Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Некоторые СС- и СХС-хемокины и их рецепторы у больных бронхиальной астмой

На правах рукописи

КОВАЛИНСКАЯ Анна Андреевна

Некоторые СС- и СХС-хемокины и их рецепторы у больных бронхиальной астмой

14.01.04. - Внутренние болезни 14.03.09. - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 и МАР гщ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, 2014

005546201

005546201

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО « Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства

доктор медицинских наук, профессор Василий Иванович Трофимов доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Арег Артемович Тотолян

доктор медицинских наук, профессор 1 кафедры терапии (усовершенствования врачей) ФГКВОУ ВПО Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Министерства обороны РФ Харитонов Михаил Анатольевич главный научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ВЦЭРМ МЧС России, доктор медицинских наук, профессор

Наталия Михайловна Калинина

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится «_»_2014 г. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д.208.090.01 в Первом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова по адресу: 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6-8. С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6-8).

Автореферат разослан «_»_2014 г.

здравоохранения РФ

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н.,профессор

Марченко В.Н.

Введение Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) относится к числу широко распространенных заболеваний. Считается, что приблизительно 300 миллионов человек во всем мире страдают Б А. Предполагается, что эта цифра возрастет еще на 100 миллионов к 2025 году (www.gmasthim.com/Guidelineitem.asp.). Кроме того, обращает на себя внимание увеличение распространенности БА в России, увеличение тяжести течения заболевания и связанный с этим рост летальности (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А., 2011).

Повышение эффективности лечения и профилактики БА связывается с необходимостью глубокого знания патогенетических особенностей заболевания. В настоящее время известно около 50 хемокинов и 20 типов поверхностных рецепторов к ним (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006). Хемокины относятся к классу цитокинов, которые являются центральным регулятором лейкоцитарной миграции, а также способствуют активации этих клеток, в частности участвуют в высвобождении гранул с биологически активными веществами ('Пап L.et al., 2011). В иммунопатогенезе БА известны хемокины, которые участвуют как в аллергическом, так и в клеточно-опосредованном иммунном воспалении. Среди них наиболее хорошо изученными являются хемокины группы эотаксинов - медиаторов аллергического воспаления при БА, которые взаимодействуют с рецептором CCR3 (Tian L. et al., 2011). Хемокинами, характеризующие и аллергическое и клеточно-опосредованное воспаление, являются CCL3/MIP-la и CCL5/RANTES, которые взаимодействуют с рецепторами: CCR1, CCR3, CCR5. К хемокииам, характеризующим клеточно-опосредованное воспаление, относятся CCL4/MIP-lp и CXCL8/1L-8, которые взаимодействуют с рецепторами: CCR5 и CXCR1, CXCR2 соответственно.

Исследование экспрессии мРНК провоспалигельных хемокинов CCL3/MIP-Ia, CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CCL11/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2 и их рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2), характеризующих иммунное воспаление в слизистой верхних дыхательных путей, в частности носоглотке, у больных БА до настоящего времени не изучалось. Взаимосвязи между содержанием этих же хемокинов в сыворотке крови и клинико-лабораторными данными у больных БА освещены не достаточно полно, что обуславливает актуальность настоящего исследования.

Цель работы

Изучить участие некоторых хемокинов (CCL3/MlP-la, CCL4/MIP-1Р, CCL5/RANTES, CCL11/эотаксииа, ССЬ24/эотаксииа-2, CXCL8/IL-8) и их рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в иммунопатогенезе БА и оценить возможность их использования в качестве новых диагностических

биомаркеров этого заболевания.

J

Задачи исследования

1. Определить экспрессию мРНК некоторых СС (ССО/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1р, ССЬ5/ЯАЫТЕ8, ССЫ 1/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2) и СХС (СХСЬ8/1Ь-8) хемокинов, а также их рецепторов (ССШ, ССЯЗ, ССП5, СХСШ,'СХСЛ2) в слизистой оболочке носоглотки больных БА в фазе обострения, в зависимости от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести заболевания, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения и у практически здоровых лиц.

2. Определить содержание некоторых СС (ССЕЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1(3, ССЬб/ЯДЫТЕБ, ССЫ 1/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2) и СХС (СХСЬ8/1Ь-8) хемокинов в сыворотке крови у больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения и у практически здоровых лиц.

3. Изучить взаимосвязи показателей системы хемокинов с клиническими, общелабораторными и функциональными показателями больных БА.

4. Провести анализ изменений изученных хемокинов и их рецепторов у больных БА и оценить их в иммунопатогенезе заболевания.

5. Изучить возможность оценки хемокинов с точки зрения биомаркеров бронхиальной астмы.

Научная новизна

1. У больных БА по сравнению с практически здоровыми лицами выявлена повышенная экспрессия мРНК ССЫ 1/эотаксина, ССЬ24/эотакснна-2, СС1.3/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1Р и рецептора СХСШ в слизистой оболочке носоглотки.

2. Впервые установлено, что у больных БА по сравнению с практически здоровыми лицами в сыворотке крови было выявлено повышенное содержание ССЬ5/ЯАЫТЕ5, СХСЬ8/1Ь-8, ССЬ24/эотаксина-2 и сниженное содержание ССЫ 1/эотаксина, причем повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови не зависело от клинико-патогенетических вариантов БА, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения.

3. Впервые показано формирование у практически здоровых курильщиков дефекта синтеза и продукции СХСЬ8/ГЬ-8, что проявлялось сниженной экспрессией мРНК в слизистой оболочке носоглотки и сниженным содержанием этого хемокина в сыворотке крови.

4. Показаны взаимосвязи у больных БА показателей системы хемокинов с общелабораторными показателями (положительные корреляции между экспрессией мРНК СС1.4/М1Р-1Р, ССЬ5/1Ъ\1МТЕ8 с эозинофилами и нейтрофилами мокроты) и показателями бронхиальной обструкции (отрицательные корреляции ССЫ 1/эотаксина с индексом Тиффно и ССЬ5/ЯАЫТЕ5 с ОФВ1).

Практическая ценность работы

1. Комплексная оценка экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки и содержания в сыворотке крови у больных БА позволяют определить преимущественный характер иммунного воспаления: гуморальное (В-клеточное) или клеточно-опосредованное (Т-клеточное).

2. Повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови у больных БА в фазе обострения независимо от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения позволяет рекомендовать соответствующий хемокин в качестве биомаркера БА.

Положения выносимые на защиту

1. В отличие от инфекционно-зависимой БА, для которой характерно сниженная экспрессия мРНК ССЬ24/эотаксина-2, повышенное системное содержание ССЬ5/КАЫТЕ8 и ССЬ24/эотаксина-2, атопическая БА характеризуется сниженным системным содержанием ССЫ 1/эотаксина, повышенным содержанием С(Х5/11АМТЕ8, ССЬ24/эотакхина-2 и повышенным местным синтезом ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1Р и ССЬ24/эотаксина-2.

2. У практически здоровых курильщиков в зависимости от длительности табакокурения развиваются дефекты местного синтеза и системной продукции СХСЬ8/1Ь-8.

3. У всех больных БА в фазе обострения не зависимо от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести заболевания, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения устойчиво повышено содержание в сыворотке крови С СЬ2 4/э ота кс и н а-2, что позволяет его отнести к биомаркерам БА.

Личное участие автора

Подбор больных БА и группы практически здоровых лиц для исследования, анализ литературных данных, взятие браш-биоптата слизистой носоглотки и выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения инфекционных агентов, мРНК хемокинов и их рецепторов в лаборатории ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, статистическая обработка выполнялось автором диссертационной работы лично. Личной участие автора в получении научных результатов подтверждено научными руководителями, заключением членов проблемной комиссии, ознакомившейся с первичной документацией проведенных исследований.

Реализация и апробация работы

Материалы докладывались на XIII всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической

конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины - 2009» (Санкт-Петербург, 2009), на региональной научно-практической конференции «Осложнения гриппа и ОРЗ в практике терапевта» (Санкт-Петербург, 2011), на научной конференции, посвященной 110-летию кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПБГМУ им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2011).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работы в отечественных изданиях, 4 из которых оригинальные статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертация имеет традиционную структуру и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, собственных данных, заключения и практических рекомендаций. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения и 7 глав, из которых первая глава - обзор литературы, 6 глав — собственные исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего (24 на русском и 111 на иностранном языках). Диссертация иллюстрирована 36 таблицами и 2 рисунками.

Материалы и методы Клиническая характеристика групп обследованных

Клиническое и лабораторное обследование больных осуществлялось на базе клиники госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО ПСПБГМУ им. акад. И.П. Павлова Минздрава РФ. Диагноз БА устанавливали в соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (GINA, 2011).

Контрольную группу составили 37 практически здоровых лиц: 20 женщин (54%) и 17 мужчин (46%). Средний возраст женщин составил 24±3 лет, а средний возраст мужчин - 26±3 лет. Для отбора контрольной группы учитывались следующие факторы: отсутствие хронических заболеваний, отсутствие признаков острого заболевания в течение последнего месяца, неотягощенная по БА и другим аллергическим бронхолегочным заболеваниям наследственность, отсутствие в анамнезе заболеваний крови, отсутствие аллергических заболеваний (БА, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, отек Квинке и др.). Учитывался фактор хронической интоксикации - табакокурение (из 37 добровольцев: 16 (43%) были курильщиками и 21 (57%) - некурильщиками). Стаж курения составлял 3-5 лет, где индекс курящего человека (пачка/лет) составил от 1,5 до 5.

В исследование было включено 70 пациентов, из них 39 (56%) женщин и 31 (44%) мужчина. Возраст обследованных больных БА находился в пределах от 17 до 68 лет у женщин (в среднем - 42,5±25,5 лет), а у мужчин -в пределах от 19 до 67 лет (в среднем - 43±24 лет). Длительность заболевания у больных БА колебалась от 0,3 до 55 лет.

По степени тяжести заболевания больные БА распределялись следующим образом: 14 (20%) больных БА были с легкой степенью тяжести (контролируемая БА) и 56 (80%) больных БА - со средней степенью тяжести (частично контролируемая БА).

До поступления в стационар большинство пациентов 66 (94%) со средней степенью тяжести БА самостоятельно использовали ингаляционные глюкокортикостероиды (ИГКС) в сочетании с (й-агонистами короткого или пролонгированного действия или комбинацией ИГКС и р2-агонистов пролонгированного действия; и только 4 (6%) пациента с легкой степенью тяжести БА - монотерапшо бронхолитиками. По клииико-патогенетическим вариантам больные БА, согласно классификации Г.Б. Федосеева, О.В. Коровиной, Н.Г. Тенегиной (1977), распределились следующим образом:

- атопический вариант был у 23 (33%) пациентов, из которых у 14 (17%) больных БА: с легкой степенью тяжести и у 9 (83%) больных БА - со средней степенью тяжести заболевания;

- сочетание атонического и иифекциошю-зависимого вариантов - у 40 (57%) больных БА со средней степенью тяжести заболевания;

- инфекционно-зависимый вариант - у 7 (10%) больных БА со средней степенью тяжести заболевания.

В период обследования больные БА были осмотрены ЛОР-врачом. У 46 (66%) из 70 больных БА имели в анамнезе, подтвержденные при осмотре, заболевания ЛОР-органов. Преобладающими заболеваниями ЛОР-органов у обследованных больных были: аллергический ринит интермиттирующая форма у 23 (50%) и аллергический ринит персистирующая форма у 5 (11%), а также полипозная риносинусопатия у 5 (11 %). Другие заболевания встречались значительно реже.

Методы исследования

Клиническое и лабораторное обследование больных БА осуществлялось на базе клиники госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО ПСПБГМУ им. акад. И.П.Павлова Минздрав России.

У всех пациентов был собран анамнез заболевания БА, в том числе аллергологический, проводилось анкетирование, большинство пациентов консультировалось узкими специалистами: аллергологом, ЛОР-врачом; также проводили стандартное клинико-лабораторное исследование, включающее клинический анализ крови, цитологический анализ мокроты, оценку состояния функции внешнего дыхания.

Показатели ФВД определяли методом спирографии с регистрацией петли «поток-объем». Регистрация проводилась на приборе БРИЮЗГРТ 3000 фирмы Рикис1а БепэЫ (Япония). У всех больных БА регистрация показателей функции внешнего дыхания проводилась до и после стандартной пробы с (32-адреномиметиком (фенотеролом или сальбутамолом) во время госпитализации. Исследованные параметры оценивались как в абсолютных

значениях, так и в процентах к должным величинам по Клементу Р.Ф. и соавт. (1986).

У 70 больных Б А и 17 практически здоровых лип получали браш-биоптат слизистой оболочки носоглотки для определения мРНК хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CCLll/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2 и СХСЬ8ЛЬ-8,) и их рецепторов: CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР выполняли на амплификаторах: iCycler Bio-Rad (США) и Терцик (Россия). Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в 1,5% агарозном геле, окрашенным бромистым этвдием, при УФ освещении на трансиллюминаторе «Волна» (Россия). Полуколичественную оценку проводили с помощью программы Gel-Pro, принимая за 100% интенсивность флюоресценции ß-актина.

У всех больных и у практически здоровых лиц хемокины (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL5/R ANTES, CCLll/эотаксин, ССЬ24/эотакспн-2, CXCL8/IL-8,) определяли в сыворотке крови количественным методом мультиплексного хемилюминисцентного анализа с использованием магнитных частиц на приборе MagPix (Luminex, США). Для количественного определения хемокинов использовались наборы серии Milliplex mag. (Millipore,CIUA) номер по каталогу HCYTOMAG-62K-PX23. Анализировали согласно инструкции фирмы производителя.

Всем больным БА в осенне-зимне-весенний период дополнительно выполнялся браш-биоптат слизистой оболочки носоглотки на наличие инфекционных агентов (вируса парагриппа, PC-вируса, аденовируса, М. pneumoniae, СИ. Psitaci). ПЦР выполняли на амплификаторах: iCycler Bio-Rad (США) - пробирки 0,2 мл и Терцик ( Россия) - пробирки 0,6 мл. Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в 1,5% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, при УФ освещении на трансиллгоминаторе «Волна» (Россия).

Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью стандартного пакета прикладного статистического анализа SPSS for Windows (Statistical Package for Social Science, версия 16.0).

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе исследования было показано, что в слизистой оболочке носоглотки у контрольной группы экспрессируются все гены хемокинов и их рецепторов, включенные в исследование.

При анализе экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки практически здоровых лиц в зависимости от фактора табакокурения, оказалось, что в подгруппе курящих лиц достоверно снижались уровни экспрессии мРНК CXCL8/IL-8 в 29 раз и CCL5/RANTES в 30 раз по сравнению с подгруппой некурящих лиц как представлено на рисунке 1.

В сыворотке крови содержание СХСЬ8/1Ь-8 было достоверно снижено у курящих практически здоровых лиц в 2,2 раза по сравнению с некурящими лицами.

*- статистически значимо при р<0,05

Рисунок 1. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов у контрольной

группы в

зависимости от фактора табакокурения Отрицательные взаимосвязи были обнаружены между мРНК СХСЬ8/1Ь-8, ССЬ5/КАЫТЕ8 слизистой оболочки носоглотки и табакокурением как представлено на рисунке 2. У группы курящих практически здоровых лиц высчитывался индекс курящего человека (пачка/лет), который составлял от 1,5 до 5. При проведении корреляционного анализа отрицательные взаимосвязи оказались между экпрессией мРНК СХСЬ8/1Ь-8 носоглотки и индексом курящего человека (пачка/лет),

г=-0,6; р=0,0007 г--0,6; р=0,0007

Рисунок 2. Корреляционные связи между экспрессией мРНК СХСХВЛЬ-8, ССЬ5/11АЫТЕ8 слизистой оболочки носоглотки и табакокурением у

практически здоровых лиц Обратной взаимосвязь была между содержанием СХСЬ8/1Ь-8 в сыворотке крови и индексом курящего человека (пачка/лет), что показано на рисунке 3. Таким образом, чем длительней курение, тем меньше будет содержание СХС 1.8/11.-8 в сыворотке крови и экспрессия мРНК в слизистой оболочке носоглотки.

мРНК СХСЬ8/1Ъ-8

М),6;р=0,003

г

г=-0,8:р=0,00()1

ИНДЕКС КУРЯЩЕГО ЧЕЛОВЕКА (ПАЧКА/ЛЕТ)

СХСХ8ЯЬ-8 сыворотки

Рисунок 3. Корреляционные связи между экспрессией мРНК СХСЪ8/1Ь-В носоглотки, содержанием СХСЬ8/1Ь-8 в сыворотке и индексом курящего человека (пачка/лет) у практически здоровых лиц Можно предположить, что табакокурение вызывает либо "дефект синтеза", либо "истощение функционального резерва" СХ(Х8/1Ь-8. При наличии "дефекта синтеза", СХСЬ8/1Ь-8 воспроизводится в сниженном количестве и табакокурение рассматривается в качестве "блокатора "его синтеза, а при "истощении функционального резерва" на ранних сроках табакокурения, возможно, имела место компенсаторная реакция в виде увеличения уровня СХСЬ8/1Ь-8, затем как проявление декомпенсации -снижение его синтеза. Несмотря на это, и в том и в другом случаях имел место дефицит экспрессии мРНК СХ(Х8/1Ь-8.

При сравнении показателей группы больных БА с контрольной группой была выявлена достоверно повышенная экспрессия мРНК СС1Л 1/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2, ССЬЗ/МНМа, ССЬ4/М1Р-1В и рецептора к СХСЬ8ЯЬ-8 СХСШв слизистой оболочке носоглотки как показано на рисунке 4.

■ Контрольная группа

Больные БА

с 0

«да/

*- статистически значимо при р<0,05 Рисунок 4. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов у больных

БА

Достоверно были повышенными в сыворотке крови у больных БА: ССЬ5/КА№ГЕ8 в 3 раза, СХСЬВЛТ-В в 5 раз и ССЬ24/эотаксин-2 в 7 раз по сравнению с контрольной группой, что представлено в таблице 1.

Как видно из полученных данных в слизистой оболочке носоглотки и в сыворотке крови повышалось содержание хемокинов, участвующих и в гуморальном и в клеточно-опосредованном иммунных ответах.

Это совпадает с данными ряда авторов 21е1ко\\'8.к1 7... е1 а1. (2010), СЬае 8.С. е{ а!. (2004) о том, что при БА хемокины группы эотаксинов имеют тенденцию к повышению. Группа эотаксинов (СОЛ 1/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2) входят в группу провоспалитеиьных хемокинов, участвующие в гуморальном иммунном ответе.

Таблица 1.. Содержание хемокинов в сыворотке крови больных БА по сравнению с практически здоровыми лицами (Ме (<ЗгСЬ)

Хемокины (лкг/мл) Контрольная группа Больные БА

CCL3/MTP-la 0 (0-0) 9(0-88)

ССЫ/MlP-lß 81,6(80,1-89,8) 93(0-193)

CCL5/RANTES 91515,4 (75783-116310,1) 269099(0-698849)*

СОЛ 1/эотаксин 193,6(190-206,4) 145(24-284)*

С€Х24/зотаксин-2 172,8(165,3-180,9) 1265(141-3381)*

CXCL8/IL-8 12.4(8,4-17,7) 56(2-423)*

*-статистически значимо при р<0.05

Что же касается повышенной экспрессии мРНК CCL3/MIP-1« и CCL4/MIP-1 ß в слизистой оболочке носоглотки и повышения содержания CCL5/RANTES в сыворотке, то они показывают активность как гуморального, так и клеточно-опосредованного иммунного воспаления у больных БА и в системе органов дыхания, и в сыворотке крови. Это подтверждается данными ряда авторов Saad-El-Din Bessa S. (2012), Louise N. (2003), Chvatchko Y. (2003). Так, например, по данным Saad-El-Din Bessa S. et al. (2012) CCL5/RANTES можно использовать в качестве иеинвазивного маркера сыворотки крови для мониторинга тяжести Б А. А Louise N. et al. (2003) показали, что CCL3/MTP-la и CCL5/RANTES почти всегда связаны с вирусными инфекциями.

У 48 из 70 больных БА ввиду наличия мокроты удалось изучить клеточный состав мокроты, в котором присутствовали эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, моноциты и эпителий бронхов. В ходе статистического анализа были получены положительные корреляционные связи между экспрессией мРНК хемокинов слизистой оболочки носоглотки и клетками мокроты (мРНК CCL3/MIP-lß и эозинофилами, эпителием бронхов, нейтрофилами, лимфоцитами, моноцитами; мРНК CCL5/RA.NTES и эозинофилами, нейтрофилами, моноцитами, макрофагами; мРНК

ССЫ 1/эотаксина и моноцитами мокроты). Полученные данные позволяют утверждать, что по выраженности экспрессии мРНК хемокинов слизистой оболочки носоглотки можно судить о клеточном составе мокроты. Полученные данные также демонстрируют, что в очаг активного воспаления эозинофилы и нейтрофилы привлекаются одними и теми же хемокинами: ССЬЗ/М1Р-1Р и (( 1.5. КАК ГЕБ как показано на рисунке 5. Это подтверждается данными Волковой ЛИ. и соавт,, (2000) о эозинофидьно-нейтрофильном воспалении в бронхах у больных БА.

г=0,4;р=0,02 г=0,3;р-0,005

г=0,3;р=0,01 г=0,3;р=0,01

Эошнофилы мокроты

Рисунок 5. Корреляционные связи между экспрессией мРНК ССЬЗ/МГР-1 (3, ССХ5/ЯАЫТЕ8 и клетками мокроты При проведении корреляционного анализа была установлена зависимость показателей выраженности бронхиальной обструкции от содержания хемокинов в сыворотке крови больных БА. Достоверная обратная корреляция была между содержанием ССЬЗЛШЯТЕБ в сыворотке крови и ОФВ1 после проведения пробы с р2-агониетом как показано на рисунке 6. Обратной корреляционной взаимосвязь была между содержанием ССЫ 1/эотаксина сыворотки и индексом Тиффно. Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии ССЪ5/ИАМТЕ8 и ССЫ 1/эотаксина на бронхиальную проходимость у всех больных БА.

г=-0,3;р-0,04

Индекс Тиффно

ССШ/эотаксин сыворотки

г=-в.3'.о=0.03

ОФВ1 после проведения пробы с р2-агонистом

СС1,5/НАМТЕ8 сыворотки

Рисунок 6. Корреляционные связи между содержанием ССЕ5/КА]ЧТЕ8, ССЫ 1/эотаксина в сыворотке и показателями бронхиальной обструкции

В нашем исследовании оценивалась экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов у больных БА, разделенных на подгруппы в зависимости от клинико-патогенетических вариантов БА.

В подгруппе больных с атонической БА были выявлены достоверно повышенная экспрессия мРНК ССЬ24/эотаксина-2 по сравнению с подгруппой больных с инфекционно-зависимым вариантом, а также достоверно повышенная экспрессия мРНК ССЬ24/эотаксина-2, CCL3/MIP-lrx, CCL4/MIP-lß, CXCR.1 и сниженная экспрессия мРНК CCR1, по сравнению с контрольной группой.

В сыворотке крови этой подгруппы достоверно сниженным было содержание CCL11/эотаксина и повышенным - ССЬ24/эотаксина-2, CCL5/RANTES по сравнению с контрольной группой. Также для этой группы больных БА характерно достоверное снижение содержания эотаксина при повышенном содержании эотаксина-2 в сыворотке крови.

В подгруппе, где сочетались атонический и инфекционно-зависимый варианты БА наблюдалась достоверно повышенная экспрессия мРНК CCL3/MIP-10, CCL4/MTP-1 ß и мРНК CXCR1 по сравнению с контрольной группой. В сыворотке крови этой подгруппы достоверно пониженным было содержание CCL11/эотаксина и повышенным - CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, ССL24/эотаксина-2 по сравнению с контрольной группой. Кроме того, содержание CCL4/MIP-lß было достоверно повышенным по сравнению с подгруппой больных БА с инфекционно-зависимым вариантом.

В подгруппе с инфекционно-зависимой БА достоверно сниженной была только экспрессия мРНК ССЬ24/эотаксина-2 по сравнению с контрольной группой. Вероятно, это связано с перераспределением С<Х24/эотаксина-2 в очаг активного воспаления, то есть нижние дыхательные пути или же недостаточной его экспрессией. В сыворотке крови этой подгруппы достоверно повышенным было содержание С(Х24/эотаксина-2 и CCL5/RANTES по сравнению с контрольной группой.

Все больные БА (п=70) были обследованы на наличие внугриклеточной инфекции (вирусы парагриппа, PC-вирусы, аденовирусы, М. pneumoniae, Ch. Psitaci) в слизистой оболочке носоглотки методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР). У больных БА с обострением заболевания вследствие перенесенного ОРЗ браш-биопсия слизистой оболочки носоглотки выполнялась на 3-4 неделе, соответственно выявленные инфекционные агенты встречались не так часто. Первую подгруппу больных БА с выявленной инфекцией составили 16 (23%) пациентов.

Наиболее часто встречаемыми были возбудители: М. Pneumoniae у 5 пациентов. Ch. Psitaci ~ у 4; реже встречались: вирус парагриппа - у 1, РС-вирус — у 1, аденовирус - у 1; так же встречались сочетания: М. Pneumoniae и Ch. Psitaci - у 2, сочетание Ch. Psitaci и аденовируса - у 1, сочетание М Pneumoniae и PC-вируса - у 1 как показано на рисунке 7. В этой подгруппе достоверно повышенной была экспрессия мРНК CCL3/MIP-la и CXCR1 и сниженной - мРНК CCR1 по сравнению с контрольной группой, в отличие от

подгруппы больных БА с не выявленной инфекцией, где достоверных изменений экспрессии мРНК хемокинов не выявлялось. В сыворотке крови этой подгруппы достоверно сниженным было содержание CCL11/эотаксииа и повышенным - €CL3/MIP-la, CCL5/RANTES, ССЬ24/эотаксии-2 по сравнению с контрольной группой. Повышение содержания ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови у больных БА с выявленной инфекцией в нашем исследовании совпадало с данными Federica S. et al., (2000) о том, что внутриклеточная инфекция может стимулировать экспрессию мРНК хемокинов, участвующие в аллергическом воспалении. Очень характерно повышение содержание в сыворотке крови CCL3/M1P-1 а и CCL5/RANTES в подгруппе с выявленной инфекцией. По данным Federica S. et al., (2000) содержание CCL3/MIP-la и CCL5/RANTES всегда повышается в ответ на внутриклеточную инфекцию, в особенности на аденовирусную и РС-вирусную.

■ сочетание Ch. Psítaci и аденовируса сочетание !-(<>%).. М.

Pneumoniae и СЬ. Psitaci 2-(13%).

" аденовирус

Н6%)"

PC-вирус 1-(6%).

сочетание М.

Pneumoniae и РС-вируса -1 (6%).

М.

Pneumoniae 5-(32%).

вирус парагриппа 1-(6%).

Ch. Psitaci 4-(25%).

Рисунок 7. Выявленная инфекция у больных БА в браш-биоптате слизистой носоглотки Во вторую подгруппу входили 54 (77%) с не выявленной инфекцией. При сравнении экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов с контрольной группой достоверных отличий выявлено не было.

В сыворотке крови этой подгруппы достоверно сниженным было содержание СС1Л1/ эотаксина и повышенным - ССЬЗ/МПМа, ССЕЗ/ЯА.ЫТЕБ, ССЬ24/эотаксин-2 по сравнению с контрольной группой.

Все обследованные больные БА в зависимости от фактора табакокурения были разделены на подгруппы: курящих (и=18) и некурящих лиц (п=52). В подгруппе некурящих больных БА достоверно сниженной была экспрессия мРНК СХСЬ8/1Ь-8. ССЬ5/ПАЫТЕ8, ССЯ1 и повышенной ССЕЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1 р, СХСНЛ по сравнению с контрольной группой некурящих лиц.

В сыворотке крови у подгруппы некурящих больных БА достоверно повышенным было содержание ССЫ 1/эотаксина, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ5/11АЫТЕ8, ССЬ24/эотаксин-2 по сравнению с подгруппой некурящих лиц контрольной группы.

В подгруппе курящих больных БА достоверно сниженной была экспрессия мРНК ССКI и повышенной - мРНК ССЫ 1/эотаксина, ССЬ4/МГР-1р по сравнению с контрольной группой курящих лиц. В сыворотке же курящих больных БА достоверно повышенным было содержание СХСЬ8/1Ь-8, ССЬЗ/ИА1МТЕ5, ССЬ24/эотаксина-2 по сравнению с группой курящих практически здоровых лиц, что свидетельствует об усиленной активности гуморального иммунного воспаления на фоне табакокурения.

Из обследованных нами больных БА с легкой степенью тяжести было 14 (20%) пациентов и 56 (80%) - со средней степенью тяжести заболевания. В соответствии с этим больные БА подразделялись на подгруппы.

В подгруппе больных БА с легкой степенью тяжести заболевания достоверно сниженной была экспрессия мРНК ССК1 по сравнению с контрольной группой. В этой же подгруппе достоверно повышенной была экспрессия мРНК ССЕЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1р, ССЕ24/эотаксина-2, СХСШ по сравнению с контрольной группой. В подгруппе больных БА с легкой степенью тяжести заболевания было достоверно повышено в сыворотке крови содержание ССЕЗ/МПМа, ССЕ24/эотаксин-2, СХСЬ8/1Ь-8 по сравнению с контрольной группой.

В подгруппе, которую составили больные БА со средней степенью тяжести, достоверно сниженной была экспрессия мРНК рецепторов ССЯ1, ССЯЗ по сравнению с контрольной группой. Достоверно повышенной экспрессией в этой же подгруппе была мРЛК ССЬЗ/М1Р-1а, ССЕ4/М1Р-1 [3, ССЫ 1/эотаксина, СХСЮ по сравнению с контрольной группой. В подгруппе больных БА, где заболевание со средней степенью тяжести было достоверно повышенным в сыворотке крови содержание ССЬЗ/МПМа, ССЬ5/ЯАМТЕ8, ССЬ24/эотаксин-2 по сравнению с контрольной группой.

Резюмируя полученные данные, следует отметить, что достоверное повышение содержания ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови наблюдалось во всех подгруппах больных

БА независимо от клииико-патогенетических вариантов БА, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения, как показано в таблице 2. По данным СЬае Б.С. сЧ а!. (2004) содержание ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови положительно коррелирует с эозинофилами периферической крови. С учетом этих данных ССЬ24/эотаксин-2 может являться биомаркером иммунного воспаления при БА. Как показано в таблице 2, наряду с ССЬ24/эотаксином-2, повышенное содержание ССЕ5/11АНТЕ8 в сыворотке крови также было достоверным во всех подгруппах независимо от клинико-патогенетических вариантов, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения, кроме подгрупп больных БА с легкой степенью тяжести заболевания.

Таблица 2 Содержание хемокинов в сыворотке крови и экспрессия мРНК в носоглотке у больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов БА, фактора табакокурения, наличия инфекции в носоглотке и степени тяжести заболевания

Хемокины Клинико-патогенетическне варианты Табакокурение Наличие инфекции в носоглотк е Степень тяжести БА

А А+ИЗ из нет да нет да легкая среди яя

СС1.3/ М1Р-1 а конц гг т Т Т Т Т

мРНК Т гг т Т Т ТТ

ССЫ/ М1Р-1Р конц т

мРНК Т тт т т Т тт

СС1.5/ КАНТЕ: 8 конц Т т г т т Т ТТ т

мРНК 1

ССЫ 1/ зотакси п конц I 1 1 1

мРНК т т

С'СЬ24/э отаксни-2 конц Т Т тт т тт тт ТТ ТТ ТТ тт

мРНК т 1 •т

СХС'1.8/ ГЬ8 КОНЦ т т

мРНК 1

Примечание: статистически значимо при р<0,05; Т|- статистически значимо р<0,005

Таким образом, повышенное содержание в сыворотке крови ССЬЗ/ИАЫТЕБ характеризовало усиление иммунного воспаления у больных БА.

Исходя из полученных данных, хемокины (ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1Р, СС1_5/11АНТЕ8, ССЫ 1/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2, СХСЬ8/1Ь-8) и их рецепторы (ССШ, ССЮ, ССР5, СХСРЛ, СХСЯ2) в комплексе могут достоверно характеризовать иммунное воспаление как в сыворотке крови, так и в системе органов дыхания у больных БА. Хемокин ССЬ24/эотаксин-2 может быть использован в качестве биомаркера при БА.

Выводы

1. При атопической БА повышенная экспрессия мРНК СС-хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1 р, ССЬ24/эотаксин-2) в слизистой носоглотки сочетается с повышенным содержанием CCL5/RANTES и ССЬ24/эотаксин-2 и сниженным содержанием CCLI 1/эотаксина в сыворотке крови, что характеризует преобладание Th-2 типа иммунного воспаления.

2. При инфекпионно-зависимой БА выявлены минимальные отклонения системы СС-хемокинов: сниженный уровень мРНК ССЬ24/эотаксин-2 в слизистой носоглотки и повышенное содержание CCL5/RANTES и ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови. Полученные данные подтверждают наличие Th-2 типа иммунного ответа в сыворотке крови у больных инфекционно-зависимой БА.

3. При смешанном варианте БА (А+ИЗ) выявлены максимальные отклонения

системы СС-хемокинов: повышенный уровень мРНК CCL3/MIP-la и CCL4/MIP-1P в слизистой носоглотки, и значительно повышенное содержание CCL3/M!P-la, CCL4/MIP-ip, CCL5/RANTES и ССЕ24/эотаксина-2 в сочетании со сниженным содержанием CCL11/эотаксина в сыворотке крови.

4. У практически здоровых курильщиков сниженная экспрессия мРНК CCL5/RANTES и CXCL8/IL-8 в слизистой носоглотки сочетается со сниженным содержанием CXCL8/IL-8 в сыворотке крови, что может свидетельствовать о повышенной чувствительности слизистой носоглотки к инфекции.

5. У курящих больных БА повышенная экспрессия мРНК CCL11/эотаксина,

CCL4/MIP-1P и сниженная экспрессия мРНК CCR1 сочетаются с повышенным содержанием CXCL8/1L-8, CCL5/RANTES и ССЕ24/эотаксина-2 в сыворотке крови. Вероятнее всего, табакокурение усиливает аллергическое воспаление у больных БА.

6. Установлена положительная корреляция между экспрессией мРНК CCL4/MIP-lp, CCL5/RANTES слизистой носоглотки и количеством эозинофилов и нейтрофилов в мокроте, что обуславливает эозинофильно-нейтрофильное воспаление дыхательных путей при БА.

7. Установлены отрицательные корреляции между содержанием CCL11/эотаксина, CCL5/RANTES сыворотки крови и основными показателям бронхиальной обструкции (индексом Тиффно и ОФВ1) соответственно. Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии CCL11/эотаксина и CCL5/RANTES сыворотки крови на основные показатели бронхиальной обструкции (индекс Тиффно и ОФВ1) у больных БА

Практические рекомендации

1. Повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови рекомендуется использовать в качестве биомаркера бронхиальной астмы.

2. Повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 и сниженное содержание

CCL11 /эотаксина в сыворотке крови больных БА может быть использовано для диагностики атопической бронхиальной астмы.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бибкова (Ковалинская) A.A. Экспрессия мРНК некоторых хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки у практически здоровых лиц / Сысоев К.А., Семенов A.B., Любимова Н.Е., Арсентьева Н.В., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. II Медицинская иммунология. -2011. - Т 13. - №6. - С.617.

2. Бибкова (Ковалинская) А.А Экспрессия мРНК хемокинов н хемокнновых рецепторов в слизистой носоглотки больных бронхиальной астмой в зависимости от внутриклеточной инфекции/ Халнль A.M., Сысоев К.А., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. // Ученые записки. - 2011. - Том XVIII. - № 3. - С. 34.

3. Бибкова (Ковалинская) A.A. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки у больных бронхиальной астмой на фоне проводимой базисной терапии / Сысоев К.А., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. // Особенности течения и лечения заболеваний у жителей блокадного Ленинграда и их потомков. - 2011. - Выпуск VII. - С. 315.

4. Бибкова (Ковалинская) A.A. Значимость определения некоторых хемокинов и их рецепторов у больных бронхиальной астмой / Сысоев К.А., Семенов A.B., Любимова Н.Е., Арсентьева Н.В., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. // Медицинская иммунология. - 2012. - Том 14. - №12. - С.109.

5. Халнль А.М. Особенности течения хронической обструктнвной болезни легких и в сочетании с гастроэзофагальной рефлюксной болезнью / Трофимов В.И., Бибкова (Ковалинская) A.A. // Ученые записки.- СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. - 2012. - Том 19. - №1. - С. 78.