Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Некоторые CC- и CXC-хемокины и их рецепторы у больных бронхиальной астмой

ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» министерства здравоохранения

Российской Федерации

^2ui«7i2i На правах рукописи

Ковалинская Анна Андреевна

Некоторые СС- и СХС-хемокины и их рецепторы у больных бронхиальной

астмой

14.01.04. - внутренние болезни 14.03.09. - клиническая иммунология, аллергология

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Заведующий кафедрой госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова, доктор медицинских наук, профессор Василий Иванович Трофимов

Заместитель директора по научной работе НИИ Пастера, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Арег Артемович Тотолян

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014

Содержание

Содержание......................................................................................................................2

Список сокращений........................................................................................................5

Актуальность темы..........................................................................................................6

Цель работы.....................................................................................................................7

Задачи исследования.......................................................................................................7

Научная новизна..............................................................................................................8

Практическая ценность работы.....................................................................................9

Положения выносимые на защиту................................................................................9

Реализация и апробация работы....................................................................................9

Глава 1. Обзор литературы...........................................................................................11

1.1 Введение.................................................................................................................11

1.2 Патогенез БА.........................................................................................................12

1.3 Роль некоторых СС- и СХС- хемокинов и их рецепторов в патогенезе БА... 14

1.4 Биомаркеры БА......................................................................................................29

Глава 2. Материалы и методы......................................................................................34

2.1 Клинико-лабораторные исследования................................................................34

2.1.1 Цитологическое исследование мокроты.............................................................34

2.1.2Исследование функции внешнего дыхания.......................................................34

2.2 Получение биоматериала.....................................................................................35

2.3 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки.......................36

2.4 Метод мультиплексного хемилюминисцентного анализа с использованием магнитных частиц для количественного определения хемокинов в сыворотке крови.......................................................................................................................37

2.5 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для верификации инфекционных возбудителей в слизистой оболочке носоглотки с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле..........................................................................................................................38

2.6 Статистическая обработка....................................................................................39

Глава 3. Иммунологическая характеристика контрольной группы.........................40

3.1 Клиническая характеристика контрольной группы..........................................40

3.2 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки носоглотки контрольной группы.........................................................................40

3.3 Содержание хемокинов в сыворотке крови контрольной группы...................43

Глава 4. Характеристика больных Б А.........................................................................45

4.1 Клиническая характеристика больных БА.........................................................45

4.2 Клиническая характеристика подгрупп больных БА........................................51

4.2.Распределение больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов заболевания.........................................................................................51

4.2.2Распределение в зависимости от инфекционного фактора..............................54

4.2.3Распределение больных БА в зависимости от фактора табакокурения..........56

4.2.4Распределение больных БА в зависимости от степени тяжести.........................

заболевания..........................................................................................................58

Глава 5. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки

носоглотки......................................................................................................................60

5.1 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки носоглотки у больных БА....................................................................................60

5.2 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки носоглотки у больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов заболевания.........................................................................................63

5.3 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки носоглотки у больных Б А в зависимости от инфекционного фактора...........65

5.4 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки носоглотки у больных БА в зависимости от фактора табакокурения.............66

5.5 Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов слизистой оболочки носоглотки у больных Б А в зависимости от степени тяжести Б А..................68

5.6 Обсуждение............................................................................................................70

Глава 6. Содержание хемокинов в сыворотке крови.................................................76

6.1 Содержание хемокинов в сыворотке крови у больных БА..............................76

6.2 Содержание хемокинов в сыворотке крови у больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов заболевания..........................................77

6.3 Содержание хемокинов в сыворотке крови у больных Б А в зависимости от инфекционного фактора.......................................................................................79

6.4 Содержание хемокинов в сыворотке крови больных БА в зависимости от фактора табакокурения.........................................................................................80

6.5 Содержание хемокинов в сыворотке крови больных Б А в зависимости от степени тяжести БА..............................................................................................82

6.6 Обсуждение............................................................................................................83

Глава 7. Заключение......................................................................................................87

Выводы.........................................................................................................................105

Практические рекомендации......................................................................................107

Список литературы.....................................................................................................108

Список сокращений

АБА Атопический клинико-патогенетический вариант

бронхиальной астмы АПК Антиген-презентирующая клетка

БА Бронхиальная астма

БАЛ Бронхоальвеолярный лаваж

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ЖЕЛ Жизненная емкость легких

ИГКС Ингаляционные глюкокортикостероиды

ИЗБА Инфекционно-зависимый клинико-патогенетический

вариант бронхиальной астмы КВВ Конденсат выдыхаемого воздуха

ОФВ1 Объем форсированного выдоха за первую секунду

ПСВ Пиковая скорость выдоха

ПЦР Полимеразная цепная реакция

PC-вирус Респираторно-синцитиальный вирус

ФВД Функция внешнего дыхания

ФЖЕЛ Форсированная жизненная емкость легких

ФНО Фактор некроза опухоли

ХОБЛ Хроническая обструктивная болезнь легких

CCL3/MIP-la, Макрофагальные воспалительные белки la, 1 р CCL4/MIP-lp

CCL5/RANTES Цитокин, секретирующийся после активации Т-клеток

(REGULATED UPON ACTIVATION, NORMAL T-CELL EXPRESSED,AND SECRETED) IgE Иммуноглобулин E

IL-1,2,4,6,8,13 Интерлейкин-1,2,4,6,8,13

IL-5R а Альфа цепь рецептора к интерлейкину 5

NO Оксид азота

Th-1,2 Т-хелперы первого и второго типа

Актуальность темы

Бронхиальная астма (БА) относится к числу широко распространенных заболеваний. Считается, что приблизительно 300 миллионов человек во всем мире страдают БА. Предполагается, что эта цифра возрастет еще на 100 миллионов к 2025 году (www.ginasthma.com/Guidelineitem.asp.). БА является заболеванием, которое имеет серьезные социальные и экономические последствия из-за пропусков занятий в школе и работы пациентами, а также высокой стоимости лечения. По оценкам ВОЗ, ежегодно БА обуславливает потерю 15 миллионов DALY (Disability-Ajusted- Life Year- дословно «год жизни, потерянный или измененный в связи с нетрудоспособностью»), что составляет 1% от общего всемирного ущерба от болезней. Кроме того, обращает на себя внимание увеличение распространенности БА в России, увеличение тяжести течения заболевания и связанный с этим рост летальности (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А., 2011).

Повышение эффективности лечения и профилактики БА связывается с необходимостью глубокого знания патогенетических особенностей заболевания. В настоящее время при достаточно хорошо изученном патогенезе БА остаются открытыми некоторые вопросы, особенно касающиеся молекулярных взаимодействий биологически активных веществ, в частности цитокинов (хемокинов). Известно около 50 хемокинов и 20 типов поверхностных рецепторов к ним (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006).

Хемокины относятся к классу цитокинов, которые являются центральным регулятором лейкоцитарной миграции, а также способствуют активации этих клеток, в частности, участвуют в высвобождении гранул с биологически активными веществами (Tian L.et al., 2011). В иммунной системе хемокины взаимодействуют со специфическими рецепторами, находящимися на мембранах клеток-мишеней, что способствует как подавлению, так и развитию иммунного воспаления (Tian L.et al., 2011). В иммунопатогенезе БА известны хемокины, которые участвуют как в аллергическом, так и в клеточно-опосредованном иммунном воспалении. Среди них наиболее хорошо изученными являются хемокины группы эотаксинов - медиаторов аллергического воспаления при БА, которые взаимодействуют с ре-

цептором CCR3 (Miles Е. В. et al., 2002; Tian L. et al., 2011). Хемокинами, характеризующими и аллергическое и клеточно-опосредованное воспаление, являются CCL3/MIP-la и CCL5/RANTES, которые взаимодействуют с рецепторами: CCR1, CCR3, CCR5. К хемокинам, характеризующим клеточно-опосредованное воспаление, относятся CCL4/MIP-lp и CXCL8/IL-8, которые взаимодействуют с рецепторами: CCR5 и CXCR1, CXCR2 соответственно. Ценность изучения хемокинов и их рецепторов в комплексе при БА заключается в более полном понимании характера иммунного воспаления (гуморальный и/или клеточно-опосредованный), исследовании факторов которые обуславливают этот характер.

Исследование экспрессии мРНК провоспалительных хемокинов CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lp, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CCL11 /эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2 и их рецепторов: CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2, характеризующее иммунное воспаление в слизистой верхних дыхательных путей, в частности носоглотке, у больных БА до настоящего времени не изучалось. Взаимосвязи между содержанием этих же хемокинов в сыворотке крови и клинико-ла-бораторными данными у больных БА освещены не достаточно полно, что обуславливает актуальность настоящего исследования.

Цель работы

Изучить участие некоторых хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES, CCL 11/эотаксина, ССЕ24/эотаксина-2, CXCL8/IL-8) и их рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в иммунопатогенезе БА и оценить возможность их использования в качестве новых диагностических биомаркеров этого заболевания.

Задачи исследования

1. Определить экспрессию мРНК некоторых СС (CCL3/MIP-1 a, CCL4/MIP-1(3, CCL5/RANTES, CCL11/эотаксин, ССЕ24/эотаксин-2) и СХС (CXCL8/IL-8) хемокинов, а также их рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в слизистой оболочке носоглотки больных БА в фазе обострения в зависимости от кли-

нико-патогенетических вариантов, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения и у практически здоровых лиц.

2. Определить содержание некоторых СС (ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1р, ССЬ5/КА№ГЕ8, СС1Л 1/эотаксин, ССЬ24/эотаксин-2) и СХС (СХСЬ8/1Ь-8) хе-мокинов в сыворотке крови у больных БА в зависимости от клинико-патогенети-ческих вариантов, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения и у практически здоровых лиц.

3. Изучить взаимосвязи показателей системы хемокинов с клиническими, общелабораторными и функциональными показателями больных БА.

4. Провести анализ изменений изученных хемокинов и их рецепторов у больных БА и оценить их в иммунопатогенезе заболевания.

5. Изучить возможность оценки хемокинов с точки зрения биомаркеров бронхиальной астмы.

Научная новизна

1. У больных БА по сравнению с практически здоровыми лицами выявлена повышенная экспрессия мРНК ССЫ 1/эотаксина, ССЬ24/эотаксина-2, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1(3 и рецептора СХСЮ в слизистой оболочке носоглотки.

2. Впервые установлено, что у больных Б А по сравнению с практически здоровыми лицами в сыворотке крови было выявлено повышенное содержание ССЬ5/ЯАМТЕ8, СХСЬ8/1Ь-8, ССЬ24/эотаксина-2 и сниженное содержание ССЫ 1/эотаксина, причем повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови не зависело от клинико-патогенетических вариантов БА, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения.

3. Впервые показано формирование у практически здоровых курильщиков дефекта синтеза и продукции СХСЬ8ЛЬ-8, что проявлялось сниженной экспрессией мРНК в слизистой оболочке носоглотки и сниженным содержанием этого хемокина в сыворотке крови.

4. Показаны взаимосвязи у больных БА показателей системы хемокинов с общелабораторными показателями (положительные корреляции между экспрес-

сией мРНК ССЬ4/М1Р-1р, ССЬ5/КА]\ПГЕ8 с эозинофилами и нейтрофилами мокроты) и показателями бронхиальной обструкции (отрицательные корреляции ССЬ11/эотаксина с индексом Тиффно и ССЬ5/ЯАМТЕ8 с ОФВ1).

Практическая ценность работы

1. Комплексная оценка экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки и содержания в сыворотке крови у больных БА позволяют определить преимущественный характер иммунного воспаления: гуморальное (В-клеточное) или клеточно-опосредованное (Т-клеточное).

2. Повышенное содержание ССЬ24/эотаксина-2 в сыворотке крови у больных БА в фазе обострения независимо от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения позволяет рекомендовать соответствующий хемокин в качестве биомаркера БА.

Положения выносимые на защиту

1. В отличие от инфекционно-зависимой БА, для которой характерно сниженная экспрессия мРНК ССЬ24/эотаксина-2, повышенное системное содержание ССЬ5/КА]ЧТЕ8 и ССЬ24/эотаксина-2, атопическая БА характеризуется сниженным системным содержанием ССЫ 1/эотаксина, повышенным содержанием ССЬ5/КАЫТЕ8, ССЬ24/эотаксина-2 и повышенным местным синтезом ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-1р и ССЬ24/эотаксина-2.

2. У практически здоровых курильщиков в зависимости от длительности табакокурения развиваются дефекты местного синтеза и системной продукции СХСЬ8/1Ь-8.

3. У всех больных БА средней степени тяжести в фазе обострения не зависимо от клинико-патогенетических вариантов, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения устойчиво повышено содержание в сыворотке крови ССЬ24/эотаксина-2, что позволяет его отнести к биомаркерам БА.

Реализация и апробация работы

Материалы докладывались на XIII всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-

Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины - 2009» (Санкт-Петербург, 2009), на региональной научно-практической конференции «Осложнения гриппа и ОРЗ в практике терапевта» (Санкт-Петербург, 2011), на научной конференции, посвященной 110-летию кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПБГМУ им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2011).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в отечественных изданиях, 4 из которых оригинальные статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Введение

На протяжении многих лет бронхиальная астма (БА) является серьезной проблемой для здравоохранения. По данным эпидемиологических исследований ISAAC и ECRHS распространенность БА составляет не менее 8-10 % среди взрослого населения, 10-15 % - среди детей. Обращают на себя внимание неблагоприятные тенденции, а именно: увеличение тяжести течения БА и связанный с этим рост летальности. Заболеваемость Б А увеличивается среди детей, подростков и взрослых, причем темпы роста заболеваемости БА в детском и подростковом возрасте опережают рост таковой среди взрослых. В связи с этим появляется необходимость в более углубленном изучении Б А, тем более, что появление новых методов исследования позволяют это делать и на молекулярном уровне.

В Европе создана Европейская сеть по глобальной аллергии и астме (GA 2 LEN), которая изучает «эпидемию» аллергии и БА. Аллергические заболевания, включая аллергический ринит, БА, риноконъюнктивит, желудочно-кишечную патологию, крапивницу и экзему, являются одними из самых распространенных в мире и занимают первое место по распространенности в Европе. Масштабы этой патологии продолжают расти, и сегодня каждый третий ребенок имеет аллергию. При существующих тенденциях к 2015 году от нее будет страдать каждый второй житель Европы.

Расходы на лечение больных БА постоянно возрастают во всем мире. В настоящее время рас�