радикалы в биологии и медицине (София, Болгария 1997); конференции молодых учёных (ВГПУ 1997), а также на межлабораторных конференциях в НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН.

Глава 1. Прямые и перекрёстные эффекты адаптации

к стрессу.

(Обзор литературы)

1.1. Определения и основные понятия адаптационной

медицины.

Способность организма адаптироваться к недостатку пищи и воды, холоду и жаре, физическим и интеллектуальным нагрузкам и, наконец, к безвыходным стрессорным ситуациям на протяжении всей эволюции Homo sapiens обеспечили выживание человека и человечества в целом в тяжёлых неблагоприятных условиях окружающей среды.

Существует генотипическая адаптация,-в результате которой на основе наследственности, мутаций и естественного отбора формировались современные виды животных и растений. Генотипическая адаптация стала основой эволюции, потому что её достижения закреплены генетически и передаются по наследству. Генотип становится исходным пунктом следующего этапа адаптации, приобретаемого в процессе индивидуальной жизни. Эта индивидуальная или фенотипическая адаптация формируется в процессе взаимодействия особи с окружающей средой и обеспечивается глубокими структурными изменениями организма. Такие приобретённые в процессе индивидуальной жизни изменения развиваются за счёт изменения экспрессии генов (6).

В понимании механизмов фенотипической адаптации и становлении новой науки - адаптационной медицины огромную роль сыграли исследования Ф. 3. Меерсона и его школы. Благодаря этим исследованиям был обобщён мировой опыт и введены основные понятия концепции адаптации организма: 1. Срочная адаптация - немедленный ответ организма на действие внешнего фактора; осуществляется путём ухода от фактора (избегание,

избавление) или мобилизацией функций, которые позволяют существовать, несмотря на действие фактора.

2. Долговременная адаптация - постепенно развивающийся ответ организма на многократное или длительное действие внешнего фактора; обеспечивает осуществление реакций, которые ранее были невозможны и существование в условиях, которые ранее были несовместимы с жизнью.

3. Доминирующая адаптационная система - система нервных центров, эндокринных желез и исполнительных органов, которые обеспечивают адаптацию.

4. Системный структурный след - комплекс структурных изменений, развивающийся в доминирующей системе за счёт селективной экспрессии генов и роста клеточных структур; составляет материальную основу устойчивой адаптации.

5. Стресс-реакция как звено адаптации. Это положение подразумевает, что стресс-реакция - необходимое звено, играющее роль в формировании системного структурного следа. После завершения формирования системного структурного следа и устойчивой адаптации, стресс-реакция исчезает.

6. Стресс-лимитирующие системы организма - центральные и локальные регуляторные системы организма, сопряжённые со стресс-реал изующей системой; ограничивают стресс-реакцию на уровне мозга и эффекты стрессорных гормонов и медиаторов на уровне органов-мишеней, предупреждают стрессорные повреждения.

7. Прямой защитный эффект адаптации - ситуация, когда адаптация к умеренному действию определённого фактора предупреждает повреждение организма большой дозой того же самого фактора.

8. Перекрёстный защитный эффект адаптации - ситуация, когда адаптация к действию определённого фактора повышает резистентность организма к повреждающему действию совершенно других факторов.

1.2. Адаптация к стрессорным ситуациям и её молекулярные механизмы.

Адаптацию к стрессорным ситуациям можно обозначить как процесс, обеспечивающий сохранение жизни, активную деятельность организма и предупреждение его заболеваний в опасных потенциально повреждающих ситуациях, которые не могут быть преодолены путём простых реакций избегания, избавления или путём специфического приспособления к какому-либо физическому, химическому или биологическому фактору (7).

Внешне такая адаптация выражается двумя хорошо воспроизводимыми явлениями. Во-первых, трансформацией поведения, в результате которой специализированная работа людей или сложные поведенческие навыки животных становятся вполне возможными, несмотря на опасность, например на высоте, в космосе, в военной обстановке, или, несмотря на прямое действие таких факторов, как боль, холод и т. д. Во-вторых, тем, что эмоционально-болевые стрессорные ситуации, которые ранее закономерно вызывали повреждения совершенно определённых систем и органов, после развития адаптации утрачивают способность вызывать такие повреждения (7).

Поскольку успешная деятельность в экстремальных природных и социальных условиях, а также профилактика в этих условиях основных неинфекционных болезней относятся к числу важных задач, выдвигаемых современным этапом цивилизации, то понятно, что изучение адаптации к стрессорным ситуациям и управление этим процессом являются одной из главных целей современной физиологии и медицины.

Процесс адаптации к стрессорным ситуациям характеризуется двумя основными чертами (8,18). Во-первых, данный процесс происходит в условиях, когда выход из стрессорной ситуации за счёт внешней поведенческой адаптации невозможен и представляет собой своеобразную внутреннюю адаптацию к безвыходным на первый взгляд ситуациям - вероятный физиологический эквивалент того, что в обычной жизни обозначается как терпение или выдержка. Во-вторых, прекращение возбуждения стресс-реализующих

систем, разбивающееся в процессе адаптации к стрессорным ситуациям, означает снижение концентрации катехоламинов, действующих на органы-мишени и в сочетании с десенситизацией уменьшает вероятность стрессор-ных повреждений внутренних органов (18).

При анализе этих фактов была выдвинута гипотеза (8), суть которой состоит в том, что одним из важных механизмов адаптац