Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Некоторые компоненты глутаматэргической системы у больных с разными типами течения рассеянного склероза

На правах рукописи

РЯЗАНЦЕВА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

НЕКОТОРЫЕ КОМПОНЕНТЫ ГЛУТАМАТЭРГИЧЕСКОИ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ С РАЗНЫМИ ТИПАМИ ТЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

14.01.11 — нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 О 2015

ИРКУТСК-2015

005558649

005558649

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Алифирова Валентина Михайловна Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Иванова Светлана Александровна Официальные оппоненты:

Прокопенко Семен Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра нервных болезней с курсом медицинской реабилитации ПО, заведующий кафедрой

Малкова Надежда Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической неврологии и алгологии, профессор; Областной центр рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний нервной системы ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница», руководитель

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_»_2015 года, в «_» часов на заседании диссертационного совета ДМ 208.031.01 при ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации и ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 664079, г. Иркутск, микрорайон Юбилейный, 100.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации (664079, г. Иркутск, микрорайон Юбилейный, 100) и на сайте http://igmapo.ru.

Автореферат разослан «_» _2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Стародубцев Анатолий Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Рассеянный склероз (PC) - широко распространенное дизиммунное воспалительно-нейродегенеративное заболевание ЦНС, характеризующееся образованием множественных очагов демиелинизации, неуклонно прогрессирующим течением и развитием стойкой инвалидизации [Завали-шин И.А., Бойко А.Н., 2004; Переседова А.В., Завалишин И.А., 2005; Гусев Е.И., Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н., 2010]. Несмотря на значительный прогресс медицинских знаний за последнее время, до сих пор нет полного понимания этиологии и патогенеза этого заболевания.

В течение последних лет накоплено много данных о мультифакториальной природе PC, согласно которой в развитии заболевания важную роль играют как эндогенные (генетическая предрасположенность, гормональный фон и др.), так и экзогенные факторы - персистирующая вирусная инфекция, экология (климат, диета) и географические особенности [Гусев Е.И., 2005; Confavreux С., 2001]. Также обсуждается вопрос о гетерогенности PC как заболевания с полиморфным течением, наличием клинико-диагностических диссоциаций, разными иммунопатологическими механизмами развития, наличием различных генетических профилей у больных. Установлено, что при PC имеет место патология нейрональной трансмиссии, обусловленная, главным образом, глутаматом и его нейроактивны-ми метаболитами с развитием эксайтотоксических механизмов повреждения ней-рональных структур, реакций окислительного стресса, индукцией процессов клеточной гибели [Carpenter D., 2002; Gonsette R.E., 2008]. Глутаматная система — самая мощная трансмитгерная система мозга. Глутаматергические нейроциты обнаружены в коре больших полушарий, обонятельной луковице, гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, сетчатке [Гусев Е.И. и др., 1997]. Основную роль в запуске эксайтотоксических процессов играет гиперактивация глутаматных рецеп-оров NMDA-класса, а целостность олигодендроцитов белого вещества зависит от ормальной работы транспортера глутамата 2 типа ЕААТ2 [Domercq, М., Etxebar-ia, Е., 2005; Vallejo-Illarramendi A., et al., 2011]. Клетки иммунной системы (лим-оциты, моноциты), которые накапливаются в крови непосредственно перед обо-грением, в большом количестве содержат глутаматные рецепторы. Эти клетки

могут быть использованы в качестве маркеров экзацербации и служить доказательством взаимодействия нервной и иммунной систем [Boldyrev A. A., Kazey V. I. et al., 2004; Miglio G„ Varsaldi F„ et al., 2005; Pacheco R., Gallart Т., et al., 2007; Pampliega et al., 2011].

Доказана роль наследственных факторов в развитии PC. Генетические факторы влияют не только на риск развития заболевания, но и на особенности его течения [Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н.,2011]. В качестве генов - кандидатов предрасположенности к PC преимущественно рассматриваются гены, так или иначе вовлеченные в иммунный ответ, гены миелина и некоторых гормонов. Считается, что вклад в развитие PC вносят ряд генов, определяющих дегенеративные изменения (например, гены, управляющие процессом апоптоза) и процессы ре-миелинизации [Судомоина М.А., Бойко А.Н., 2003;Frohman Е.М., Filippi М. et al., 2005;0ksenberg J.R., Baranzini S.E. et al., 2008]. Вместе с тем представляет интерес изучение полиморфных генов глутаматопосредованной эксайтотоксичности как одного из главных компонентов воспалительного и нейродегенеративного процессов при PC.

Степень разработанности темы исследования. В отечественной литературе показано, что повышение экстрацеллюлярного уровня глутамата может быть связано с характерной для этого заболевания гибелью олигодендроцитов, которые, как предполагается, являются ключевыми клетками, ответственными за клиренс глутамата в белом веществе головного мозга [Переседова А.В., Завалишин И.А.,

2005]. Наряду с этим зарубежными авторами показана избыточная продукция глутамата проникающими в ЦНС активированными иммунными клетками и его высвобождение из демиелинизированных аксонов [Stys Р.К., 2004; Werner Р. et al.,

2006]. Полиморфизмы генов глутаматэргической системы мало изучены и литературные данные, указывающие на ассоциацию с частотой встречаемости определенных полиморфизмов и фенотипическими проявлениями PC, немногочисленны и противоречивы [Westall F.C., et al., 2008; Strijbis E.M., InksterB., et al., 2013]. Таким образом, необходимость комплексной оценки как самой глутаматопосредованной эксайтотоксичности, так и генетических предикторов данного процесса определяется актуальностью изучения PC с позиций комплексного взгляда на

тиологию и патогенез заболевания.

Цель исследования - изучить уровень глутаминовой кислоты в сыворотке рови и оценить роль полиморфных вариантов генов глутаматэргической системы больных рассеянным склерозом в зависимости от типа течения и тяжести завоевания. Задачи исследования:

1. Оценить особенности клинических проявлений РС в зависимости от ти-а течения, стадии заболевания и степени выраженности неврологических нару-ений.

2. Выявить зависимость концентрации глутамата в сыворотке больных РС т пола, длительности болезни, типа течения, стадии заболевания, степени инва-идизации, скорости прогрессирования, характера клинического дебюта болезни.

3. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов глутама-ргической системы: гена транспортера глутамата 8ЬС1А2 ге4354668 и генов ио-отропных рецепторов глутамата ОКШ2А ге1969060, «2650427 у больных РС и

оровых лиц.

4. Выявить ассоциации полиморфных вариантов генов ОШИ2А (гб 1969060, 2650427) и БЬС1А2 («4354668) с типом течения, возрастом и характером клини-еского дебюта, скоростью прогрессирования, степенью инвалидизации, уровнем

утамата сыворотки крови.

Научная новизна исследования. Впервые проведена комплексная оценка онцентрации глутаминовой кислоты в сыворотке крови больных РС в зависимо-л от клинических особенностей заболевания. Установлено, что больные РС меют достоверно высокий уровень глутамата по сравнению с группой здоровых иц, что отражает высокую степень глутаматопосредованной эксайтотоксичности ри данной патологии. Увеличение уровня глутамата по сравнению с группой оровых лиц отмечено у пациентов с ремиттирующим типом течения болезни, в адию обострения патологического процесса, легкой степенью инвалидизации по кале ЕОЭЗ, быстрой скоростью прогрессирования и длительностью заболевания олее 5 лет. Впервые установлено увеличение концентрации глутамата в группе ольных с дебютом заболевания в виде пирамидных и чувствительных наруше-

ний.

Впервые исследованы и проанализированы полиморфные варианты генов глу-таматэргической системы ОШЫ2А (ге1969060, гб2650427) и Б1С1А2 (гб4354668) у больных РС. Показано, что носительство генотипа вО гена ОиША (ге 1969060) ассоциировано с более тяжелым типом течения заболевания (ППРС) и более поздним возрастом (старше 40 лет) дебюта у пациентов РС. Установлена ассоциация носительства генотипа вв гена БЬС1А2 (г$4354668) с медленным темпом прогрессирования болезни. Доказано, что концентрация глутамата сыворотки у больных РС не ассоциирована с носительством генотипов ТТ, СТ, вв гена Б1С]А2.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Установленные различия в содержании глутамата у больных РС в зависимости от типа течения и стадии болезни, клинического характера дебюта, степени инвалидизации и продолжительности болезни дополняют знания о патогенетических особенностях заболевания и позволяют оптимизировать подходы к лечению больных. Обнаруженные ассоциации генетических вариантов с клиническими характеристиками заболевания служат основой для дальнейшего изучения механизмов развития РС. Полученные данные об особенностях распределения частот аллелей и генотипов генов глутаматэргической системы у больных РС дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте этого полиморфного заболевания.

С теоретической точки зрения полученные данные могут быть использованы в качестве новых знаний о патогенезе и генетической гетерогенности РС. Сведения о связи полиморфных маркеров изученных генов с клиническими характеристиками РС могут быть использованы для оценки характера течения патологического процесса у больных РС.

Методология и методы исследования. Диссертационное исследование было разделено на три части. В первой проводился анализ демографических и клинических особенностей РС в исследуемой когорте больных. Во второй - оценка уровня глутаминовой кислоты в зависимости от различных характеристик заболевания. В третьей части исследовались частота встречаемости генов глутаматэргической системы (¿ЭШША «1969060, ге2650427 и БЬС1А2 гэ4354668) в вы-

борке больных и здоровых лиц; анализ ассоциаций указанных генов с клиническими характеристиками заболевания. На заключительном этапе произведен статистический анализ данных исследования. Пациенты находились на стационарном лечении, а также наблюдались амбулаторно в неврологической клинике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России г. Томска. Диагноз был установлен с помощью диагностических критериев McDonald et al. (2000, 2005, 2010) в зависимости от времени начала заболевания. В соответствии с целью и задачами исследования пациенты были разделены на группы в зависимости от следующих признаков: пола, возраста (от 18 до 60 лет включительно); типа течения (ремитти-рующий, вторично-прогрессирующий, первично-прогрессирующий, клинически изолированный синдром); стадии заболевания (обострение, ремиссия); длительности заболевания (до 5 лет, от 5 до 10 лет и более 10 лет); клинического характера дебюта заболевания; длительности первой ремиссии (менее 6 месяцев, от 6 до 12 месяцев, более 12 месяцев); степени инвалидизации по шкале EDSS и FS (0 - 3 балла; от 3,5 до 5,5 баллов; выше 6,0 баллов); скорости прогрессирования (отношение балла EDSS к длительности болезни в годах); получаемой базисной терапии (глатирамера ацетат; препараты интерферона-бета; без терапии ПИТРС).

Положения, выносимые на защиту:

1. При рассеянном склерозе имеется увеличение концентрации глутамата в сыворотке крови пациентов по сравнению со здоровыми лицами.

2. Концентрация глутаминовой кислоты в сыворотке крови больных PC сопряжена с типом течения, стадией и продолжительностью заболевания, степенью инвалидизации и клиническим характером дебюта болезни.

3. Первично-прогрессирующий PC, поздний возраст дебюта (старше 40 лет) и медленный темп прогрессирования заболевания ассоциированы с полиморфизмами генов GRIN2A (rsl969060) и SLC1A2 (rs4354668) глутаматэргической системы.

Степень достоверности и апробация результатов. Настоящее исследования являлось открытым, однофазным и включало в себя клиническое, биохимическое и генетическое исследование больных рассеянным склерозом и группы здо-

ровых добровольцев. В работе использована высокоточная аппаратура и сертифицированные наборы реагентов.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII Международной крымской конференции «Окислительный стресс и свобод-норадикальные патологии» (Судак, Крым, Украина, 2012); II Интернациональном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции синаптической трансмиссии» (Киев, 2012); Международной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 115-летию СПбГМУ им.акад. И.П. Павлова «Дни биохимии в СПбГМУ» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской XIX научно-практической конференции «Нейроиммунология. Рассеянный • склероз» (Санкт-Петербург, 2013); VI Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз и другие аутоиммунные заболевания нервной системы» (Новосибирск, 2013); Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); XIX научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Современные техника и технология» (Томск, 2013); Первом Конгрессе Российского комитета исследователей рассеянного склероза «Демие-линизирующие заболевания и нейроинфекции, вопросы диагностики и терапии» (Казань, 2013); I национальной конференции с международным участием «От фундаментальной неврологической науки к клинике» (Москва, 2014 г.); Международной заочной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты развития современной науки» (Москва, 2014 г.); EFNS-ENS Joint Congress of Neurology (Istanbul, 2014).

По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 107 страницах, содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, три главы с результатами исследования и их обсуждением, заключение, выводы и практические рекомендации. Работа иллюстрирована 23 таблицами, 29 рисунками. Список литера-

туры включает 150 наименований, из них 38 работ - отечественных и 112 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Проведено обследование 95 больных с клинически достоверным диагнозом рассеянного склероза (PC) и 6 пациентов с клинически изолированным синдромом (КИС). Критериями включения в исследование для больных являлись: наличие подписанного информированного согласия; достоверный диагноз PC или КИС; возраст до 60 лет. Критериями исключения из исследования для здоровых лиц и больных PC и КИС являлись: возраст моложе 18 и старше 60 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; наследственные и психические болезни, злокачественные новообразования, алкогольная и наркотическая зависимости; отказ от участия в исследовании. С целью определения концентрации глутаминовой кислоты в сыворотке крови больных рассеянным склерозом использовался набор реагентов Glutamate Assay Kitt (BioVision, США) для количественного измерения содержания глутамата в сыворотке крови спектрофото-метрическим методом. Выделение геномной ДНК осуществлялось микрометодом с использованием набора фирмы «Медиген» (Россия) на основе стеклянного сорбента. Для генотипирования использовали набор реагентов TaqMan® SNPGeno-typingAssay фирмы AppliedBiosystems (США). Определение аллельных вариантов генов SLC1A2 (rs4354668) и GRIN2A (rs2650427 и rs 1969060) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени со специфическими праймерами. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ SPSS 17.0 for Windows. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05 (р - достигнутый уровень значимости).

Всего в исследование вошли 309 человек, из них в группу больных - 101 (32,7%) человек, в контрольную группу - 208 (67,3%) здоровых добровольцев. Обследованы 95 пациентов с клинически достоверным диагнозом PC и 6 больных клинически изолированным синдромом. Группа контроля для исследования содержания глутамата сыворотки крови составила 66 (31,7%) лиц. Для генотипиро-

вания группа здоровых добровольцев составила 142 (68,3%) человека. В группе больных обследовано 60 (59,6%) женщин и 41 (40,6%) мужчина. Соотношение полов оказалось равным 1,5:1. В контрольной группе было 118 (56,7%) мужчин и 90 (43,3%) женщин, соотношение полов 1,3:1.

Результаты исследования и их обсуждение

Среди обследованных пациентов ремиттирующий тип течения заболевания наблюдался у 68 человек (67,3%), вторично-прогрессирующий - у 21 пациента (20,8%), первично-прогрессирующий - у 6 (5,9%). Выделена группа с клинически изолированным синдромом, в которую вошли 6 пациентов (5,9%). При РРС отмечалось преобладание женщин (75%), при ВПРС и ППРС - мужчин (26,8%) и (9,8%) соответственно. Соотношение полов в группе с РРС составило 2:1, в группе с ВПРС 0,90:1, в группе ППРС 0,5:1, с КИС 1:1.

Ремиттирующий тип течения заболевания наблюдался у более молодых лиц, возраст которых составил 31 [25;39] год, при вторично-прогрессирующем течении - 45 [37;56], при первично-прогрессирующем течении - 49 [39;57] лет. Самый молодой возраст - 21 [20;22] год - выявлен в группе пациентов с клинически изолированным синдромом. Самый ранний возраст начала заболевания (13 лет) оказался в группе пациентов с РРС, самый поздний - 54 года - у пациента с ППРС (р=0,001). Заболевание дебютировало при РРС в возрасте 23 [19;31] лет, при ВПРС - в 30 [23;33] лет. Пациенты с ППРС заболевали в более позднем возрасте -39 [28;47] лет. Возраст дебюта заболевания в группе с КИС составил 21 [20;22] год. Пациенты с РРС и КИС имели более ранний возраст начала заболевания по сравнению с прогрессирующими типами течения болезни (р=0,03). В общей группе обследованных больных средняя продолжительность заболевания составила 7 [4; 12] лет. В группе с РРС длительность болезни была равна 6 [4;9] годам. В группе с ВПРС продолжительность заболевания была выше и составила - 16 [12;21] лет (р=0,001). В группе с первично-прогрессирующим типом течения данный показатель оказался равным 8 [4; 10] годам. Среди обследованных пациентов с РРС на момент включения в исследование клиническое обострение отмечалось у 25 больных (36,8%), стадия ремиссии - у 43 пациентов (63,2%). Все больные во время экзацербации находились на стационарном лечении и получали соответст-

вующую терапию. Как легкое обострение трактовалось поражение одной FS с минимальными нарушениями ежедневной активности [Бойко А.Н., 2014]. Тяжелая атака заболевания - поражением более двух FS со значительным ограничением повседневной активности [Бойко А.Н., 2014]. Пациенты (п=12) в зависимости от степени выраженности обострения преимущественно получали «пульс» - терапию кортикостероидами (метилпреднизолон 1000 мг, №3-5) внутривенно капель-но на 500 мл физиологического раствора. Два пациента получали в качестве купирования обострения плазмаферез (8%). У одного больного с РРС (4%) наблюдалось тяжелое течение заболевания, третье обострение за последние 8 месяцев и прогрессирование по шкале EDSS на 1 балл. В связи с этим пациент получал ми-токсантрон в дозе 20 мг внутривенно капельно на 400 мл физиологического раствора однократно. В случае легкого обострения применялась сосудисто-метаболическая терапия. В нашем исследовании таких пациентов было 10 (40%).

Оценка неврологического дефицита проводилась по шкале инвалидизации EDSS, тяжесть состояния колебалась от 1,0 до 8,0 баллов. Балл EDSS в общей группе пациентов с PC составил 2,5 [2,0;3,5]. Пациентов с легкой степенью инвалидизации (от 0 до 3 баллов) было 52,5% (п=53), больных средней тяжести (от 3,5 до 5,5 балла) оказалось 46,6% (n=47), а с тяжелой инвалидизацией (от 6,0 и более баллов) - всего 0,9% (п=1). При оценке по каждой из функциональных шкал в отдельности (зрительная, стволовая, пирамидная, мозжечковая, сенсорная, функция мочевого пузыря и кишечника, функция мышления) выявлен больший неврологический дефицит в группе больных ВПРС по сравнению с РРС (р<0,05) (таблица

Таблица 1 - Клиническая характеристика пациентов по шкале функциональных

систем в зависимости от типа течения PC

Группы симптомов (функциональные системы, ФС) РРС п=68 ВПРС n=21 ППРС n=6

Количество баллов, Me [Q1;Q3]

I ФС. Поражения зрительного нерва i[i;i] 2 [1;2] 2 [1;2]

II ФС. Нарушения функции черепных нервов (кроме II пары) 0 [0;1] 2 [1;2] * 1 El; il

III ФС. Симптомы поражения пирамидного пути 2 [2;3] 3 [3;4] * 3 [3;3]

IV ФС. Нарушения координации 1 [1;2] 3 [2;3] * 2 [2;2]

V ФС. Нарушения чувствительности 2 [1;2] 2 [2;3] 2 [2;3]

VI ФС. Нарушения функции тазовых органов 1 [0;2] 3 [3;3] * 3 [2;3]

VII ФС. Нейропсихологические нарушения (церебральная ФС) 1 [0;1] 2 [1;2] * 2 [1;2]

Примечание - * р<0,05 - статистически значимые различия баллов при

сравнении с группой больных ремитгирующим PC (по точному критерию Фишера).

Проведена оценка скорости прогрессирования (нарастание степени тяжести EDSS в единицу времени). В общей группе обследованных больных медиана данного показателя составила 0,36 [0,25;0,62] балла/год. При РРС скорость прогрессирования достоверно ниже по сравнению с ППРС и была равна 0,38 [0,23;0,59] балла/год и 0,47 [0,28; 0,63] балла/год (р=0,001) соответственно. При ВПРС типе течения данный показатель составил 0,27 [0,18;0,40] балла/год.

В нашей выборке больных встречался моносимптомный дебют заболевания. Самыми частыми симптомами дебюта PC в общей группе больных был ретро-бульбарный неврит (РБН) (33 пациента, 32,7%) и чувствительные расстройства (32 пациента, 31,7%). У 21 пациента (20,8%) - пирамидные расстройства. Реже встречались мозжечковые нарушения (9 человек, 8,9%), стволовые симптомы - (5 больных, 4,9%). У больных РРС и ВПРС самыми частыми симптомами дебюта были РБН, а также чувствительные нарушения. Больные ППРС имели достоверно чаще пирамидные нарушения в начале болезни, и достаточно редко болезнь манифестировала со стволовых нарушений. Самым редким симптомом дебюта выступали психические расстройства, которые выявлены только у одного пациента с РРС (1,5%). У пациентов с КИС на первом месте оказались РБН, на втором - чувствительные нарушения.

В зависимости от получаемой базисной терапии препаратами, изменяющими течение PC (ПИТРС), все пациенты были разделены на группы. В группу пациентов, получающих глатирамера ацетат, вошли 57 человек (56,4%) - пациенты с

PPC. В группу терапии препаратами ИФН - 25 больных (24,8%), из них 7 (28%) пациентов с ВПРС и 18 (72%) - с РРС. Митоксантрон получал 1 (1%) больной. Не лечились ПИТРС 18(17,8%) пациентов. Причинами этого были тяжелая степень инвалидизации, отказ от терапии, а также КИС.

Анализ концентрации глутаминовой кислоты у больных PC Нами проведен анализ концентрации глутаминовой кислоты в сыворотке крови у 63 пациентов с PC и 66 здоровых добровольцев. В группу «контроль» вошли 24 (36,4%) мужчины и 43 (63,6%) женщины, соотношение полов 1:1,8; в группу больных PC - 26 (41,3%) мужчин и 37 (58,7%) женщин, соотношение полов 1:1,4. Возраст больных составил 36,5 лет (от 18 до 58), здоровых добровольцев - 37,6 лет (от 18 до 59). Таким образом, группа контроля соответствовала по половому и возрастному составу группе больных.

Концентрация глутаминовой кислоты в сыворотке здоровых лиц составила 13,09 [9,94;17,92] нмоль/мкл. Полученные данные использовались в качестве показателя нормы в настоящем исследовании. Установлено, что концентрация глу-тамата в общей группе больных PC была достоверно выше (р<0,001) и оказалась равной 16,23 [15; 19] нмоль/мкл. При сравнении уровня глутамата среди лиц мужского и женского пола между группой больных PC и здоровых добровольцев также получены достоверные отличия (р<0,001). При сравнении данного показателя у больных PC лиц мужского и женского пола достоверных различий не выявлено. Таким образом, изменений в концентрации глутаминовой кислоты в зависимости от тендерных признаков у больных PC не показано, они полностью определялись клиническими характеристиками заболевания.

У пациентов с РРС (п=43) доказано повышение концентрации глутамата 16,27 [14,85;18,67] нмоль/мкл относительно аналогичного показателя в контроле 13,09 [9,94; 17,92] нмоль/мкл. Вместе с тем достоверных отличий от группы с прогрессирующими типами заболевания (п=19) не выявлено, где величина данного показателя составила 16,18 [12,97; 18,79] нмоль/мкл. В проведенном исследовании концентрация глутамата у больных в стадии обострения была достоверно выше относительно показателя в контроле: 17,17 [14,93;19,34] нмоль/мкл и 13,09 [9,94;17,92] нмоль/мкл, соответственно. Вместе с тем достоверных отличий от

группы больных в стадии клинической ремиссии не показано, где данный показатель составил 16,15 [14,69;19] нмоль/мкл.

Проведена кластеризация всех пациентов в зависимости от степени инвалиди-зации. В первую группу вошли больные с баллом ЕБББ от 0 до 3 (легкая степень инвалидизации) - 41 (65,1%) человек, во вторую - 21 (33,3%) пациент с баллом ЕОББ от 3,5 до 5,5 (умеренно-выраженная инвалидизация). В группе с высоким баллом ЕОБЗ (свыше 6,0) оказался лишь 1 (1,6%) больной, не являющийся репрезентативным для статистической обработки. Концентрация глутамата достоверно повышена в группе с легкой степенью инвалидизации 17,03±3,18 нмоль/мкл, по сравнению с группой контроля 13,69±5,25 нмоль/мкл, но вместе с тем не отличается от группы с умеренной степенью инвалидизации 15,5±6,12 нмоль/мкл.

Проведена оценка уровня глутамата у больных с разной скоростью прогресси-рования заболевания. Таким образом, в группе с медленным темпом прогрессиро-вания (^>,25 балл/год) оказался 21 (33,3%) пациент, с умеренным прогрессирова-нием (0,25<У;0,75 балл/год) - 34 (54%) и с быстрым (>0,75 балл/год) - 8 (12,7%). Уровень глутамата у больных с быстрой и умеренной скоростью прогрессирова-ния (20,80 [15,80;21,7] нмоль/мкл : 16,25 [14,92;18,17] нмоль/мкл, соответственно) превышал аналогичный показатель здоровых лиц 13,09 [9,94;17,92] нмоль/мкл. Вместе с тем уровень глутамата у больных с медленным темпом прогрессирова-ния болезни статистически достоверно не отличался от показателя здоровых лиц. Внутригрупповых различий среди больных РС с разной скоростью прогрессиро-вания болезни не выявлено.

Одновременно был проведен анализ уровня глутамата сыворотки у больных с разным клиническим дебютом заболевания. В первую группу вошли больные с РБН в дебюте болезни - 21 (33,3%) человек. Пациенты, у которых заболевание начиналось с чувствительных расстройств, составили вторую группу - 19 (30,2%) лиц, третью - больные с пирамидными нарушениями в начале заболевания - 15 (23,8%) человек, четвертую и пятую - больные со стволовыми и мозжечковыми нарушениями (4 (6,3%); 3 (4,8%) соответственно) в начале болезни. Из-за малочисленной выборки пациенты последних двух групп не учитывались для статистической обработки. Установлен более высокий уровень глутамата у больных, в

дебюте которых были пирамидные и чувствительные нарушения (17,5 [15,7; 19,0] нмоль/мкл : 17,7 [16,0;21,4] нмоль/мкл, соответственно), в сравнении с группой здоровых лиц 13,09 [9,94;17,92] нмоль/мкл. Вместе с тем статистически значимых различий содержания глутамата у больных с клиническим дебютом в виде РБН 15,6 [13,3;17,2] нмоль/мкл в сравнении с контрольной группой не выявлено. Кроме того, содержание глутамата было достоверно ниже у пациентов, в дебюте заболевания которых имел место РБН, по сравнению с чувствительными расстройствами (р<0,05).

Мы разделили всех пациентов PC на группы в зависимости от продолжительности болезни. В первую группу вошли 19 (30,1%) пациентов, у которых стаж болезни составил менее 5 лет. Вторая группа характеризовалась длительностью заболевания от 5 до 10 лет - 17 (27%) пациентов. Третья группа с наибольшим сроком заболевания - более 10 лет была сформирована из 27 (42,9%) больных. Достоверных различий в содержании глутамата в группе больных PC с разной продолжительностью болезни не получено. Вместе с тем установлен более высокий уровень глутамата у больных при стаже болезни от 5 до 10 лет (17,66 [14,64;20,12] нмоль/мкл) и более 10 лет (17,02 [14,96;18,83] нмоль/мкл) по сравнению с контрольной группой 13,09 [9,94; 17,92] нмоль/мкл (р<0,05).

Полиморфизм генов GRIN2A (rs2650427), GRIN2A (rsl969060) и SLC1A2

(rs4354668) глутаматэргической системы у больных PC Анализ распределения генотипов по исследуемым генам показал соответствие их распределению закону Харди-Вайнберга. При распределении генотипов и аллелей исследуемых генов не было выявлено значимых отклонений ни для общей выборки больных, ни для группы здоровых добровольцев (р>0,05).

Проведена оценка распределения генотипов исследуемых генов у больных PC в зависимости от типа течения заболевания. Частота генотипа GG гена GRIN2A (rs 1969060) у здоровых лиц составила 5,4%, а у больных РРС - 7,4%, в то время как частота данного генотипа среди больных ППРС составила 16,7%, а в группе контроля - 30%. Таким образом, носительство генотипа GG гена GRIN2A (rs 1969060) у больных PC ассоциировано с более тяжелым типом течения заболевания (ППРС) (р<0,05), в соответствии с рисунком 1.

Рисунок 1 - Распределение генотипов гена СШИ2А (ге 1969060) у больных РС в зависимости от типа течения заболевания (%) Проанализировано распределение генотипов и аллелей исследуемых генов СШША (гб 1969060), (ЖШ2А (ге2650427) и БЬС1А2 (ге4354668) у больных рассеянным склерозом в зависимости от возраста дебюта заболевания. Показано, что носительство генотипа ОС гена 01Ш2А (гб 1969060) ассоциировано с более поздним (старше 40 лет) началом заболевания у больных РС (р<0,05), в соответствии с рисунком 2.

100% 90%

50% 40% 30% 20% 10% 0%

61,3% 38,1% 42,9%

32,3%

14,3%

6,5% 4,8%

□ АА ВАв

все

от 20 до 40 лет Возраст дебюта РС

старше 40 лет

Рисунок 2 - Распределение генотипов гена СШША (ге 1969060) у больных РС в зависимости от возраста дебюта заболевания (%)

В зависимости от скорости прогрессирования все больные были разделены на три группы: с медленным прогрессированием (<0,25 балла/год) - 30 человек; с умеренной скоростью прогрессирования (0,25<У<0,75 балла/год) - 56 пациентов и с быстрым прогрессированием заболевания (>0,75 балла/год) - 15 человек. Достоверных различий не выявлено для носителей генотипов генов С1?Ш2А (« 1969060) и («2650427). Вместе с тем установлено, что носительство

генотипа СС гена БЬС1А2 («4354668) у больных РС ассоциировано с медленным темпом прогрессирования заболевания (р=0,05), в соответствии с рисунком 3.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

ОТТ швТ

□ ее

<0,25 б/г 0,25<У<0,75 б/г >0,75 б/г Скорость прогрессирования РС

Рисунок 3 - Распределение генотипов гена («4354668) у больных РС в за-

висимости от скорости прогрессирования заболевания (%)

Концентрацию глутаминовой кислоты в сыворотке больных РС оценивали только относительно гена глутаматного переносчика БЬС1А2 («4354668). Таким образом, у носителей генотипа ТТ концентрация глутамата составила 15,97 [ 14,7; 18,3] нмоль/мкл; для носителей генотипа ОТ данный показатель был равен 17,15 [ 14,8; 19,9] нмоль/мкл; у носителей генотипа вС - 15,88 [14,24;20,1] нмоль/мкл. Достоверно установлено, что концентрация глутамата сыворотки у больных РС не ассоциирована с носительством генотипов ТТ, ОТ, ОС гена БЬС1А2 («4354668).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Перспективы дальнейшей разработки темы

Перспективным направлением в исследовании глутаматной эксайтотоксич-ности является поиск новых лекарственных препаратов, оказывающих положительный эффект на данный феномен. Многочисленные генетические исследования РС изучают новые ассоциации и доказывают генетическую гетерогенность заболевания. Выявление корреляционных связей между уровнем глутамата сыворотки крови и генетическими предикторами глутаматной эксайтотоксичности являются перспективным направлением для дальнейшего генетического исследования.

Выводы

1. Клиническая характеристика рассеянного склероза определяется типом течения, скоростью прогрессирования и степенью выраженности неврологического дефицита. Ремиттирующий тип течения заболевания встречается чаще у молодых лиц преимущественно женского пола, характеризуется меньшей скоростью прогрессирования и минимальной степенью инвалидизации. Пациенты с вторично-прогрессирующим рассеянным склерозом имеют большую продолжительность болезни и более выраженный неврологический дефицит. У больных первично-прогрессирующим рассеянным склерозом имеются высокая скорость прогрессирования, более поздний возраст дебюта заболевания и максимально выраженные неврологические нарушения.

2. Уровень глутаминовой кислоты в сыворотке больных рассеянным склерозом достоверно выше, чем у здоровых добровольцев. Уровень глутамата в сыворотке крови больных рассеянным склерозом у пациентов с ремиттирующим типом течения, в стадии обострения патологического процесса, легкой степенью инвалидизации, быстрой скоростью прогрессирования болезни, длительностью заболевания более 5 лет и клиническим дебютом в виде пирамидных и чувствительных нарушений был достоверно выше по сравнению с группой здоровых лиц. Тендерные соотношения концентрации глутаминовой кислоты у больных рассеянным склерозом и в группе здоровых лиц были одинаковы.

3. Частота встречаемости полиморфных вариантов генов глутаматэргиче-ской системы ОиЫ2А (гэ 1969060,^2650427), 81С1А2 (гб4354668) одинакова в общей выборке больных рассеянным склерозом и в группе здоровых лиц.

4. Носительство генотипа вй гена ОШМ2А (гб1969060) ассоциировано с первично-прогрессирующим типом течения и более поздним (старше 40 лет) возрастом дебюта заболевания у больных рассеянным склерозом. Медленный темп прогрессировал!« болезни у больных рассеянным склерозом ассоциирован с но-сительством генотипа Св гена БЬС1А2 (гб4354668). Концентрация глутамата сыворотки у больных рассеянным склерозом не связана с носительством различных генотипов гена 8ЬС1А2.

Практические рекомендации

1. Полученные результаты клинического исследования могут быть использованы в клинической практике, а такие показатели, как скорость прогрессирова-ния, длительность первой ремиссии и степень выраженности неврологического дефицита требуют особого внимания при прогнозировании дальнейшего течения заболевания и назначении соответствующей терапии.

2. Сопоставление результатов клинических и биохимических исследований у больных рассеянным склерозом расширяет представление о механизмах развития клинических особенностей заболевания и может быть использовано при разработке новых методов терапии.

3. Обобщение результатов клинических и генетических исследований о связи полиморфных маркеров изученных генов глутаматэргической системы (СтШША гб 1969060, БЬС1А2 ге4354668) с клиническими характеристиками заболевания может использоваться для оценки характера течения патологического процесса у больных рассеянным склерозом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Алифирова, В.М. Оценка эффективности копаксона у больных с ремитти-

рующим типом течения рассеянного склероза / В. М. Алифирова, М. А. Титова, А. А. Верещака // Бюллетень Сибирской медицины. - 2010. - Т.9, № 4.

- С. 19-22.

2. Алифирова, В.М. Глутаматная эксайтотоксичность при рассеянном склерозе / В.М. Алифирова, А.А. Рязанцева, С.А. Иванова, А.С. Бойко, Н.М. Кротен-ко // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. - 2013. - Т.7, №2. - С, 16-20.

3. Алифирова, В.М. Глутаматная эксайтотоксичность: клинические показатели рассеянного склероза / В.М. Алифирова, С.А. Иванова, А.А. Рязанцева, А.С. Бойко, Н.М. Кротенко // XI международная научно-практической конференция с международным участием : матер, конф. / Изд-во «Спецкнига». -Москва. - 2014,- С. 168-173.

4. Рязанцева, А.А. Зависимость уровня глутаматной активности в плазме крови больных рассеянным склерозом от дебюта заболевания /А.А. Рязанцева, В.М. Алифирова, С.А. Иванова, Н.М. Кротенко, А.С. Бойко // Практическая медицина. Неврология. Рассеянный склероз, специальный выпуск №1-1 (68) / Научно-практический рецензируемый медицинский журнал. - 2013. - С. 71-72.

5. Ермаков, Е.А. Иммуноглобулины больных рассеянным склерозом обладают способностью расщеплять перекись водорода / Е.А. Ермаков, Л.П. Смирнова, В.Н. Бунева, А.А. Рязанцева, С.А. Иванова, Н.М. Кротенко // «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии»: матер. 8-й междунар. крымской конф. - Судак, Крым, Украина. - 2012. - С. 27-28.

6. Ermakov, Е.А. IgG with oxidoreductase activity as a possible mechanism of protection against oxidative stress in multiple sclerosis / E.A. Ermakov, N.M. Kro-tenko, L.P. Smirnova, N.V. Krotenko, A.A. Ryazantseva, V.N. Buneva, S.A. Ivanova // II Scientific Conference of Young Physiologists "Physiology: from Molecules to the Body" 8-9 October, 2012 : National Academy of Sciences of Ukraine Bogomoletz Institute of Physiology. - Kiev, 2012. - P. - 51.

7. Бразовская, Н.Г. Коррекция двигательных нарушений у больных рассеянным склерозом с помощью биоуправления / Н.Г. Бразовская, А.А. Рязанцева, А.Н. Прибыльская // XIX научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Современные техника и технология» : сборник трудов. Томск, 2013. -Т.1, № 3 - С. 405-406.

8. Ермаков, Е.А. Корреляция каталазной активности IgG и некоторых показателей окислительного стресса плазмы крови при рассеянном склерозе / Е.А.Ермаков, Н.М., Кротенко, Л.П. Смирнова, Н.В. Кротенко, В.Н. Бунева, A.A. Рязанцева, С.А. Иванова // Таврический медико-биологический вестник. - 2012. - Т.15, №3, ч. 2 (59) // Украинский научно-практический журнал. - 2012,-С.402.

9. Кротенко, Н.М. Молекулы средней массы и антитела к нативной и денатурированной ДНК у пациентов при различных типах течения рассеянного склероза / Н.М. Кротенко, В.М. Алифирова, Н.В. Кротенко, A.A. Рязанцева, A.C. Бойко, С.А. Иванова // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 5-2.-С. 305-310.

Ю.Ермаков, Е.А. Оксидоредуктазная активность JgG у больных рассеянным склерозом / Е.А. Ермаков, A.A. Рязанцева, Е.С. Одинцова // «Дни биохимии в СПбГМУ» : матер, междунар. конф. студентов и молодых ученых поев. 115-летию СПбГМУ им.акад. И.П. Павлова. — Санкт-Петербург, 2-4 декабря 2012 года : статьи и тезисы. - Санкт-Петербург, 2012. - С.23.

П.Ермаков, Е.А. Оксидоредуктазные активности IgG у больных с ремитирующим типом рассеянного склероза / Е.А. Ермаков, Н.М. Кротенко, Л.П. Смирнова, Н.В. Кротенко, С.А. Иванова, В.Н. Бунева, В.М. Алифирова, А.А Рязанцева // XIX Всероссийская конференция «Нейроиммуннология. Рассеянный склероз» : материалы конференции. - Санкт-Петербург, 2013. - T.XI, № 1-2. -2013.-С. 53.

12.Алифирова, В.М. Оценка эффективности длительной терапии глатирамера ацетатом у больных с ремитирующим рассеянным склерозом в Томской области / В.М. Алифирова, Н.Ф. Мусина, М.А. Титова, A.A. Рязанцева // Практическая медицина. Неврология. Рассеянный склероз, специальный выпуск №1-1 (68) / Научно-практический рецензируемый медицинский журнал. - 2013. - С. 149-152.

13.Бойко, A.C. Сравнительная характеристика антинуклеарных антител к ДНК в сыворотке крови больных шизофренией с тардивной дискинезией и рассе-

янным склерозом / A.C. Бойко, A.A. Рязанцева, Н.М. Кротенко // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2014. - № 2(83). - С. 5-9.

14.Бойко, A.C. Уровень глутаминовой аминокислоты у здоровых лиц и у больных рассеянным склерозом / А.С.Бойко, A.A. Рязанцева, В.М. Алифирова, Н.М. Кротенко, С.А. Иванова // XXII съезд физиологического общества им. И.П. Павлова : материалы съезда. — Волгоград, 2013. — С. 70.

15.Алифирова, В.М. Эксайтотоксичность у больных рассеянным склерозом /В.М. Алифирова, A.A. Рязанцева, С.А. Иванова, Н.М. Кротенко // VI Сибирская межрегиональная научно-практическая конференция «Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания : материалы конференции. - Новосибирск, 2013. - С. 8-9.

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВПРС - вторично-прогрессирующий рассеянный склероз ИФН - интерферон

КИС - клинически изолированный синдром

ПИТРС — препараты, изменяющие течения рассеянного склероза

ППРС - первично-прогрессирующий рассеянный склероз

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PC — рассеянный склероз

РРС - ремиттирующий рассеянный склероз

СНД — сумма неврологического дефицита

ЕААТ — excitatory amino acid transporter (транспортер «возбуждающих» аминокислот)

EDSS — expanded disability status scale (расширенная шкала инвалидизации) GRIN2A — ген, кодирующий NR2A субъединицу NMDA-рецептора FS - Functional Systems Score (шкала функциональных систем) NMDA — N-метил-О-аспартат

SLC — solute carrier family (семейство растворимых переносчиков) SLC1A2 - ген, кодирующий глутаматный транспортер 2 типа (ЕААТ2)

Подписано в печать 23.12.2014 г. Усл.печ.листов 0,65 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № 314 Тираж 100 экземпляров