Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Функциональное состояние лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -80°С под защитой комбинированного криоконсерванта

На правах рукописи

Худяков Андрей Николаевич

Функциональное состояние лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -80°С под защитой комбинированного криоконсерванта

14.01.21 - гематология и переливание крови 03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

? 0. МАМ 2010

Санкт-Петербург - 2010

004602339

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор медицинских наук, профессор Сведенцов Евгений Павлович

доктор медицинских наук, профессор Данильченко Владимир Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Захаров Юрий Михайлович

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Санкт-Петербург)

Защита состоится Ч> СМ 2010 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфу-зиологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Автореферат диссертации разослан « ¿3» аи/ьМ^? 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Применение различных клеточных компонентов крови в лечебной практике возможно только при наличии постоянных запасов консервированных клеток. Криоконсервация компонентов крови в настоящее время является одной из актуальных областей развития научной исследовательской деятельности (A.M. Белоус, В.И. Грищенко, 1994; Е.П.Сведенцов, 1999; J.Wolfe et al. 1999; С.Koshimoto, 2002). На сегодня криоконсервирование - единственный известный метод, способный обеспечить длительную сохранность ядерных клеток животных и растений. Данные по этой проблеме свидетельствуют, что чем проще организованы клетки, тем лучше они переносят неблагоприятное воздействие факторов охлаждения (замораживания) - отогрева. На примере крови этот тезис был доказан применительно к разным популяциям клеток крови (A.A. Цуцаева, 1981; A.M. Голдовский, 1986; A.M. Белоус, 1994, C.B. Утемов и соавт., 1995, 1999; Е.П. Сведенцов и соавт., 2000, 2004). Различные виды клеток крови, имея сложную внутреннюю структуру, нуждаются в индивидуальных методах замораживания, включающих программу охлаждения и состав криозащитного раствора.

В настоящее время показаниями к применению лейкоконцентрата являются патологические состояния различного происхождения, при которых организм не в состоянии самостоятельно остановить инфекционный процесс (В.А. Аграненко, 1985; K.M. Абдулкадыров, 1994; Д.Н. Балашов, 2001; J. Neppert, 1996; A. Sputtek, 2004). Однако, лейкоцитарная масса как трансфу-зионная среда до сих пор не получила широкого распространения в лечебной практике. Во многом это связано с трудностями хранения данного трансфу-зионного компонента. Установлено, в частности, что у выделенных грануло-цитов быстро нарушаются морфофункциональные свойства: уже через 48 часов исчезает способность к фагоцитозу (A.M. Белоус, В.И. Грищенко, 1994; М.Ф. Заривчацкий, 1995). Единственным методом долгосрочного хранения лейкоцитов является замораживание при температурах ниже 0°С. Исследования по криоконсервации лейкоцитов при температурах -20°С и -40°С пока-

зали возможность лишь недолговременного сохранения их функциональной активности и морфологического состояния (О.Н. Деветьярова, 2005; О.О. Щеглова, 2005). Использование диапазона низких температур весьма перспективно в связи с рядом преимуществ перед сохранением при ультранизких температурах. В числе этих преимуществ следует назвать использование электроморозильников вместо дорогого в эксплуатации жидкоазотного криогенного оборудования (C.B. Утемов, 1999; Е.П. Сведенцов и соавт. 2000). Криоконсервация при температуре -80°С обеспечивает длительную сохранность клеток без сильного влияния на их функциональную полноценность, что особенно важно в отношении лейкоцитов, которые быстро изменяют деятельность различных систем клетки (С.С. Лаврик, 1971; C.B. Утемов, 1995; A. Galmes, et al., 1996; P. Halle et al., 2001). Таким образом, актуальным является вопрос о создании метода криоконсервации лейкоцитов, позволяющего сохранить функциональную активность данных клеток на высоком уровне в течение длительного времени и не требующего использования дорогостоящего оборудования.

Цель исследования - определить функциональное состояние лейкоцитов крови человека, перенёсших холодовой анабиоз при -80°С, введение в который осуществлялось по разработанному методу с помощью нелинейной программы замораживания под защитой оригинального комбинированного криоконсерванта.

Задачи исследования:

1. Разработать оптимальный состав хладоограждающего раствора, сравнив три варианта раствора по показателям функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов, замороженных под их защитой до -80°С.

2. Изучить функциональные и морфологические свойства лейкоцитов крови человека, замороженных до -80°С, через различные сроки хранения.

3. Провести биологические испытания нового оптимального хладоограждающего раствора и переносимость аутотрансфузий лейкоконцентрата,

подвергавшегося холодовому стресс-воздействию под его защитой, на экспериментальных животных.

Научная новизна. Изучено функциональное состояние лейкоцитов крови человека, вышедших из долговременного криоанабиоза при -80°С, введение в который осуществлялось с применением нелинейной программы охлаждения с помощью электроморозильников на -30°С и -80°С и под защитой разработанного криоконсервирующего раствора. Разработанный поликомпонентный криоконсервирующий раствор для лейкоцитов крови человека содержит протекторы различного типа действия: ГМБТОЭМ (гексаметиленби-стетраоксиэтилмочевина) и ДМСО (диметилсульфоксид), а также антигипок-сант и антиоксидант ОМЭПС (сукцинат оксиметилэтилпиридина). Дано научное обоснование его криозащитных свойств.

Теоретическая и практическая значимость работы. Дано научное обоснование криозащитных свойств нового хладоограждающего раствора, включающего в себя криопротекторы ГМБТОЭМ и ДМСО и «реставрирующую» добавку ОМЭПС. Результаты проведённых исследований расширяют представление об общих механизмах криоповреждения и криозащиты на клеточном уровне при температуре хранения -80°С.

В результате проведенных биологических (определение пирогенности, «острой» и «хронической» токсичности) исследований выявлено, что разработанный хладоограждающий раствор нетоксичен, апирогенен, не требует отмывания от биообъекта после его размораживания, не вызывает реакций и осложнений у животных при внутривенном введении с размороженным лейкоцитным концентратом. Результаты данного исследования представляют интерес для различных учреждений биологического и медицинского профиля.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хладоограждающий раствор, содержащий протекторы ГМБТОЭМ и ДМСО, а также антигипоксант и антиоксидант ОМЭПС и воду, нетоксичен, апирогенен и не требует отмывания биообъекта после отогрева и перед трансфузией.

2. Новый криозащитный раствор позволяет вводить лейкоциты в холо-довой анабиоз при -80°С по нелинейной программе с помощью 2-х электроморозильников (на -30°С и -80°С) без использования жидкого азота и дорогого криогенного оборудования.

3. Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -80°С под защитой нового хла-доограждающего раствора, сохраняются на высоком уровне в течение 180 суток (срок наблюдения).

Апробация работы. Результаты исследований доложены на V и VI молодежных научных конференциях Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006, 2007); I Всероссийской молодёжной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008); научно-практической конференции «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2008); научных конференциях с международным участием «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Новые криобиотехнологии для решения фундаментальных и прикладных задач медицины» (Харьков, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); объединённом заседании Кировского филиала Российского физиологического общества имени И.П. Павлова и Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2008), Ученом Совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2008).

Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и размороженных лейкоцитов, проведена статистическая обработка результатов исследования. Он принимал участие в разработке и исследовании хладоограждающего раствора, проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе три статьи, одна из них в журнале рекомендованном ВАК.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 98 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов экспериментальных исследований), выводов, списка цитируемой литературы (198 источников, из них 112 отечественных и 86 иностранных) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация содержит 20 таблиц, 7 рисунков.

Материалы и методы исследования Для проведения исследований использовали лейкоцитный концентрат, полученный по информированному согласию из цельной крови доноров-добровольцев (средний возраст 35,6 ± 5,0 лет) в отделении гравитационной хирургии крови клиники ФГУ Кировского НИИГиПК ФМБА России. Кровь в полиолефиновых мешках для её сбора «Teruflex 450-400-400» помещали в стакан центрифуги Sorvall (США), избегая образования складок, уравновешивали и центрифугировали (960g) с охлаждением в течение 5 мин. Далее контейнер с кровью помещали в плазмоэкстрактор «ПЭК-3». Обогащенную тромбоцитами плазму переводили в спаренный мешок, затем лейкоцитарную пленку осторожно переводили в контейнер «Компопласт 300». Оставшуюся эритроцитную массу разбавляли в соотношении 5:1 изотоническим 0,9% раствором NaCl и реинфузировали донору. Объём лейкоцитного концентрата в среднем составлял 22,7 ±6,1 мл.

Лейкоконцентрат смешивали с разработанным хладоограждающим раствором в соотношении 1:1 и эквилибровали при комнатной температуре в течение 20 мин. Подготовленный биообъект погружали в заполненную хладо-носителем - 96% этиловым спиртом 4-литровую ванну камеры Криостата (электрический морозильник на -30°С, разработанный ГУ Кировским НИИ гематологии и переливания крови и Институтом проблем криобиологии и криомедицины HAH Украины), охлажденную до -28°С (температура адапта-

ции), экспозиция в которой составляла в среднем 15 мин. Далее биоматериал переносили в электроморозильник на -80°С для дальнейшего замораживания и хранения. Запись термограмм осуществляли с помощью прибора ГСП-04 по датчику ТСМ-3-02, установленному в одном из контейнеров с имитатором - раствором криоконсерванта с конечной концентрацией его ингредиентов. Отогрев проводили в водяной ванне с температурой +38°С.

Величину рН измеряли на ионометре Эксперт-001 фирмы «Эконикс-эксперт». Значение рН до замораживания и после отогрева смеси во всех опытах соответствовало физиологической норме: 7,0-7,4.

Изучение свойств лейкоцитов до замораживания и после отогрева проводили по следующим методикам:

Подсчет общего количества лейкоцитов выполняли в камере Горяева.

Изучение морфологического состава концентрата лейкоцитов.

Содержание Т- и В-лимфоцитов оценивали с помощью моноклональных антител в непрямом иммунофлуоресцентном тесте.

Жизнеспособность лейкоцитов определяли в пробах исключения витального красителя эозина по методу Я. БЬгеск (1936).

Функциональное состояние лейкоцитов выявляли по показателям фагоцитарной активности нейтрофилов, уровню окислительно-восстановительного метаболизма и содержанию лизосомапьно-катионных белков.

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по модифицированному методу С.Г. Потаповой и соавторов (1977), основанному на определении способности данных клеток поглощать инертные частицы латекса (диаметр частиц 0,8 микрона). Выявляли процент фагоцитирующих нейтрофилов, то есть фагоцитарную активность (ФА).

Оценку окислительно-восстановительного метаболизма в нейтрофилах осуществляли с помощью НСТ-теста (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992). НСТ-тест отражает кислородозависимый метаболизм и связанную с ним наработку свободных радикалов.

Содержание соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофи-лов без участия кислорода (дефензинов, серпроцидинов, кателицидинов), определяли с помощью лизосомапьно-катионного теста по методике А.А. Сла-винского и Г.В. Никитиной (1999).

Изучение биологических особенностей хладоограждающего раствора на экспериментальных животных проводили согласно Х1-й Государственной Фармакопее (ГФ) СССР (1990). Изучали такие показатели как острая и хроническая токсичность препарата, его пирогенность и переносимость ауто-трансфузий размороженных лейкоцитов.

Таблица 1

Животные, использованные в экспериментальных исследованиях_

Виды животных Число животных

Мыши 25

Кролики 13

Собаки 3

Всего 41

Все полученные данные были подвергнуты статистической обработке: вычисляли среднее арифметическое значение, среднее квадратичное отклонение. Достоверность различия между показателями оценивали по критерию Уилкоксона (С. Гланц, 1998). Результаты считали достоверными при р<0,05.

Изучение стабильности применяемого хладоограждающего раствора для лейкоцитов было проведено на трех его сериях методом ускоренного старения («Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре», 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -80°С

Основным компонентом для приготовления хладоограждающего раствора выбрали отечественный криопротектор гексаметиленбистетраокси-этилмочевина (ГМБТОЭМ) - производное мочевины, обладающее экзо- и эндоцеллюлярным действием, хотя большая молекулярная масса, чем у эн-

доцеллюлярных криопротекторов (глицерин, ДМАЦ, ДМСО) говорит о преимущественном экзоцеллюлярном действии.

Для усиления эндоцеллюлярных свойств криоконсервирующего раствора был введён диметилсульфоксид (ДМСО). ДМСО обладает высокой способностью вступать в реакции и оказывает тормозящее влияние на межмолекулярное образование З-Б-связей, чем предотвращает распад молекул ферментов. ЛД50 для ДМСО составляет в зависимости от их вида: от 2,5 и до 9,2 г/кг массы тела (С.С. !УШЬке, 1984).

С целью улучшения других характеристик хладоограждающего раствора в его состав ввели антиоксидант и антигипоксант ОМЭПС (сукцинат гидро-ксиметилэтилпиридина). Это стимулятор синтеза восстановительных эквивалентов в клетке за счет быстрого окисления его в цитоплазме, которое сопровождается быстрым ресинтезом АТФ (Л.Д. Лукьянова, 1990). Выбор данного антиоксидантного вещества обусловлен также его доступностью: на территории Российской Федерации препарат находится в свободной продаже в аптечной сети.

Все используемые ингредиенты производятся в Российской Федерации.

Для проведения исследований были приготовлены 3 варианта хладоограждающего раствора, различающиеся по процентному содержанию ингредиентов. Хладоограждающий раствор имеет оптимальный для клеток рН 7,0-7,4. Состав всех вариантов хладоограждающего раствора представлен в табл. 2.

Таблица 2

Характеристика вариантов нового хладоограждающего раствора, используемого для замораживания лейкоцитов крови человека при низкой температуре -80°С_

Вариант раствора

ГМБТОЭМ, % 24 22 20

Состав хладоограждающего раствора

ДМСО,%

10

ОМЭПС, % 0,3 0,2 0,1

Вода для икьекщш, мл До 100

_До 100_

_До 100_

Смесь клеток с криоконсервантом эквилибрировали в полимерном контейнере «Компопласт 300», при комнатной температуре в течение 20 мин. Установлено (Е.П. Сведенцов, 1987), что лейкоциты, максимально обезвожи-

ваются криопротектором ГМБТОЭМ через 20 минут после смешивания. Охлаждение лейкоцитов до необходимой температуры производили по нелинейной программе (рис. 1). Данная программа позволяет разным видам лейкоцитов входить в состояние холодового анабиоза на разных уровнях охлаждения, и позволяет избежать концентрированного выброса кристаллизационного тепла и процесса рекристаллизации.

время, мин

Рис. 1. Термограмма замораживания лейкоцитного концентрата

Размораживание лейкоконцентрата проводили через одни сутки в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35-50 с. (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании контейнера до температуры концентрата +2°С ^ +4°С. Результаты данной серии исследований представлены в табл. 3.

После отогрева замороженных лейкоцитов абсолютное их количество при использовании всех трех вариантов хладоограждающего раствора достоверно не изменилось, тогда как относительное - достоверно снизилось в опытах с вариантами № 1 и № 3. Кроме того, защитные свойства у варианта 1-го хладоограждающего раствора были достоверно ниже, чем у 2-го и 3-го. Оценка сохранности мембраны (эозинорезистентность) показала, что при использовании хладоограждающего раствора варианта № 2 отмечается большее количество размороженных жизнеспособных клеток, чем в опытах с вариантами раствора № 1 и № 3.

Таблица 3

Сохранность морфологических и функциональных показателей лейкоцитов, перенесших холодозой анабиоз при -80°С в течение одних суток хранения с разными вариан-

тами хладоограждающего раствора

Номер хладоограждающего раствора Число опытов (п) Количество клеток в 1 мкл лейкокон-центрата Относительное количество клеток в% к исходному

до замораживания после размораживания

Морфологическая сохранность лейкоцитов

1 7 10180 ±4902 8250 ±1153 79,83 ± 5,0

2 7 9450±2191 9250 ±2472 96,83 ±4,2*

3 7 7100 ±985 6192 ±1286 91,40 ±4,0*

Эозинорезистентаость в %

1 7 99,0 ± 1,1 76,0 + 6,7 п 77,0 ±7,7

2 7 97,5 ± 0,6 86,2 ± 7,6 п 88,6 ± 7,3 *#

3 7 99,5 ± 0,6 77,0 ±8,1 п 77,6 ±8,4

Морфологический состав в % ГРАНУЛОЦИТЫ

1 7 17,0 ±2,2 14,6 ±3,7 82,8 ±13,4

2 7 14,0 ±2,3 13,3 ±2,7 94,5 ± 6,9 #

3 7 17,5 ±1,6 12,4 +4,3 п 68,2 ± 8,3

Морфологический состав в % ЛИМФОЦИТЫ

1 7 81,0 + 2,2 83,6 ± 4,0 103,6 ±2,7

2 7 84,0 ±2,3 84,5 ±2,5 100,5 ± 0,6 #

3 7 80,5 ± 1,6 85,6 ± 4,3 п 107,0 ±3,1

Морфологический состав в % МОНОЦИТЫ

1 7 2,0 ±0,0 2,0 ±0,0 100,0 ±0,0

2 7 2,0 ±0,0 2,0 ±0,0 100,0 ±0,0

3 7 2,0 ±0,0 2,0 ±0,0 100,0 ±0,0

Фагоцитарная активность нейтрофилов в %

1 7 51,0± 1,1 28,2 ±3,3 а 55,0 ±7,2

2 7 56,0 ±6,7 42,8 ± 1,8 а 75,5 ± 8,5 * #

3 7 44,0 ±1,1 25,2 ± 1,5 п 57,0 ± 4,0

Содержание лизосомально-катионных белков лейкоцитов

1 7 1,68 ±0,02 1,35 ±0,14 80,2 ± 8,4

2 7 1,22 ±0,01 1,11 ±0,06 91,7 ±4,6*

3 7 1,95 ±0,03 1,94 ±0,28 99,0 ±0,3*

Примечания: Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение;

а - различие с данными до замораживания достоверны (р<0,05);

* - различие с результатами при использовании варианта № 1 достоверно (р<0,05);

# - различие с результатами при использовании варианта № 3 достоверно (р<0,05).

Анализ морфологического состава показал, что вариант раствора №3 обладает худшими хладоограждающими свойствами, так как при его использовании наблюдалось достоверное снижение количества гранулоцитов после размораживания. Повышение числа лимфоцитов после размораживания объ-

ясняется тем, что подсчет клеток в мазках проводили на 100 форменных элементов, уменьшение числа гранулоцитов способствовало относительному увеличению числа лимфоцитов после выхода из холодового анабиоза. Положительно зарекомендовал себя вариант раствора № 2 и при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов. С этим вариантом раствора после размораживания уровень основной функции нейтрофилов был достоверно выше, чем при использовании вариантов раствора № 1 и № 3.

Данные НСТ-теста показали, что при использовании всех вариантов раствора у размороженных нейтрофилов наблюдается существенное повышение окислительно-восстановительного метаболизма. Так, при замораживании нейтрофилов под защитой хладоограждающего раствора 1-го варианта исходное количество НСТ-положительных клеток составляло 4,5 ± 0,6%, а после размораживания - 27,8 ± 4,8%, т.е. увеличивалось примерно в 6 раз. В опытах с вариантом № 2 исходное значение равнялось 5,0 ±0,1%, после отогрева - 21,3 ± 1,9%, т.е. увеличилось в 4 раза. При использовании варианта раствора № 3 исходное значение, равное 4,5 ± 0,6% увеличилось после размораживания до 16,5 ± 3,9, т.е. в 3,5 раза. Полученные данные указывают на то, что поддерживать метаболизм клетки в большей степени удаётся вариантам раствора № 2 и № 3.

По результатам лизосомально-катионного теста уровень среднего цитохимического коэффициента у размороженных нейтрофилов при использовании варианта раствора № 3 соответствует исходному, незначительно ему уступает вариант раствора № 2. Достоверно результат при замораживании лейкоцитов с вариантом раствора № 1.

На основании того, что главным критерием сохранения функции клетки является ее способность к фагоцитозу, можно заключить, что наилучшими хладоограждающими свойствами обладает вариант раствора № 2. Результаты опытов показали, что после замораживания с хладоограждающим раствором № 2, содержащим в конечной концентрации ГМБТОЭМ - 11%, ДМСО - 4%,

ОМЭПС - 0,1%, получен самый высокий процент функциональных и морфологических показателей лейкоцитов.

Таким образом, на основании проведённых исследований был найден оптимальный состав раствора для замораживания лейкоцитов при температуре -80°С, с которым проводили дальнейшие исследования: изучение сохранности показателей лейкоцитов после выхода из состояния криоанабиоза при -80°С в течение длительного срока хранения.

2. Исследование функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека до введения в холодовой анабиоз (~80°С) и через разные сроки после выхода из него

Исследования с оптимальным вариантом проводились при сроках 1 и 180 суток (время наблюдения).

При подсчете количества лейкоцитов в камере Горяева до введения в состояние холодового анабиоза и после выхода из него не выявлено достоверного снижения относительного количества лейкоцитов после 180-суточного хранения по сравнению со сроком хранения 1 сутки (табл. 4).

Таблица 4

Количество лейкоцитов, замороженных с оптимальным хладоогражданшшм раствором

при -80°С, до и после выхода из криоанабиоза в зависимости от срока хранения

Длительность хранения Число опытов (п) Количество лейкоцитов

До замораживания После размораживания Относительное количество в % к исх.

1 сутки 10 15470 ±3967 14940 ±3636 95,9 ±4,0

180 суток 12 16200 ±3189 15020 ± 3987 89,3 ±6,4

Таблица 5

Эозинорезистентность лейкоцитов, замороженных с оптимальным криозащитным раствором при -80°С, до и после выхода из криоанабиоза в зависимости от срока хранения

Длительность хранения Число опытов (п) Эозинорезистентность лейкоцитов

До замораживания После размораживания Относительное количество в % к исх.

1 сутки 10 97,8 ± 0,9 88,7 ± 7,0 п 90,9 ±7,1

180 суток 12 98,1 ± 1,6 89,3 ± 5,0 о 91,0 ±5,1

Примечание: п - различия с данными до замораживания достоверны (р<0,05).

Изучение целостности клеточной мембраны лейкоцитов показало, что после отогрева клеток, замороженных под защитой оптимального хладоо-граждающего раствора по нелинейной программе и хранившихся при темпе-

ратуре -80°С разные сроки (1 и 180 суток), происходит достоверное уменьшение их эозинорезистентности по сравнению с исходным уровнем. В то же время отсутствует достоверное различие между сроками хранения лейкоцитов (табл. 5).

Исследование морфологического состава лейкоконцентрата выявило достоверное увеличение относительного количества лимфоцитов и моноцитов по сравнению с исходными значениями лейкоформулы (табл. 6).

Таблица 6

Морфологический состав лейкоцитов, замороженных с оптимальным криозащитным раствором при -80°С, до и после выхода из криоанабиоза в зависимости от срока хранения

Длительность хранения Число опытов (п) Морфологический состав

До замораживания После размораживания Относительное количество в % к исх.

ГРАНУЛОЦИТЫ

1 сутки 10 14,0 ±2,3 13,3 ±2,7 94,5 ± 6,9

180 суток 12 36,7 ±8,0 33,6 ±6,0 | 85,3 ±7,2*

МОНОЦИТЫ

1 сутки 10 2,0 ±0,0 2,0 ± 0,0 100,0 ±0,0

180 суток 12 21,9 ±3,0 29,7 ± 4,8 п 166,0 ±28,0*

ЛИМФОЦИТЫ

1 сутки 10 84,0 ±2,3 84,5 ± 2,5 100,5 ±0,6

180 суток 12 50,0 ±5,8 60,3 ± 6Д а 112,1 ±14,5*

Примечание: п - различия с данными до замораживания достоверны (р<0,05);

* - данные достоверно отличаются (р<0,05) от таковых при сроке хранения 1 сутки. В то же время достоверного изменения количества гранулоцитов при обоих сроках хранения не наблюдали. Также выявлено достоверное уменьшение количества гранулоцитов в через 180 суток хранения по сравнению с 1 сутками, вследствие чего количество моноцитов и лимфоцитов достоверно увеличивалось. Это обусловлено, прежде всего, более высокой устойчивостью этих видов клеток к агрессивным факторам холодового стресс-воздействия при замораживании. Изучение популяции лимфоцитов в размороженных образцах через 1 сутки показало, что количество Т- и В-лимфоцитов достоверно не изменялось по сравнению с данными до замораживания (табл. 7). В то же время после отогрева через 180 суток количество В-лимфоцитов достоверно уменьшалось, по сравнению со сроком хранения 1 сутки.

Таблица 7

Содержание Т- и В-лимфоцигов в ЛК, подвергнутых холодовому воздействию (-80°С)

в течение 1 суток

Число опытов (П) Количество лимфоцитов

Длительность До замораживания После

хранения размораживания

через 1 сутки через 180 суток

Т-лимфоцигы, % 5 80,0 ± 14,1 87,33 ± 8,1 83,75 ±9,8

В-лимфоцита, % 5 8,5 ±2,12 10,75 ± 1,0 8,50 ±2,1*

Примечание: * - данные достоверно отличаются (р<0,05) от срока хранения 1 сутки.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов (процентное отношение фагоцитирующих клеток к общему числу сосчитанных) выявлено, что в результате хранения лейкоцитов с исследуемым раствором происходит достоверное уменьшение количества клеток, способных поглощать частицы латекса при различных сроках хранения. Однако отсутствует достоверное различие между сроками хранения 1 и 180 суток (табл. 8).

Таблица 8

Фагоцитарная активность лейкоцитов, замороженных с оптимальным криозащитным раствором при -80°С, до и после выхода из криоанабиоза в зависимости от срока хранения

Длительность хранения Число опытов (п) Фагоцитарная активность нейтрофилов

До замораживания После размораживания Относительное количество в % к исх.

1 сутки 10 57,4 ±6,2 43,0 ± 1,7 п 78,1 ± 5,9

180 суток 12 65,3 ± 1,7 41,8 ± 4,0 п 76,7 ±14,7

Примечание: а - различия с данными до замораживания достоверны (р<0,05).

Данные лизосомального-катионного теста (табл. 9) свидетельствуют о том, что после хранения клеток в течение 1 и 180 суток количество лизосо-мально-катионных белков по среднему цитохимическому коэффициенту достоверно не отличается от исходного уровня. Также нет отличия в зависимости от сроков хранения (р>0,05).

Таблица 9

Содержание лизосомально-катионных белков, замороженных с оптимальным раствором при -80°С, до и после выхода из криоанабиоза в зависимости от срока хранения

Длительность хранения Число опытов (П) Содержание лизосомально-катионных белков

До замораживания После размораживания Огн. количество в % к исх.

I сутки 10 2,62 ±0,18 2,43 ± 0,49 92,6 ±4,7

180 суток 12 2,31 ±0,18 2,22 ±0,15 93,8 ±9,4

Примечание: различия с данными до замораживания не достоверны (р>0,05).

По данным НСТ-теста установлено достоверное (р<0,05) увеличение доли активированных нейтрофилов после отогрева клеток (рис. 2).

25

1 сутки 180 суток

В До замораживания & После отогрева

Рис. 2. Динамика кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, замороженных при -80°С, в зависимости от срока хранения.

При хранении клеток в течение 1 суток при -80°С эта доля возросла в 4,6 раза (исходное количестве клеток с формазаном 4,6 ± 0,7 %, после отогрева- 21,3 ± 2,3 %), тогда как после их хранения в течение 180 суток увеличение в 6,8 раза (до замораживания 3,0 ± 0,9%, после отогрева 20,5 ± 3.5%).

Таким образом, предложенный нами метод криоконсервирования ядерных клеток крови человека в условиях холодового анабиоза при -80°С, введение в который осуществляли по нелинейной программе замораживания с оптимальным хладоограждающим раствором позволяет сохранять функциональные и морфологические свойства лейкоцитов в течение 180 суток на высоком уровне.

Изучение биологических особенностей хладоограждающего раствора

Изучение «острой» токсичности хладоограждающего раствора проводилось на мышах. После внутривенного введения тест-дозы защитного раствора при наблюдении за мышами на протяжении 5 суток не отмечалось их гибели, каких-либо отклонений в поведении и внешнем виде. На основании полученных данных сделано заключение об отсутствии «острой токсичности» у испытуемого раствора.

Изучение «хронической» токсичности проводилось путем ежедневного введения данного раствора с конечной концентрацией ГМБТОЭМ, ДМСО и

ОМЭПС (11%, 4% и 0,1% соответственно) 10 дней двум видам животных: мышам и кроликам.

Криоконсервант в тест-дозе 0,5 мл вводили внутрибрюшинно 20 белым лабораторным мышам течение 10 дней. Количество ГМБТОЭМ, вводимое животному во время одной инъекции составило при этом 0,013 мл/г массы тела, ДМСО - 0,0021 мл/г, а количество ОМЭПСа - 0,00053 мл/г. Контрольной группе (5 мышей) вводили аналогичный объем 0,9% раствора хлорида натрия в дозе 0,5 мл. Все животные хорошо перенесли 10-ти дневное ежедневное внутрибрюшинное введение испытуемого раствора и изотонического раствора хлорида натрия. Поведение и внешний вид не отличались от обычных. Гистологическое исследование в опытной группе мышей не выявило деструктивных изменений во внутренних органах после 10-дневного введения хладоограждающего раствора. Полнокровие сосудов, незначительные кровоизлияния, обнаруженные у некоторых животных в контрольной и опытной группах, отражали посмертные изменения.

Во время испытания раствора на кроликах криозащитный раствор в конечной концентрации вводился 5 животным ежедневно в течение 10 дней в краевую вену ушной раковины в тест-дозе 6,6 мл/кг. Общее состояние животных, поведение и внешний вид в опытной (5 кроликов-неальбиносов) и контрольной (5 кроликов-неальбиносов) группах после 10-ти дневного введения испытуемого раствора и после аналогичного введения 0,9% раствора хлорида натрия не изменилось. Результаты свидетельствуют о том, что хла-доограждающий раствор не оказывал токсического влияния при его длительном введении на такие параметры как масса тела, сердечная деятельность, показатели периферической крови, функция почек, общее состояние животных не приводил к другим явлениям, характерным для <осронической» токсичности. Гистологическое исследование внутренних органов животных опытной и контрольной групп не выявило патологических изменений в организме кроликов, получавших хладоограждающий раствор.

Таким образом, многократное введение испытуемого хладоограждающе-го раствора не оказывает токсического действия на организм подопытных животных.

Испытание хладоограждающего раствора на пирогенность проводили в соответствии с ГФ XI (1990) на трех кроликах, которым внутривенно вводилась тест-доза 6,6 мл указанного раствора в конечной концентрации на кг массы тела. При введении раствора отклонение температуры у животных не превышало 0,21 ± 0,03°С. Сумма максимального отклонения составила +0,3°С •*■ +0,7°С, во всех случаях отклонение было ниже допустимого предела - 1,4°С. Данные свидетельствуют, что хладоограждающий раствор не обладает пирогенными свойствами.

Изучение переносимости трансфузий концентратов отогретых лейкоцитов, замороженных до -80°С с разработанным хладоограждающим раствором, проводили на трех беспородных собаках массой 10,5-16,1 кг.

Трансфузия не вызывала отклонений от нормы в показателях крови и мочи, в поведении и внешнем виде животных. Масса и температура тела, пульс, частота дыхания после внутривенного переливания размороженных аутолейкоконцентратов не изменились по сравнению с исходными.

Исходя из результатов исследований, можно заключить, что крупные экспериментальные животные (собаки) благоприятно переносят переливание размороженных лейкоцитных концентратов, консервированных с разработанным хладоограждающим раствором, поэтому данный раствор не требует отмывания от биообъекта после его размораживания.

Влияние длительного хранения оптимального хладоограждающего раствора на его криозащитные свойства

Хранение хладоограждающего раствора № 2 в течение 45 суток при температуре +60°С, которые приравниваются к хранению в течение 2-х лет при температуре +4°С, показало нестойкость его физико-химических свойств (табл. 10), в частности кислотности, которая изменяется в кислую сторону, в виду чего приготовление раствора необходимо осуществлять непосредственно перед процедурой замораживания.

Таблица 10

Значения рН исследуемого раствора

№ серий Исходное значение рН Значение рН после хранения

I 7,25 5,90

II 7,29 6,05

III 7,20 5,83

М±<г 7,24 ±0,05 5,93 ±0,И*

Примечание: * - различия с исходными значениями достоверны (р>0,05).

Таким образом, на основании проведенных биологических исследований и изучения функциональных и морфологических свойств лейкоцитов на протяжении различных сроков хранения установлено, что применённый нами хладоограждающий раствор безвреден для лейкоцитов и позволяет сохранять их свойства на высоком физиологическом уровне в течение 180 суток, а также не требует отмывания после оттаивания биообъекта и перед трансфузией.

Данные, полученные в ходе исследований на экспериментальных животных и ядро содержащих клетках крови человека, дают основание рекомендовать разработанный метод замораживания лейкоцитов для применения в научных лабораториях криофизиологического, биологического и медицинского профиля.

ВЫВОДЫ

1. Оптимальным хладоограждающим раствором, сохраняющим жизнеспособность и функциональную активность лейкоцитов, введенных в состояние криоанабиоза (-80°С) по нелинейной программе и хранившихся в течение 1 и 180 суток (срок наблюдения), является раствор, содержащий в конечной концентрации ГМБТОЭМ - 11%, ДМСО - 4%, ОМЭПС - 0,1% и воду для инъекций.

2. Через 180 суток хранения под защитой предложенного хладоограж-дающего раствора достигается высокая сохранность функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека. Уровень фагоцитарной активности нейтрофилов составляет 76,7 ± 14,7% от исходного уровня, содержание лизосомально-катионных белков - 93,8 ± 9,4% от исходного уровня. Сохраняется 91,0 ± 5,1%, жизнеспособных лейкоцитов, содержание гра-нулоцитов - 85,3 ± 7,2% от исходного уровня. Не изменяется количество

Т-лимфоцитов, незначительно снижается численность субпопуляции В-лимфоцитов.

3. Разработанный хладоограждающий раствор не вызывает гибели животных при внутривенном введении, не вызывает изменений в их поведении, гемограммах, урограммах, не повышает ректальную температуру, не приводит к функциональным нарушениям и деструктивным изменениям внутренних органов и благоприятно переносится экспериментальными животными, не требует отмывания от клеток перед трансфузией.

Практические рекомендации

Метод криоконсервации лейкоцитов человека, основанный на использовании хладоограждающего раствора №2, нелинейной программы замораживания лейкоцитов и их хранения при -80°С (в электрическом морозильнике), при котором функциональная активность лейкоцитов сохраняется в течение 180 суток на высоком уровне, рекомендуется для использования в криофи-зиологии и в лабораториях биологического и медицинского профиля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Сведенцов, Е.П. Сохранение биологических мембран ядерных клеток крови при температуре -80°С / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, А.Н. Худяков, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, C.B. Утемов, Ф.С. Шерстнев // Биологические мембраны. - 2008. - Т. 25, № 1. - С. 23-29.

Статьи в прочих журналах:

2. Сведенцов, Е.П. О сохранении функции ядерных клеток крови при низких температурах / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, А.Н. Худяков, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина // Вестник Поморского университета: сер «физиологические и психолого-педагогические науки» - 2007. - Вып. 1(11). - С. 28-35.

3. Сведенцов, Е.П. Ресурсосберегающие технологии для криоконсерви-рования лейкоцитов / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев // Фундаментальные исследования. -2007. - № 12 (ч. 2). - С. 377-379.

4. Svedentsov, Е.Р. Cryopreservation of Functionally Active Blood Nuclear Cell Membranes at -80°C / E.P. Svedentsov, T.V. Tumanova, A.N. Khudyakov, O.O. Zaytseva, O.N. Solomina, S.V. Utemov, F.S. Sherstnev // Biochemistry

(Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. - 2008. - Vol. 2, № l.-P. 19-25.

Тезисы докладов на конференциях

5. Сведенцов, Е.П. Применение криоанабиоза для консервирования яд-росодержащих клеток крови при низкой температуре) / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.Н. Соломина, О.О. Щеглова, А.Н. Худяков // Конференция РАЕ «Новейшие технологические решения и оборудование» апрель 2006 г. -Москва. Успехи современного естествознания. - 2006. - № 6. - С. 47-48.

6. Худяков, А.Н. Морфофункциональная характеристика лейкоцитов крови человека, перенесших холодовой анабиоз при низкой температуре / А.Н. Худяков, О.О. Щеглова, Т.В. Туманова, Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина // Тезисы докладов V молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» 11-13 апреля 2006 г. - Сыктывкар. - С. 100-102.

7. Худяков, А.Н. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека перенесших холодовой анабиоз (-80°С) / А.Н. Худяков, О.О. Щеглова, Т.В. Туманова, Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина // В сб. науч. трудов IX Всероссийской медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье» 22 апреля 2006 г. - Санкт-Петербург. - С. 372-373.

8. Сведенцов, Е.П. Разработка новых хладоограждающих сред для сохранения функциональной полноценности ядерных клеток крови при -20°С, -40°С и -80°С / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев // Сб. трудов IV международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности. 2-5 октября, 2007. - Санкт-Петербург - Т. 11. - С. 268269.

9. Худяков, А.Н. Сохранность морфологического состава лейкоцитов крови человека после выхода из холодового анабиоза при -80°С / А.Н. Худяков, О.О. Зайцева, Т.В. Туманова, Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина // Тезисы докладов VI молодежной научной конференции института физиологии Коми НЦ УрО РАН, 20-22 марта 2007 г. - Сыктывкар. - С. 130-132.

10. Худяков, А.Н. Изучение биологических особенностей криоконсер-ванта (-80°С) для ядерных клеток крови / А.Н. Худяков, О.О. Зайцева, Е.П. Сведенцов, Д.С. Лаптев, Т.В. Туманова, О.Н. Соломина // Мат-лы докладов Всероссийского совещания «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» 27-28 мая 2008 г. - Киров. - С. 51-52.

11. Зайцева, О.О. Сохранность лейкоцитов человека в условиях околонулевых и отрицательных температур / О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев, Е.С. Степанова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова// Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда 25-27 июня 2008 г. - Барнаул. - С. 87-88.

12. Сведенцов, Е.П. Новые криоконсерванты для сохранения функции ядерных клеток крови при температурах -10-^-80°С / Е.П. Сведенцов, Ю.С. Оводов, О.Н. Соломина, Т.В. Туманова, О.О. Зайцева, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев, Е.С. Степанова, Р.Г. Оводова, В.В. Головченко, C.B. Утёмов, A.A. Костяев, Ф.С. Шерстнёв // Материалы международной конференции «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» 28-30 октября 2008 г. - Пущино. - С. 117-118.

13. Худяков, А.Н. Эффективность применения линейной и экспоненциальной программ для замораживания лейкоцитов до -80°С / А.Н. Худяков, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, A.A. Костяев // Проблемы криобиологии. -2008. - Т. 18, № 2 (Мат-лы научной конференции с международным участием «Новые криобиотехнологии для решения фундаментальных и прикладных задач медицины», 26-28 ноября 2008 г. - Харьков. - С. 256.

14. Худяков, А.Н., Фагоцитарная активность моноцитов крови человека, перенесших холодовой анабиоз (-80°С) в течение одних суток / А.Н. Худяков, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина // Фундаментальная наука и клиническая медицина: тезисы XII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, 18 апреля 2009 г. - Санкт-Петербург. - С. 411-412.

15. Худяков, А.Н. Сохранность моноцитов крови человека после холодо-вого анабиоза при -80°С / А.Н. Худяков, О.Н. Соломина, О.О. Зайцева, Д.С. Лаптев // Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии: материалы научно-практической конференции, 20-21 мая 2009 г. - Гродно. - С. 168-170.

Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность за помощь в выполнении диссертационной работы: научному руководителю доктору медицинских наук профессору Евгению Павловичу Сведещову, сотрудникам лаборатории криофизиологии крови Учреждения Российской академии наук Института физиологии Коми НЦ УрО РАН: к.б.н. Т.В. Тумановой, к.б.н. О.О. Зайцевой, к.б.н. ОН. Соломиной, Г.А. Никулиной, сотрудникам ФГУ КНИИГи ПК: K.M.H. C.B. Утёмову, H.JI. Ежовой, Ф.С. Шерстнёву, Т.А. Ко-ряковцевой, работникам библиотеки Л.Н. Устюжановой и В.Н. Нечаевой, работникам вивария.

Подписано в печать 16.04.2010 г. Формат 60x84 %б. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,43. Тираж 100 экз. Заказ № 1039.

Издательство Вятского государственного гуманитарного университета, 610002, г. Киров, ул. Красноармейская, 26

Издательский центр Вятского государственного гуманитарного университета, 610002, г. Киров, ул. Ленина, 111, т. (8332) 673-674

Актуальность исследования. Применение различных клеточных компонентов крови в лечебной практике возможно только при наличии постоянных запасов консервированных клеток. Криоконсервация компонентов крови в настоящее время является одной из актуальных областей развития научной исследовательской деятельности (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994; Сведенцов Е.П., 1999; Wolfe J. et al. 1999; Koshimoto С., 2002). На сегодня криоконсервирование - единственный известный метод, способный обеспечить длительную сохранность ядерных клеток животных и растений. Данные по этой проблеме свидетельствуют, что чем проще организованы клетки, тем лучше они переносят неблагоприятное воздействие факторов охлаждения (замораживания) - отогрева. На примере крови этот тезис был доказан применительно к разным популяциям клеток крови (Цуцаева А.А., 1981; Голдовский A.M., 1986; Белоус A.M., 1994, Утемов С.В. и соавт., 1995, 1999; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2004). Различные виды клеток крови, имея сложную внутреннюю структуру, нуждаются в индивидуальных методах' замораживания, включающих программу охлаждения и состав криозащитного раствора.

В настоящее время показаниями к применению лейкоконцентрата являются патологические состояния различного происхождения, при которых организм не в состоянии самостоятельно остановить инфекционный процесс (Аграненко В.А, 1985; Абдулкадыров К.М., 1994; Балашов Д.Н., 2001; Neppert J., 1996; Sputtek А., 2004). Однако, лейкоцитарная масса как трансфузионная среда до сих пор не получила широкого распространения в лечебной практике. Во многом это связано с трудностями хранения данного трансфузионного компонента. Установлено; в частности, что у выделенных гранулоцитов быстро нарушаются морфофункциональные свойства: уже через 48 часов исчезает способность к фагоцитозу (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994; Заривчацкий М.Ф., 1995). Единственным методом долгосрочного хранения лейкоцитов является замораживание при температурах ниже 0°С.

Исследования по криоконсервации лейкоцитов при температурах -20°С и -40°С показали возможность лишь недолговременного сохранения их функциональной активности и морфологического состояния (Деветьярова О.Н., 2005; Щеглова О.О., 2005). Температура -80°С относится к низким температурам. Использование данного температурного диапазона весьма перспективно в связи с рядом преимуществ перед сохранением при ультранизких температурах. В числе этих преимуществ следует назвать использование электроморозильников вместо трудоёмкого и дорогого в эксплуатации жидкоазотного криогенного оборудования (Утемов С.В., 1999; Сведенцов Е.П. и соавт. 2000). Криоконсервация при данной температуре обеспечивает длительную сохранность клеток и допускает колебания температуры без сильного влияния на их функциональную полноценность, что особенно важно в отношении лейкоцитов, которые быстро реагируют на состояние окружающей их среды, изменяя деятельность различных систем клетки (Лаврик С.С., Когут Г.И., 1971; Утемов С.В., 1995; Galmes A., et al., 1996; Halle P. et al., 2001). Таким образом, актуальным является вопрос о создании метода криоконсервации лейкоцитов, позволяющего сохранить функциональную активность данных клеток на высоком уровне в течение длительного времени и не требующего использования дорогостоящего оборудования.

Цель исследования - определить функциональное состояние лейкоцитов крови человека, перенёсших холодовой анабиоз при -80°С, введение в который осуществлялось по разработанному методу с помощью нелинейной программы замораживания под защитой оригинального комбинированного криоконсерванта. Задачи исследования:

1. Разработать оптимальный состав хладоограждающего раствора, сравнив три варианта раствора по показателям функциональной и морфологической сохранности лейкоцитов, замороженных под их защитой до -80°С.

2. Изучить функциональные и морфологические свойства лейкоцитов крови человека, замороженных до -80°С, через различные сроки хранения.

3. Провести биологические испытания нового оптимального хладоограждающего раствора и переносимость аутотрансфузий лейкоконцентрата, подвергавшегося холодовому стресс-воздействию под его защитой, на экспериментальных животных.

Научная новизна. Изучено функциональное состояние лейкоцитов крови человека, вышедших из долговременного криоанабиоза при — 80°С, введение в который осуществлялось с применением нелинейной программы охлаждения с помощью электроморозильников на -30°С и -80°С и под защитой разработанного криоконсервирующего раствора. Разработанный поликомпонентный криоконсервирующий раствор для лейкоцитов крови человека содержит протекторы различного типа действия: ГМБТОЭМ (гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина) и ДМСО (диметилсульфоксид), а также антигипоксант и антиоксидант ОМЭПС (сукцинат оксиметилэтилпиридина). Дано научное обоснование его криозащитных свойств.

Теоретическая и практическая значимость работы. Дано научное обоснование криозащитных свойств нового хладоограждающего раствора, включающего в себя криопротекторы ГМБТОЭМ и ДМСО и «реставрирующую» добавку ОМЭПС. Результаты проведённых исследований расширяют представление об общих механизмах криоповреждения и криозащиты на клеточном уровне при температуре хранения -80°С.

В результате проведенных биологических (определение пирогенности, «острой» и «хронической» токсичности) исследований выявлено, что разработанный хладоограждающий раствор нетоксичен, апирогенен, не требует отмывания от биообъекта после его размораживания, не вызывает реакций и осложнений у животных при внутривенном введении с размороженным лейкоцитным концентратом. Результаты данного исследования представляют интерес для различных учреждений биологического и медицинского профиля.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Хладоограждающий ■ раствор, содержащий протекторы ГМБТОЭМ и ДМСО, а также антигипоксант и антиоксидант ОМЭПС и воду, нетоксичен, апирогенен и не требует отмывания биообъекта после отогрева и перед трансфузией.

2. Новый криозащитный раствор позволяет вводить лейкоциты в холодовой анабиоз при -80°С по нелинейной программе с помощью 2-х электроморозильников (на -30°С и -80°С) без использования жидкого азота и дорогого криогенного оборудования.

3. Функциональная активность и морфологическая полноценность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -80°С под защитой нового хладоограждающего раствора, сохраняются на высоком уровне в течение 180 суток (срок наблюдения).

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на V и VI молодежных научных конференциях Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006, 2007); I Всероссийской молодёжной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008); научно-практической конференции «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2008); научных конференциях с международным участием «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Новые криобиотехнологии для решения фундаментальных и прикладных задач медицины» (Харьков, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); объединённом заседании Кировского филиала Российского физиологического общества имени И.П. Павлова и Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2008), Ученом Совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2008).

Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных и морфологических свойств нативных и размороженных лейкоцитов и проведена статистическая обработка результатов исследования. Он принимал участие в разработке и исследовании хладоограждающего раствора, проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК, 2 в прочих журналах.

Выводы

1. Оптимальным хладоограждающим раствором, сохраняющим жизнеспособность и функциональную активность лейкоцитов, введенных в состояние криоанабиоза (-80°С) по нелинейной программе и хранившихся в течение 1 и 180 суток (срок наблюдения), является раствор, содержащий в конечной концентрации ГМБТОЭМ - 11%, ДМСО - 4 %, ОМЭПС - 0,1 % и воду для инъекций.

2. Через 180 суток хранения под защитой предложенного хладоограждающего раствора достигается высокая сохранность функциональных и морфологических свойств лейкоцитов крови человека. Уровень фагоцитарной активности нейтрофилов составляет 76,7±14,7% от исходного уровня, содержание лизосомально-катионных белков - 93,8±9,4% от исходного уровня. Сохраняется 91,0±5,1%, жизнеспособных лейкоцитов, содержание гранулоцитов - 85,3±7,2% от исходного уровня. Не изменяется количество Т-лимфоцитов, незначительно снижается численность субпопуляции В-лимфоцитов.

3. Разработанный хладоограждающий раствор не вызывает гибели животных при внутривенном введение не вызывает изменений в их поведении, гемограммах, урограммах, не повышает ректальную температуру, не приводит к функциональным нарушениям и деструктивным изменениям внутренних органов и благоприятно переносится экспериментальными животными, не требует отмывания после размораживания ядерных клеток крови и может применяться в научных лабораториях криобиологического и медицинского профиля.

Практические рекомендации

Метод криоконсервации лейкоцитов человека, основанный на использовании хладоограждающего раствора №2, нелинейной программы замораживания лейкоцитов и их хранения при -80°С (в электрическом морозильнике), при котором функциональная активность лейкоцитов сохраняется в течение 180 суток на высоком уровне, рекомендуется для использования в криофизиологии и в лабораториях биологического и медицинского профиля.