Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Низкотемпературное консервирование эритроцитов под защитой комбинированного криопротектора на основе пропиленгликоля и диметилацетамида

На правах рукописи

РГб од

2 з п:он

вильянинов

Владимир Николаевич

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЕ КОНСЕРВИРОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ ПОД ЗАЩИТОЙ КОМБИНИРОВАННОГО КРИОПРОТЕКТОРА НА ОСНОВЕ ПРОПИЛЕНГЖМЯ И ДИМЕТЙЛАЦЕТАЩА

14.00.29 - Гематология и переливание кроеи

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт - Петербург 199?

Работа выполнена в Военно-медицинской академии Научный руководитель:

кандидат медицинских наук старший научный сотрудник С.П. Калеко Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор В.Н. Мельникова доктор медицинских наук профессор С.Ф. Малахов Ведущая организация:

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

и

Защита состоится " 1997 г. в часов на

заседании специализированного совета (шифр Д.084.19.01) при Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии (Санкт-Петербург, 193024, 2-я Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

В.С. Быков

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

В практической реализации долгосрочного хранения эритроцитов в России доминирующим остаются способы их криоконсервирова-ния при -150°' •,-19б°С> то есть в жидком азоте или его парах. Использование с этой целью электрорефрижераторной аппаратуры до настоящего времени не получило в стране широкого распространения, несмотря на ряд преимуществ этого метода перед жидкоазот-ным: замораживание клеточных суспензий в электрохолодильниках позволяет отказаться от громоздкого и дорогостоящего жидкоазот-ного оборудования и специальных металлических контейнеров; возможна транспортировка эритроцитов в замороженном состоянии в изотермическом ящике с использованием хладагентов (Пушкарь Н.С., 1872; Канеко С.П. и соавт., 1983; Дудаева A.A., 1983).

С учетом этих преимуществ в нашей стране и за рубежом специалистами предложен ряд методов замораживания эритроцитов при температуре -Е0°.. ,-60°0. Так в ЦНИИГПК разработаны методы низкотемпературного консервирования эритроцитов при температуре -30°С и -60° v -70°с под защитой глицерина в конечной концентрации 33 - 34 X и 40 Z соответственно. Сотрудниками Львовского НИЙГПК МЗ УССР предложен метод замораживания эритроцитов при температуре -40°С с ограждающим раствором на основе глицерина в конечной концентрации 39,6 1. Н.Т. Терехов и соавт. (1986) (Киевский НИЙГПК) создали способ долгосрочного хранения замороженных эритроцитов при -40° * -60°С под защитой диметилсудьфоксида (ДМСО) и поливинилпирролидона (ПВП). В.Н. Мельникова и соавт. (ЛенНИИГПК) в 1990 г. разработали метод замораживания эритроцитов при -25° * -40°С под защитой криоконсерванта со сниженной до 20 1 конечной концентрацией глицерина. Большинство этих методов

основано на использовании в качестве криопротектора глицерина, который не является идеальным криофилактиком в силу своей достаточно высокой токсичности и медленной скорости проникновения через мембрану, что делает процедуры низкотемпературного консервирования эритроцитов под его защитой и последующей деглицериниза-ции размороженной эритроцитной суспензии длительными и трудоемкими. Методы, предложенные специалистами Киевского и Львовского НШГДК, ориентированы на эксплуатацию стеклянных флаконов, а технология подготовки эритроцитов к замораживанию предусматривает деление 1 дозы эритроцитов на две части и последующую их раздельную обработку. Все эти методы ориентированы на диапазон умеренно низких температур, при которых не достигается достаточная степень клеточного анабиоза.

Все это значительно ограничивает использование этих способов замораживания эритроцитов в практической работе учреждений службы крови. Поэтому поиск новых решений проблемы низкотемпературного консервирования эритроцитов является актуальным.

Среди наиболее перспективных направлений исследования в этой области представляется использование электрохолодильников на -80°С, -140°С.

Цель исследования:

Разработать способ низкотемпературного консервирования эритроцитов при -80°...-140°С под защитой криофилактика на основе 1,£-пропандиола ШГ) и диметилацетамвда (ДМАД) в полимерных гемоконтейнерах отечественного производства.

Задачи исследования:

1. Сравнительное изучение и выбор наиболее перспективных вариантов криофилактического раствора для замораживания эритроцитов при -80°...-140°С.

2. Разработка методик замораживания эритроцитов при -80°С и -140°С с использованием отечественных полимерных контейнеров.

3. Изучение морфологических и функциональных свойств эритроцитов, замороженных под защитой «-пропиленгликоля и ДМАЦ при -80°С и -140°С.

Научная новизна.

Разработан способ криоконс ервирования эритроцитов под защитой пропиленгликоля (18,5 X) и ДМАЦ (5 %) при -80°...-140°С. Впервые доказана возможность долгосрочного хранения эритроцитов при -80° и -140°С под защитой криофилактика на основе 1,2-про-пандиола и ДЩ в стандартных полимерных гемоконтейнерах отечественного производства.

Практическая значимость работа и ее реализация.

Разработанные методы предусматривают замораживание и хранение эритроцитов б электрорефрижераторах под защитой ограждающего раствора на основе пропиленгликоля и ДЩ при температуре -80°...-140°С в отечественных полихлорвшшовых гемоконтейнерах, что позволяет отказаться от эксплуатации жидкаазотного оборудования и металлических контейнеров многоразового использования. Это существенно удешевляет процедуру низкотемпературного консервирования эритроцитов, способствует повышению их качества и упрощает организацию работы "банка" клеток крови.

Консервирование эритроцитов при -80°С, -140°С под защитой ПГ и ДМАЦ в конечных концентрациях 18,5 % и 5 % соответственно обеспечивает более высокую степень сохранности монофункциональных свойств клеток, чем использование классических методов крио-консервирования эритроцитов при -19б°С под защитой глицерина или "Яропандиосахароля" (ПДС).

Работа выполнена в соответствии -с планом НИР по теме

100-95-пб "Обоснование системы долгосрочного хранения запасов гемотерапевтических средств, их транспортировки и применения в военное время", заданной ГВМУ МО РФ.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и транс-фузиологии" (С.-Петербург, 1995), II международной конференции "Новые информационные технологий в медицине и экологии" (Ялта -Гурзуф, 1995).

По теме исследования опубликовано 10 работ, получена приоритетная справка на изобретение: N 96114116/14 (019888) "Способ низкотемпературного консервирования эритроцитов"; оформлено б рационализаторских предложений.

Структура и объем работа.

Диссертация излажена на 1£5 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Текст иллюстрирован 16 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 134 источника, в том числе 87 отечественных и 47 зарубежных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Низкотемпературное консервирование эритроцитов при температуре -80°С и -140°С под защитой комбинированного криопротек-тора на основе ПГ и ДМАЦ в конечных концентрациях 18,5 7, и 5 % соответственно б полихлорвиниловых гемоконтейнерах отечественного производства обеспечивает сохранность 94 ± 3 % клеток.

2. Эритроциты, замороженные этим методом, по своим морфо-функционалшш характеристикам не уступают клеткам, криоконсер-вированным в жидком азоте под защитой ограждающего раствора

"Пропандиосахароль", а по удобству и экономичности предлагаемый способ превосходит методы замораживания эритроцитов в жидком азоте под защитой ПДС и глицерина.

3. Изменение температуры хранения криоконсервированных эритроцитов с -196°С на -140°С не приводит к ухудшению морфо-функциональных свойств этих клеток.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Исследования по разработке метода низкотемпературного консервирования и последующей реабилитации эритроцитов выполняли в научно-исследовательской лаборатории - Центре крови и тканей Военно-медицинской академии.

Объектом изучения в данной работе являлся эритроцитокон-центрат (ЭК), получаемый из консервированной донорской крови 1 - 2 суток хранения; вес ЭК, подвергаемого замораживанию, составлял 199 ± 2,55 г, объем - 191,3 ± 2,5 мл, содержание общего гемоглобина в 1 дозе было не ниже 48,4 г.

Низкотемпературное консервирование эритроцитов проводили при -80°С, -140°С и -196°С.

Криоконсервирование эритроцитов при температуре -196°С в жидком азоте под защитой 1,2-пропандиола выполняли по общепринятой методике ( в соответствии с Методическими рекомендациями "Криоконсервирование эритроцитов под защитой криоконсерванта "Пропандиосахароль", Харьков, 1990 г.).

Заморатоание и хранение эритроцитов при температуре -80°С производили в электрорефрижераторе фирмы "Reveo" в том же полимерном гемоконтейнере, в который был заготовлен ЭК.

Выбранный нами криоконсервант для эритроцитов включает: й-пропиленгликоль (ВФС - 42-1594-86) - 370,0 ДМАЦ (М-Диметилацетамид), х.ч.,

ТУ 6-09-537-73, ГОСТ 3885-73 - 100,0 сахароза, чда, ГОСТ 8833-75 - 32,0

натрия хлорид, чда, ГФ X, с. 426, 442 - 6,0 Воды для инъекций ( РФ X, с. 74 ) до 1000 мл

Все ингредиенты, включенные в указанный раствор, разрешены Фармкомитетом МЗ РФ для клинического применения и отвечают требованиям, предъявляемым к веществам для внутривенного введения.

Подвергнутый автоклавированию в течение 45 минут при 1,1 атм. криофилактический раствор подвергали испытанию на токсичность и пирогенность по методике В.М. Гучка (1987). Среда, подвергавшаяся исследованию, была стерильна, нетоксична, адиро-генна и не содержала механических включений.

Насыщение эритроцитов осуществляли путем осторожного наслаивания криолротектора по стенке контейнера в соотношении 1:1 к объему ЭК и последующего быстрого их перемешивания переворачиванием герметизированного "Гемакона" с суспензией эритроцитов (5 - 10 раз) при температуре +£0°...+25°С. Перемешивание осуществляли в "Гемаконе", после чего, с соблюдением правил асептики, этот контейнер соединяли с контейнером "Компопласт 300". Взвесь эритроцитов в криофилактическом растворе равномерно распределяли в двух контейнерах, которые помещали в металлический пенал-холдер. Между стенками холдера и контейнером размещали картонные прокладки толщиной 1,0 - 1,5 мм. Затем холдер с подготовленными к замораживанию эритроцитами на 35 - 40 минут помещали в заморачшватель на -140°С или в пары жидкого азота (в хранилище ХБ-0.2); при этом охлаждение биосуспензии происходило со

скоростью 2,5 - 3°С/мин. до температуры -80°С. Замороженные эритроциты переносили в низкотемпературный прилавок на -80°С для хранения.

Размораживание эритроцитов проводили в водяной бане при температуре +42°...+45°С в течение 2 - 3 мин.

Отмывание размороженных эритроцитов осуществляли общепринятым методом двух-трехкратного серийного центрифугирования в тех же полимерных контейнерах, в которых они хранились, с использованием стандартных отмывающих растворов, приготовленных на основе маннита.

Отмытые эритроциты ресуспендировали в растворе ДНИИГПК 8В в соотношении 1:1.

Криоконсервирование эритроцитов при температуре -140°С осуществляли в электрорефрижераторе фирмы "Reveo". Состав криокон-серванта и порядок насыщения им ЭК аналогичны способу низкотемпературного консервирования эритроцитов при температуре -80°С. Этап замораживания отличался от вышеописанного метода тем, что гемоконтейнеры со взвесью эритроцитов в крисфшгактическом раст-Еоре переносили сразу в рабочую камеру низкотемпературного прилавка, где эритроциты подвергались спонтанному замораживанию и последующему хранению. Последовательность и содержание этапов реабилитации клеток после их криоконсервирования при -140°С соответствовали аналогичным манипуляциям метода замораживания эритроцитов при -80°С.

Помимо трех методов низкотемпературного консервирования эритроцитов, указанных выше, в данной работе были изучены ЭК, криоконсервированные при температуре -196°С, а затем в процессе хранения перенесенные из жидкоазотного хранилища в электрорефрижераторный прилавок фирмы "Reveo" на -140°С. В первой серии опы-

тов. ЭК замораживали под защитой криоконсерванта "Пропандиосаха-роль" (НДС), во второй - под защитой глицерина по методу ЦНЖРПК в конечной концентрации криопротектора 20 согласно "Инструкции по криоконсервированию клеток крови" (1995) и "Руководству по военной трансфузиологии" (1991).

Таким образом изучение монофункциональной полноценности эритроцитов, подвергавшихся низкотемпературному консервированию при различных температурах, проводилось в 6-ти группах образцов (табл. 1).

Исследования морфофункциональной полноценности эритроцитов в каддой группе проводили до и после низкотемпературного консервирования ЭК.

Эритроцитоконцентрат, криоконсервированный под защитой ВДС и глицерина при температуре -19б°С (I и IV серии опытов), рассматривали в качестве контрольных.

Оценку морфофункциональной полноценности эритроцитов проводили по следующим методикам: подсчет количества эритроцитов; определение процентного соотношения дискоидных, обратимо измененных и предгешлитических форм эритроцитов при помощи сканирующей электронной микроскопии (СЭМ); определение содержания общего гемоглобина в дозе ЭК; определение уровня свободного гемоглобина в надосадочной жидкости (в образцах размороженнных эритроцитов) на спектрофотометре по методу Singer (1951); определение гематок-ритного показателя в ЭК унифицированным микрометодом в модификации Й. Тодорова (.1961); определение кислотной резистентности исследуемых эритроцитов; исследование реологических свойств биосреды по методу З.Д. Федоровой (.1995); исследование степени активации процесса перекисного окисления липидов (ГОЛ) на мембра-

нах эритроцитов, определяемого по уровню содержания малонового диальдегида (МДА) по методу М. Uchiyama et М. Michara в модификации Л.И. Андреевой и соавт. (1988); определение содержания АТФ в эритроцитах методом Лампрехта - Тротшольда (1965); изучение газотранспортной функции эритроцитов при помощи анализатора диссоциации кислорода НЕМ-О-SCAN фирмы "Aminco" (USA), позволяющего построить кривую диссоциации оксигемоглобина (КДО) декриоконсер-вированных эритроцитов и рассчитать точку Р50.

Таблица 1

Распределение ЭК по группам исследования

1 ■ 1 |Группа! (опытов! Криопротек-тор 1 1 | Тип | | контейнера | 1 | Температура хранения " 1 Количество | образцов ЭК |

1 I 1 ЦДС I 1 |металлический! 1 | -196°С 15 !

1 П 1 ПДС +■ ДМАЦ 1 1 ! полимерный | -80°С 60 !

1 III 1 ЩС + ДМАЦ | полимерный | 1 | -140°С SO I

1 IV 1 глицерин 1 ! ¡металлический! 1 | -19б°С 15 1

1 V | ЩС 1 1 ¡металлический! 1 1 1 1 ; | -19б°С И перенос на -140°С яо |

1 VI | | 1 глицерин 1 1 (металлический) 1 1 ! 1 1 1 -19б°С и перенос на -140°С SO | 1

| ИТОГО: 150 | | |

- 10 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

На первом этапе исследования определена морфофункциональная полноценность эритроцитов, подвергавшихся замораживанию до -80°С под защитой комбинированного криопротектора на основе пропиленгликоля и ДМАЦ, в сравнении с аналогичными свойствами эритроцитов, криоконсервированных в жидком азоте под защитой ВДС.

Установлено, что некоторые показатели морфофункциональной полноценности эритроцитов, подвергавшихся замораживанию и хранению при температуре -80°С и криоконсервированных при температуре -Ш°С, не имеют статистически достоверных различий (р > 0,05; табл. 2). Статистически значимые различия наблюдались в величинах таких показателей морМункциональной полноценности клеток, как кислотная резистентность, реологические свойства, уровень АТФ и газотранспортная функция, которые были достоверно Еыше в опытной серии по сравнению с эритроцитами, криоконсервированными в жидком азоте (р < 0,05).

В ходе исследования установлено, что эритроциты, хранившиеся при температуре -80°С, более устойчивы к действию гемолитика, чем криоконсервированные эритроциты контрольной группы. Содержание в исследуемых ЭК высокостойких форм клеток для опыта и контроля составило 74,5 ± 2,5 % и 64,8 ± 2,7 I соответственно (р < 0,05). Реологические характеристики эритроцитосодержащих сред, подвергавшихся исследованию, были достоверно лучше у опытных ЭК по сравнению с контролем. Так индекс деформируемости (ИДэ) У эритроцитов, хранившихся в электрохолодильнике при температуре -80°С и в жидком азоте был 0,98 ± 0,04 у.е. и 0,87 * 0,04 у.е. соответственно (р < 0,05), а коэффициент вязкости (ИВЭ/С) ЭК, хранившихся в электрохолодильнике, был ниже,

Таблица 2

Показатели сохранности морфофункциональных свойств эритроцитов, замораживавшихся при температурах -80°С (I) и -196°С (II) (М ± ш)

№ ........... Показатель ( п 1 = 45 ) ( !') II = 15 ) Р

1 Вес ЭК, г 181,6 ± 2,02 182,4 ± 2,71 > 0,05

Содержание общего гемогло- 47,1 ± 0,80 46,6 ± 0,40 > 0,05

бина в дозе, г

3 Количество эритроцитов в 3,95 ± 0.04* 3,96 ± 0,07* > 0,05

ЭК, х1012/л

4 Уровень свободного гемо- 0,69 ± 0,04* 0,62 * 0,05* > 0,05

глобина, г/л

5 Гематокрит, 1 41,8 ± 0,28* 41,2 ± 0,3-6* > 0,05

6 Морфология:

- X дискоидных и др. обра- 97,6 ± 0,39 96,6 ± 0,40 > 0,05

тимо измененных клеток;

- 7, сфероцитов 2,4 ± 0,39 3,4 * 0,40 > 0,05

7 Кислотная резистентность:

- % высоко- и среднестой- 90,9 ± 0,70 89,3 ± 1,20 0,05

КИХ форм;

- % низкостойкях форм и 9,1 ± 0,70 10,7 + 1,20 < 0,05

сфероцитов;

- пик гемолиза, мин; 5,5 + 0,16 5,0 ± 0,14 < 0,05

- окончание гемолиза, мин. 8,9 ± 0,16 8,1 1 0,17 < 0,05

8 Реологические св-ва:

" ИДэритроиита. У-6.; 0,98 ± 0,04 0,87 * 0,04 0,05

- КВзр/среды, У.е. 2,08 ± 0,05 О О! ± 0,07 < 0,05

9 Содержание ЩА, 1 от 1, е.- 4 0,09 1,14 ± 0,08 > 0,05

нмоль/'Ю9 клеток

10 АТФ, мкмоль/г НЬ о оо О, ± 0,05 3,15 ± 0,02 < 0,05

11 Газотранспортная функция:

- Р50, мм рт.ст. £3,0 ±0,38 21,2 ± 0,44 < 0,01

- коэффициент Бора, у.е. .............. -0,31 ± 0,003 -0,30 1 0,002 < 1 0,05

*-после добавления к ЭК взвешивающего раствора в соотношении 1:1

чем у ЭК, замороженных при -19б0С, и составлял соответственно 2,08 ± 0,05 у.е. и 2,21 ± 0,07 у.е. (р < 0,05). Содержание АТФ в эритроцитах опытной серии (3,33 ± 0,05 мкмоль/г НЬ) было достоверно (р < 0,05; табл. 2) выше, чем в контроле (3,15 ± 0,02 мкмоль/г НЬ). Эти данные косвенно свидетельствуют о лучшей сохранности эритроцитов опытной серии по сравнению с контрольной.

В ходе изучения монофункциональных свойств эритроцитов после размораживания выявлена достаточно высокая степень сохранности их в процессе замораживания-хранения при температуре -80°С в электрохолодильнике, которая составила 04 ± 3% для экспериментальных ЭК и 90 ± 3% для контроля.

Результаты исследования зритроцитоконцентратов методом сканирующей электронной микроскопии также свидетельствуют о морфологической полноценности эритроцитов в ЭК, сохраняемых при температуре -80°С: количество дискоцитов составило 78 Ж, шиповатых эритроцитов (эхиноцитов) - 8 отростчатых клеток - 7 %, угловатых форм - 4 I, сфероцитов - 3 X.

Показатели, характеризующие степень сохранности газотранспортной функции декриоконсервированных эритроцитов, были достоверно лучше у клеток, подвергавшихся низкотемпературному хранению при -80°0: Р50 у эритроцитов в опыте составил £3,0 ± 0,38 мм рт.ст., а в контроле - £1,2 ± 0,44 мм рт.ст. (р < 0,01); коэффициент Бора соответственно равнялся -0,31 ± 0,003 у.е. и -0,30 ± 0,002 у.е. (р < 0,05; табл.2).

Таким образом эритроциты, замороженные по разработанной нами методике под защитой ПГ и ДМАЦ в полимерном контейнере 'Тема-кон 500/300" в электрорефрижераторе при температуре -80°С, по своим морфофункциональным свойствам практически не уступают эритроцитам, криоконсервированным при -196°С в жидком азоте в

алюминиевых контейнерах под защитой ПДС; по некоторым показателям (кислотная резистентность, реологические свойства, уровень АТФ, газотранспортная функция) сохранность опытных ЭК достоверно выше, чем в декриоконсервированных ЭК контрольной группы,

Даше была исследована возможность замораживания эритроцитов в полимерных гемоконтейнерах отечественного производства (типа 'Темакон") при -140°С; изучена морфофункциональная сохранность клеточного материала в ЗК, криоконсервированных под защитой ограждающего раствора на основе 1,2- пропандиола и ЩЩ при указанной температуре.

В результате серии экспериментов, проведенных на предварительном этапе исследования, мы установили принцишшьную возможность использования отечественных полихлорвиниловых контейнеров для хранения эритроцитов в диапазоне температур -80°...-140°С. На следующем этапе исследований мы приступили к низкотемпературному консервированию эритроцитов при температуре -140°С. Техническое решение данного вопроса выглядело следующим образом. Получение ЭК из донорской крови 51 подготовку их к замораживанию осуществляли по общепринятой методике (в соответствии с требованиями руководящих документов). К "Гемакону 500", содержащему насыщенный криофилактиком ЭК, соблюдая правила асептики, подсоединяли полимерный контейнер емкостью 300 мл, после чего взвесь клеток в растворе криопротектора (суммарный объем 400 ± 20 мл) равномерно распределяли по отделениям сдвоенного гемоконтейнера и помещай в металлический пеная-холдер так, чтобы слой биосуспензии составлял 14 - 18 мм. Между стенками холдера и полимерного контейнера находились картонные прокладки толщиной 1,0 - 1,5 мм. Затем холдер с находящейся в нем «.неточной суспензией помещали на -140°С в рабочую камеру низкотемпературного прилавка

"Reveo". Охлаждение клеточных суспензий происходило со средней скоростью 3°С/мин. Требуемая температура при этом достигалась за 50 - 55 мин. Длительность хранения эритроцитов, замороженных таким способом колебалась в эксперименте от 10 суток до 24 месяцев (срок наблюдения). Затем замороженные ЭК извлекали из холодильника и подвергали декриоконсервированию по обычной методике, после чего изучали шрфкх^ункциональяые свойства размороженных и отмытых эритроцитов.

Исследовано £0 образцов ЭК, обработанных криопротектором, содержащим ПГ и ДМАЦ, подвергавшихся замораживанию и хранению при температуре -140°С. В качестве контроля использовали 15 образцов ЭК, криоконсервированных в жидком азоте (при температуре -196°С) под защитой ПДС.

Шрфс#нкциональные свойства эритроцитов, криоконсервированных при температуре -140°С в электрохолодильнике под защитой комбинированного криопротектора, представлены в таблице 3.

При статистической обработке результатов исследования мор-фзфункциональной полноценности эритроцитов, подвергавшихся замо-рада.анию и хранению при температуре -140°С и криоконсервированных при температуре -196°С, между величинами некоторых показателей в опытной и контрольной сериях статистически достоверных различий не выявлено (р > 0,05; табл. 3). Так, вес де-криоконсервированного ЭК в опыте (186,2 ± 1.58 г) и контроле (.182,4 t 2,?1 г) не имел достоверных отличий (р > 0,05). Содержание общего гемоглобина в дозе ЭК в эксперименте и контроле достоверно не отличалось (р > 0,05) и составляло соответственно 47,4 ± 0,62 г и 46,6 ± 0,40 г. Различия в количестве эритроцитов в дозе декриоконсервированного ЭК не были статистически значимыми и составили в опыте 3,98 ± 0,06 х ю12/л и контроле 3,96 ±

Таблица 3

Морфофункциональные свойства эритроцитов, замороженных под зашдтой ПГ+ДМАЦ при температуре -140°С (I) и ПДС

при -196°С (II /контроль/ (М ± т)

N0 Показатель (п 1 I 1 = 20) | (п II = 15) Р

1 Вес ЭК, г 186,2 ± 1,58 | 182,4 + 2,71 > 0,05

о Содержание общего гемоглобина в дозе, г 47,4 ± 0,62 ! 46,6 4 0,40 > 0,05

3 Количество эритроцитов в ЭК, х101й/л 3,98 ± 0,06*1 3,96 * 0,07* > 0,05

4 Уровень свободного гемоглобина, г/л 0,37 ± 0,08*! 0,62 ± 0,05* < 0,05

5 6 Гематокрит, л/л Морфология: 0,48 4 0,01*1 0,41 ± 0,02* > 0,05

- % дискоидных и др. обра- 98,1 ± 0,33 1 96,6 ± 0,40 < 0,05

тимо измененных клеток;

- 7, сфероцитов 1,9 ± 0,33 | 3,4 — 0,40 < 0,05

7 Кислотная резистентность:

- % высоко- и среднестой- 92,3 ± 0,55 1 89,3 * 1,20 < 0,05

ких форм;

- % низкостойких форм и 7,7 ± 0,55 | 10,7 ± 1,20 < 0,05

сфероцитов;

- пик гемолиза, мин; 5,5 ± 0,18 ! 5,0 ± 0,14 < 0,05

- окончание гемолиза, мин. 8,5 ± 0,18 | 8,1 ± 0,17 > 0,05

8 Реологические св-ва:

~ ВДэритроцита» У-е.; 0,99 + 0,08 | 0,87 ± 0,04 > 0,05

- КВЭр/среды> У- 2,10 ± 0,07 | 2,21 ± 0,07 > 0,05

9 Содержание ИДА, 1,19 ± 0,06 ! 1,14 ± 0,08 > 0,05

нмоль/109 клеток

10 АТФ, мкмоль/г НЬ 3, ЗУ ± 0,04 | 3,15 ± 0,02 < 0,05

11 Газотранспортная функция:

- Р50, мм рт.ст. 23,5 ± 0,315 | 21,2 ± 0,44 < 0,01

- коэффициент Бора, у.е. -0,31 1 ± 0,002 1 -0,30 t 0,002 < 0,05 |

*-после добавления к ЭК взвешивающего раствора в соотношении 1:1

0,07 х ю12/л (р > 0,05). Гематокрит в эксперименте составлял 0,42 ± 0,01 л/л и не имел достоверных отличий от аналогичного показателя в контрольной серии (0,41 ±0,02 л/л) (р > 0,05; табл. 3). Реологические характеристики эритроцитов, криоконсер-вированных под защитой ПГ и ДМАЦ при температуре -140°С, практически совпадали с соответствующим "Показателем эритроцитов, крио-консервированных в жидком азоте: ИДЭ составлял соответственно 0,99 ± 0,08 у.е. и 0,87 1 0,04 у.е., а КВЭ/С - 2,10 ± 0,07 у.е. и 2,21 ± 0,07 у.е. (р > 0,05). Содержание МДА в эксперименте и контроле не имело статистически значимых отличий и составляло соответственно 1,19 ± 0,06 нмапь/109 клеток и 1,14 ± 0,08 нмоль/109 клеток (р > 0,05; табл. 3).

Вместе с этим некоторые показатели морфофункциояальной полноценности опытных и контрольных декриоконсервированных эритроцитов имели статистически достоверные различия. Так уровень свободного гемоглобина в надосадочной жидкости в эксперименте (0,37 ± 0,08 г/л) был достоверно ниже, чем в контроле (0,62 ±0,05 г/л) (р < 0,05; табл. 3). При изучении морфологии эритроцитов было установлено, что в опытных образцах ЗК содержится несколько большее количество дискоидных и других обратимо измененных клеток (98,1 ± 0,33 %) по сравнению с контролем (96,6 ± 0,40 I) (р < 0,05). Кислотнорезистентные свойства исследуемых эритроцитов были достоверно лучше, чем в контроле: высоко- и среднестойкие формы составляли 92,3 ± 0,55 1 и 89,3 ± 1,20 1 соответственно (р < 0,05); а пик гемолиза отмечался на 5,5 ± 0,18 мин. и 5,0 ± 0,14 мин. (р < 0,05; табл. 3). Содержание АТФ в эритроцитах опытной серии (3,39 ±0,04 мкмоль/г НЬ) было достоверно (р < 0,05; табл. 3) выше, чем в контроле (3,15 ± 0,02 мкмоль/г НЬ). Показатели газотранспортной функции были достовер-

но лучше у клеток, подвергавшихся низкотемпературному хранению при -140°С: Р50 у эритроцитов в опыте составил 23,5 ± 0,35 мм рт.ст., а в контроле - 21,2 ± 0,44 мм рт.ст. (р < 0,01); коэффициент Бора соответственно равнялся -0,31 ± 0,002 у.е. и -0,30 ± 0,002 у.е. (р < 0,05; табл. 3),

Сохранность клеточного материала в экспериментальных образцах ЭК (93,5 ± 2,5 %) была несколько выше, чем в контроле (90 ± 3 X).

При изучении морфологии клеток в опытной серии ЭК методом сканирующей электронной микроскопии были получены данные, свидетельствующие о морфологической полноценности эритроцитов, сохраняемых при температуре -140°С. Количество дискоцитов в ЭК, длительно хранившихся при температуре -140°С в электрохолодильнике под защитой ПГ и ДМАЦ, составило 79 I, шиповатых эритроцитов (эхиноцитов) - 8 а, отростчатых клеток - 8 X, угловатых форм - 3 X, сфероцитов - 2 X. Эти данные свидетельствуют о преобладании в опытных образцах ЭК морфологически неповрежденных форм эритроцитов.

Таким образом, зритроцитоконцентраты, сохраняемые в полимерных гемоконтейнерах при -140°С, отвечают требованиям, предъявляемым к декриоконсервированным эритроцитам для клинического применения и по своим морфофунщгонашьным свойствам не уступают эритроцитам, криоконсервированннм в жидком азоте при температуре -Ш°С, а по некоторым из показателей и превосходят эритроциты, криоконсервированные традиционным способом.

Нами изучена также возможность переноса эритроцитосодержа-щих сред, изначально криоконсервированных и длительно хранившихся в жидком азоте при температуре -19б°С под защитой "Пропандио-сахароля" и глицерина, в электрорефрижератор на -140°С. В декри-

(консервированных образцах крови, подвергшихся изменению температурного режима хранения, исследовали все указанные выше показатели морфофункционаяьной полноценности клеток. Достоверных различий с контролем не было выявлено ни по одному показателю морфофункциональ ной полноценности клеточного материала.

Показатель сохранности клеток для ЭК, криоконсервированных с ГЩС и раствором ЦНИИГПК lis, составил соответственно 90 ± 3 I и 66 t 2,5 I. Результаты лабораторных исследований эритроцитосо-держащих сред свидетельствуют о сохранении эритроцитами после изменения (повышения) температуры хранения до -140°С своих мор-фофункциональных свойств на удовлетворительном для дальнейшего клинического применения уровне.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ консервирования (замораживания) эритроцитов при температуре -80°С и -140°С с использованием криоза-щитяого раствора на основе пропиленгликоля и диметилацетамида в конечных концентрациях 18,5 % и 5 % соответственно, обеспечивающий сохранность до 94 ± 3 1 клеток. Такие эритроциты по своим мор|юфункциональным свойствам не уступают эритроцитам, криокон-сервированным в жидком азоте под защитой 1Щ0, и отвечают требованиям, предъявляемым к декряоконсервированным эритроцитам для клинического применения.

2. Предлагаемый метод замораживания и хранения эритроцитов в электрорефрижераторе позволяет использовать отечественные полимерные гемоконтейнеры, дает возможность отказаться от жидкого азота и алюминиевых контейнеров, что значительно упрощает технологий низкотемпературного консервирования меток крови.

3. Изменение температуры хранения ЭК, изначально криокон-сервированных при температуре -19б°С под защитой ПДС и глицерина, на -140°С не сопровождается ухудшением морфофункциональных характеристик эритроцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью создания запасов эритроцитосодержашдх сред использовать замораживание и хранение зритроцитоконцентрата в отечественных полихлорвинмовых контейнерах типа Темакон" при температуре -80°,.,-140°С в электрорефрижераторе.

2. В качестве криопротектора при замораживании эритроцитов до -80°. . .-140°С применять ограждающий раствор на основе 1,2-пропандиола и дшетилацетамида в конечных концентрациях 18,5 1 и 5 X соответственно.

3. При возникновении аварийных ситуаций в банке крови, связанных с выходом из строя жидкоазотного оборудования, с целью сохранения запаса криоконсервированных ЭК следует осуществлять перенос контейнеров, содержащих замороженные эритроциты, из жидкого азота в электрохолодильные установки на -140°С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Багаутдинов Ш.М., Петренко Г.И., Вильянинов В.Н., Мядзю-та В.Е. Метод ускоренного охлаждения биосуспензии в электрохолодильнике // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: Сб. изобр. и рац. предложений. Вып. 27. - СПб., 1996. - С. 8.

Z. Вильянинов В.H., Захаров B.B., Данильченко B.B., Калеко С.П., Петренко Г.И., Рождественская E.H., Ващенко В.И., Игнатович Г.П., Мядзюта В.Б. Способ замораживания эритроцитов при -80°С // Новые информационные технологии в медицине и экологии: Тез. докл. 11-й Международной конф. - Ялта-Гурзуф, 1936.- С. 15,

3. Вильянинов В.Н., Калеко С.П., Багаутдинов Ш.М. Метод замораживания эритроцитов под защитой комбинированного криопротек-тора // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: Сб. изобр. и рац. предложений. Вып. 27. - СПб., 1996. - С. 15.

4. Вильянинов В.Н., Шкатов Е.А. Отмывание эритроцитов на аппарате РК-05 // Итоговая конференция военно-научного общества курсантов академии, посвященная XIX Всесоюзной партконференции: Сб. тез. научн. работ. - Л.: BMA, 1988. - С. 263.

5. Вильянинов В.Н., Шкатов Е.А., Петренко Г.И., Багаутдинов Ш.М. Способ хранения стандартных криоконсервированных эритроцитов /7 Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: Сб. изобр. и рац. предложений. Вып. 20. - Л., 1989. - С. 21.

6. Даншьченко В.В., Сидоркевич C.B., Калеко С.П., Багаутдинов Ш.М., Петренко Г.И,, Тюрин Р.В., Вильянинов В.Н. Организация банков низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга /7 Актуальные вопросы службы крови и трансфузио-логии. - СПб. 1995. - С.56.

7. Калеко С.П., Петренко Г.И., Багаутдинов Ш.М., Вильянинов В.Н., Шкатов Е.А. Применение криоконсервированных стандартных эритроцитов при определении групповой принадлежности крови //

Актуальные вопросы военно-морской и клинической хирургии: Тез. докл. научн. конф. - Л., 1989. - С. 72-73.

8. Петренко Г.И., Багаутдинов Ш.М., Калеко С.П., Вильянинов

B.Н. Метод сохранения биопродукта при переносе его с -196°С на -140°0 // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: Сб. изобр. и рад. предложений. Вып. 27. - СПб., 1996. - С. 53-54.

9. Петренко Г.И., Сидоркевич C.B., Багаутдинов Ш.М., Вильянинов В.Н. Опыт замораживания эритроцитов при -80° * -140°С // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. - СПб., 1995. - С. 225-226.

10. Шкатов Е.А., Вильянинов В.Н., Петренко Г.И., Багаутдинов Ш.М. Приспособление для укладки пластикатных контейнеров // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: Сб. изобр. и рац. предложений. Вып. 20. - Л., 1989. -

C. 114.

Подписано в печать 14.05.97. Формат 60x84/16 Печать ризографическая. Заказ № 1/1405. П. л. 1.31. Уч.-изд. л. 1.3. Тираж 100 экз.

АОЗТ "КопиСервис", 194156, Санкт-Петербург, Б. Сампсониевский пр., 93