Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:NO-зависимые механизмы фармакологической регуляции артериального давления в эксперименте

На правах рукописи

Тыртышшгкова Анна Владимировна

Ж)-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология 03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток — 2011

1 с 2СТТ

4853867

Диссертация выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Елисеева Екатерина Валерьевна Научный консультант:

Доктор медицинских наук Дюйзен Инесса Валерьевна Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии с курсом иммунологии Юшков Владимир Викторович, Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Матвеева Наталья Юрьевна, Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита диссертации состоится 11 г. в {0_ часов на

заседании диссертационного совета Д 20^.007.03 при Владивостокском государственном медицинском университете (690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2)

Автореферат разослан <<JU » L- 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Jj /

доктор медицинских наук, профессор /О Ж^/^И^Просекова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Важнейшими патогенетическими звеньями в развитии артериальной гипертензии (АГ) являются увеличение активности симпато-адре-наловой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем, а также дисбаланс эндотелиозависимых механизмов (Шляхто Е.В., Конради А.О., 2003; Paul. L Huang., 2000; Rahn K.Y., 2000). Избыточная активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РАСС) приводит не только к задержке натрия и воды в организме, но и к изменениям органов-мишеней — сердца, почек, мозга и периферических сосудов (Манухина Е.Б., 2002; Guyenet G.,2006).

Открытие молекулы оксида азота (NO) позволило по-новому взглянуть на механизмы патогенеза АГ и наметить новые мишени фармакологического действия гипотензивных препаратов. Выявление роли NO в нейрогенной, гуморальной и эндотелиальной регуляции артериального давления (АД) открыло широкие перспективы для разработки новых подходов к фармакологической коррекции гипертензивного синдрома (Дупляков Д.В., Емельяненко В.М., 2001; Моисеева О.М. и соавт., 2003; Покровский В.И., Виноградов В.А., 2005). Известно, что взаимодействие симпато-адреналовой и NO-ергической систем на разных уровнях нейро-эндокринного контроля АД имеет специфические черты и может проявляться развитием как антагонистических, так и синергических модулирующих эффектов (Shaohua Ye et al., 1997; 2006). Взаимомодулирующие отношения между РААС и системой синтеза NO имеют свои особенности в зависимости уровня их реализации, стадии развития гипертонической болезни и характера проводимой лекарственной терапии.

Изученные к настоящему времени эффекты NO-зависимой модуляции АД и фармакологического действия антигипертензивных средств ограничивается изучением регулирующего влияния NO на эндотели-альные механизмы регуляции сосудистого тонуса (Соболева Г.Н. и соавт., 2001; Галявич A.C., 2007). Кроме того, в доступных источниках представлены данные об NO-зависимых механизмах действия лишь некоторых гипотензивных препаратов (Галявич A.C., 2007). В этой связи детальное исследование NO-ергических процессов, протекающих на различных уровнях функциональной системы регуляции АД при его эндогенных и фармакологически индуцированных сдвигах, считается весьма актуальным, поскольку позволит выявить новые патогенетические механизмы формирования гипертензивного синдрома и возможные мишени его лекарственной терапии. Кроме того, выяв-

ление ТЧО-модулирующего компонента в спектре фармакологических эффектов известных антигипертензивных препаратов позволит объяснить некоторые особенности реализации их основных и побочных эффектов, а также наметить пути усовершенствования их химического состава путем включения селективных ]ЧО-модулирующих компонентов.

Цель исследования: определить значение нитроксидергического механизма в реализации фармакологических эффектов ингибитора анги-отензинпревращающего фермента (иАПФ), р-адреноблокатора и бло-катора кальциевых каналов при экспериментальной нефрогенной ги-пертензии.

Задачи исследования:

1. Установить гистохимическую локализацию NADPH-диaфopaзы (КАРРН-с!) в ядрах гипоталамуса и продолговатого мозга, сосудах мышечного (внутренней сонной и базиллярной артерий) и эластического (аорты) типа, нейронах мозгового вещества надпочечников в условиях физиологической нормы и при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

2. Изучить характер изменений МО-ергической активности в указанных клеточных элементах животных с экспериментальной нефрогенной гипертензией под действием Р-адреноблокатора.

3. Определить активность NADPH-d в указанных структурах экспериментальных животных под действием ингибитора АПФ.

4. Установить динамику ТЧО-ергической активности в ядрах гипоталамуса и продолговатого мозга, сосудах мышечного и эластического типа, нейронах мозгового вещества надпочечников под влиянием бло-катора кальциевых каналов.

5. Обосновать значение центральных и периферических МО-ерги-ческих механизмов в реализации фармакологических эффектов гипотензивных препаратов при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

Научная новизна

В условиях моделирования экспериментальной нефрогенной гипертензии у лабораторных животных установлена гистохимическая локализация ЫАОРН-с1 и проведено гистохимическое исследование динамики активности фермента синтеза N0 в центральных и периферических структурах, причастных к регуляции сердечно-сосудистой системы. Показано, что формирование АГ, инициированное химической деструкцией части почечной паренхимы, сопровождается динамическими и селективными изменениями >Ю-ергической активности нейронов гипоталамуса, продолговатого мозга, мозгового вещества над-

почечников, эндотелиальных клеток сосудов. Установлено >Ю-моду-лируюшее действие антигипертензивных препаратов из группы ингибиторов АПФ, р-адреноблокаторов и блокаторов кальциевых каналов. Полученные данные позволяют уточнить роль центральных и периферических ЫО-ергических механизмов в патогенезе нефрогенной ги-пертензии и значение N0 в реализации фармакологических эффектов гипотензивных препаратов указанных групп.

Теоретическая и практическая значимость работы

В ходе работы получены новые факты, расширяющие представление о нейрохимических механизмах регуляции артериального давления. Показано значение центральных и периферических МО-зависимых механизмов в динамике развития экспериментального гипертен-зивного синдрома. Полученные в эксперименте данные о влиянии ингибиторов АПФ, р-адреноблокаторов и блокаторов кальциевых каналов на МО-ергическую активность нейронов вазомоторных центров головного мозга, эндотелиальных клеток сосудов мышечного и эластического типа, нейронов мозгового вещества надпочечников позволяют обосновать значение МО-ергического механизма в реализации центральных и периферических эффектов гипотензивных препаратов, а также разработать патогенетические обоснованные подходы к коррекции нарушений АД.

Полученные в ходе работы данные используются в лекционном курсе и в материалах практических занятий на кафедрах общей и клинической фармакологии, гистологии, патологической физиологии и при базовой и последипломной подготовке врачей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Регуляция артериального давления в условиях нефрогенной экспериментальной гипертензии обеспечивается центральными и периферическими >Ю-ергическими механизмами.

2. Фармакодинамические эффекты пропранолола, эналаприлата и вера га мила в условиях экспериментальной артериальной гипертензии являются МО-зависимыми и реализуются как на уровне периферической, так и центральной регуляции.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2007,2008, 2009,2010); Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, сентябрь 2007, 2008, 2009, 2010); XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2009, 2010); обществе Специа-

листов по клинической фармакологии Приморского края (Владивосток, ноябрь 2010).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседании проблемной комиссии по морфологии, физиологии и биохимии и по фармакологии, клинической фармакологии и фармации. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе в журналах, рекомендованные ВАК для публикации основных результатов диссертационных исследований: «Тихоокеанский медицинский журнал», Бюллетень Сибирского отделения РАМН.

Личный вклад

Автор участвовал в планировании, постановке цели и задач исследования. Подбор и анализ литературы, проведение экспериментов, статистическая обработка экспериментальных данных и их анализ осуществлялись непосредственно соискателем.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста на русском языке (включая список литературы). Диссертация состоит из введения и 5 глав: обзора литературы (глава 1), материала и методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований (главы 3, 4, 5), заключения, а также выводов и списка литературы, состоящего из 225 источников, в том числе 120 — отечественных и 105 — зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 35 рисунками, включающими 24 графика и 44 микрофотографии.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования были выбраны ядра гипоталамуса, продолговатого мозга, сосуды мышечного и эластического типа, нейроны мозгового вещества надпочечников лабораторных животных.

Исследование выполнено на 90 здоровых белых нелинейных крысах-самцах, массой 200-220 граммов. Работа проводилась в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.) и Стандарта отрасли «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» ОСТ 42-511-99 (утв. Минздравом РФ 29.12.1998 г.). Учитывая этический аспект экспериментального исследования, мы пытались максимально сократить количество используемых в эксперименте животных, оставаясь в рамках статистически репрезентативной группы (по 5 животных в каждой экспериментальной точке). Все крысы были разделены на 4 экспери-

ментальные группы по 20 животных в каждой. Экспериментальная часть работы складывалась из нескольких последовательных этапов:

Экспериментальная модель нефрогенной гипертензии. Для изучения патогенеза АГ используются различные экспериментальные модели. Стойкого повышения АД можно добиться, влияя на различные звенья системы нейрогуморальной регуляции сосудистого тонуса. Поскольку почкам принадлежит ведущая роль в регуляции АД, наиболее часто использовались методы воспроизведения АГ, связанные с различного рода вмешательствами на этих органах. Предпочтение следует отдавать моделям, позволяющим приблизить результаты исследования к клинике и затрагивающим ключевые звенья патогенеза нефрогенной гипертензии такие, как активация прессорной и снижение депрессор-ной гормональной активности почечного эндокринного аппарата.

В нашей работе использована модель экспериментальной нефрогенной гипертензии, разработанная О.В. Тищенко, Е.В. Елисеевой, П. А. Могавкиным (2002). Стойкое повышение АД у животных достигалось в результате разрушения части почечной паренхимы инъекцией 0,1 мл 10% формалина в нижний полюс левой и правой почек. Преимуществами используемой модели являются: простота выполнения (не требует тяжелой полостной операции, как предусматривается при удалении почки или перевязке аорты и почечных артерий); постепенное повышение АД, приводящее к структурным, функциональным и патологическим изменениям органов — мишеней.

Морфологические изменения в почках наблюдались нами уже через неделю после операции. Макро- и микроскопические признаки склерозирования почечной паренхимы и многочисленные кровоизлияния свидетельствуют о повреждении большей части органа, особенно в его нижнем полюсе и средней порции. В этих участках наблюдается изменение цвета почки, сморщивание, уменьшение в размерах. На препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, выявлялись изменения клубочков (некроз капиллярных петель, выраженный отек), которые сочетаются с дистрофией эпителия извитьгх канальцев и многочисленными кровоизлияниями в паренхиме коркового и мозгового вещества. В области верхнего полюса почки склеротические изменения сочетаются с наличием вполне морфологически сохранных участков коркового и мозгового вещества.

Измерение АД у экспериментальных животных проводили 1 раз в неделю в утренние часы с помощью системы неинвазивного монито-рирования кровяного давления ML U/4c 501 (Medlab) и Meter LE-5001 (Испания) методом наложения хвостовой манжеты. Формирование гипертензивного синдрома у экспериментальных животных про-

исходило постепенно, максимального развития уровень АД достигал через 2 месяца после операции, после чего давление стабилизировалось (рис. 1). При введении гипотензивных препаратов исследуемых групп систолическое и диастолическое АД достоверно снижалось.

»56.75-

12^25

ГП

1111

4 неделя АГ Шдиастпичекков Л

6 неделя АГ

Рис. 1. Динамика изменения систолического и диастол ического артериального давления при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

Достоверность различий по отношению к контролю: * - р<0,05

В 1 экспериментальную группу были включены животные (группа АГ), не получавшие лекарственных препаратов. Начиная с 28 дня после операции, животным 2-4 групп проводили фармакологическую коррекцию развивающегося гипертензивного синдрома: 2 группе ежедневно внутримышечно вводили препарат из группы неселективных р-адреноблокаторов пропранолол (2 мг/кг, группа АГ+пропранолол), 3 группе внутрибрюшинно вводили иАПФ эналаприлат (0,3 мг/кт/6 часов, группа АГ+эналаприлат), 4 группе вводили внутримышечно БКК верапамил (0,1 мг/кг, группа АГ+верапамил). В работе использованы препараты из разных фармакологических групп, обладающие неодинаковой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), и, соответственно, проявлять различную степень выраженности Центральных эффектов. Блокатор кальциевых каналов верапамил и Р-адреноблокатор пропранолол хорошо проникают через ГЭБ, хотя механизмы и способы реализации их мозговых эффектов изучены к настоящему времени достаточно фрагментарно. Ингибитор АПФ эналаприлат, по сравнению с другими препаратами данного класса, обладая высокой липофильностью и проходимостью через гистогемати-ческие барьеры, обладает невысокой способностью к преодолению ГЭБ. Однако описанные к настоящему времени «мозговые» побочные эф-

фекты препарата (слабость, головокружение, головная боль), а также полученные в настоящем исследовании сведения о его NO-модулиру-ющих эффектах в гипоталамусе и структурах продолговатого мозга, заставляют пересмотреть данные о фармакокинетике препарата или его основных метаболитов.

Животных выводили из эксперимента на 7,14, 28 и 42 сутки после начала фармакологической коррекции (по 5 крыс в каждой точке). Контролем служили животные сходного возраста, не подвергавшиеся фармакологическим и оперативным воздействиям (п=5). В качестве второго контроля использовались 5 ложноперированных крыс, которым аналогичным способом в почки вводили физиологический раствор. Наблюдение за последней группой животных (включающее мониторинг АД и гистохимическое исследование их тканей) осуществлялось в течение 1 послеоперационной недели. Дальнейшего наблюдения они не требовали, поскольку результаты изучения их тканей, а также показатели АД не отличались от таковых у животных интактной контрольной группы.

Эвтаназию животных проводили путем декапитации на фоне эфирного наркоза. Исследуемый материал (головной мозг, аорта, надпочечники и почки) тотчас после извлечения, 4 часа фиксировали в 4% забуференном растворе параформалвдегида и обрабатывали для последующего общеморфологического и гистохимического исследования.

Общеморфологические методы исследования. Для идентификации общего количества нейронов в исследуемых участках мозга и надпочечников использовалась окраска по Нисслю. Изучение морфологического состояния паренхимы почек в месте инъекции формалина (с целью верификации точности инъекции) проводилось на срезах, окрашенных гематоксилином-эозином.

Гистохимический метод на NADPH-диафоразу. Использовали метод на NADPH-диафоразу (NADPH-d), предложенный Hope, Vincent (1989), который основан на образовании нерастворимого осадка диформазана в присутствии экзогенного субстрата - нитросинего тетразолия (НСТ) и косубстрата — NADPH. Известно, что NADPH-диафораза солокали-зована со всеми тремя известными изоформами NOS - нейрональной, эндотелиальной и индуцибельной (Furukawa et al., 1995, Bassoulett et al., 1996). В связи с этим реакция на NADPH-диафоразу позволяет судить о гистохимической локализации NOS.

В NO-продуцирующий тканевых элементах активность NADPH-диафоразы и NO-синтазы изменяется синхронно и однонаправлено, поэтому плотность образующегося в результате гистохимической реакции диформазанового преципитата прямо пропорциональна молеку-

лярной концентрации NOS, что позволяет не только установить ее гистохимическую локализацию, но и судить об активности фермента.

Исследуемый материал в течение 4 часов фиксировали в охлажденном, приготовленном на 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,4) 4% растворе параформальдегида; затем сутки промывали при той же температуре в 30% забуферном растворе сахарозы. Из замороженных в криоста-те образцов изготавливали срезы аорты, магистральных сосудов, надпочечников (толщиной 25 мкм), срезы продолговатого мозга и гипоталамуса (толщиной 50 мкм), которые монтировали на предметные стекла. Высушенные срезы помешали в среду, состав и конечная концентрация котором были следующими: 50Мм трис-буфер (pH 8,0), 1 мМ NADPH («Sigma», США), 0,5 мМ нитросинего тетразолия («Sigma», США), и 0,2 % тритон X - 100 («ISN», США). Инкубацию проводили в течение 30 мин для срезов надпочечников и 1 час для остальных срезов при температуре 37°С, после чего срезы ополаскивали в дистиллированной воде, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.

Морфометрическая и статистическая обработка данных. Визуальную оценку активности фермента проводили по плотности осадка, структуре и цвету. Подсчет числа нейронов производили в 20-25 последовательных серийных срезах, включающих срединную порцию исследуемых ядер. В исследуемых нервных образованиях подсчитывали абсолютное количество позитивных нейронов, затем считали их долю из числа нервных клеток, окрашенных в сходных областях по методу Ниссля, и определяли удельное распределение в 10000 мкм3 нервной ткани (учитывая толщину среза 50 мкм — в 0,5 мм3), используя программное обеспечение Adobe Photoshop 7.0 и Image J.

Количественную оценку ферментативной активности определяли, измеряя плотность преципитата гистохимической реакции с помощью видео-компьютерной системы Panasonic, смонтированной на микроденситометре Jenaval Carlzeiss Jena (Германия). Цифровую обработку изображения проводили в программах Adobe Photoshop 7.0 и Microsoft Excel 97. Активность фермента выражали в единицах оптической плотности (ЕОП). Для статистической обработки использовался пакет прикладных программ Statistica 6.0 фирмы StatSoft Inc.

Дизайн исследования одобрен междисциплинарным независимым этическим комитетом ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (протокол № 13 от 31.05.2006 г).

Работа выполнена при финансовой поддержке по государственным контрактам с Федеральным агентством по науке инновациям Российской Федерации № 02.740.11.0450 и № 14.740.11.0186.

Результаты исследований и их обсуждение

Нитроксидергическая регуляция АД имеет многоуровневую организацию и состоит из центральных и периферических звеньев. Центральные ТЧО-ергические системы регуляции сердечно-сосудистой системы представлены ядрами гипоталамуса и продолговатого мозга. В гипота-ламическом центре регуляции АД мы рассматривали ядра, обеспечивающие нейрогенный и гуморальный контроль вазомоторных реакций.

Мелкоклеточная зона паравентрикулярного ядра, синтезирующая кортикотропин-релизинг-гормон, и структуры срединного возвышения включены в обмен гормонов коркового вещества надпочечников и участвуют в регуляции АД за счет активации гипоталамо-гипофизар-но-надпочечниковой системы. В мелкоклеточной зоне гипоталамуса N0 локализуется в нейронах, секретирующих кортикотропин-рели-зинг-гормон (Уатайа К. е1 а1., 1996) и обладает стимулирующим влиянием на биосинтез кортикотропин-релизинг-фактора и его высвобождение в портальную систему гипофиза (ЦпЬе Я.М. « а!., 1999). Поэтому активность ИО-ергических процессов в мелкоклеточных нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса и тканевых элементах срединного возвышения может в определенной мере отражать уровень кортикотропной активности.

По нашим наблюдениям, у крыс контрольной группы 41 % от общей клеточной популяции мелкоклеточной зоны паравентрикулярного ядра маркировались на ЫАОРН-диафоразу. При формировании экспериментальной нефрогенной гипертензии у животных мы наблюдали изменения количества и нитроксидергической активности нейронов мелкоклеточной зоны и их нейросекреторных волокон, которые распределяются в области срединного возвышения дна III желудочка и являются местом высвобождения нейросекрета в портальную систему гипофиза. По мере развития нефрогенной гипертензии число Т^АОРН-ё-продуцирующих нейронов сокращалось в 1,5-2 раза по сравнению с контрольной группой. Незначительный прирост количества ЫАОРН-с1-позитивных клеток наблюдался к 6 неделе развития гипертензии. Сходную динамику активности ЫАОРН-диафоразы имели структуры срединного возвышения на фоне развития нефрогенной гипертензии. Исходя из тех соображений, что единственным типом гипофизотроп-ных клеток гипоталамуса, солокализующих ЫО-синтазу, являются КРФ-синтезирующие нейроны мелкоклеточной зоны параветрикулярного ядра гипоталамуса, можно считать NADPH-d-пoзитивныe волокна срединного возвышения аксонами именно этих клеток.

Таким образом, при формировании экспериментальной нефрогенной гипертензии не только уменьшалась совокупная нитроксидерги-

ческая активность мелкоклеточных образований паравентрикулярного ядра, но и создавались менее благоприятные условия для высвобождения их нейросекреторных продуктов в портальную систему гипофиза.

Крупноклеточные нейроны паравентрикулярного и супраоптическо-го ядер за счет секреции гормона вазопрессина обеспечивают комплексное регулирующее влияние сосудистого тонуса. У крыс контрольной группы 16% от общего числа нейронов крупноклеточной зоны паравентрикулярного ядра и 19% супраоптического маркировались на NADPH-диафоразу. У нормотензивных животных нейроциты паравентрикулярного ядра гипоталамуса имеют низкую активность NADPH-диафоразы (44,5±2,7 ЕОП), а гистохимическая активность NOS супраоптического ядра соответствовала высоким показателям (141,77± 6,5ЕОП).

Изменения в эндокринной части гипоталамуса при развитии экспериментальной гипертензии касались как собственно числа NADPH-d-продуцирующих нейроцитов, так и их нитроксидергической активности. Общая тенденция динамики NO-ергической активности нейроцитов супраоптического и крупноклеточной зоны паравентрикулярного ядра имела нарастающий характер. В большей мере этот процесс был присущ нейронам паравентрикулярного ядра, где двукратное нарастание гистохимической активности сопровождалось увеличением их числа примерно в 3.5 раза. В супраоптическом ядре увеличение числа NADPH-d-продуцирующих нейронов в 2.5 раза, напротив, протекало на фоне снижения их гистохимической активности.

При применении J1C во всех исследуемых групп с АГ в ядрах гипоталамуса, мы отмечали статистически достоверное изменение, как количества NADPH-d-позитивных нейронов, так и их нитроксидергической активности. При этом сроки реализации и направленность N0-модулирующих эффектов у препаратов разных групп имели свои особенности.

Введение верапамила и эналаприлата сопровождалось резким увеличением количества NADPH-d-позитивных нейронов в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра гипоталамуса, хотя показатели из гистохимической активности оставались на уровне контрольных значений (рис. 2).

Аналогичный эффект наблюдался в отношении крупноклеточных образований гипоталамуса на всем протяжении введения верапамила и эналаприлата животным с экспериментальной нефрогенной гипертен-зией. Пропранолол, несмотря на развитие гипотензивного эффекта, активность NADPH-диафоразы в нейронах гипоталамуса не изменял. Известно, что большая популяция NO-ергических нейронов в крупноклеточных образованиях гипоталамуса является вазопрессин-ерги-

ческими клетками (Arevalo R., Sanchez F. et al., 1992). Этот нейропеп-тид оказывает стимулирующее влияние на продукцию оксида азота, находясь при этом под тормозным контролем с его стороны (Li Y.F., Patel К.P., 2003, 2005). Поэтому изменение эндогенных NO-ергичес-ких процессов в нейроэндокриноцитах гипоталамуса, по нашим данным, создает дополнительные возможности для развития гипотензивных эффектов препаратов, максимально выраженные у верапамила и эналаприлата.

25

11 .S"4» 20.1"**

* 1АГ 2АГ 4АГ б АГ

контроль артериальная гипертензия

1 нед 2 нед 4 нед 6 нед коррекция ЛС

—^—контроль и АГ • пропранопоп ■ эналалрилат вераламил

Рис. 2. Изменение числа NADPH-d-позитивных нейронов в мелкоклеточной зоне паравет-рикулярного ядра гипоталамуса при коррекции АГ гипотензивными препаратами. Достоверность различий по отношению к контролю: * — р<0,05; ** — р<0,0001; по отношению к нефрогенной гипертензии 4 недели: Н— р<0,05; ++ — р<0,0001

Продолговатый мозг, ядра которого составляют бульбарный вазомоторный центр, играет важную роль в регуляции сердечной деятельности и функционировании барорефлекса. Деятельность сосудодвига-тельного центра определяется активностью нейронов моторного ядра блуждающего нерва — двойного ядра (nucí, ambiguus), специфически-ех вазомоторных зон ядра солитарного тракта (вентро-медиальное и комиссуральное подъядра), а также нейронами дорсального ядра блуждающего нерва. Известно, что N0, солокализованный в данных нейронах с нейромедиатором ацетилхолином, обеспечивает прямое модулирующее влияние на его синтез и высвобождение, и, соответственно, изменяет параметры сердечной деятельности — частоту сердечных сокращений (Цырлин В.А., 2003).

У крыс при экспериментальном повышении АД в указанных ядрах бульбарного вазомоторного центра можно выделить 2 фазы изменений нитроксидергической активности. В течение недели после операции происходило снижение как количества NADPH-d-позитивных нейронов, так и их активности в кардиоваскулярных отделах ядра солитарного тракта и дорсальном ядре. Данное морфо-химическое состояние чувствительных и двигательных нейронов, формирующих блуждающий нерв, обуславливает снижение парасимпатического тонуса и является одной из причин гиперактивации симпатической нервной системы и повышения АД (Сосунов А.А., 2000; Цырлин В.А., 2003; Коцюба А.Е., 2010). Снижение синтеза NO и гиперакгивация симпатической нервной системы провоцируют, кроме того, ремоделирование сосудистой стенки и способствуют закреплению АГ (Шляхто Е.В., 2002).

Начиная со 2-й недели эксперимента наблюдается активация NADPH-диафоразы в nucí, tractos solitarius, что свидетельствует о развитии компенсаторных парасимпатических реакций в ответ на стойкое повышение АД (Kishi Т. et al., 2001, 2003; Цырлин В.А., 2003). В дорсальном и двойном ядре, начиная со 2-ой недели развития АГ, изменения активности nNOS и количества NADPH-d-позитивных нейронов носили нарастающий характер. На 6 неделе АГ число нейронов и активность NADPH-диафоразы в них превышали в 1,5 раза исходные показатели.

При фармакологической коррекции все используемые в эксперименте препараты в отношении NO-ергической активности нейронов сосудодвигателъного центра продолговатого мозга демонстрировали сходную активность. Их введение животным с АГ сопровождалось тенденцией к увеличению количества нейронов, положительно реагирующих на NADPH-диафоразу, по сравнению с группой с экспериментальной АГ и возрастанием их активности в ядре солитарного тракта (рис. 3), а в дорсальном (рис. 4) и двойном ядре вагуса увеличение NADPH-d-позитивной популяции нейронов сопровождалось снижением их гистохимической активности.

Описанные изменения выявлялись уже на 1 неделе использования препаратов. К 6 неделе введения препаратов, измененные показатели нитроксидергической активности вагусных центров приближались к показателям интактного контроля.

Оксид азота и ацетилхолин в ядрах вагуса солокализованы и имеют однонаправленную динамику при изменении АД. Наблюдаемая нами при фармакологической коррекции нормализация NO-ергической активности в ядрах бульбарного вазомоторного центра может служить косвенным признаком восстановления парасимпатических влияний исследуемых препаратов и обеспечивать развитие ваготонических эффектов пропранолола, эналаприлата и верапамила.

5 120

о

ы

£ «о

¡Z со 6

2 40

__^ ítOJ.M»«

™ ™ * «С • 4 SS4I"**

101.01** iur'»N Т

«б.«"»»

. 70.51"

20 0

контроль

1 АГ 2АГ 4АГ

артериальная гипертензия

коррекция ПС ■контроль и АГ —» пропранолол

6АГ

1 нед 2 нед 4 нед 6 нед

зналаприлат

-верапамил

Рис. 3. Изменение показателей гистохимической активности NADPH-d-позитивных нейронов nucí, tractus solitarius продолговатого мозга при коррекции гипотензивными препаратами. Достоверность различий по отношению к контролю: * — р<0,05; ** — р<0,0001; по отношению к нефрогенной гипертензии 4 недели: Н— р<0,05; +Н— р<0,0001

с

О fго

w

Я

CU SD

Z es & «

77,79

контроль 1АГ 2АГ * АГ 6 АГ артериальная гипертензия

1 нед 2 неб 4 нед б нед коррекция ЛС

- контроль и АГ пропранолол

зналаприлат

■ верапамил

Рис. 4. Изменение показателей гистохимической активности NADPH-d-позитивных нейронов дорсального ядра продолговатого мозга при коррекции гипотензивными препаратами. Достоверность различий по отношению к контролю: * — р<0,05; ** ~ р<0,0001; по отношению к нефрогенной- гипертензии 4 недели: + - р<0,05; ++ - р<0,0001

Динамический рисунок NO-ергической активности в тканевых структурах периферического звена модуляции АГ (эндотелии сосудов, мозговом веществе надпочечников) имеет собственные характеристики, отражающие степень вовлеченности данных органов в патологический процесс и выраженность их компенсаторных возможностей.

В эндотелии сосудов мышечного (внутренней сонной и базилляр-ной артерий) и эластического (аорте) типа нарастание АД сопровождалось последовательным угнетением их NO-продуцирующей функции в 1,5 раза по сравнению с крысами контрольной группы (р<0,001). Данное обстоятельство позволяет считать, что механизмы нарастания артериального давления при моделировании ренопривной гипертен-зии обеспечиваются не только структурно-функциональным повреждением почек, но и выраженным дисбалансом эндотелиально-зависи-мых систем регуляции сосудистого тонуса.

Эффективность коррекции NO-синтезирующей функции эндотелия для решения вопросов не только снижения АД, но и купирования пролиферативных эффектов настоящее время не вызывает сомнений (Мареев В.Ю., 2001; Задионченко B.C., 2002; Небиеридзе Д.В., 2006). На основе этого механизма создаются новые и эффективные препараты с NO-высвобождающим эффектом — небиволол, нитраты (Остроумова О.Д., 2006; Галявич A.C., 2007; Gaiane S. 2001).

В нашем исследовании показано, что в разной степени модулирующее влияние на сниженную при гипертензии NO-ергическую функцию эндотелия присуще всем изученным препаратам. При коррекции экспериментальной АГ максимальный эффект в отношении NO-продуцирующей активности эндотелия сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерих) был отмечен у эналаприлата и верапамила. Нормализация NO-ергической функции эндотелия аорты успешно протекала при использовании всех препаратов (рис. 5).

Многочисленные клинические и экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что использованные в нашей работе препараты не только эффективно снижают и контролируют уровень АД, но и оказывают благоприятное воздействие на состояние органов-мишеней: миокард, сосуды, почки (Остроумова О.Д. и соавт., 2007). В основе этого эффекта лежит способность препаратов восстанавливать баланс между двумя вазоактивными системами — ангиотензина II и NO (Задионченко B.C. и соавт., 2002).

Развитие экспериментальной артериальной гипертензии сопровождалось динамическими изменениями NO-ергической активности нейронов мозгового вещества надпочечников экспериментальных животных. Известно, что в мозговом веществе надпочечников NADPH-d-

позитивными (ЫО-ергическими) являются собственные медуллярные интернейроны и пресинаптические вегетативные волокна (А1т Р. ег а]., 1993; МаНеу С..1Х. е1 а!., 1996). МО-ергические нервные элементы богато иннервируют мозговое вещество надпочечников, формируя многочисленные варикозные утолщения на телах ЫАОРН-с1-негатив-ных хромаффинных клеток. Это позволяет предполагать, что высвобождаемый ими N0 способен модулировать секреторную активность катехоламинергических клеток в норме, при патологии и ее фармакологической коррекции.

М С 80

£ 70 л

•в 60

§ 30 Я

х 20

" 10

Рис. 5. Динамика активности NADPH-d диафоразы в эндотелии сосудов эластического типа при коррекции гипотензивными препаратами. Достоверность различий по отношению к контролю: * — р<0,05; ** - р<0,0001; по отношению к нефрогенной гипертензии 4 недели: н— р<0,05; +Н—

р<0,0001

В развитии изменений ТЧО-ергической активности можно выделить три периода. Первая фаза повышения активности фермента, очевидно, определялась региональной травмой и сопровождалась как увеличением числа ^РРН-с1-позитивных нейронов, так и достоверным повышением показателей их гистохимической активности. Второй период, длящийся до конца 4 недели, приводит к постепенному уменьшению показателей; данный морфо-химический феномен мы склонны относить за счет развития компенсаторной реакции со стороны нейромедиаторных систем мозгового вещества надпочечников. В течение последующих 4 недель развитие гипертензивного синдрома сопровождалось активацией МО-ергической популяции медуллярных нейронов, хотя их гистохимическая активность сохраняла тенденцию к снижению.

Г 4АГ 1АГ

1 нед 2 нед 4 нед 6 нед коррекция ПС

-контроль и АГ при введении эналаприлата

•при введении пропранолопа —при введении верапамила

Механизмы влияния N0 на ткань мозгового вещества надпочечников при гипертензии и проведении гипотензивной терапии до настоящего времени остаются малоизученным и противоречивыми и касаются, в основном, анализа его ингибиторных (Tores М. et al., 1994), либо активирующих эффектов в моделях in vitro.

В настоящей работе установлено, что развитие экспериментальной АГ сопровождалось реакцией со стороны NO-ергических нейронов мозгового вещества надпочечников. Эти клетки, выполняя функции локальных интернейронов, модулируют биохимическую активности хромаффиноцитов (Barnes R.D. et al., 2001) и, как показывают результаты нашего исследования, могут принимать участие в реализации гипотензивных эффектов фармакологических препаратов. Введение экспериментальным животным гипотензивных препаратов сопровождалось угнетением активности синтеза N0 в этих клетках, максимально выраженным у пропранолола и эналаприлата (рис. 6).

контроль ГАГ 2 АГ 4АГ 6АГ

I tied. 2 иед. 4 Нед. 6 неА коррекций Л С

—♦—нейроны в норме н при АГ —♦ • при коррекции пролравололом

- ♦ при коррекции эналаприлатом ♦ при коррекции верапамилом

Рис. 6. Динамика числа ЫАЭРН-с1-позитивных нейронов в 5 мм2 мозгового вещества надпочечников у крыс с моделью экспериментальной нефро-генной гипертензии при введении препаратов гипотензивного действия. Достоверность различий по отношению к контролю: * — р<0,05; ** — р<0,0001; по отношению к нефрогенной гипертензии 4 недели: Н— р<0,05; ++ — р<0,0001

Вывозы:

1. Центральное звено МО-ергической регуляции артериального давления включает нейроны гипоталамуса (паравентрикулярного, супра-оптического ядер, срединного возвышения) и продолговатого мозга (ядро солитарного тракта, дорсальном и двойном ядрах). Периферическое звено представлено ЫО-продуцирующими эндотелиоцитами сосудов и нейронами мозгового вещества надпочечников.

2. Развитие артериальной гипертензии сопровождается специфическими изменениями активности МО-ергических нейронов головного мозга, участвующих в регуляции артериального давления: уменьшением числа и активности ЫАОРН-с1-позитивных нейронов мелкоклеточной зоны паравентрикулярного ядра, волокон срединного возвышения гипоталамуса, нейронов ядра солитарного тракта; увеличением числа и активности МАОРН-с1-позитивных нейроцитов в эндокринных ядрах гипоталамуса, дорсальном и двойном ядрах продолговатого мозга.

3. Системное повышение АД при нефрогенной гипертензии ведет к угнетению ЫО-продуцирующей функции эндотелия сосудов мышечного и эластического типов; в нейронах мозгового вещества надпочечников изменение МО-ергической активности имеет динамический характер.

4. В условиях экспериментальной нефрогенной гипертензии про-пранолол повышает активность фермента и количество МАОРН-с1-по-зитивных нейронов в дорсальном и ядре одиночного пучка продолговатого мозга, восстанавливает МО-продуцирующую активность эндо-телиоцитов сосудов.

5. ТЧО-модулирующие эффекты эналаприлата и верапамила реализуются как на центральном, так и на периферическом уровне. В нейронах гипоталамуса и продолговатого мозга под влиянием препаратов регистрируется увеличение числа ЫАОРН-ё-позитивных нейронов и восстановление активности фермента в тканевых элементах срединного возвышения. Антигипертензивное действие препаратов сопровождается увеличением МО-ергической активности эндотелиальных клеток сосудов мышечного и эластического типа и восстановлением синтеза N0 в нейронах мозгового вещества надпочечников.

6. Полученные данные свидетельствуют об участии центральных и периферических МО-ергических механизмов в реализации фармакологических эффектов пропранолола, эналаприлата и верапамила при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Елисеева Е.В., Агапов Е.Г., Лучанинова В.Н., Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф. Значение оксида азота в реализации артериальной гипертензии при врожденном гидронефрозе// Тихоокеанский медицинский журнал.,2005. №3. С. 23—26.

2. Елисеева Е.В., Дюйзен И.В.,Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф., Савченко C.B. Нитрооксидергическая регуляция надпочечников при экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы IV Дальневосточного регионального конгресса с международным участием «Человек и лекарство». Владивосток: Медицина Д В, 2007. С. 19.

3. Елисеева Е.В., Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф., ДюйзенИ.В. Влияние пропранолола на нитроксидергическую активность мозгового слоя надпочечников при экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы V Дальневосточного регионального конгресса с международным участием «Человек и лекарство». Владивосток: Медицина ДВ, 2008. С. 18-194. Тыртышникова A.B., Елисеева Е.В., Романченко Е.Ф., Дюйзен И.В.

Динамика нитроксидергической активности в эндотелии сосудов гипоталамуса при коррекции верапамилом, эналаприлатом в условиях экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы VII Международного контресса «Доказательная медицина — основа современного здравоохранения». Хабаровск, 2008. С. 202—204.

5. Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф., Елисеева Е.В., Дюйзен И.В., Савченко С. В. Нитроксидергическая активность паравентрикулярного и супраоптического ядра при экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы V Дальневосточного регионального конгресса с международным участием «Человек и лекарство». Владивосток: Медицина ДВ, 2008. С. 77-78.

6. Тыртышникова А.В., Елисеева Е.В., Романченко Е.Ф., Дюйзен И.В. Нитроксидергическая активность сосудов головного мозга при экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы научно-практической конференции «Организация лекарственного обеспечения рациональной фармакотерапии в условиях реализации национального проекта в Дальневосточном федеральном округе». Хабаровск, 2008. С. 40-42.

7. Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф. Влияние эналаприлата на нитроксидергическую активность мозгового слоя надпочечников при экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы V Дальневосточного регионального конгресса с международным участием «Человек и лекарство». Владивосток: Медицина ДВ, 2008. С. 103—104.

8. Елисеева Е. В., Тыртышникова A.B.,. Романченко Е.Ф, Дюйзен И.В. Активность NO-синтазы эндотелия аорты и сосудов головного мозга в условиях экспериментальной ренопривной гипертензии // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса. (Москва, апрель). М., 2009. С. 656.

9. Романченко Е.Ф., Елисеева Е.В., Дюйзен И.В.,Тыртышникова A.B. Активность нитроксидсинтазы в эпителиоцитах дистальных канальцев почки при экспериментальной ренопривной гипертензии //Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. №4 (приложение). С.131.

10. Тыртышникова A.B., Елисеева Е.В., Романченко Е.Ф., Дюйзен И.В. Коррекция эндотелиальной дисфункции сосудов продолговатого мозга в условиях экспериментальной ренопривной гипертензии // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса. (Москва, апрель). М., 2009. С. 562.

11. Тыртышникова A.B., Елисеева Е.В., Дюйзен И.В., Романченко Е.Ф. Нитроксидергическая активность паравентрикулярного ядра гипоталамуса в условиях экспериментальной гипертензии // Клиническая фармакология и терапия. 2009. № 6. С. 303-304.

12. Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф., Демина И.Г. Динамика нитроксидергической активности паравентрикулярного ядра при коррекции верапамилом в условиях в условиях экспериментальной ренопривной гипертензии // Материалы X Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». Владивосток, 2009. С. 340—341.

13. Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф., Демина И.Г. NO-син-таза эндотелия сосудов головного мозга у крыс с экспериментальной гипертензии и ее состояние при введении препаратов гипотензивного действия // Материалы X Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». Владивосток, 2009. С. 339—340.

14. Елисеева Е.В., Дюйзен И.В., Тыртышникова A.B., Романченко Е.Ф. Изменение NO-ергической активности нейронов мозгового вещества надпочечников при экспериментальной гипертензии и ее фармакологической коррекции // Бюллетень СО РАМН. 2010. Том 30, №5. С. 52-57.

15. Романченко Е.Ф., Тыртышникова А.В., Дюйзен И.В., Елисеева Е.В., Сарлатынова Ю.А. Состояние нитроксидпродуцирующей функции почек при использовании различных групп // Тихоокеанский медицинский журнал. 2011. №1. С. 41-45.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ артериальная гипертензия

АД артериальное давление

АДГ антидиуретический гормон

АК адренокортикотропный гормон

АПФ ангиотензин-превращающий фермент

иАПФ ингибитор ангиотензин-превращающего фермента

БКК блокатор кальциевых каналов

ЕОП единицы оптической плотности

КРФ кортикотропин-рилизинг фактор

РААС ренин-ангиотензин-альдостероновая система

СНС симпатическая нервная система

ЧСС частота сердечных сокращений

NADPH никотинамиддинуклеотид фосфат

NADPH-d NADPH-диафораза

NO оксид азота

NOS нитрооксидсинтаза (NO-синтаза)

HCT нитросиний тетразолий

Тыртышникова Анна Владимировна

РЮ-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 18.01.2011 Формат 60х84/|6 Уч. изд. л. 1,4 Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ №6

Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического комплекса ДВФУ, 690950, г. Владивосток, ул. Алеутская, 56.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Важнейшими патогенетическими звеньями в развитии артериальной гипертензии (АГ) традиционно считается увеличение активности симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем, а также дисбаланс эндотелиозависимых механизмов [119, 191, 197]. Избыточная активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РАСС) приводит не только к задержке натрия и воды в организме, но и к изменениям органов-мишеней - сердца, почек, мозга и периферических сосудов [60, 61, 149, 178].

Открытие молекулы оксида азота (NO) позволило по-новому взглянуть на механизмы патогенеза АГ и наметить новые мишени фармакологического действия гипотензивных препаратов [35]. Выявление роли NO в нейрогенной, гуморальной и эндотелиальной регуляции артериального давления (АД) открыло широкие перспективы для разработки новых подходов к фармакологической коррекции гипертензивного синдрома [31, 69, 84, 203, 215]. Известно, что взаимодействие симпатоадреналовой и NO-ергической систем на разных уровнях нейроэндокринного контроля АД имеет специфические черты и может проявляться развитием как антагонистических, так и синергических модулирующих эффектов [203]. Взаимомодулирующие отношения между РААС и системой синтеза N0 имеют свои особенности в зависимости уровня их реализации, стадии развития гипертонической болезни и характера проводимой лекарственной терапии.

Изучение влияния на активность NO-синтазы (NOS) гипотензивных препаратов различных групп позволит установить значение центральных и периферических NO-ергических механизмов в патогенезе нефрогенной гипертензии и фундаментально обосновать новые подходы к ее коррекции. Изученные к настоящему времени эффекты NO-зависимой модуляции АД и фармакологического действия антигипертензивных средств ограничиваются изучением регулирующего влияния N0 на эндотелиальные механизмы регуляции сосудистого тонуса [24, 92]. Кроме того, в доступных источниках представлены данные об МО-зависимых механизмах действия лишь некоторых гипотензивных препаратов [24]. В этой связи детальное исследование Ж)-ергических процессов, протекающих на различных уровнях функциональной системы регуляции АД при его эндогенных и фармакологически индуцированных сдвигах, считается весьма актуальным, поскольку позволит выявить новые патогенетические механизмы формирования гипертензивного синдрома и возможные мишени его лекарственной терапии. Кроме того, выявление ИО-модулирующего компонента в спектре фармакологических эффектов известных антигипертензивных препаратов позволит объяснить некоторые особенности реализации их основных и побочных эффектов, а также наметить пути усовершенствования их химического состава путем включения селективных ЫО-модулирующих компонентов. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: определить значение нитроксидергического механизма в реализации фармакологических эффектов ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), р-адреноблокатора и блокатора кальциевых каналов при экспериментальной нефрогенной гипертензии. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Установить гистохимическую локализацию МАОРН - диафоразы (ЫАОРН-с1) в ядрах гипоталамуса и продолговатого мозга, эндотелии сосудах мышечного (внутренней сонной и базиллярной артерий) и эластического (аорты) типа, нейронах мозгового вещества надпочечников в условиях физиологической нормы и при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

2. Изучить характер изменений Ж)-ергической активности в указанных клеточных элементах животных с экспериментальной нефрогенной гипертензией под действием Р-адреноблокатора.

3. Определить активность КАБРН-ё в указанных структурах экспериментальных животных под действием ингибитора АПФ.

4. Установить динамику Ж)-ергической активности в ядрах гипоталамуса и продолговатого мозга, сосудах мышечного и эластического типа, нейронах мозгового вещества надпочечников под влиянием блокатора кальциевых каналов.

5. Обосновать значение центральных и периферических МО-ергических механизмов в реализации фармакологических эффектов гипотензивных препаратов при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В условиях моделирования экспериментальной нефрогенной гипертензии у лабораторных животных установлена гистохимическая локализация КАБРН-ё и проведено гистохимическое исследование динамики активности фермента синтеза N0 в центральных и периферических структурах, причастных к регуляции сердечно-сосудистой системы. Показано, что формирование АГ, инициированное химической деструкцией части почечной паренхимы, сопровождается динамическими и селективными изменениями Ж)-ергической активности нейронов гипоталамуса, продолговатого мозга, мозгового вещества надпочечников, эндотелиальных клеток сосудов. Установлено >Ю-модулирующее действие антигипертензивных препаратов из группы ингибиторов АПФ, Р-адреноблокаторов и блокаторов кальциевых каналов. Полученные данные позволяют уточнить роль центральных и периферических МЭ-ергических механизмов в патогенезе нефрогенной гипертензии и значение N0 в реализации фармакологических эффектов гипотензивных препаратов указанных групп. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В ходе работы получены новые факты, расширяющие представление о нейрохимических механизмах регуляции артериального давления. Показано значение центральных и периферических Ж)-зависимых механизмов в динамике развития экспериментального гипертензивного синдрома. Полученные в эксперименте данные о влиянии ингибиторов АПФ, Р-адреноблокаторов и блокаторов кальциевых каналов на Ж)-ергическую активность нейронов вазомоторных центров головного мозга, эндотелиальных клеток сосудов мышечного и эластического типа, нейронов мозгового вещества надпочечников позволяют обосновать значение Ж)-ергического механизма в реализации центральных и периферических эффектов гипотензивных препаратов, а также разработать более совершенные и рациональные подходы к фармакологической регуляции АД.

Полученные в ходе работы данные используются в лекционном курсе и в материалах практических занятий на кафедрах общей и клинической фармакологии, гистологии, патологической физиологии, при базовой и последипломной подготовке врачей. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Регуляция артериального давления в условиях нефрогенной экспериментальной гипертензии обеспечивается центральными и периферическими Ж)-ергическими механизмами.

2. Фармакодинамические эффекты пропранолола, эналаприлата и верапамила в условиях экспериментальной артериальной гипертензии являются МО-зависимыми и реализуются как на уровне периферической, так и центральной регуляции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2007, 2008, 2009); Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, сентябрь 2007, 2008, 2009); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2009); обществе Специалистов по клинической фармакологии Приморского края (Владивосток, ноябрь 2010).

ВЫВОДЫ:

1. Центральное звено >Ю-ергической регуляции артериального давления включает нейроны гипоталамуса (паравентрикулярного, супраоптического ядер, срединного возвышения) и продолговатого мозга (ядро солитарного тракта, дорсальном и двойном ядрах). Периферическое звено представлено N0-продуцирующими эндотелиоцитами сосудов и нейронами мозгового вещества надпочечников.

2. Развитие артериальной гипертензии сопровождается специфическими изменениями активности М>ергических нейронов головного мозга, участвующих в регуляции артериального давления: уменьшением числа и активности КАБРН-ё-позитивных нейронов мелкоклеточной зоны паравентрикулярного ядра, волокон срединного возвышения гипоталамуса, нейронов ядра солитарного тракта; увеличением числа и активности ЫАВРН-с!-позитивных нейроцитов в эндокринных ядрах гипоталамуса, дорсальном и двойном ядрах продолговатого мозга.

3. Системное повышение АД при нефрогенной гипертензии ведет к угнетению ЖЗ-продуцирующей функции эндотелия сосудов мышечного и эластического типов; в нейронах мозгового вещества надпочечников изменение N0-ергической активности имеет динамический характер.

4. В условиях экспериментальной нефрогенной гипертензии пропранолол повышает активность фермента и количество ЫАОРН-ё-позитивных нейронов в дорсальном и ядре одиночного пучка продолговатого мозга, восстанавливает ЫО-продуцирующую активность эндотелиоцитов сосудов.

5. №>модулирующие эффекты эналаприлата и верапамила реализуются как на центральном, так и на периферическом уровне. В нейронах гипоталамуса и продолговатого мозга под влиянием препаратов регистрируется увеличение числа NADPH-d-позитивных нейронов и восстановление активности фермента в тканевых элементах срединного возвышения. Антигипертензивное действие препаратов сопровождается увеличением NO-ергической активности эндотелиальных клеток сосудов мышечного и эластического типа и восстановлением синтеза NO в нейронах мозгового вещества надпочечников.

6. Полученные данные свидетельствуют об участии центральных и периферических NO-ергических механизмов в реализации фармакологических эффектов пропранолола, эналаприлата и верапамила при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Конец XX века ознаменовался не только интенсивным развитием фундаментальных понятий патогенеза АГ, но и критическим пересмотром многих представлений о причинах, механизмах развития и лечении этого заболевания. Артериальная гипертензия — наиболее значимое по эпидемиологическим масштабам, социальным и экономическим последствиям заболевание в мире. В настоящее время АГ рассматривается как сложнейший комплекс нейрогуморальных, гемодинамических и метаболических факторов [46]. Важнейшими патогенетическими звеньями в развитии АГ является увеличение тонуса симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем [119, 191], а также дисбаланс эндотелиозависимых механизмов. Избыточная активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) приводит не только к задержке натрия и воды в организме, но и к изменениям органов-мишеней — сердца, почек, мозга и периферических сосудов [63]. При выборе антигипертензивных препаратов патогенетически обоснованным представляется применение ЛС, подавляющих активность РААС и СНС [6, 28, 72, 74, 75, 86, 89, 109].

Выявление роли N0 в нейрогенной, гуморальной и эндотелиальной регуляции АД открыло широкие перспективы для разработки новых подходов к фармакологической коррекции гипертензивного синдрома. [31, 69, 84, 203, 215]. В настоящее время на фармацевтическом рынке появляются новые препараты, включающие в свой состав Ж)-ергические компоненты, улучшающие свойства препарата-предшественника (небиволол). Известно, что взаимодействие симпатоадреналовой и М>ергической систем на разных уровнях нейро-эндокринного контроля АД имеет специфические черты и может проявляться развитием как антагонистических, так и синергических модулирующих эффектов [203]. Взаимомодулирующие отношения между РААС и системой синтеза N0 также имеют свои особенности в зависимости от уровня их реализации, стадии развития гипертонической болезни и характера проводимой лекарственной терапии.

Известные к настоящему времени эффекты МО-зависимой модуляции АД и фармакологического действия антигипертензивных средств ограничиваются изучением регулирующего влияния N0 на эндотелиальные механизмы регуляции сосудистого тонуса. При этом в доступных источниках представлены данные об ТЧО-зависимых механизмах действия лишь некоторых гипотензивных препаратов [24, 29]. В этой связи детальное исследование N0-ергических процессов, протекающих на различных уровнях функциональной системы регуляции АД при его эндогенных и фармакологически индуцированных сдвигах, позволит выявить новые патогенетические механизмы формирования гипертензивного синдрома и возможные мишени его лекарственной терапии. Кроме того, выявление Ж)-модулирующего компонента в спектре фармакологических эффектов известных антигипертензивных препаратов позволит объяснить некоторые особенности реализации их основных и побочных эффектов, а также наметить пути усовершенствования их химического состава путем включения селективных Ж)-модулирующих компонентов.

Для изучения патогенеза АГ используются различные экспериментальные модели. Самыми распространенными являются модели, воспроизводимые на крысах путем стеноза почечной артерии, субтотальной нефроэктомии, минералкортикоидной нагрузки. Большинство из предложенных моделей ренопривной и реноваскулярной гипертензии нуждаются в проведении тяжелых полостных операций, что может значительно искажать получаемые результаты [62]. В настоящее время предпочтение отдается моделям, позволяющим приблизить результаты исследования к клинике и затрагивающим ключевые звенья патогенеза нефрогенной гипертензии, в частности, такие как активация прессорной и снижение депрессорной гормональной активности почечного эндокринного аппарата. В нашем исследовании мы использовали модель экспериментальной нефрогенной гипертензии путем химического разрушения части почечной паренхимы инъекцией в нижний полюс правой и левой почки 0,1 мл 10% раствора формалина. В предложенной модели наличие АГ подтверждено высокими показателями систолического АД, типичными изменениями стенки аорты (гиперплазией и расслоением ее эластических мембран), активацией прессорной РААС, а также развитием гипертрофии миокарда, что, в свою очередь, было доказано на основании увеличения массы сердца, сердечного индекса и диаметра кардиомиоцитов на 69,5% через 6 месяцев от начала эксперимента [97, 98].

Нитроксидергическая регуляция АД имеет многоуровневую организацию и состоит из центральных и периферических звеньев. Результаты проведенного в настоящем исследовании гистохимического мониторинга активности КАОРН-диафоразы в ядрах гипоталамуса и продолговатого мозга, эндотелии сосудов мышечного (внутренней сонной и базиллярной артерий) и эластического типа (аорты), нейронах мозгового вещества надпочечников позволили уточнить гистохимическую локализацию КАБРН-с! и динамику ее активности при экспериментальной нефрогенной гипертензии.

Экспериментальные работы последних лет свидетельствуют о том, что молекулярные регуляторы, синтезируемые в нервной ткани, в том числе N0, принимают активное участие в нейрогенных механизмах формирования АГ [36, 77]. Центральные МЭ-ергические системы регуляции сердечно-сосудистой системы представлены ядрами гипоталамуса и продолговатого мозга. В гипоталамическом центре регуляции АД мы рассматривали ядра, обеспечивающие нейрогенный и гуморальный контроль вазомоторных реакций.

Мелкоклеточная зона паравентрикулярного ядра, синтезирующая кортикотропин-релизинг-гормон, и структуры срединного возвышения включены в обмен гормонов коркового вещества надпочечников и участвуют в регуляции АД за счет активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. В исследованных ядрах гипоталамуса человека [140], крысы [125] и других млекопитающих [154] ЫАОРН-с1-реактивные нейроны имеют однотипную локализацию, полностью совпадающую с местами синтеза N0-синтазы [139]. Можно считать поэтому, что изучение динамики нитроксидергических процессов в мозге экспериментальных животных при АГ в определенной мере отражали, соответствующие процессы, протекающие у человека при формировании данного патологического состояния.

Известно, что в мелкоклеточной зоне гипоталамуса NO локализуется в нейронах, секретирующих кортикотропин-релизинг-гормон [224] и обладает стимулирующим влиянием на биосинтез КРФ и его высвобождение в портальную систему гипофиза [214]. Поэтому активность NO-ергических процессов в мелкоклеточных нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса и тканевых элементах срединного возвышения может в определенной мере отражать уровень кортикотропной активности.

При формировании экспериментальной нефрогенной гипертензии у животных мы наблюдали изменения количества и нитроксидергической активности нейронов ч мелкоклеточной зоны и их нейросекреторных волокон, которые распределяются в области срединного возвышения дна III желудочка и являются местом высвобождения нейросекрета в портальную систему гипофиза. По мере развития нефрогенной гипертензии число и гистохимическая активность в этих структурах постепенно изменялась. Число NADPH-d-продуцирующих нейронов мелкоклеточной зоны гипоталамуса сокращалось в 1.5-2 раза по сравнению с контрольной группой. Незначительный прирост популяции NADPH-d-позитивных клеток наблюдался лишь к 6 неделе развития гипертензии.

Сходную динамику ферментативной активности имели структуры срединного возвышения на фоне развития нефрогенной гипертензии. Здесь основная доля ферментативной активности приходилась на NADPH-d-позитивные волокна внутреннего слоя срединного возвышения III желудочка. Исходя из тех соображений, что единственным типом гипофизотропных клеток гипоталамуса, солокализующих NO-синтазу, являются КРФ-синтезирующие нейроны мелкоклеточной зоны параветрикулярного ядра гипоталамуса [224], можно считать NADPH-d-позитивные волокна срединного возвышения аксонами именно этих клеток.

Таким образом, при формировании экспериментальной нефрогенной гипертензии не только уменьшалась совокупная нитроксидергическая активность мелкоклеточных образований паравентрикулярного ядра, но и создавались менее благоприятные условия для высвобождения их нейросекреторных продуктов в портальную систему гипофиза.

Крупноклеточные нейроны паравентрикулярного и супраоптического ядер за счет секреции гормона вазопрессина обеспечивают комплексное регулирующее влияние сосудистого тонуса. Изменения в эндокринной части гипоталамуса при развитии экспериментальной гипертензии касались как собственно числа NADPH-d-продуцирующих нейроцитов, так и их нитроксидергической активности. Общая тенденция динамики NO-ергической активности нейроцитов супраоптического и крупноклеточной зоны паравентрикулярного ядра имела нарастающий характер. В большей мере этот процесс был присущ нейронам паравентрикулярного ядра, где двукратное нарастание гистохимической активности сопровождалось увеличением числа их популяции примерно в 3.5 раза. В супраоптическом ядре увеличение числа NADPH-d-продуцирующих нейронов (в 2.5 раза), напротив, протекало на фоне снижения их гистохимической активности. Этот факт, очевидно, связан с разным химическим фенотипом NO-ергических эндокриноцитов гипоталамуса, так в супраоптическом ядре вырабатывают, преимущественно, окситоцин, а в паравентрикулярном ядре — вазопрессин [158, 222, 224].

Вазопрессин и окситоцин, вырабатываемые крупноклеточными ядрами гипоталамуса, помимо участия в водно-солевом гомеостазе, регуляции уровня кровяного давления и контроля репродуктивной функции, интегрируют работу стрессовой оси за счет влияния на ее кортикотропную активность. В условиях физиологической нормы и при стрессовых ситуациях окситоцин воздействовал на КРФ-синтезирующие нейроны, тормозил их метаболическую активность. Вазопрессин, высвобождаемый гипоталамическими крупноклеточными структурами, напротив, стимулировал уровень продукции кортикотропинов в гипофизе, воздействовал на специфические рецепторы железистых клеток передней доли [121].

Большинство исследователей демонстрировали ингибиторную природу влияний NO на гормональную функцию гипоталамуса. У крыс контрольной группы и у человека предшественники N0 снижали уровень продукции гормонов, угнетали электрофизиологическую активность нейронов in vivo и in vitro, а вещества, нейтрализующие активность NOS, напротив, ее усиливали.

Известно, что в эндокринных ядрах гипоталамуса NO выступает в звене тормозной обратной связи. Его синтез находится под стимулирующим контролем со стороны вазопрессина и окситоцина, а связанная с этим гипернаработка NO вела к торможению их последующего выброса [205]. В основе этого действия лежала способность газа регулировать процессы локальной тормозной нейротрансмиссии [200].

Продолговатый мозг, ядра которого составляют бульбарный вазомоторный центр, играет важную роль в регуляции сердечной деятельности и функционировании барорефлекса. Деятельность сосудодвигательного центра определяется активностью нейронов моторного ядра блуждающего нерва — двойного ядра (nucí, ambiguus), специфическиех вазомоторных зон ядра солитарного тракта (вентро-медиальное и комиссуральное подъядра), а также нейронами дорсального ядра блуждающего нерва.

Рефлекторные влияния на нейроны сосудодвигательного центра осуществляются при возбуждении хемо — и механорецепторов, локализованных в сосудистой стенке [34]. Возбуждение механорецепторов дуги аорты, каротидного синуса при повышении АД вызывает торможение активности сосудодвигательного центра и, как следствие, рефлекторное снижение сосудистого тонуса. Напротив, при повышении давления в системе полых вен наблюдается усиление активности сосудистого центра и вазоконстрикторный эффект. Следует отметить, что деятельность сосудодвигательного центра сочетается с функцией моторного ядра блуждающего нерва — двойного ядра, снижающего в норме частоту сердечных сокращений. Известно, что N0, солокализованный в данных нейронах с нейромедиатором ацетилхолином, обеспечивает прямое модулирующее влияние на его синтез и высвобождение, и, соответственно, изменяет параметры сердечной деятельности - частоту сердечных сокращений [104, 105].

В физиологических условиях NO облегчает процессы передачи сенсорной информации внутри ядра солитарного тракта, усиливается барорецепторное торможение симпатической вазомоторной активности, способствуя тем самым снижению АД [27, 51, 163, 190]. При сокращении синтеза NO наблюдается противоположный эффект — повышение сосудистого тонуса [93, 104]. Реализация симпатоингибиторных влияний происходит в ядрах так называемого бульбарного вазомоторного центра.

У крыс при экспериментальном повышении АД в указанных ядрах бульбарного вазомоторного центра можно выделить 2 фазы изменений нитроксидергической активности. В течение недели после операции происходило снижение как количества NADPH-d-позитивных нейронов, так и их активности в кардиоваскулярных отделах ядра солитарного тракта и дорсальном ядре. Данное морфо-химическое состояние чувствительных и двигательных нейронов, формирующих блуждающий нерв, обуславливает снижение парасимпатического тонуса и является одной из причин гиперактивации симпатической нервной системы и повышения АД [5, 51, 93, 104]. Снижение синтеза NO и гиперактивация симпатической нервной системы провоцируют, кроме того, ремоделирование сосудистой стенки и способствуют закреплению АГ [120].

Начиная со 2-й недели эксперимента наблюдается активация NADPH-диафоразы в nucí, tractus solitarius, что свидетельствует о развитии компенсаторных парасимпатических реакций в ответ на стойкое повышение АД [104, 105, 163].

В дорсальном и двойном ядре, начиная со 2-ой недели развития АГ, изменения активности nNOS и количества NADPH-d-позитивных нейронов носили нарастающий характер. На 6 неделе АГ число нейронов и активность КАБРН-диафоразы в них превышали в 1,5 раза исходные показатели.

При АГ, по-видимому, происходит компенсаторная активация нитроксидергической системы, приводящая в итоге к дисбалансу внутри самой регуляторной системы, способствуя закреплению стабильной АГ. Соответствующие сигналы к его нейронам могут поступать из ядра солитарного тракта, в котором большинство ЫО-позитивных афферентов вагусного происхождения [26].

Динамический рисунок 1чЮ-ергической активности в тканевых структурах периферического звена модуляции АГ (эндотелии сосудов и мозговом веществе надпочечников) имеет собственные характеристики, отражающие степень вовлеченности данных структур в патологический процесс и выраженность их компенсаторных возможностей.

В эндотелии сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артериях) и эластического типа (аорты) нарастание АД сопровождалось последовательным угнетением их ЫО-продуцирующей функции в 1,5 раза по сравнению с крысами контрольной группы. Данное обстоятельство позволяет считать, что механизмы нарастания артериального давления при моделировании нефрогенной гипертензии обеспечиваются не только структурно-функциональным повреждением почек, но и выраженным дисбалансом эндотелиально-зависимых систем регуляции сосудистого тонуса.

N0 является локальным тканевым гормоном, поддерживающим вазодилатацию, и одним из основных факторов, регулирующих кровоток и контролирующих АД [21, 76]. Большое значение N0 имеет в регуляции мозгового кровообращения. Как известно, гладкие мышцы этих артерий иннервируются главным образом нервами, электрическая стимуляция которых вызывает расслабление сосудистой стенки, не опосредуемое адренергическими или холинэргическими нейромедиаторами [134]. Многие из этих неадренергических и нехолинергических нервов способны синтезировать и выделять N0. Иммуногистохимическими исследованиями было установлено наличие конститутивной NOS в этих нейронах. NO является главным регулятором локального кровотока в головном мозге [63, 131].

Важную роль как основное звено симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем в развитии АГ играют надпочечники. Мозговое вещество надпочечников представляет собой нервный ганглий, в котором локализовались хромаффиноциты и локальные интернейроны. Хромаффинные клетки мозгового вещества синтезировали катехоламины -адреналин, норадреналин и дофамин, которые депонировали и выделяли в кровоток. Медуллярные интернейроны имели различный химический фенотип и выполняли в ганглии модулирующую роль в отношении секреторной активности хромаффинных клеток и параметров внутриорганного кровотока [128].

До настоящего времени в литературе нет единого мнения относительно направленности эффектов NO на синтез и высвобождение катехоламинов. Ряд исследователей обосновывали стимулирующее влияние самого NO, его доноров или предшественников на уровень продукции биогенных моноаминов в мозге [164], симпатических ганглиях [187] и надпочечниках [183]. Другие подтверждали симпатоингибирующее действие NO [177, 192], либо вообще отрицали участие N0 в модуляции хромаффинной ткани [185]. Такая неоднозначная ситуация, очевидно, определяется разными условиями проведения эксперимента, сроками наблюдения и выбором экспериментальной модели. Не исключено также, что ингибирующие эффекты NO реализовались при солокализации NOS и тирозингидроксилазы в одном нейроне [177] или под влиянием эндотелиальной NOS [128], в то время как симпатоактивирующее действие N0 проявлялось при его ретроградном или антероградном влиянии на мишень [183].

Установлено, что развитие экспериментальной гипертензии сопровождалось динамическими изменениями NO-ергической активности нейронов мозгового вещества надпочечников. Известно, что в мозговом веществе надпочечников NADPH-d-позитивными (NO-ергическими) являются собственные медуллярные интернейроны и пресинаптические вегетативные волокна [122, 179].

NO-ергические нервные элементы на наших препаратах богато иннервировали мозговое вещество надпочечников, формировали многочисленные варикозные утолщения на телах NADPH-d-негативных хромаффинных клеток [122, 185]. Это позволяло предполагать, что высвобождаемый ими NO принимал участие в модуляции секреторной активности катехоламинергических клеток в норме, при патологии и ее фармакологической коррекции.

В развитии изменений NO-ергической активности можно выделить три периода. Первая фаза повышения активности фермента, очевидно, определялась региональной травмой и сопровождалась как увеличением числа NADPH-d-позитивных нейронов, так и достоверным повышением показателей их гистохимической активности. Второй период, длящийся до конца 4 недели, когда происходило последовательное уменьшение обоих этих показателей, мы склонны относить за счет развития компенсаторной реакции со стороны нейромедиаторных систем мозгового вещества надпочечников. В течение последующих 4 недель развитие гипертензивого синдрома сопровождалось активацией NO-ергической популяции медуллярных нейронов, хотя их гистохимическая активность сохраняла тенденцию к снижению.

Таким образом, в нашем исследовании при использовании модели экспериментальной нефрогенной гипертензии можно предполагать, что в развитии АГ участвуют не только нефрогенные механизмы, но и формируется дисбаланс эндотелиально-зависимых механизмов регуляции сосудистого тонуса. Данное обстоятельство необходимо учитывать в клинической практике при подборе стратегии терапии больных с нефрогенной артериальной гипертензией.

Требования к современной антигипертензивной терапии предусматривают эффективное воздействие не только на функциональные параметры гемодинамики - уровень АД, ЧСС, периферическое сопротивление сосудов, но и тормозящее влияние на процессы структурной перестройки (ремоделирование) сердца и сосудов. Раскрытие роли локальных регуляторных факторов эндотелия - эндотелина, N0 - позволяют по-новому оценить возможности антигипертензивной терапии. Так, депрессия синтеза эндотелиального N0, мощного вазодилатирующего и вазопротекторного агента, как правило, наблюдающаяся у больных с развившейся АГ, может вносить вклад в прогрессирование АГ и ускорение ремоделирования сердечнососудистой системы. Поэтому теоретически обоснованным представляется применение воздействий и лекарственных препаратов, стимулирующих синтез N0 в эндотелии сосудов [14]. В работе были использованы препараты из разных фармакологических групп, обладающие разной способностью проникать через ГЭБ, и, соотвестсвенно проявлять различную степень выраженности центральных эффектов. Используемые в работе БКК верапамил и р-адреноблокатор пропранолол хорошо проникают через ГЭБ, хотя механизмы и способы реализации их мозговых эффектов изучены к настоящему времени достаточно фрагментарно. Ингибитор АПФ эналаприлат, по сравнению с другими препаратами данного класса (каптоприл, фозиноприл, лизиноприл, рамиприл), обладая высокой липофильностью и проходимостью через гистогематические барьеры, обладает невысокой способностью к преодолению ГЭБ. Однако описанные к настоящему времени "мозговые" побочные эффекты препарата (слабость, головокружение, головная боль), а также полученные в настоящем исследовании сведения о его N0-модулирующих эффектах в гипоталамусе и структурах продолговатого мозга, заставляют пересмотреть данные о фармакокинетике препарата или его основных метаболитов. Эксперименты, выполненные с использованием известных и широко применяемых в клинике антигипертензивных препаратов с разными механизмами действия (пропранолола, эналаприлата, верапамила), приводили не только к снижению повышенного АД у экспериментальных животных, но и сопровождались изменением нитроксидергической активности во всех изучаемых структурах, что позволило получить новые сведения о специфике их КЮ-модулирующей активности.

При применении ЛС во всех исследуемых групп с АГ в ядрах гипоталамуса, мы отмечали статистически достоверное изменение, как количества КАОРН-ё-позитивных нейронов, так и их нитроксидергической активности. При этом сроки реализации и направленность Ж)-модулирующих эффектов у препаратов разных групп имели свои особенности.

Введение верапамила и эналаприлата сопровождалось резким увеличением количества NADPH-d-пoзитивныx нейронов в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра гипоталамуса, хотя показатели из гистохимической активности оставались на уровне контрольных значений.

Аналогичный эффект наблюдался в отношении крупноклеточных образований гипоталамуса на всем протяжении введения верапамила и эналаприлата животным с экспериментальной нефрогенной гипертензией. Пропранолол, несмотря на развитие гипотензивного эффекта, активность КАЭРН-диафоразы в нейронах гипоталамуса не изменял. Известно, что большая популяция Ж>ергических нейронов в крупноклеточных образованиях гипоталамуса является вазопрессин-ергическими клетками [125]. Этот нейропептид оказывает стимулирующее влияние на продукцию оксида азота, находясь при этом под тормозным контролем с его стороны [171, 190]. Поэтому изменение эндогенных Ж)-ергических процессов в нейроэндокриноцитах гипоталамуса, по нашим данным, создает дополнительные возможности для развития гипотензивных эффектов препаратов, максимально выраженные у верапамила и эналаприлата.

При фармакологической коррекции все используемые в эксперименте препараты в отношении ЫО-ергической активности нейронов сосудодвигательного центра продолговатого мозга демонстрировали сходную активность. Их введение животным с АГ сопровождалось увеличением количества нейронов, положительно реагирующих на КАБРН-диафоразу, по сравнению с группой с экспериментальной АГ и возрастанием их активности в ядре солитарного тракта, а в дорсальном и двойном ядре вагуса увеличение КАБРН-ё-позитивной популяции нейронов сопровождалось снижением их гистохимической активности. Описанные изменения выявлялись уже на 1 неделе использования препаратов. К 6 неделе введения препаратов, измененные показатели нитроксидергической активности вагусных центров приближались к показателям интактного контроля. Оксид азота и ацетилхолин в ядрах вагуса солокализованы и имеют однонаправленную динамику при изменении АД. Наблюдаемая нами при фармакологической коррекции нормализация N0-ергической активности в ядрах бульбарного вазомоторного центра может служить косвенным признаком восстановления парасимпатических влияний исследуемых препаратов и обеспечивать развитие ваготонических эффектов пропранолола, эналаприлата и верапамила.

Многочисленные клинические и экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что использованные в нашей работе препараты не только эффективно снижают и контролируют уровень АД, но и оказывают благоприятное воздействие на состояние органов-мишеней: миокард, сосуды, почки [36, 62, 72, 80, 81]. В основе этого эффекта лежит способность препаратов восстанавливать баланс между двумя вазоактивными системами — ангиотензина II и N0.

В нашем исследовании показано, что в разной степени модулирующее влияние на сниженную при гипертензии ЫО-ергическую функцию эндотелия присуще всем изученным препаратам. При коррекции экспериментальной АГ максимальный эффект в отношении ЫО-продуцирующей активности эндотелия сосудов мышечного типа (внутренней сонной и базиллярной артерих) был отмечен у эналаприлата и верапамила. Нормализация МЭ-ергической функции эндотелия аорты успешно протекала при использовании всех препаратов.

До настоящего времени считалось, что способность иАПФ усиливать вазодилатирующие свойства сосудов связывают с их влиянием на функцию эндотелия, опосредованое брадикинином. Другим механизмом воздействия иАПФ на эндотелиальную функцию является блокада образования ангиотензина II (АТ И), который рассматривается как индуктор оксидантного стресса. Экспериментально продемонстрировано увеличение образования активных форм кислорода (супероксид анион) под действием АТ II. Механизмы действия АТ II на продукцию супероксид аниона связаны со стимуляцией НАДФН/НАДН оксидаз. Таким образом, снижение АТ II приводит к уменьшению оксидантного стресса, продукты которого снижают активность N0. Ангиотензин II во многом обладает противоположным действием по отношению к N0 и в настоящее время признается практически его антагонистом. Ингибирование ангиотензинпревращающего фермента может восстанавливать баланс между двумя вазоактивнами системами -ангиотензина II и N0 [36]. В нашем исследовании показано, что дополнительным эффектом иАПФ является нормализация ИО-ергической функции эндотелия аорты и сосудов мышечного типа.

В экспериментальных и клинических исследованиях перспективными в коррекции дисфункции эндотелия оказались БКК, которые ограничивают сосудосуживающее влияние ангиотензин II и эндотелина - 1 путем уменьшения пула внутриклеточного Са2+' Были получены данные о том, что БКК дигидропиридинового ряда, такие как амлодипин, фелодипин улучшают эндотелийзависимую вазодилатацию за счет экспрессии N0 [38, 67, 165, 219]. Считается, что основным механизмом увеличения N0 на фоне применения БКК является их антиоксидантное действие, активности супероксиддисмутазы, уменьшение разрушения N0 [38]. Полученные в нашей работе данные позволяют предположить, что верапамил, так же как БКК дигидропиридинового (амлодипин) ряда предотвращает реализацию феномена эндотелиальной дисфункции в эксперименте за счет нормализации синтеза N0 эндотелиальными клеками.

Большое значение при патологии сердечнососудистой системы имеют изменения метаболической активности клубочковой и пучковой зон коры надпочечников, а также клеток хромаффинной ткани мозгового вещества. В совокупности эти элементы, а также модулирующие их нейроэндокринные механизмы формировали сложную разветвленную систему регуляции АД.

В настоящей работе мы анализировали нитроксидергическую активность мозгового вещества надпочечников. Деятельность мозгового вещества надпочечников, секретирующего основное количество адреналина, находится под нейрогенным контролем со стороны центральной нервной системы и локальных интернейронов [128]. В нашем исследовании показано, что небольшая популяция NO-ергических медуллярных интернейронов достаточно активно реагируют на повышение АД и на проведение антигипертензивной терапии. Механизмы влияния NO на ткань мозгового вещества надпочечников при гипертензии и проведении гипотензивной терапии до настоящего времени остаются малоизученным и противоречивыми и касаются, в основном, анализа его ингибиторных [213], либо активирующих эффектов в моделях in vitro.

Наиболее выраженное торможение NO-ергической активности медуллярных интернейронов зафиксировано нами в мозговом веществе надпочечников. Введение экспериментальным животным лекарственных препаратов, сопровождаясь развитием гипотензивного эффекта, изменяло динамику биохимической реакции NO-ергических нейронов мозгового вещества надпочечников на развитие АГ. При этом NO-ергический "ответ" нейронов при использовании препаратов различных групп имел специфические черты, приводя к уменьшению числа NADPH-d-позитивных нейронов, их гистохимической активности или сочетанной реализацией обоих этих изменений. Все использованные в эксперименте средства из различных фармакологических групп ([3-адреноблокаторы, иАПФ и БКК) развивали антигипертензивное действие на фоне динамического, дифференцированого и селективного угнетения активности синтеза NO в этих клетках. Данные эффекты могут быть обусловлены спецификой функционирования внутриклеточных сигнальных каскадов в нервной ткани мозгового вещества надпочечников, или возникают вторично за счет изменения нейромедиаторного баланса в пресинаптических нервных цепях.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об участии центральных и периферических МЭ-ергических механизмов в реализации фармакологических эффектов пропранолола, эналаприлата и верапамила при эксперименальной нефрогенной гипертензии.