Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Научные основы прогноза токсичности и опасности химических веществ с учетом механизма токсического действия

На правах рукописи

ХАРЧЕВНИКОВА НИНА ВЕНИАМИНОВНА

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРОГНОЗА ТОКСИЧНОСТИ И ОПАСНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ С УЧЕТОМ МЕХАНИЗМА ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ.

14.02.0! - Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Москва-2011 г.

4846885

Работа выполнена в лаборатории эколого-гигиенической оценки и прогнозирования токсичности веществ Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Жолдакова Зоя Ильинична

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Пинигин Мигмар Александрович ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздравсоцразвития РФ

доктор биологических наук, профессор Юдина Татьяна Васильевна ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора

доктор медицинских наук Хамидулина Халидя Хасбулаевна ФГУЗ «Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ» Роспотребнадзора

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова»

Защита состоится 23 июня 2011 г. в II00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.133.01 в ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина» Минздравсоцразвития России по адресу: 119992, Москва, Погодинская ул., д. 10/15, стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « » мая 2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета / /

доктор биологических наук, профессор ^Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Оценка эколого-гигиенической безопасности химических веществ в эксперименте и установление безопасных уровней воздействия в различных объектах окружающей среды являются неотъемлемой частью гигиенических исследований. Так, в России разработаны и утверждены ПДК в воде для 1370 веществ. Вместе с тем, в мире в настоящее время зарегистрировано около ста тысяч химических веществ, используемых в производстве и потреблении, и ежегодно в этот список добавляется более 1000 соединений (Национальная токсикологическая программа США, National Toxicology Program, NTP; X.X. Хамидулипа, 1998). В токсикологическом плане изучено лишь 15% из них. Объем исследований на лабораторных животных, необходимых для полной токсикологической оценки всех веществ, таков, что задача оценить все соединения практически невыполнима. Кроме того общественность требует соблюдения правил экспериментов на животных, сформулированных в концепции "трех R" (W.M.S. Russell, R.L. Burch, 1959). В связи с этим, очевидна необходимость развития альтернативных методов оценки токсичности и опасности веществ. Эксперименты на клеточных культурах in vitro не позволяют оценить все виды эффектов с учетом сложных процессов интоксикации in vivo при длительном воздействии веществ (Bhogal N. et al., 2005). С другой стороны, как показано в работах Г.Н.Красовского и соавт. (Г.Н.Красоеский, Н.А.Егорова, 2000, Г.Н.Красовский, Ю.А.Рахмаиин, Н.А.Егорова, 2009) результаты исследований на живых организмах более низкого филогенетического уровня нельзя экстраполировать на человека для определения безопасных уровней химических веществ.

В связи с этим весьма актуальным является совершенствование методов прогноза токсичности и опасности на основе количественных соотношений структура-активность. Такие методы применяются в США, Канаде, Германии (Cronin M.T.D. et al., 2003, Walker J.D., 2002) и других странах для выделения приоритетных веществ, для решения вопроса об объеме экспериментальных исследований вещества, для классификации, маркировки и регистрации. Применение методов прогноза токсичности и опасности на основе соотношений структура-активность как на стадии планирования эксперимента, так и для прогноза величин временных гигиенических нормативов и классов опасности позволяет ускорить исследования и повысить их эффективность, существенно снизить материальные и временные затраты. Особенно важным является прогноз отдаленных эффектов, и в первую очередь - канцерогенного из-за чрезвычайной опасности этих эффектов. Вместе с тем, исследование канцерогенных свойств, в частности проведение стандартного теста на канцерогенность в рамках NTP США требует проведения экспериментов на животных в течение 2-х лет и стоит около двух миллионов долларов. В прошлом веке обоснование отечественных нормативов многих веществ в объектах окружающей среды проводили без учета канцерогенного действия. В связи с этим даже качественный прогноз канцерогенной активности на уровне да/нет очень важен.

Необходимость прогноза токсичности была осознана отечественными гигиенистами уже в 60-х годах прошлого века (В.А.Филов, Е.И.Люблина, ¡965). В течение лет, прошедших со времени написания пионерских работ Н.В.Лазарева (1944), ЕЛ Люблипой, В.А. Филова (1965), С. Hansch (1979), A. Pullman, В. Pullman (1955) развивались различные направления прогноза токсичности: регрессионный анализ связи с физико-химическими параметрами (С.М. Новиков, 1980, 1982, 1984, 1986; Г.Н. Красовский 1979, 1980; H.A. Егорова, 1980; З.И. Жолдакова, 1985, 1986,

1987; JI.A. Тепикипа, 1990), экспресс-экспериментальный прогноз (М.А. Пинигин, Г.Н. Красовский, ¡979; Г.Н. Красовский, З.И. Жолдакова 1981,1992; М.А. Пинигин, 1972); методы распознавания образов (Т.Р. Зулъкарнаев, Л.А. Тюрина, С.М. Новиков, 1999), нейронные сети (D. Villemin, 1994), подходы, основанные на гипотезах о механизме действия (G.II. Loew, 1983, 1984, 1985; З.И. Жолдакова, 1987; А.И. Халепо, И.П. Уланова, П.Н. Дьячков, 1990; В.К. Кондратов, Ю.А. Рахманин, 1995) и т.д.

Прогноз параметров токсикометрии применительно к обоснованию нормативов веществ в воде впервые осуществлен Г.Н.Красовским и Н.А.Егоровой с использованием моделей Ханча и Фри-Вильсона [Г.Н. Красовский, H.A. Егорова, 1980; H.A. Егорова, 1980). В работах З.И. Жолдаковой изучена возможность применения различных физико-химических параметров для прогноза острой и хронической токсичности веществ (З.И. Жолдакова, 1979, 1980, 1983, 1985). В этих исследованиях, основанных на эмпирическом выборе независимых переменных для получения наиболее достоверных связей, недостаточно учитывался механизм действия веществ. Разработанный в дальнейшем З.И.Жолдаковой (З.И. Жолдакова 1987) подход с учетом патогенетической модели интоксикации, был первым шагом к построению моделей структура-активность с учетом механизма токсического действия на молекулярном уровне.

Единичные работы, которые были основаны на явном учете механизма токсического действия и процессов биотрансформации, были посвящены прогнозу острой токсичности в ряду бензолов с простыми заместителями (А.И. Халепо, И.П. Уланова, П.Н. Дьячков, 1990) и качественному прогнозу канцерогенности в единичных структурных рядах (G.H. Loew et al., 1983, 1984, 1985).

Проблема ускорения и повышения эффективности токсикологических исследований может быть решена при использовании современных информационных технологий, в частности прогнозирующих, и экспертных систем (G. Klopman, 1992, 1998; J.E. Ridings et al., 1996; К. Enslein, et al., 1994, O. Mekenyan et al., 2003), с применением различных методов интеллектуального анализа данных. Одним из таких методов является логико-комбинаторный метод ДСМ (В.К.Финн, 1991), основанный на автоматизированном поиске подструктур молекул, отвечающих за наличие эффекта или принадлежность соединения к определенному классу опасности по этому эффекту. ДСМ-метод позволяет не только сделать прогноз наличия и степени выраженности эффекта, но и объяснить его, т.е. выявить структурные фрагменты, присутствие которых в молекуле определяет эффект. Прогноз канцерогенности на основе компьютерной ДСМ-системы оказался одним из наилучших в рамках открытого проекта, организованного Национальным институтом США по изучению рака в 2000-2001 году. Однако при проведении прогноза с использованием ДСМ-системы не учитывалась возможность биоактивации, что, возможно, явилось одной из причин недостаточной полноты прогноза. Учет возможности биоактивации соединений в процессе биотрансформации в организме при прогнозе токсичности и опасности с использованием логико-комбинаторного метода ДСМ представлял собой нерешенную проблему. Необходимо отметить, что в России не разработаны доступные компьютерные системы по прогнозу токсичности и опасности веществ в объектах окружающей среды.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось научное обоснование и разработка системы прогноза токсичности и опасности органических

соединений в воде, в том числе специфического, канцерогенного и мутагенного действия на организм, с учетом процессов биотрансформации. В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод научно обоснованного выбора физико-химических параметров для построения соотношений структура-активность в зависимости от определяющей стадии механизма токсического действия.

2. Обосновать преимущества и ограничения связей структура-активность с учетом биотрансформации, по сравнению с соотношениями, основанными на свойствах исходных веществ, по надежности и применимости для количественного прогноза биологической активности веществ в различных структурных рядах.

3. Обосновать комплексный метод прогноза опасности химических веществ в воде по острой, хронической токсичности, специфическим и отдаленным эффектам на основе использования логико-комбинаторного метода ДСМ и квантово-химических расчетов.

4. Разработать систему прогноза токсичности и опасности химических веществ, включающую базы данных, интеллектуальную логико-комбинаторную ДСМ систему, программы, реализующие методы квантовой химии.

Научная новизна. Разработан метод выбора физико-химических параметров для построения соотношений структура-активность на основе гипотезы об определяющей стадии механизма токсического действия и установлении с помощью квантово-химических расчетов ключевой реакции биотрансформации - наиболее энергетически выгодной из возможных для данного соединения скорость-лимитирующей реакции процесса биотрансформации.

Для соединений структурных рядов производных бензола, полициклических ароматических углеводородов, их метил и галогенпроизводных, галогенсодержащих алифатических соединений и спиртов с помощью квантово-химических расчетов определены ключевые реакции биотрансформации. Впервые установлены зависимости:

• острой, хронической токсичности, метгемоглобинобразующей, мутагенной активности в рядах соединений, ключевая реакция биотрансформации которых связана с образованием нестабильных интермедиатов (производные бензола, ароматические и алифатические амины) от параметров, характеризующих ключевую реакцию;

• мутагенной активности в рядах соединений, ключевая реакция биотрансформации которых связана с образованием стабильных метаболитов (галогенированнные алифатические углеводороды и спирты), от параметров, характеризующих реакционную способность продуктов ключевой реакции биотрансформации;

• активности в ряду стабильных соединений - ПХБ, галогензамещенных азааренов от параметров, характеризующих способность соединений связываться с биомолекулами-рецепторами.

Показано, что метод выбора и расчета квантово-химических параметров, основанный на гипотезе об определяющей стадии механизма токсического действия и ключевой реакции биотрансформации, позволяет осуществлять теоретически обоснованный и более надежный прогноз по сравнению с эмпирическим выбором параметров для прогноза токсичности и опасности веществ. Впервые обоснованы и разработаны:

• классификация канцерогенной опасности для прогноза безопасных уровней веществ в воде на основе значений ЬТОщ для подопытных животных и группы

канцерогенное™ для человека по классификации МАИР, а также метод прогноза порядка величины безопасных уровней;

• комплексный метод прогноза классов опасности веществ по специфическим токсическим эффектам, основанный на совместном использовании методов квантовой химии и логико-комбинаторного анализа. С использованием этого метода сделан прогноз классов канцерогенной активности галогенсодержащих алканов, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), метил и галоген замещенных ПАУ, ароматических аминов;

• автоматизированная система прогноза токсичности и опасности, которая включает базу данных \VATERTOX и базу данных по канцерогенное™ веществ, сопряженную с логико-комбинаторной ДСМ системой и программами расчетов электронных параметров методами квантовой химии. Система позволяет осуществить прогноз классов опасности неизученных химических веществ, сделать предварительную оценку токсичности для целей планирования экспериментов по обоснованию допустимых суточных доз, пороговых и максимально недействующих доз и концентраций для целей нормирования в воде; определить сравнительную токсичность веществ для выбора менее опасных технологий; выявить вещества, ПДК которых подлежат пересмотру.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 .Новый метод определения квантово-химических параметров для соотношений структура-токсичность на основе гипотезы об определяющей стадии механизма токсического действия - стадии взаимодействия вещества или продуктов его биотрансформации с биомолекулами; гипотезы о ключевой реакции биотрансформации; прогноза ключевой реакции биотрансформации для данного соединения по результатам квантово-химических расчетов, и использовании характеристик этой реакции или ее продуктов для прогноза токсичности.

2.Научное обоснование возможности прогноза различных видов токсических эффектов и параметров токсикометрии на основе разработанного метода.

3.Новый метод прогноза класса опасности веществ, в том числе класса опасности по канцерогенной активности, на основе использования логико-комбинаторного ДСМ метода автоматического порождения гипотез, включающего анализ числовых параметров, в частности рассчитанных методами квантовой химии, и характеризующих ключевую реакцию биотрансформации или ее продукты.

4.Комплексная система прогноза токсичности и опасности веществ, основанная на совмещении интеллектуальной ДСМ - системы и методов квантовой химии.

Теоретическая значимость работы.

Теоретически обоснован метод определения физико-химических параметров для построения соотношений структура-токсичность с учетом возможности образования в ходе биотрансформации соединений более активных, и следовательно, более токсичных, чем исходные (соотношения структура-биотрансформация-токсичность). Метод включает выдвижение гипотезы об определяющей стадии токсического действия на основе данных литературы об экспериментально обоснованном механизме токсического эффекта; в случае, если эта стадия представляет собой взаимодействие продуктов биотрансформации соединений с биомолекулами, определение ключевой реакции биотрансформации и ее продуктов по результатам квантово-химических расчетов; построение регрессионных зависимостей структура-

биотрансформация-токсичность для прогноза параметров токсикометрии и других количественных характеристик токсического эффекта с использованием в качестве независимых переменных параметров, характеризующих эту реакцию или ее продукты.

Научно обоснована и апробирована методика включения числовых параметров, в частности, рассчитанных методами квантовой химии и характеризующих ключевую реакцию биотрансформации или ее продукты, в логические рассуждения метода ДСМ. Каждое соединение представляется гибридным объектом, состоящим из структурной части, которая описывается с помощью графов или дескрипторов специального языка, и числового параметра. Методика позволяет учитывать процессы биоактивации при прогнозе классов опасности по различным токсическим эффектам, в том числе по канцерогенному эффекту.

Практическая значимость работы. Разработанная база данных \VATERTOX по эколого-гигиеническим свойствам химических веществ, загрязняющих воду водных объектов (токсичность и опасность веществ) зарегистрирована в государственном регистре «Информрегистр», номер государственной регистрации 0229601490. Методы прогноза токсичности и опасности использованы при планировании токсикологических экспериментов для обоснования ПДК в воде ряда веществ, при обосновании необходимости пересмотра ПДК более 30 соединений, при обосновании ОБУВ в атмосферном воздухе смеси смолистых веществ. Полученные результаты внедрены в виде Методических указаний «Расчетные и экспресс-экспериментальные методы оценки токсичности химических веществ в воде» ГКСЭН №01-19.10-11 от 4.08.92, Методических указаний МУ 2.1.5.720-98 «Обоснование гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования», перечней нормативов ГН 2.1.5.2280-07 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования», ГН 2.1.5.2307-07 «Ориентировочные допустимые уровни (ОДУ) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования», утвержденных Госсанэпиднадзором; материалы работы использованы при подготовке Руководства Р 2.1.10.1920-04 по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду. Результаты работы используются в учебном процессе на лекциях и семинарах кафедры коммунальной гигиены Российской медицинской академии постдипломного образования.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 20-ти международных и всероссийских конгрессах, симпозиумах, конференциях и пленумах, в том числе международной конференции «Безопасность окружающей среды: медицинские, экологические и правовые аспекты» (г. Пермь, 1992), 12-ом Европейском симпозиуме по количественным соотношениям структура-активность (Копенгаген, Дания, 1998), 1-ом, П-ом и Ш-ем съездах токсикологов России (г. Москва 1998, 2003, 2008 гг.), 4-ом Международном конгрессе «Вода: экология и технология. ЭКВАТЕК-2000», г. Москва, 2000 г.), Международном форуме "Информационные технологии и общество" (Кемер, Турция, 2003), конференции «Информацонно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины» (Москва,

2004), пленумах Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ (Москва, 2001, 2005, 2008, 2010 гг.), Х-ом, Х1-ом, XII-ом, ХШ-ом, XIV-ом, XV, XVI и XVII-ом Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (г. Москва, 2003 г.-2010 гг.), Четвертом международном симпозиуме «Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007)» (Москва, 2007), Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), 11-ом международном семинаре «New trends in chemical toxicology» (Москва, 2008 г.), на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, из них 22 в журналах, рекомендованных ВАК, 3 главы в монографиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Текст изложен на 345 страницах машинописного текста, иллюстрирован 32 таблицами, 39 рисунками, 14 приложениями. Список литературы включает 430 источников, из них 116 отечественных и 314 иностранных.

Личный вклад автора. Вклад автора составляет 85% и состоит в формировании направления, постановке общей задачи, выборе методов исследования, разработке компьютерных моделей, базы данных, алгоритмов и программ, проведении компьютерных экспериментов. Теоретические исследования и большая часть компьютерных экспериментов выполнялись самостоятельно. Обобщение результатов и их интерпретация также проведены автором.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа выполнена в лаборатории комплексного эколого-гигиенического нормирования (с 2003 г. лаборатория эколого-гигиенического нормирования и прогнозирования токсичности веществ) в рамках плановых тем ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина РАМН: «Разработка принципов, критериев и методов единого гигиенического нормирования на основе допустимой суточной дозы и выявление особенностей биологической активности веществ при разных путях поступления» (№ г/р 01.9.10013586); «Методы обоснования и прогнозирования допустимой суточной дозы (ДСД) веществ с учетом общетоксического и отдаленных эффектов» (№ г/р 01.9.40001795); «Выявление общих закономерностей и особенностей токсичности веществ при разных путях поступления в организм» (№ г/р 01.9.70002125); «Разработка и внедрение методов комплексного нормирования химических веществ, различающихся по показателям опасности и критериям вредности» (№ г/р 01.20.0000688), «Разработка системы методов обоснования и верификации эколого-гигиенических нормативов химических веществ в окружающей среде на основе компьютерного моделирования и экспериментальных исследований.» (№ г/р 01.20.0 303903), а также в рамках гранта РФФИ № 02-01-00537а «Интеллектуальный анализ данных средствами правдоподобных рассуждений».

На первом этапе исследований собрана и проанализирована информация о механизмах токсического действия веществ на молекулярном уровне и соответствующих физико-химических моделях для различных структурных рядов. Поиск таких моделей проводился с использованием баз данных Citation index, Life science, Medline, коммерческих баз данных по метаболизму Metabolite [MDL Metabolite Database 2001.1. MDL Information Systems, Inc., 14600 Catalina Street, San

Leandro, CA, USA (http://www.mdli.com)], Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA (http://www.accelrys.com).

В качестве источников информации для построения зависимостей структура-активность использовалась созданная нами база данных WATERTOX, содержащая токсикологическую информацию архива Секции гигиены воды и санитарной охраны водоемов Проблемной комиссии РАМН «Экология человека и гигиена окружающей среды», базы данных SARETbase, TOXNET. При изучении канцерогенной активности критериями отбора литературных данных для составления обучающих выборок являлись соответствие международным критериям экспериментальных исследований канцерогенности. Этим критериям удовлетворяет информация, приведенная в базе данных CPDB, разработанной в Калифорнийском университете и содержащей результаты длительных хронических экспериментов по выявлению канцерогенного эффекта на различных видах лабораторных животных, а также результаты тестов NCI/NTP на канцерогенную активность и качественную оценку мутагенности в тесте Эймса. Использовались также литературные данные (справочники по канцерогенное™, обучающие выборки из статей, где прогноз проводили другими методами).

При прогнозе класса опасности по острой и хронической токсичности использовались классификации, приведенные в Методических указаниях по обоснованию нормативов химических веществ в воде. В качестве независимых переменных - параметров хронической токсичности использовались пороговые и максимальные недействующие дозы хронического эксперимента.

Выделение структурных рядов проводили на основе найденных в литературе результатов экспериментального и теоретического (физико-химические модели взаимодействия с биомолекулами) изучения механизма действия на молекулярном уровне, т.е. выделялся фрагмент, который в наибольшей степени определяет данный токсический эффект.

Таблица 1. Структурные ряды, для которых построены модели прогноза

Структурный ряд Количество веществ

Производные бензола 97

Ароматические амины 82

Алифатические амины 40

Спирты 110

Галогенсодержащие алифатические углеводороды 34

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) 85

Метилированные ПАУ 45

Галогензамещенные ПАУ 23

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) 18

Гетероциклические соединения 24

Замещенные пиридины 15

Изучены соотношения структура-токсичность для следующих структурных рядов (таблица 1) и следующих видов биологических эффектов: замещенные бензолы (показатели острой и хронической токсичности, наличие мутагенности и канцерогенности), ароматические амины (мутагенная, канцерогенная и метгемоглобинобразующая активности), полициклические ароматические углеводороды и их метилзамещенные производные (канцерогенная активность,

способность связываться с АН рецептором, определяющая, в частности, негенотоксический канцерогенный и иммунотоксический эффект), азаарены (способность связываться с АН рецептором), галогензамещенные алифатические углеводороды (хроническая токсичность, нефротоксичность, мутагенный и канцерогенный эффекты).

Характеристики химических реакций, моделирующих ферментативные реакции и индексы реакционной способности - параметры соотношений структура-активность - рассчитывали методами квантовой химии: метод Хюккеля, полуэмпирические методы расчета (методы MNDO, AMI и РМЗ). Расчеты проводили по программе МОРАС 6.0. Для предварительного поиска наиболее устойчивой конформации молекул использовался метод молекулярной механики. При построении соотношений структура-биотрансформация-токсичность для прогноза показателей острой и специфической токсичности использовали стандартный регрессионный анализ.

Для прогноза показателей хронической токсичности и канцерогенной активности использован логико-комбинаторный ДСМ-метод автоматического порождения гипотез в базах данных с неполной информацией и оригинальный комплексный подход, основанный на совместном использовании ДСМ метода и квантово-химических расчетов.

ДСМ метод разработан в лаборатории теоретической и прикладной информатики ВИНИТИ РАН проф. В.К.Финном и сотрудниками.. Применение метода к задачам прогноза биологической активности основано на анализе сходства соединений, вызывающих определенный эффект. К неоспоримым достоинствам метода относятся отсутствие необходимости в больших обучающих выборках и интерпретируемость результатов. В отличие от статистических методов интеллектуального анализа данных логико-комбинаторный ДСМ-метод позволяет не только сделать прогноз, но и выявить причины прогноза. ДСМ-прогноз производится в два этапа:

- выявление структурных (или структурно-числовых) фрагментов-гипотез наличия или отсутствия активности;

- использование этих гипотез для прогноза активности тестовых соединений.

Для описания структуры молекул при использовании ДСМ-метода применяли

разработанный в ВИНИТИ РАН специальный язык ФКСП (фрагментарный код суперпозиции подструктур), а также описание структуры соединений с помощью помеченных графов. Для включения числовых параметров, характеризующих в частности биоактивацию соединений, в систему ДСМ-рассуждений использовали специально разработанную алгебру интервалов.

Для прогноза пути и скорости биотрансформации ксенобиотиков рассчитаны энергетические параметры, характеризующие энергию активации реакций ароматического гидроксилирования субстратов различных изоформ цитохрома Р450. Рассчитаны все возможные интермедиа™ и радикалы - промежуточные соединения 96 реакций биотрансформации для 24 веществ.

При изучении соотношений структура-биотрансформация-активность всего рассчитано более 900 квантово-химических параметров.

Расчеты проведены на персональном компьютере с использованием квантово-химической программы МОРАС 6.0. Расчеты при тестировании моделей биотрансформации производили на компьютере OrigmMO, 2x180 MHz/1 MB cache R10000, OS IRIX 6.5. Версия ДСМ-программы, включающая анализ числовых

параметров, составлена М.В.Максиным, версия с описанием структуры с помощью графов составлена М.В.Самохиным (ВИНИТИ РАН). ДСМ-эксперименты проведены с участием В.Г.Блиновой и Д.А.Добрынина (ВИНИТИ РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Научное обоснование прогноза токсичности веществ в воде на основе соотношений структура-биотрансформация-активность и сравнительная оценка этого подхода и стандартных методов КССА

Первый этап включал анализ литературных данных о биохимических процессах взаимодействия веществ с ферментными системами и теоретических работ, посвященных моделированию процессов биотрансформации и их связи с токсичностью; реакции биоактивации систематизированы в соответствии с их механизмом. Проведенный анализ свидетельствует, что как реакции первой фазы биотрансформации, так и реакции второй фазы могут приводить не только к детоксикации, но и к биоактивации (токсификации) чужеродных химических веществ. Сделано заключение, что возможные пути биотрансформации и механизмы токсического действия определяются структурой вещества, т.е. наличием определенных структурных фрагментов, а степень выраженности эффекта -вероятностью осуществления реакций биотрансформации, которая обусловлена их энергетическими характеристиками.

В соответствии с развитой ранее (З.И. Жолдакова, 1987) патогенетической моделью интоксикации выделены ведущие стадии взаимодействия вещества с организмом - стадия всасывания и транспорта к активному центру фермента или к макромолекулярному рецептору, стадия трансформации на активном центре фермента, стадия взаимодействия образовавшихся метаболитов с макромолекулами-рецепторами, стадия выведения.

Вторая стадия — это высокоспецифичная реакция, протекающая с участием ферментов и приводящая к биотрансформации вещества. На третьей стадии осуществляется взаимодействие образовавшихся в ходе биотрансформации продуктов или интермедиатов (короткоживущих промежуточных соединений) с биомолекулами. На этой же стадии возможно взаимодействие с биомолекулой-мишенью самого вещества, обуславливающее его токсическое действие. Таким образом, интоксикация организма может быть вызвана взаимодействием как с самим веществом, так и с продуктами его биотрансформации. Токсичность на второй и третьей стадиях может быть описана с помощью параметров, характеризующих реакционную способность ксенобиотиков.

Взаимодействие веществ или продуктов их биотрансформации с биомолекулами-рецепторами вызывает целый ряд биохимических и феноменологических изменений, приводящих к наблюдаемому токсическому эффекту, поэтому во многих случаях именно эта стадия является определяющей.

Интенсивное развитие экспериментальных исследований механизма взаимодействия вещества с организмом на молекулярном уровне, с изучением токсикокинетики, установлением структуры и количества образовавшихся метаболитов и их токсичности позволяет сделать обоснованные предположения о том, какая стадия является определяющей для механизма токсического действия соединений данного структурного ряда и данного токсического эффекта.

На основе классификации механизмов токсического действия на молекулярном уровне и гипотезы о природе определяющей стадии взаимодействия вещества или

продуктов его биотрансформации с биомолекулами, включающей гипотезу о природе реакций биотрансформации, разработан метод определения параметров для построения зависимостей структура-биотрансформация-активность.

При анализе токсичности неизвестного вещества проводили;

- отнесение его к определенному структурному ряду;

- поиск и анализ данных о биохимических механизмах действия веществ этого ряда на организм и процессов биотрансформации;

- поиск данных о предполагаемых метаболитах и их токсичности.

Выбор независимых переменных соотношений структура-биотрансформация-токсичность осуществляли исходя из гипотезы об определяющей стадии взаимодействия вещества с биомолекулами:

• в случае, когда согласно гипотезе действие вещества на организм связано с взаимодействием самого вещества с биомолекулой-рецептором - в качестве независимых переменных использовали параметры, характеризующие электронное строение и реакционную способность самого вещества (энергии высшей заполненной и нижней свободной молекулярных орбиталей, заряды атомов и т.д.);

• в случае, когда согласно гипотезе действие вещества на организм связано с образованием в ходе биотрансформации метаболитов более реакционноспособных и следовательно более активных, чем исходные вещества, проводили расчет параметра, характеризующего энергию активации модельной реакции биотрансформации -разности теплот образования (энергий) продуктов и исходных соединений;

• если для данного соединения имеется несколько реакционных центров (атомов), с участием которых может проходить реакция - по результатам расчета параметра, характеризующего энергию активации, определяли, какая именно реакция биотрансформации из всех возможных на данном пути реализуется для данного соединения, т.е. определяли наиболее энергетически выгодную, ключевую реакцию биотрансформации;

• если определяющая стадия механизма токсического действия связана с образованием в ходе биотрансформации короткоживущих интермедиатов, в качестве независимой переменной использовали параметр, характеризующий энергию активации ключевой реакции биотрансформации;

• в случае, если определяющая стадия механизма токсического действия связана с образованием в ходе биотрансформации стабильных высокотоксичных метаболитов, в качестве независимых переменных использовали характеристики реакционноспособности этих метаболитов - продуктов ключевой реакции биотрансформации или их производных.

Далее с использованием регрессионного анализа получали уравнение зависимости показателей токсикометрии от определенных таким образом независимых переменных - модель структура-токсичность. После построения достоверной модели структура-токсичность проводили ретроспективную верификацию и расчет показателей токсикометрии для неизученных веществ (прогноз).

Так, для соединений ряда замещенных бензолов гипотеза, выдвинутая П.Н. Дьячковым, И.П.Улановой и A.B. Кузнецовым и развитая в настоящей работе (Харчевпикова Н.В., Дьячков П.Н. и соавт., 2004; Dyachkov P.N., Kharchevnikova N. V.,

е/ а1., 2007, 2010), состояла в том, что стадией механизма токсического действия, определяющей острую токсичность, является взаимодействие с биомолекулами метаболитов, образующихся в ходе биотрансформации ароматического гидроксилирования. Реакция биотрансформации идет через стадию образования ареноксидного интермедиата с тетраэдрически координированным атомом углерода бензольного кольца (рис. 1).

^iJ

Х2Ъ

ключевой реакции реакции образования токсичности включал

Рисунок 1. Биотрансформация замещенных бензолов под действием цитохрома Р450 (оксеноидная модель).

Согласно выдвинутой гипотезе, острая токсичность замещенных бензолов определяется легкостью осуществления (скоростью) биотрансформации - наиболее энергетически выгодной ареноксидного инетрмедиата IV (рисунок 1). Прогноз определение ключевой реакции биотрансформации - т.е. прогноз положения присоединения кислорода. Параметром, определяющим это положение, является минимальная для данного соединения разность энергий интермедиатов, различающихся положением присоединения кислорода, и исходного производного бензола ДЕтт.

Адекватность метода прогноза ключевой реакции биотрансформации была проверена нами с использованием выборки субстратов ароматического гидроксилирования из коммерческой базы данных Metabolite 2001.1. Для 24 сложных соединений, которые можно рассматривать как замещенные бензолы, для всех возможных путей биотрансформации ароматического гидроксилирования были рассчитаны значения параметра, характеризующего устойчивость интермедиата ДЕ. Согласно гипотезе о ключевой реакции биотрансформации, экспериментально наблюдаемый метаболит должен соответствовать наименьшему значению параметра. Точность прогноза положения ароматического гидроксилирования составила 92%. В таблице 2 приведены примеры прогноза в сопоставлении с экспериментальными данными.

Наши расчеты подтвердили, что и для сложных соединений существует прямая зависимость острой токсичности в этом ряду от параметра, характеризующего ключевую реакцию (минимальной разности энергий, ареноксидных интермедиатов и исходного соединения, ДЕтш).

Получена достоверная зависимость острой токсичности для ароматических соединений, которые могут рассматриваться как бензолы с простыми и сложными заместителями (хлорированных бифенилов, бифениловых эфиров, соединений типа дифенилметана), от параметра ДЕтш.

Таблица 2. Сравнение теоретических и экспериментальных данных по

ключевой реакции биотрансформации ароматического гид роксилирования

Соединение Возможные положения гидроксилирования ДЕ (ккал/моль) Эксперимент

5 6 3 , f у 4 0,32 +

5 4,53 -

6 1,32 -

«f~ s 17 16 16 -0,83 +

4 0,27 +

18 0,67 -

17 0,87 -

8 7,17 -

9 1,17 -

4 4 2,15 +

5 7,65

2 5,8 -

Зависимость описывает острую токсичность около 70 соединений с использованием одного параметра.

Из-за включения замещенных бензолов со сложными заместителями соединения в этом ряду довольно сильно различаются по размерам молекул, поэтому показатели токсикометрии, для которых строятся соотношения структура-активность (например ЛД50), были пересчитаны в миллимоли на килограмм.

Для всего ряда изученных производных бензола, включая бифенил, хлорированные бифенилы, бифениловые эфиры и соединения типа дифенилэтана получены следующая зависимость ЛД50 для мышей от параметра ДЕП11П (рис.2):

lgJIflso (ммоль/кг) = 1,408 + 1,066 ДЕга,„; г = 0,793 п = 67 s = 0,262 F = 110,27 р < 0,0001 Зависимость острой токсичности для крыс в этом ряду имеет вид:

lgJIfl50 (ммоль/кг) = 1,511 + 1,03 AEmi„; г = 0,734 п = 67 s = 0,29 F = 81,7 р<0,0001

При высокой достоверности зависимостей коэффициенты корреляции не очень высоки, что определяется природой экспериментальных данных. Типичные лабораторные различия в определении ЛД50 составляют 2-3 раза (Каспаров A.A., Сапоцкий И.В., 1986).

Был сделан ретроспективный прогноз показателей острой токсичности для замещенных бензолов, не вошедших в обучающую выборку. Расхождения значений показателей острой токсичности, взятых из баз данных, с рассчитанными по

уравнению (1), не превышали 3 раз, что подтверждает надежность прогноза на основании данного уравнения.

Для всего ряда замещенных бензолов выявить достоверную линейную связь хронической токсичности с параметром АЕ1ШП не удалось. Такая зависимость выявлена для 13 соединений этого ряда.

Линейная зависимость между ^МНД и параметром ДЕтш, аналогична полученной для показателя острой токсичности.

^МНД (ммоль/кг) = -2,76 + 1,95 ДЕ,Г11П г =0,82 п = 13 р < 0,01 Вещества, которые укладываются в зависимость, включают алкил и гидрокси замещенные бензолы, тогда как амино- и нитрозамещенные производные выпадают из зависимости. Необходимо отметить, что для ряда соединений, выпадающих из зависимости, сопоставление МНД и референтной дозы RfD при поступлении per os свидетельствует, что зарубежный норматив вносит коррекцию в сторону сближения с зависимостью, полученной для других членов ряда. Так, для бифенила МНД на три порядка ниже, чем RfD, для ацетофенона - на порядок, хлорбензола и о-дихлорбензола - ла 2 порядка. Очевидно, требуется гармонизация отечественных и

АЕт1п еУ

Рисунок 2. Зависимость острой токсичности замещенных бензолов для мышей при внутрижелудочном введении от параметра АЕт1„.

С использованием того же параметра ДЕт1П создана модель, позволяющая отделять канцерогенные одно- и двукратно замещенные бензолы от не канцерогенных. Гипотеза состояла в том, что ареноксидные интермедиаты, образование которых определяет острую токсичность бензолов, не являются конечными канцерогенами, а процесс гидроксилирования, энергия активации которого характеризуется параметром ДЕт;п, приводящий к образованию соединений более гидрофильных, чем исходные, в общем случае приводит к снижению канцерогенного эффекта. Показано, что соединения, для которых ДЕтш < -0,17 эВ, т.е. для которых гидроксилирование проходит легко, не обладают канцерогенностью,

тогда как соединения с ДЕтш > -0,17 эВ являются канцерогенами. Исключение составляет случай, когда вещества, легко подвергающиеся гидроксилированию, как, например, гидрохинон, обладают собственной канцерогенной активностью, связанной с альтернативными путями метаболической трансформации. С использованием дополнительного параметра, характеризующего легкость образования фенилгидроксиламинов и нитрениевых ионов на пути И-окисления амино группы и восстановления нитрогруппы получена дискриминантаная функция, позволяющая отделить канцерогенные нитро и амино двукратно замещенные бензолы от не канцерогенных.

Параметр ДЕтш использован при создании модели для прогноза пути и интенсивности биодеградации полихлорированных бифенилов под действием бактерий.

Достоверные соотношения структура-биотрансформация-токсичность для различных видов эффектов - нефротоксичности, гонадотоксичности, мутагенной активности получены в ряду галогенсодержащих алифатических соединений. Гипотеза состояла в том, что различные виды токсичности галогенированных алифатических соединений определяются способностью соединений вступать в одну и ту же химическую реакцию с биомолекулами и могут быть предсказаны с использованием одного параметра, характеризующего эту реакцию. Выбор параметра определялся тем, что в ряду веществ, подвергающихся одному типу трансформации, разность энергий граничных орбиталей характеризует легкость прохождения реакции. С использованием этого параметра получены достоверные зависимости нефротоксичности, гонадотоксичности и генотоксичности в ряду галогенированных пропанов и мутагенности в ряду галогенированных алканов и спиртов с короткой цепью. В том же ряду получена достоверная зависимость мутагенности от параметра, характеризующего реакционную способность метаболитов, образующихся в ходе окислительного дегалогенирования под действием цитохрома Р450.

При прогнозе токсичности и опасности соединений ряда ароматических аминов исходили из представления о том, что как общая токсичность, так и избирательная (метгемоглобинобразующая), и специфическая (мутагенность и канцерогенность) активности определяются биоактивацией в ходе И-окисления аминогрупп.

тон

Р450 эритроциты _ аддукт с

гемоглобином

х

Нг0

X

аддукты с ДНК

Рисунок 3. Схема биотрансформации ароматических аминов.

Установлено, что ответственными за образование метгемоглобина при действии ароматических аминов являются не сами соединения, а их промежуточные метаболиты - продукты И-окислсния. Первый метаболит - И-фенилгидроксиламин

окисляется оксигемоглобином до питрозобензола. Нитрозобензол восстанавливается в N-фенилгидроксиламин. Прогноз выполнен на основании схемы биоактивации (рис. 3), построенной по результатам данных биохимических исследований (McLean, 1968, Kadbular, 1990). N-фенилгидроксиламины и особенно нитрозобензолы выделены как промежуточные продукты биотрансформации анилина, алкиланилинов, п-фенетидина, 2-аминофлюорена и других ариламинов.

Таблица 3. Метгемоглобинобразование под действием ариламинов

№ п/п Название Енсмо нитро-зобен-золов, эВ крысы в/ж 1/2ЛД,0 крысы в /ж / 1/5ЛД5„ кошки в/в 0,25 м/кг кошки в/ж 0,25 м/кг

%Mt Hb %Mt Hb

1 Анилин -0,85 32 4,8 61,6 48,1

2 пара-толу идин -0,89 24,9 5 50,5 -

3 мета-толуидин -0,85 32,6 7 61,3 -

4 орто-толуидин -0,86 19,9 5 32,1 -

5 2,4-диметиланилин -0,85 - - 6,3 -

6 2,5-диметиланилин -0,89 - - 29,1 -

7 2,6-диметиланилин -0,81 - - 7,2 -

8 3,4-диметиланилин -0,82 - - 14,1 -

9 3,5-диметиланилин -0,84 - - 38,3 -

10 п-фторанилин -1,18 - - 66 -

11 м-фторанилин -1,06 - - 60,8 -

12 о-фторанилин -1,07 - - 45,5 -

13 2,4-дифторанилин -1,27 - - 62,5 -

14 п-аминобензойная кислота -0,70 - - 0 -

15 2-аминобензиловый спирт -0,79 - - 6,9

16 3-аминобензиловый спирт -0,79 - - 0,6

17 пара-хлоранилин -1,25 60 30 - -

18 орто-хлоранилин -1,18 - - - 53,1

19 мета-хлоранилин -1,17 42 20 - 47,3

20 пара-анизидин -0,97 29,9 8,4 - -

21 орто-анизидин -0,92 16 6,5 - -

22 2,4,6-трихлоранилин -1,22 7,2 - - 38,8

23 2,6-дихлоранилин -1,02 - - - 17

24 2,4-дихлоранилин -1,23 - - - 31,7

25 пара-фенетидин -0,76 35,3 9,9 - -

26 Пентафторанилин -2,02 - - - 1,4

27 2,3,4,5-тетрафторанилин -2,12 - - - 3,3

28 2-броманилин -1,05 - - - 56,4

29 3-броманилин -1,03 - - - 46,6

30 2,6-диброманилин -0,98 - - - 2,6

31 2,4,6-диброманилин -0,91 - - - 19,1

Сделано предположение, что метгемоглобинобразующая активность ароматических аминов может коррелировать с параметрами, характеризующими легкость окислительно-восстановительного процесса, протекающего в эритроцитах при действии на организм ариламинов. В таблице 3 представлены данные по метгемоглобинобразованию под действием ариламинов в острых и подострых опытах

на белых крысах (в/ж введение, % метгемоглобина), данные работы по метгемоглобинобразованию под действием ариламинов у кошек (в/в и в/ж введениие, % метгемоглобина) (McLean et ai, 1967), а также результаты расчетов ЕНсмо нитрозосоединений, образующихся в результате метаболизма исходных замещенных ариламинов.

Гипотеза состояла в том, что, что метгемоглобинобразующая активность ариламинов определяется не только легкостью образования первого метаболита, но и его способностью вступать в следующую реакцию метаболизма - окисления в эритроцитах. Активным окислительным агентом в реакциях превращения оксигемоглобина в метгемоглобин является свободный радикал, образующийся в процессе восстановления нитрозогруппы в гидроксиламиногруппу. Известно, что способность соединения к восстановлению, т.е. сродство к электрону, характеризуется энергией нижней свободной молекулярной орбитали Енсмо- Первой стадией окисления N-фенилгидроксиламинов в эритроцитах является образование катион-радикалов с переносом одного электрона на связанный с гемоглобином кислород. Перенос второго электрона с железа(П) приводит к образованию метгемоглобина и перекиси водорода.

Зависимости содержания метгемоглобина в крови крыс, получавших ариламины в остром опыте в дозе 1/2ЛД50 (%MtHb (ас)) и подостром эксперименте в дозе 1/5ЛД50 (%MtHb (subac)), от Енсмо нитрозосоединений, имеют вид: %MtHb (ас) = -33,7 Енсмо- 68,9 ; г=0,88, п=12, р<0,01

%MtHb (subac) = -30,93 ЕНСмо -19.36; г=0,81, п=9, р<0,01

Показано, что метгемоглобинобразующая активность соединений коррелирует с Енсмо- Снижение ЕНсмо (рост сродства к электрону) сопровождается ростом метгемоглобинобразующей активности. Зависимости хорошо передают и объясняют известную качественную закономерность об увеличении метгемоглобинобразующей активности анилина при введении в качестве заместителе атомов хлора.

Таким образом, метгемоглобинобразующая активность ариламинов обусловлена активностью их метаболитов в процессах окисления-восстановления. Зависимость метгемоглобинобразующей активности от структуры ариламинов удалось описать с использованием параметров, характеризующих окислительно-восстановительные свойства не самих ариламинов, а их метаболитов.

Предлагаемый подход позволяет не только получить достоверные и теоретически обоснованные зависимости структура-токсичность, но и предсказать вид токсического эффекта. Так, гипотеза состояла в том, что существует обратная зависимость между метгемоглобинобразующей и мутагенной активностью ариламинов, и эти виды активности должны коррелировать с относительной устойчивостью N-фенилгидроксиламинов и нитрениевых ионов - двух последовательных метаболитов ариламинов, т.е. с энтальпией реакции перегруппировки:

ArNHOH + Н+ <=> ArNH+ +Н20 , где Аг - арил, ароматическая система.

Высказанное предположение подтверждено с использованием рассчитанного методом AMI параметра Д(ДЩ - разности энергий образования нитрениевых ионов и соответствующих N-фенилгидроксиламинов (таблица 4).

За нуль принято значение параметра для анилина. Данные по метгемоглобинобразующей активности ариламинов взяты из работы McLean (McLean

а а!., 1967), в которой активность соединений определена на кошках как наиболее

чувствительных к этому виду активности животных. Таблица 4. Мутагенная и метгемоглобинобразующая активности ариламииов

Соединение % MtHb Логарифм удваивающей дозы в тесте Эймса (мкм/чашку) Д(ДНг) (ккал/моль)

Анилин 61,6 2 0

п-Толуидин 50,5 0,86 -3,8

о-Толуидин 32,1 0,58 -5,7

2,4-диметиланилин 6,3 -0,65 -11,2

2,6-диметиланилин 7,2 0,44 -10,8

2,5-диметиланилин 29,1 0,34 _, -10,5

2,3-диметиланилин 24,3 0,46 -5,5

3,4-диметиланилин 14,1 -0,12 -7,9

3,5-диметиланилин 38,3 0,55 -5,4

Исследования проведены при введении соединений внутривенно и внутрижелудочно на двух дозах - 0,25 моль/кг и 0,065 моль/кг. Выбраны данные для метгемоглобинобразующей активности соединений при в/в введении в дозе 0,25 моль/кг, т.к. при этих условиях изучено больше соединений, для которых известна также мутагенная активность в тесте Эймса. Использованы данные для случая метаболической активации микросомальной фракцией клеток печени хомяка (Zeiger Е. etat., 1988, 1992).

Видно (рис. 4), что зависимости представляют из себя "ножницы", т.е. с ростом Д(АН(), соответствующим затруднению образования нитрениевого иона, растет метгемоглобинобразующая активность и падает мутагенность (растет удваивающая доза).

ü(üHf) ккал/моль

i(AHf) ккал/моль

Рисунок 4. Зависимости метгемоглобинобразующей активности (%МНЬ) и мутагенной активности в тесте Эймса (удваивающие дозы) от относительной устойчивости метаболитов в ряду ароматических аминов.

Таким образом, по крайней мере, в изученном ряду соединений существует обратная зависимость этих двух видов активности, и они связаны с относительной устойчивостью двух последовательных метаболитов ариламинов - Ы-фенилгидроксиламинов и нитрениевых ионов. Можно сделать вывод, что общетоксический эффект и мутагенный эффект соединений определяются различными метаболитами исходных веществ - ароматических аминов.

Таблица 5. Соотношения структура-биотрансформация-токсичность

Структурный ряд Эффект Регрессионное уравнение

Замещенные Бензолы Общая токсичность Ig-TOso = 1,64+ 1,23 ДЕт,„ г= 0,793 п = 67 р< 0,001 1ёМНД =-2,76 + 1,95 ДЕт|„ г = 0,82 п= 13 р<0,01

Ароматические Амины Мутагенная активность в тесте Эймса Метгемоглобин-образующая активность на млекопитающих Токсичность для млекопитающих Ig(l/C) = - 1,65-0,15 Д(ДНГ) г=0,91 п= 10 р < 0,001 %MtHb = 66,9 + 5,03 Д(ДП|) r=0,92 n=10 р < 0,001 18ЛД50 =-33,17-4.05 Д(ДНГ)Ш, г=0,82 п=22 р<0,01

Галогензаме-щенные пропаны Некроз почек Генотоксичность in vivo IgC = -16,69+ 1,71 ДЕгр г=0,99 n=6 р < 0,001 IgC = -18,07+ 1,73 ДЕгр 1=0,99 п=6 р < 0,001

Гапогензаме-щенные углеводороды и спирты с короткой цепью Мутагенная активность на бактериях (вариант без активации) Мутагенная активность на бактериях (вариант с активацией) lgDmut=- 17,62+1,55ДЕФ -0,791gP r=0,76 п=25 р < 0,001 lgDmut=-26,24+2,54AEvp.M i=0,76 n=21 р < 0,001 lgDmut= - 2,69-5,7 4схс2 г=0,72 п=21 р< 0,001

Алифатические спирты Хроническая токсичность 1ёМНД = -21,02-1,56 Еномо -0,77 lgP п=28 г=0,86 р<0,001

Алифатические амины Острая токсичность Хроническая тоскичность 1ёЛД50 = 2,42 - 0,21 lgP -0,029 (lgP)2-0,142 рКа п = 40 г = 0,84 р <0,001 lgnfl=-5,68 +0,17Д(ДНГ)Г n = 9 r=0,81 р < 0,01

Замещенные пиридины Острая токсичность Хроническая токсичность ^ЛДад „ -2,4 + 0,33 ДЕф п = 17 г = 0,86 р < 0,001 1ёМНД = -24,7 + 2,04 ДЕ^ п = 7 г = 0,75 р < 0,05

Эта зависимость может быть использована при выборе показателей при обосновании безвредных доз ароматических аминов. Таким образом, предлагаемый подход позволяет осуществлять прогноз вида токсического эффекта.

Развиваемый подход позволяет статистически корректно и надежно прогнозировать параметры токсикометрии в различных рядах, а также виды

эффектов, включая неспецифическую, специфическую токсичность и отдаленные эффекты (таблица 5), что позволяет рассматривать его как универсальный.

В таблице 6 приведены результаты сравнения полученных уравнений с зависимостями, установленными в рамках стандартных методов КССА без учета биоактивации. Показано, что предлагаемый подход позволяет получить более достоверные зависимости с меньшим числом параметров.

Таблица 6. Результаты сопоставления статистических показателей качества соотношений структура-биотрансформация-токсичность и соотношений структура-токсичность__

Структурный ряд Показатель Модель структура-токсичность Модель структура-биотрансформация-токсичность

токсичности Источник Коэффициент корреляции Число соединений Достоверность Число параметров Коэффициент корреляции Число сое-дине -ний Достоверность Число параметров

Замещенные бензолы ЛД50 Жол-дако-ва, 1987 0,5 40 р <0,01 61 0,79 67 р<0,001 1

Dura D., 1982 0,88 18 р <0,01 5

мнд Жол-дако-ва, 1987 0,5 16 э<0,05 2 0,82 13 р<0,01 1

Егорова 1980 0,91 23 р <0,01 5

Алифатичес- лд50 Жол- 0,89 24 b <0,001 1 0,84 40 р<0,001 3

кие амины МНД дако- 0,81 10 э <0,01 5 0,81 18 р<0,01 1

Спирты мнд ва, 1987 0,82 13 5 <0,01 3 0,86 28 р<0,001 2

Таким образом, теоретический подход к построению зависимостей структура-биотрансформация-токсичность на основе ключевой реакции механизма токсического действия с учетом возможности биотрансформации позволяет прогнозировать как общую, так и специфическую токсичность. По таким критериям, как теоретическая обоснованность, надежность, универсальность предлагаемый подход обладает преимуществом перед стандартным подходом «структура-активность».

Надо отметить, что построение моделей на основе регрессионного анализа имеет ряд ограничений. В связи с чрезвычайной сложностью процессов, определяющих хроническую токсичность, особенностей постановки эксперимента, в частности выбором доз, как правило, с шагом 10, регрессионные уравнения для прогноза показателей токсикометрии хронического эксперимента, таких как пороговые и безвредные уровни, чаще всего недостаточно статистически достоверны. Кроме того, параметры хронической токсичности, в отличие от ЛД5о не являются статистически рассчитанными величинами и имеют дискретный характер распределения.

Не представляется возможным осуществлять прогноз токсичности соединений в неизученных структурных рядах. Построение соотношений структура-биотрансформация-токсичность предполагает строго гомогенную природу обучающей и тестовой выборок, т.е. схожесть структуры соединений, определяющую возможность одного механизма действия. В связи с недостаточной точностью регрессионных уравнений для прогноза токсикометрических показателей для млекопитающих, наиболее приемлемым является использование методов, позволяющих получать классификационные модели для прогноза токсичности веществ (Worth, 2003). Одним из таких методов является логико-комбинаторный метод ДСМ. Прогноз класса опасности соединений может быть выполнен для любых неизученных в токсикологическом отношении соединений. Выборка может быть гетерогенной, т.е. в общем случае содержать соединения разных структурных рядов, однако для дальнейшего изучения более правомерен подбор соединений одного структурного ряда. Такой прогноз может быть ориентировочным при выделении веществ, которые должны быть изучены экспериментально.

Научное обоснование возможности и ограничений логико-комбинаторного ДСМ-метода к гигиеническим исследованиям

С использованием интеллектуальной ДСМ-системы проведены компьютерные эксперименты по прогнозу классов опасности по хронической токсичности в рядах замещенных бензолов и галогензамещенных алифатических углеводородов, острой и хронической токсичности в ряду спиртов, канцерогенной активности в ряду полиароматических углеводородов.

При прогнозе хронической токсичности соединения, относящиеся к первым двум классам по классификации Методических указаний по обоснованию ПДК веществ в воде (МУ, 1998), были объединены в один из-за малочисленности чрезвычайно опасных соединений в выборке. Таким образом, к I классу относили чрезвычайно и высоко опасные вещества, ко II классу - умеренно опасные, к III классу - малоопасные по классификации, принятой в Методических указаниях по обоснованию безопасных уровней веществ в воде.

В результате работы ДСМ-системы сформированы гипотезы - структурные фрагменты, определяющие принадлежность соединения к первому, второму или третьему классам по хронической токсичности.

В таблице 7 приведены сгенерированные в результате ДСМ-эксперимента по прогнозу хронической токсичности замещенных бензолов гипотезы-структурные фрагменты, определяющие проявление высокой, умеренной и слабой хронической токсичности. С использованием этих гипотез были определены как принадлежащие к определенному классу по хронической токсичности 9 соединений тестовой выборки.

Согласно этим результатам 3,5-диметилфенол и пирокатехол должны быть отнесены к малоопасным веществам по хронической токсичности, 2- и 3-нитрозамещенные анилины, 1,3,5-тринитробензол, 2,4,6-тринитротолуол, 2,6-динитрофенол - к высоко опасным веществам. 2-Метиланилин отнесен к классу умеренно опасных соединений по хронической токсичности, однако это соединение является известным канцерогеном (группа 2А по МАИР). По данным биохимических и теоретических исследований (Loew G.H., 1983, 1985) можно предположить, что ключевые реакции биотрансформации для насыщенных и ненасыщенных алифатических ГСС различаются.

Таблица 7. Гипотезы (структурные фрагменты), опрсдслеляюшие хроническую токсичность замещенных бензолов

Положительные гипотезы (структурные фрагменты), ответственные за проявление выскокой хронической токсичности

Отрицательные гипотезы (структурные фрагменты), определяющие снижение токсического эффекта

о-с^с (—

Положительные гипотезы (структурные фрагменты), определяющие принадлежность соединения к умеренно опасным по хронической токсичности

мн2

ч

Положительные гипотезы (структурные фрагменты), определяющие принадлежность соединения к классу малоопасных соединений по хронической токсичности

он

он

он -к

Для предварительного прогноза на смешанной обучающей выборке соединений этих структурных рядов был проведен компьютерный эксперимент по прогнозу хронической токсичности. Массив содержал 47 соединений, для которых в базе данных \VATERTOX приведены показатели хронической токсичности.

В результате компьютерного эксперимента с использованием этой выборки удалось сделать прогноз класса опасности по хронической токсичности для 8 соединений. По результатам ДСМ-прогноза 1,2-дибромэган и 1,2-дихлорпропан, отнесены к группе высоко опасных веществ. Норматив 1,2-дихлорпропана был недавно пересмотрен с учетом зарубежных данных. Новый норматив, в отличие от старого, соответствует отнесению соединения к группе высоко опасных веществ по хронической токсичности. Для 1,2-дибромэтана утверждено значение ориентировочной допустимой дозы, соответствующее группе высокотоксичных веществ. 1,1-Дихлор-4-метилпентадиен, вещество, изученное в эксперименте, первоначально не был включен в обучающую выборку. Для этого соединения предсказан второй класс опасности по хронической токсичности. Экспериментальное значение МНД 0,26 мг/кг, что соответствует второму классу опасности. Для 1,1,2,2,3 пентахлорпропана предсказан третий класс опасности. Определенная экспериментально пороговая доза хронического эксперимента составляет 5 мг/кг, максимальная недействующая доза обычно в 5-10 раз меньше, что соответствует

третьему классу опасности по принятой в данной работе классификации. По результатам прогноза 1,2,3-трихлорпропан отнесен к первому классу опасности, тогда как экспериментальное значение МИД (0,3 мг/кг) соответствует второму классу. 1,2,3-Трихлорпропан является установленным канцерогеном для многих видов животных, вероятным канцерогеном для человека (по классификации МАИР), проявляет нефротоксичность. Очевидно, его норматив должен быть пересмотрен с учетом канцерогенного эффекта.

Качественный анализ данных по острой токсичности различных спиртов для крыс и мышей позволяет выделить некоторые структурные фрагменты, наличие которых в молекуле приводит к усилению токсичности (например, двойные и тройные связи). Кроме того, насыщенные спирты с очень малым или очень большим числом атомов углерода менее токсичны, тогда как спирты с числом атомов углерода от 4 до 10 более токсичны. Такие факторы трудно характеризовать в численной форме, и они не могут быть учтены при рассмотрении с использованием регрессионного анализа. Задача может быть решена с использованием экспертных систем. На примере острой токсичности результаты ДСМ прогноза сопоставлены с результатами прогноза с использованием экспертной системы, построенной на правилах, предварительно сформулированных экспертами (продукционной системы). При сравнении работы самообучающейся ДСМ-системы и продукционной системы, оказалось, что ДСМ-система породила гипотезы, которые полностью совпали с продукциями (правилами), изначально заданными в продукционной системе.

Таблица 8. Гипотезы (структурные фрагменты), определяющие хроническую токсичность спиртов.__

Гипотезы, определяющие среднюю и высокую хроническую токсичность спиртов Гипотезы, определяющие среднюю и высокую хроническую токсичность спиртов

н3е^он ноХ^ р е г Р

X

он

сн^лн А СН3СН3

Структурный фрагмент, препятствующий проявлению высокой и средней хронической токсичности спиртов. .

"«Ч/Ч/0« 1

Эффективность работы ДСМ системы практически та же, что и продукционной системы.

Анализ соотношения структура-хроническая токсичность спиртов методом регрессионного анализа выявил наличие большого числа соединений - "оиШпегБ", не укладывающихся в зависимость. В связи с этим был проведен компьютерный ДСМ эксперимент на массиве данных по хронической токсичности для 38 спиртов. По его результатам, приведенным в таблице 8, присутствие в молекуле третичной бутильной группы, фторзамещеных алкильных групп, двойной связи определяет принадлежность соединения к группам высоко- или среднетоксичных соединений, тогда как наличие диметилэтаноламинной группы связано с низкой хронической токсичностью.

Для оценки возможности прогноза отдаленных эффектов с использованием ДСМ-системы проведен компьютерный ДСМ эксперимент по прогнозу канцерогенной активности полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) на обучающей выборке из 25 ПАУ. Структура соединений описывалась кодами ФКСП, причем изменение структуры в ходе биотрансформации никак не учитывалось. Канцерогенная активность ПАУ характеризовалась по Бэджеру, в классификации которого по результатам экспериментов на млекопитающих соединения относятся к одной из 5 групп - неактивные (-), слабо активные (+), умеренно активные (++), сильно активные (+++) и чрезвычайно активные (++++).

В соответствии с предположениями, без учета биотрансформации как полнота, так и точность прогноза были недостаточны. Так, сильный канцероген бенз(а)пирен (исключенный из обучающей выборки и рассмотренный как тестовый пример) был отнесен к слабо или не канцерогенным соединениям, а не канцерогенный пентацен -к канцерогенам.

Таким образом, по результатам компьютерных экспериментов по прогнозу хронической токсичности методом ДСМ в большинстве случаев удалось сделать правильный ретроспективный прогноз классов опасности по хронической токсичности и дать прогноз для не изученных соединений. Однако прогноз для многих соединений оказался невозможным или неполным, в некоторых случаях, как при прогнозе канцерогенное™ - неверным, что потребовало проведения дальнейших исследований.

Возможно, причина заключается в том, что метод не учитывает возможность биоактивации в процессе биотрансформации.

Прогноз канцерогенности химических веществ с использованием логико-комбинаторного ДСМ метода и анализа числовых параметров

Был разработан комплексный подход, в котором параметры, характеризующие биоактивацию, были включены в ДСМ «рассуждения». Квантово-химические параметры, как и другие дескрипторы соотношений структура-активность, являются числами. До настоящего времени логико-комбинаторный ДСМ метод не применялся к числовым объектам. Для включения числовых параметров в ДСМ систему была разработана специальная алгебра интервалов. Соединение представляли в виде гибридного объекта, состоящего из числового параметра (параметров) и описания химической структуры метаболитов либо исходных соединений с помощью дескрипторов языка ФКСП или с помощью графов.

В данном разделе работы предлагаемый комбинированный подход применен для прогноза наличия и степени выраженности канцерогенного эффекта. Канцерогенез веществ многих структурных рядов определяется их биоактивацией в организме. Это было отмечено еще в ранних работах по изучению канцерогенной

активности (Miller Е.С., 1966, 1981). Так, канцерогенность является основным токсическим эффектом соединений ряда ПАУ. Канцерогенная и мутагенная активность различных ПАУ варьируется в очень широких пределах в зависимости от структуры углеводорода. В результате экспериментальных исследований была выявлена определяющая роль метаболической активации в канцерогенной активности ПАУ (Guengerich F.P., Shimada Т„ 1991). Прогноз канцерогенности ПАУ в нашей работе основан на гипотезе Джерины и Лера (Jerina P.M., Lier R.E., 1977) о том, что наиболее опасными метаболитами являются диолэпоксиды, способные образовывать аддукты с ДНК, атакуя критические нуклеофильные позиции ДНК по механизму нуклеофилыюго замещения первого порядка (Ssl) с образованием в качестве интермедиатов триолкарбокатионов. Механизм биоактивации по пути образования диолэпоксидов признан до сих пор одним из ведущих механизмов канцерогенеза под действием ПАУ (IARC Monographs, 2010). Гипотеза состояла в том, что ключевой реакцией, лимитирующей скорость процесса биоактивации, является образование триолкарбокатионов из диолэпоксидов. В результате расчетов прогнозировали ключевую реакцию биотрансформации для данного соединения - определяли триолкарбокатион, образование которого энергетически наиболее выгодно. Из всех карбокатионов, которые могут образоваться в результате биотрансформации ПАУ, наиболее легко образуется катион, для которого разность энергии карбокатиона и диолэпоксида ДЕкатион наименьшая.

Значение параметра АЕкатион, характеризующее ключевую реакцию биотрансформации для этого карбокатиона и использовалось при прогнозе.

Для определения ключевой реакции биотрансформации была составлена программа расчета параметров ДЕкатион - разности энергий всех возможных диолэпоксидов и триолкарбокатионов методом Хюккеля (рис. 5).

По программе определяется как значение параметра, так и структура наиболее устойчивого карбокатиона, т.е. метаболита, соответствующего ключевой реакции биотрансформации.

В ходе апробации метода проведен ДСМ-эксперимент на структурах метаболитов ПАУ. Для 41 незамещенного ПАУ с использованием квантово-химического модуля генерации метаболитов были определены наиболее активные конечные метаболиты - карбокатионы. На массиве метаболитов -диолэпоксидов, предшественников этих наиболее устойчивых карбокатионов был проведен компьютерный ДСМ-эксперимент.

Метаболитам соединений был приписан экспериментально определенный уровень канцерогенной активности исходных ПАУ по Бзджеру. С использованием полученных гипотез канцерогенная активность неактивного пентацена была предсказана правильно, канцерогенная активность бенз(а)пирена была определена не полностью - он был отнесен к высоко или умеренно активным соединениям, неактивный бензо(а)нафто(2,1,8-Ьу)нафтацен был отнесен к умеренно активным или неактивным соединениям.

В целом прогноз согласуется с экспериментальными данными, однако недостаточная точность прогноза приводит к необходимости явного учета энергетических параметров. Согласно принятой модели, в ряду ПАУ с ростом устойчивости карбокатиона возрастает канцерогенная активность.

=-20.1847,Д£1„„ =-0.7364 Е[1тш„ = -20.203=-0-7549

¿11.Ш. = "20-1618, лЕЦ^, = -0.848СК = -20.0834, Л= -0.7697

Рисунок 5. Алгоритм установления наиболее устойчивого метаболита бенз(а)антрацена (обведен кружком).

Однако помимо биоактивации с образованием диолэпоксидов, в организме могут идти и другие процессы биотрансформации: образование гидроксилированных продуктов, при окислении так называемых Ь-областей образуются хиноны. Согласно экспериментальным исследованиям, эти процессы биотрансформации могут привести к снижению канцерогенной активности. Возможна также биоактивация через образование катион-радикалов в результате одноэлектронного окисления (Ссп>аНеп Е.Ь. е! а1., 1995, 2005), через метилирование с последующим образованием сложных эфиров, которые связываются с ДНК также через стадию образования карбокатионов (Ье/тег А.Р. е1 а1„ 1996), через образование орто-хинонов (ВигсгупяИ М.Е., 1999, СауаНеп Е.Ь. е! а!.. 2002). Анализ зависимости канцерогенной активности от энергии образования конечного метаболита на пути биоактивации по модели Джерины и Лера свидетельствует, что одной этой численной характеристики недостаточно для надежного прогноза. В частности, плохо прогнозируется канцерогенная активность соединений, структура которых содержит несколько Ь-областей.

Высказана гипотеза, что описанный выше комплексный подход позволит улучшить результаты прогноза. ДСМ-анализ проводили на гибридных объектах, состоящих из числового параметра ДЕктюн и описания структуры конечного метаболита - триолкарбокатиона либо исходного ПАУ с помощью дескрипторов кода ФКСП. В продолжение этих исследований были проведены компьютерные эксперименты с использованием варианта ДСМ системы с альтернативным описанием структуры химического соединения с помощью графов. Структуры ПАУ описывали с помощью ¿-циклических проекций (для множества молекулярных графов было построено множество подграфов, состоящих из к связанных циклов из объединения минимальных циклических базисов хотя бы одного из исходных графов). Как и в эксперименте с описанием структуры языком ФКСП, вместе со структурной частью рассматривался числовой параметр, характеризующий энергию образования наиболее активного конечного метаболита ПАУ.

При описании с помощью графов с использованием выборки из 25 ПАУ в качестве обучающей осуществлен прогноз канцерогенной активности 18-ти соединений, активность которых была известна (ретроспективный прогноз). Прогнозировалось отнесение соединения к одной из трех групп по канцерогенности: 1 группа - сильно канцерогенные, 2 группа -умеренно и слабо канцерогенные и 3 группа - не канцерогенные соединения.

В процессе тестирования язык описания был исправлен и дополнен. Так, была определена необходимость различать структуры, которым соответствуют графы, содержащие и не содержащие вершины, являющиеся началом новых ребер. Циклы, содержащие эти вершины, не должны быть концевыми. Такое различие определяется возможностью реакций присоединения кислорода к «свободным», находящимся в пара положении к друг другу, атомам углерода колец. Наличие двух таких «внутренних» сопряженных (с общим ребром) колец колец в одной молекуле сильно облегчает прохождение этой реакции, приводящей к ослаблению канцерогенной активности. Необходимо также различать «угловые» структурные фрагменты, содержащие и не содержащие циклы с вершинами, являющимися началом новых ребер.

Введение таких поправок в описание структур соединений позволило уменьшить до минимума число неправильных прогнозов. В результате канцерогенная активность только одного соединения была предсказана неправильно, активность одного соединения не удалось предсказать с использованием гипотез, сгенерированных на стадии анализа обучающей выборки, активность трех соединений предсказана частично (не полностью объяснена), точность прогноза 95% .

Полученные результаты позволили применить разработанную систему для прогноза канцерогенной активности 20 неизученных соединений. Обучающая выборка взята из литературных данных (/"Уетйег У.(У. е! а!., 1996). Как показали недавние экспериментальные исследования, одно из соединений обладает генотоксичностью в согласии с нашим прогнозом.

Проведенные эксперименты по сопоставлению с другими методами машинного обучения показали, что применение ДСМ-метода на данном массиве по точности дает лучшие результаты среди всех рассмотренных методов машинного обучения. В то же время использование проекций ведет к незначительному изменению числа правильных предсказаний по отношению к результатам, полученным с применением ФКСП-кодов. Однако подход, основанный на операторе проекции графов значительно сокращает временные затраты на анализ данных обучающей выборки и

последующее применение полученных гипотез, с целью классификации, к данным тестовой выборки, в тоже время не приводя к большим информационным потерям (т.е. неправильным классификациям).

Структурный ряд ПАУ содержит несколько десятков соединений. Однако каждый из таких углеводородов является родоначальником большого числа замещенных производных. Например замещение метальной группой в бенз(а)антрацене можно осуществить в 12 различных положениях и получить таким образом более десятка только его монометил производных. Более ста соединений возникают при введении двух и более метальных групп. При замене в сопряженной системе некоторых атомов С на N и другие элементы могут возникать разнообразные гетероциклические производные. Все эти многие сотни и тысячи соединений не могут быть изучены экспериментально. Известно лишь, что среди замещенных ПАУ содержатся сильные канцерогены, встречающиеся в окружающей среде. Введение метальной группы в углеводород может сопровождаться резким усилением активности. Известно, что метаболизм ПАУ под действием цитохрома Р450 высоко стереоспецифичен (Silverman B.D., Lowe J.P., 1983). Поэтому для выборки ПАУ и метил замещенных ПАУ был проведен расчет исходных соединений, дигидродиолов и диолэпоксидов с полной оптимизацией геометрии полуэмпирическим квантово-химическим методом РМЗ и определено значение параметра ДЕСС, представляющего собой разность полных энергий карбокатиона и диолэпоксида. Согласно модели, чем меньше значение параметра, тем более канцерогенным должно быть соединение.

По результатам квантово-химических расчетов для 75 соединений выборки ПАУ и их метилзамещенных производных существует область значений параметра (около 145,5-147,5 ккал/моль), соответствующая пограничной +/- активности. Предполагалось, что совместное использование ДСМ-анализа и квантово-химических расчетов должно дать возможность уточнить прогноз. Соединения с определенной активностью и пограничными значениями параметра (4 соединения) были исключены из обучающей выборки, для прогноза канцерогенной активности был проведен компьютерный ДСМ эксперимент с использованием числового параметра ДЕСС.

Таблица 9. Прогноз канцерогенности метилзамещенных ПАУ с использованием комплексного метода прогноза ___

Соединение ДЕСС* Эксперимент Результат ДСМ-

(ккал/моль) прогноза

бенз(а)пирен 0 + +

2,4-диметилбензо(с)хризен 3,48 ? +

7,14-диметилбензо(а)тетрацен 5,66 ? +

1,2-диметилиндено( 1,2,3-сс1)пирен 8,86 7 -

Флуорантен 0,59 -

5-ОН- бензо(Ь) флуорантен 2,68 +

Бензо(к) флуорантен 10,3 +

БензоО) флуорантен 7,49 +

дибензо(а,е)флуорантен 2,64 +

1 -метилбензо(Ь)флуорантен 3,61 ? +

4-метилбензо(Ь)флуорантен 4,86 7 +

2,3-диметилфлуорантен 2,91 7 +

10,11-димстилбензо(к)флуорантен 9,68 ? -

* - за нуль принято значение ДЕСС для бенз(а)пирена, равное 139,64 ккал/моль.

Результаты прогноза с использованием интегрированной системы совпали с экспериментальными данными. Было предсказано наличие/отсутствие канцерогенной

активности соединений, для которых данные противоречивы и неизученных метил замещенных ПАУ. Результаты представлены в таблице 9.

Известно, что флуорантен и изомерные бензфлуорантены в наибольших среди ПАУ количествах присутствуют в воде. По результатам квантовохимических расчетов флуорантен по активности должен быть сопоставим с бенз(а)пиреном. Действительно установлено, что флуорантен обладает высокой мутагенной активностью. Однако в отличие от бенз(а)пирена он не связывается с цитозольным АН рецептором и не является промотором. Среди изомерных бензфлуорантенов бензо(Ь)флуорантен и особенно его 5-ОН-замещенный метаболит в согласии с результатами расчета должны обладать самой высокой среди изомеров генотоксичностью. Кроме того, бензо(Ь)флуорантен обладает высоким сродством к АН рецептору. Вероятно вследствие этого бензо(Ь)флуорантен является наиболее канцерогенным среди бензфлуорантенов. Самым высоким сродством к АН рецептору среди всех ПАУ обладает бензо(к)флуорантен. Это вероятно определяется наибольшей близостью линейных размеров бензо(к)флуорантена и 2,3,7,8-тетрахлордибензопарадиоксина - наилучшего агониста АН рецептора (11,06 и 10,996 А). Такую же примерно близость размеров обнаруживают и другие ПАУ, проявляющие высокое сродство к рецептору - бенз(а)пирен и хризен (11,41 А и 11,43 А). При этом надо учесть, что реакционная способность, в частности донорно-акцепторная способность ПАУ выше, чем у 1,2,7,8-дибензопарадиоксина. Поэтому в определении сродства к рецептору должны играть роль стерические факторы. Анализ экспериментальных данных и результатов расчетов показывает, что параметр ДЕСС характеризует генотоксичность ПАУ, а сродство к АН рецептору определяется стерическими факторами, донорно-акцепторными свойствами и поляризумостью молекул. Такая зависимость установлена в ряду 34-х ПАУ, азааренов и их галогензамещенных производных.

Получена достоверная зависимость способности связываться с АН-рецептором, определенной в скрининговой тест-системе, в которой коэкспрессируются гены человеческого АН рецептора и транслокатора этого рецептора (5аек( К. е1 а1., 2003) от параметров, характеризующих акцепторную способность, поляризуемость и размер молекул.

С использованием параметра ДЕСС, а также значений энергии высшей заполненной молекулярной орбитали, как параметра, характеризующего активность соединения в реакции биотрансформации через окисление по одноэлектронному механизму (СагаНеп Е.Ь. е.1 а!., 1995, 2005), сделан ДСМ прогноз класса опасности по канцерогенному эффекту для 5 неизученных галогензамещенных ПАУ.

При исследовании зависимости структура-канцерогенная активность алифатических галогенсодержащих соединений (ГСС) была апробирована классификация по силе канцерогенного действия, поскольку для соединений этого ряда в базе данных СРОВ имеются данные по величинам ТО50 (ТО5о- доза, соответствующая вероятности образования злокачественных опухолей у 50% животных, в данном случае крыс и мышей, с учетом образования опухолей у контрольных животных, при ежедневном введении в течение всей жизни животных).

В качестве количественного критерия используется величина канцерогенного потенциала ^(М/Т05о), где М - молекулярный вес. При этом низкими считались дозы, для которых ^(М/ТО50) > 0, умеренными и высокими дозы, для которых -1< ^(МЛГО5о) < 0. К первому классу отнесены соединения, в низких дозах вызывающие образование злокачественных опухолей в различных органах у нескольких видов

животных, ко второму классу - соединения, в умеренных дозах (-1<^(М/ТО50) < 0) вызывающие образование опухолей у нескольких видов животных либо в различных органах у одного вида, либо в низких дозах (^(М/"ГО5о) > 0) вызывает образование опухолей у одного вида животных; 3 класс - при умеренных или высоких дозах (-1< ]§(М/Т05о) < 0) вызывает образование опухолей у одного вида животных; 4 класс - не канцероген или в сверхвысоких дозах (^(М/ТО50) < -1) вызывает образование опухолей в одном органе у одного вида животных. Предлагаемая классификация представлена в таблице 10.

При прогнозе канцерогенности насыщенных алифатических ГСС мы исходили из гипотезы, высказанной О.Н.Ьоеж (¿оеи> О.П., е! а!., 1984) что ключевой реакцией механизма токсического действия является взаимодействие стабильных высокотоксичных метаболитов - альдегидов и кетонов с ДНК.

Таблица 10. Классификация для прогноза канцерогенной опасности химических веществ_

Показатель Высоко опасные (1 класс) Умеренно опасные (2 класс) Низко-умеренно опасные (3 класс) Слабо опасные и не канцерогены (4 класс)

Канцерогенный потенциал (ср) {1е(М/ТО50)} >0 -1<ср<0 >0 -1<ср<0 ср<-1 не вызывает образования опухолей

Количество видов животных с с опухолями >1 >1 1 1 1

Количество пораженных органов у одного вида >1 >1 1 1 1

Ключевая реакция биотрансформации определялась по результатам расчета наиболее стабильного радикала, образующегося при отрыве атома водорода от углерода. В процессе дальнейшей биотрансформации происходит присоединение гидроксильного радикала и образование карбонильных метаболитов с отрывом НС1 или НВг. Структура конечного метаболита однозначно определяется структурой радикала, образующегося на первой стадии. Для обучающей выборки, включающей 19 веществ и тестовой выборки, включающей 8 веществ, проведен прогноз ключевой реакции биотрансформации, т.е. методом AMI рассчитаны минимальные значения энтальпии активации модельной реакции образования радикалов (ДНай) (Yin Н. el al, 1995). По результатам расчетов установлено граничное значение этого параметра - 26 ккал/моль. Если энтальпия активации превышает эту величину, вещества не подвергаются биотрансформации по пути окислительного гидроксилирования, и не обладают канцерогенной активностью.

Для метаболитов, соответствующих ключевой реакции биотрансформации рассчитан параметр, характеризующий реакционную способность в реакции с ДНК -энергия нижней свободной молекулярной орбитали, разрыхляющей по карбонильной связи С=0 (Емо)- Для характеристики выраженности канцерогенного эффекта для соединений обучающей выборки с использованием информации из базы данных CPDB были рассчитаны значения канцерогенного потенциала ^(МЯО50).

Соединения обучающей выборки было отнесены к определенному классу по канцерогенности в соответствии с предложенной классификацией.

В результате компьютерного эксперимента был осуществлен правильный прогноз канцерогенной активности известных канцерогенов трихлорметана и 1,2,3-трихлорпропана, сделан прогноз класса опасности 8 неизученных соединений. Результаты (Таблица 11) не противоречат оценке, данной экспертами (Шоо У.-Т. еГ а!., 2002).

По результатам прогноза 1,2-дибром-1,1,5-трихлорпентан может обладать канцерогенной активностью, в настоящее время ПДК установлена по органолептическому признаку вредности (запах).

Таблица 11. Прогноз класса опасности галогенированных алканов по канцерогенному эффекту ____

Название Метаболит min (ккал/ моль) Енсмо метаболита (эВ) Прогноз класса опасности

1,2,3-трихлорпропан 2-хлорпропеналь 23,31 -0,469 1

1,1,1,2-тетрабром-2-хлорэтан 1,1,1 -бромацетилхлорид 23,36 -0,548 2

2,3-дихлорбутан 3 -хлорбутан-2-он 22,17 0,204 3

1,1,5,5-тетрахлорпентан 1,1-дихлорпентаноил хлорид 24,94 -0,301 3

1-хлороктан октаналь 22,86 0,888 4

2-хлордодекан додека-2-он 22,53 0,779 4

1,2-дихлор-2-метилбутан 2-хлор-2-метилбутаналь 23,15 0,235 3

1,2-дибром-1,1,5-трихлорпентан 1,2-дибром-1,1 -дихлорпента-наль 23,54 -0,376 2/3

1,2-дибромпропан бромацетон 22,34 -0,115 2

Обоснована необходимость пересмотра норматива в воде для 1,2,3-трихлорпропана - вероятного канцерогена для человека по классификации МАИР (группа 2А). В настоящее время 1,2,3-трихлорпропан нормирован по органолептическому признаку вредности.

При изучении канцерогенной активности ароматических аминов исходили из гипотезы, что ключевой реакцией биотрансформации является перенос электрона с субстрата на фермент с образованием катион-радикала (Franke R. et al., 2001) R. В обучающую выборку из 82 соединений включены аминопроизводные бензола, флуорена, нафталина, бифенила. В результате ДСМ-эксперимента на этом массиве были порождены гипотезы, включающие как структурную часть, описанную с помощью графов, так и интервалы значений числовых параметров - энергии высшей заполненной молекулярной орбитали и логарифма коэффициента распределения октанол/вода. С использованием порожденных гипотез все соединения обучающей выборки были правильно отнесены к канцерогенным и не канцерогенным веществам (выполнен критерий достаточного основания). Был сделан прогноз для трех неизученных ариламинов. Согласно прогнозу, 3,5-диметиланилин, 3,5-диметоксианилин и 5-хлор-орто-анизол не должны обладать канцерогенной активностью. В тестовую выборку были включены о-метиланилин, п-метиланилин и м-метиланилин. По результатам прогноза о-метиланилин и п-метиланилин должны обладать канцерогенной активностью, а м-метиланилин не активен, что согласуется с экспериментальными данными.

В целом результаты прогноза канцерогенной активности свидетельствуют, что использование числовых параметров позволяет существенно повысить как полноту (количество тестовых соединений, для которых с помощью сгенерированных гипотез удается прогнозировать класс по канцерогенности), так и точность ДСМ-прогноза.

Прогноз порядка величины безопасных уровней канцерогенных веществ в воде

Использованное при прогнозе показателей токсикометрии разделение на классы не дает возможности прогнозировать безопасные уровни. Поэтому была поставлена задача разработки классификации для их прогноза. Проанализированы величины безопасных уровней веществ, для которых ПДК в воде установлены с учетом канцерогенного эффекта. Величины ПДК в основном различаются на порядки. Эта же закономерность - различие на порядки характерна и для критериев, используемых для оценки риска канцерогенных веществ. В связи с этим, при разработке классификации опасности канцерогенов для цели прогноза их безопасных уровней в воде можно принять, что необходимым и достаточным является прогноз порядка величины. Такая классификация должна быть основана на величинах наименьших доз канцерогенных веществ, определенных в эксперименте. Для нескольких сот веществ имеется информация о величинах LTD10 - нижней доверительной границы дозы, соответствующей возникновению рака у 10% животных. Именно эти величины были использованы для классификации. Для большинства веществ наблюдается закономерность: чем ниже величина LTDi0, тем ниже величина ПДК. Однако по зависимости величин ПДК от LTD,0 интервалы значений ПДК, соответствующие высокой, умеренной и слабой канцерогенной активности определить не удается. Кроме того, классификация должна учитывать информацию о канцерогенной опасности не только для лабораторных животных, но и для человека, что связано с проблемой экстраполяции данных, полученных на лабораторных животных, на человека (Г.Н.Красовский,!973;Ю.А.Рахмапин, 1965; Г.Н.Красовский, Ю.А.Рахмании, Н.А.Егорова, 2009).

Таблица 12. Алгоритм определения класса веществ по канцерогенной опасности

группа по классификации МАИР) Значения LTDio (мг/кг)

<0,01 0,01-1 1-10 >10

Класс опасности

1 1 1 2

2А 2 2 3

2В 2 3 3 3

3 3 3 4 4

Высказано предположение, что объединение классификации по 1ЛТ>ю и классификации канцерогенности для человека, принятой МАИР, позволит более правильно предсказывать безопасные уровни.

Такой подход аналогичен принятому ЕРА для оценки сравнительной опасности канцерогенов. Алгоритм классификации представлен в таблице 12.

Можно видеть (рис. 6), что различным классам в основном соответствуют различные интервалы значений ПДК. Для веществ 3 и 4 классов характерны значения ПДК выше 0,01 мг/л, для веществ 2-го класса - от 0,0001 до 0,01 мг/л, для веществ 1 класса - ниже 0,0001 мг/л.

Класс опасности по предлагаемой классификации для неизученных соединений может быть предсказан по результатам системы прогноза.

|дЬТОш

-2

-2 А

П-З

|дпдк

О - 1 класс опасности О - 2 класс опасности А - 3 класс опасности Рисунок 6. Зависимость ПДК веществ, нормированных в воде по канцерогенному эффекту, от ЬТОщ с указанием класса опасности

После установления класса опасности неизученного вещества порядок величины ПДК может быть предсказан в соответствии с таблицей 13.

Таблица 13. Предлагаемые интервалы значений безопасных уровней в соответствии с классами опасности по канцерогенному эффекту_

Класс канцерогенной опасности Интервалы значений безопасных уровней (мг/л)

1 класс - высоко опасные вещества ПДК< 0,0001

2 класс - опасные вещества 0,0001 <ПДК<0,01

3 класс -умеренно опасные вещества 0,01 <ПДК<0,1

4 класс - мало опасные вещества Канцерогенный эффект не прогнозируется

В таблице 14 приведены вещества, нормативы которых в воде предлагается скорректировать или вновь принять по результатам системного прогноза и величины действующих нормативов.

Выделены вещества, для которых установлены или рекомендованы нормативы в воде за рубежом. Порядки величин, определенные по предлагаемой методике, совпали с порядками этих безопасных уровней.

Разработанные методы прогноза позволили определить классы опасности по канцерогенному эффекту 35 веществ, дать рекомендации по корректировке ПДК 11 веществ. Рекомендованы порядки безопасных уровней 4-х ранее не изученных не нормированных веществ без проведения токсикологических экспериментов на животных.

Таким образом, предлагаемая методика прогноза порядка величины безопасных уровней веществ позволяет скорректировать нормативы веществ, которые были установлены без учета канцерогенного эффекта, а также предсказать порядок величины норматива неизученных веществ, которые по результатам прогноза канцерогенное™ могут обладать этим видом эффекта. Таблица 14. Порядки ПДК канцерогенных веществ в воде, предлагаемые на основании прогноза

Вещество Порядки ПДК ПДК, мг/л Лимитирующий показатель вредности Класс опасности

Акрилонитрил ю-з 2 с.-т. 2

Бензил хлористый ю-з 0,001 с.-т. 2

Бензотрихлорид 10-3 - - -

Пропиленоксид 10-2 0,01 с.-т. 2

1,2,3-Трихлорпропан 10-4 0,07 орг. зап. 3

Гексахлорциклогексан 10-4 0,02 орг. зап. 4

Гептахлор 10-4 0,05 с.-т. 2

Гидразин* Ю-2 0,01 с.-т. 2

Катехол 10-2 0,1 орг. окр. 4

о-Нитроанизол Ю-2 0,3 орг.привк. 3

Бензндин** <10-4 - - -

4-Аминобифенил** <10-4 - - -

2-метиланилин гидрохлорид** ю-з - - -

4-метил анилин Ю-2 0,6 орг. окр. 3

*-ОДУ

** - вещество ранее в воде нормировано не было

Комплексная система, основанная на совмещении логико-комбинаторного ДСМ-метода и анализа числовых параметров соотношений структура-биотрансформация-токсичность

На основании проведенных исследований была разработана комплексная версия интеллектуальной ДСМ системы, в которой стандартная система дополнена квантово-химическим модулем генерации метаболитов и расчета их электронных параметров, а в ДСМ-рассуждения включен анализ числовых параметров. Таким образом, комплексная система основана на совмещении логико-комбинаторных методов и методов квантовой химии, используемых для моделирования процессов взаимодействия веществ с организмом, и в частности процессов биотрансформации под действием ферментных систем.

Разработано также сопряжение ДСМ-системы с созданной нами базой данных по токсичности и опасности веществ в воде \VATERTOX и базой данных по канцерогенности СРРВ, что дает возможность формировать обучающую выборку для прогноза класса опасности по острой и хронической токсичности, а также класса

опасности по канцерогенному эффекту. В основу структуры базы данных WATERTOX легли показатели разработанной ранее (Красовский Г.Н., Жолдакова З.И. и соавт., 1992) формы аннотационных карт опасности химических веществ. Информацию по веществу можно разделить на следующие блоки:

• блок идентификационной информации, содержащий название вещества, синонимы и товарные наименования, регистрационные номера, в частности номер по CAS;

• блок информации о физико-химических свойствах вещества; блок информации, содержащий данные об органолептических свойствах и данные по влиянию на процессы самоочищения водоемов, блок информации по токсичности для гидробионтов и млекопитающих в острых, подострых и хронических опытах (смертельные, пороговые и безвредные дозы);

• блок информации по специфическим и отдаленным эффектам вещества (пороговые и максимальные недействующие дозы вещества по данному виду эффекта, класс по МАИР; информация по нормативам в объектах окружающей среды.

Для сопряжения базы данных WATERTOX с ДСМ системой был реализован ее перевод из DBF-формата (кодировка DOS) в MDB-формат (кодировка Windows).

Доступ к базе данных осуществляется через технологию Microsoft ADO, что позволяет реализовать ее использование в сети.

Создана программа для формирования файла свойств при создании выборки из базы данных WATERTOX. Набор свойств, в простейшем случае «+» и «-», характеризует отнесение соединения к определенному классу опасности. Предусмотрен прогноз класса опасности по острой токсичности (по величине ЛД50 для крыс и мышей) и хронической токсичности (по величине ПКхр и МНКхр.). Алгоритм системы приведен на рисунке 7.

Если прогноз проводился с использованием числовых параметров, проводится расчет этих параметров в соответствии с используемой моделью по программам, интегрированным в систему, и значение параметра добавляется к файлу параметров, а файл описания структуры - в директорию эксперимента. В случае, если соединение относится к неизученному ряду, подбирается обучающая выборка из баз данных по токсичности и опасности WATERTOX или канцерогенности (CPDBase) и осуществляется стандартный компьютерный ДСМ эксперимент с анализом сходства структур соединений. Развитие системы заключается в расширении количества структурных рядов и видов эффектов, для которых в соответствии с определяющей стадией механизма токсического действия разработаны модели прогноза структура-биотрансформация-токсичность и определены числовые параметры.

Для расчета электронных параметров соотношений структура-биотрансформация-токсичность разработано сопряжение ДСМ-системы и баз данных с квантово-химическими программами расчета электронных параметров. Для каждого вида эффекта и каждого структурного ряда параметры специфичны и определяются гипотезой о ключевой реакции взаимодействия вещества с организмом. Возможность использования того или иного квантово-химического метода также определяется спецификой структурного ряда. Метод Хюккеля интергрирован в ветвь системы, предназначенную для прогноза наличия и степени выраженности канцерогенного эффекта.

Рисунок 7. Алгоритм системы прогноза токсичности и опасности химических веществ.

Для расчета параметров соединений, не имеющих системы сопряженных связей, и в том случае, когда возможность биоактивации зависит от конформации молекулы вещества или его метаболитов, применяют полуэмпирические квантово-химические методы.

Сопряжение с программой, реализующей полуэмпирический метод, проиллюстрировано на примере модели для прогноза канцерогенности галогенированных алканов. Согласно гипотезе о ключевой реакции биотрансформации соединений этого ряда и ее связи с канцерогенностью, для тестового соединения рассчитывается разность теплот образования радикалов, получающихся при отрыве атома водорода от всех неэквивалентных по симметрии атомов углерода молекулы и исходного соединения. Эта разность характеризует энтальпию активации. Минимальное значение энтальпии определяет положение биотрансформации. Гипотеза состоит также в том, что если это минимальное для данной молекулы значение больше 27 ккал/моль, соединение не подвергается метаболизму и не будет канцерогеном. В противном случае строится структура метаболита и рассчитывается энергия нижней свободной молекулярной орбитали метаболита. Разность теплот образования радикала и исходного соединения и энергия нижней свободной молекулярной орбитали метаболита используются в качестве параметров при ДСМ-эксперименте по прогнозу канцерогенности.

Расчеты производятся с использованием построенного в химическом редакторе файла описания структуры, затем проводится минимизация геометрии методом молекулярной механики и полуэмпирическим методом AMI. Результирующее значение теплоты образования исходной молекулы, рассчитанное этим методом, запоминается. Затем моделируется отрыв атомов водорода путем соответствующего изменения файла описания структуры. Теплота образования получившихся радикалов рассчитывается неограниченным методом Хартри-Фока. Положение отрыва атома водорода, соответствующее минимальному значению энтальпии активации, однозначно определяет структуру карбонильного метаболита. Нахождение минимального значения энтальпии активации, построение структуры метаболита, соответствующего минимальной энергии активации, расчет энергии нижней свободной молекулярной орбитали метаболита и добавление параметров во входной файл ДСМ-системы происходят автоматически.

Результатом является прогноз значения свойств (+/-), что означает прогноз отнесения соединения к определенному классу по канцерогенности.

Система содержит результаты ДСМ-экспериментов для определенных структурных рядов и различных токсических эффектов, т.е. гипотезы, сгенерированные на обучающих выборках из соединений этих структурных рядов. В настоящее время разработаны и внесены в систему модели для прогноза класса канцерогенности, мутагенности, острой и хронической токсичности, метгемоглобинобразования.

Обсуждение результатов исследований.

Правомерность принципов, лежащих в основе разработанной системы прогноза токсичности и опасности химических веществ подтверждается тем, что в последние годы подходы, связанные с учетом биотрансформации при прогнозе токсичности, стали активно развиваться за рубежом. В связи с этим выделилось новое направление исследований, сокращенно называемое ADME (absorption, distribution, metabolism,

excrection), т.е. изучение и прогноз абсорбции, распределения в организме, биотрансформации (метаболизма) и выделения химических веществ. Определяющая роль этих стадий взаимодействия вещества с организмом в развитии токсического эффекта подчеркивалась еще в 1980-х годах в работах З.И. Жолдаковой в ходе разработки патогенетической модели интоксикации (Жолдакова З.И., ¡987).

Развиваемый нами подход к учету биотрансформации при прогнозе токсичности и опасности основан на некоторой модели (гипотезе) о механизме биотрансформации и квантово-химических расчетах, и не требует наличия обширных баз данных по метаболизму, как в случае прогноза биотрансформации с обучением на положительных и отрицательных примерах.

Основное положение нашего подхода - необходимость понимания механизма токсического действия на молекулярном уровне для построения соотношений структура-токсичность, разделяется в настоящее время большинством исследователей. Основным итогом данной работы является вывод о безусловной важности учета механизма токсического действия и процессов биотрансформации для прогноза токсичности и опасности химических соединений, и адекватности применения методов квантовой химии и логико-комбинаторного анализа для целей прогноза.

Апробация предложенной системы прогноза показала, что система позволяет прогнозировать вид и механизм токсического эффекта, выбирать адекватные показатели токсического действия и дозы для проведения острых и хронических экспериментов по обоснованию ПДК веществ, сокращать объем исследований при обосновании временных нормативов веществ в окружающей среде.

ВЫВОДЫ

1. Теоретически обосновано, что на разных стадиях взаимодействия химического вещества с организмом в процессе трансформации вероятна его биоактивация, проявляющаяся в усилении токсичности, опасности, появлении новых специфических эффектов. На примере веществ, проявляющих мутагенные, канцерогенные свойства, способность к метгемоглобинообразованию и др. показано, что биоактивация при трансформации веществ в организме - скорее правило, чем исключение.

2. На основе квантово-химических расчетов на примере 255 веществ показано, что в рядах соединений с известным механизмом действия на организм выбор квантово-химических параметров для надежного прогноза токсичности и опасности необходимо осуществлять с учетом определяющей стадии механизма токсического действия: для стабильных веществ (полигалогенированных бифенилов, азааренов) - параметры, характеризующие способность самих соединений связываться с биомолекулами-рецепторами, при биоактивации с образованием нестабильных интермедиатов (полициклические ароматические углеводороды, производные бензола, ароматические и алифатические амины) - параметры, характеризующие ключевую реакцию биотрансформации, приводящую к усилению эффекта, при биоактивации с образованием стабильных продуктов трансформации (галогенированнные алифатические углеводороды и спирты) - параметры, характеризующие реакционную способность этих метаболитов.

3. Использование теоретически обоснованных квантово-химических параметров для прогноза ЛД50, ПД, МИД в гигиенически значимых рядах производных бензола, ароматических аминов, галогенсодержащих алифатических углеводородов, спиртов, алифатических аминов позволило увеличить статистическую значимость уравнений регрессии (увеличение коэффициента корреляции и увеличение уровня достоверности до р<0,001) по сравнению с зависимостями «структура исходного вещества - активность» при уменьшении количества независимых переменных от трех-шести до одной-двух.

4. Поскольку для веществ, принадлежащих к структурному ряду, для которого не изучен механизм токсического действия, не может быть разработана физико-химическая модель, включающая дескрипторы, характеризующие процессы биотрансформации, а параметры хронической токсичности не являются статистически рассчитанными величинами и их распределение носит дискретный характер, постольку применение регрессионных уравнений «структура-биотрансформация-активность» для прогноза параметров токсикометрии не всегда оправдано.

5. На примере ПАУ, их метил и галогенпроизводных, галогензамещенных алканов и др. показано, что даже при ограниченном числе веществ в структурном ряду с известным механизмом токсического действия надежный прогноз наличия и степени выраженности отдаленных эффектов возможен при сочетании логико- комбинаторного метода порождения гипотез и квантово-химических параметров, характеризующих ключевую реакцию биотрансформации или ее продукты.

6. Классификация канцерогенной опасности веществ на высоко опасные, опасные, умеренно опасные и не канцерогенные, основанная на величине нижней 95% доверительной границы толерантной дозы для 10% лабораторных животных (крыс и мышей) при ежедневном введении per os в течение всей жизни, с учетом группы канцерогенности по МАИР и количества поражаемых органов, может использоваться для прогноза порядка величины безопасных уровней в воде веществ, обладающих канцерогенной активностью.

7. Автоматизированная комплексная система прогноза параметров токсичности и классов опасности веществ, загрязняющих воду, позволяет осуществить прогноз класса опасности по острой, хронической токсичности, канцерогенности, мутагенности, пороговых и недействующих доз, сделать предварительную оценку токсичности для целей планирования экспериментов по обоснованию допустимых суточных доз, определить сравнительную токсичность веществ при выборе наименее опасных технологий, выявить вещества, ПДК которых подлежат пересмотру. Система включает базу данных о токсичности и опасности 1800 веществ по 64 показателям, базу данных по канцерогенности 1500 веществ для лабораторных животных, программы для квантово-химических расчетов характеристик ключевых реакций биотрансформации, программу, реализующую логико-комбинаторный ДСМ-метод с учетом числовых параметров и программу регрессионного анализа.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1 .Жолдакова З.И., Журков B.C., Харчсвникова Н.В., Фельдт Е.Г. Герасимов И.В. Методические основы развития банка данных по эколого-гигиеническим свойствам химических веществ, загрязняющих окружающую среду.// Гигиена и санитария. - 1995. -№2, с.27-29.

2. Харчсвникова Н.В., Жолдакова З.И., Красовский Г.Н., Дьячков П.Н. Квантовохимическое моделирование биодеградации полихлорированных бифенилов.// Гигиена и санитария. - 1993. - №9, с.68-69.

3.Жолдакова З.И., Харчсвникова Н.В., Журков B.C. Соотношения структура-генотоксичность галогензамещенных производных пропана и метана для млекопитающих. // Гигиена и санитария. - 1997. - №1, с.33-35.

4. Харчсвникова Н.В., Жолдакова З.И. Соотношения структура-метгемоглобинобразующая активность в ряду ароматических аминов. // Гигиена и санитария. - 1997. - №3. - С. 41-43. .

5.Жолдакова З.И., Харчсвникова Н.В., Журков B.C., Новиков С.М., Полякова Е.Е. Соотношения структура-мутагенная активность на штамме ТА 100 Salmonella typhimurium в ряду галогенированных углеводородов и спиртов с короткой цепью// Генетика. - 1997. - Т. 33. - N5, с.710-713.

6.Жолдакова З.И., Харчсвникова Н.В., Журков B.C. Теоретическое обоснование связи структура-генотоксичность для млекопитающих и бактерий в ряду галогензамещенных алифатических соединений с короткой цепью. // Вестник Российской академии медицинских наук.- 1997,-№7, с.8-13.

7. Жолдакова З.И., Харчсвникова Н.В., Журков В.С.Теоретические подходы к прогнозу метаболизма и токсичности ароматических аминов.// Гигиена и санитария. - 1998. - №4, с.62-65.

8. Жолдакова З.И., Харчсвникова Н.В., Журков B.C., Синицына О.О. К обоснованию безвредных уровней для единого гигиенического нормирования веществ.//Гигиена и санитария - 2000,- №6, с. 51-54.

9. Маневич С.И., Харчевникова Н.В. Прогнозирование контрпродуктивных свойств химических соединений при комбинированном использовании структурных формул и численных энергетических параметров.// Научно-техническая информация. Серия 2. Информационные процессы и системы.-2000.-№5, с. 21-26.

10. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Прогноз опасности веществ в рамках зависимостей структура-активность с учетом биотрансформации.// Гигиена и санитария. -2000.-№ 1, с. 26-29.

11. Харчевникова Н.В., Блинова В.Г. Прогноз токсичности замещенных бензолов с помощью ДСМ-метода автоматического порождения гипотез и квантово-химических расчетов.// Химико-фармацевтический журнал.-2000. - №4, с.44-48.

12. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Механизмы процессов биоактивации чужеродных химических веществ под действием ферментных систем организма. Вестник Российской академии медицинских наук. - 2002. - № 8, с. 44-49.

13. Максин М.В., Харчевникова Н.В. Квантово-механический модуль системы, реализующей комбинаторно-численный подход к проблеме прогнозирования свойств химических соединений. Научно-техническая информация, серия 2. - 2002. - Вып.6, с.25-31.

14. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В.,Зайцев H.A., Полякова Е.Е., Лебедев А.Т Жолдакова З.И., Зайцев H.A., Полякова Е.Е., Лебедев А.Т Сравнительная опасность СОЗ, их заменителей и продуктов переработки с учетом эколого-гигиенических критериев опасности (стабильность, биоаккумуляция и трансформация)// Гигиена и санитария,- 2003.-№6, с.27-31.

15.Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Прогноз токсичности и опасности веществ по зависимости структура-биотрансформация-активность.// Российский химический журнал. -2004,- №2, с. 16-24.

16. Харчевникова Н.В. Система прогноза канцерогенное™, основанная на совместном использовании логических и численных методов.// Гигиена и санитария. - 2005. - №6, с . 2124.

17. Харчевникова Н.В., Дьячков П.Н., Бородина Ю.В., Дмитриев А.В. Квантовохимическая модель для прогноза положения гидроксилирования ароматических соединений под действием цитохрома Р450.// Биомедицинская химия,- 2005. -Т. 51. - № 3, с. 341-355.

18. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Использование квантово-химических методов в прогнозе канцерогенности веществ.// Вестник Российской академии медицинских наук. -2006.- №4, С.46-51.

19. Харчевникова Н.В., Блинова В.Г. Прогнозирование токсичности химических соединений посредством ДСМ-метода. //Научно-техническая информация. Серия 2. Информационные процессы и системы.. - 2007. -№12. - С. 10-15.

20. Харчевникова Н.В., Блинова В.Г., Добрынин Д.А., Федорова Н., Нович М., Врачко М. Интеллектуальный анализ канцерогенности химических соединений с помощью стратегий метода, основанного на логике Джона Стюарта Милля // Научно-техническая информация. Серия 2. Информационные процессы и системы. - 2009. - №11. - С.18-23.

21. Кузнецов С.О., Самохин М.В., Харчевникова Н.В. Прогнозирование контрпродуктивных свойств химических соединений на основе узорных структур: сравнительный анализ подходов. Часть 1. Научно-техническая информация, Серия 2. Информационные процессы и системы.- 2006,- №2, с. 1-8.

22. Кузнецов С.О., Самохин М.В., Харчевникова Н.В. Прогнозирование контрпродуктивных свойств химических соединений на основе узорных структур: сравнительный анализ подходов. Часть 2. Научно-техническая информация, Серия 2. Информационные процессы и системы. - 2006. - №3, с. 1-8.

В других изданиях:

23. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Количественная зависимость между структурой и активностью ксенобиотиков при их биотрансформации. Общая токсикология/Под ред. Б.А.Курляндского,В.А.Филова -М.:Медицина, 2002 г. - с.76-88.

24. Харчевникова Н.В., Блинова В.Г., Добрынин Д.А., Максин М.В., Жолдакова З.И. Применение ДСМ метода и квантовохимических расчетов для прогноза канцерогенности и хронической токсичности галогензамещенных алифатических углеводородов// Автоматическое порождение гипотез в интеллектуальных системах/под ред. В.Г. Финна -М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», 2009. - С.322-335.

25. Кузнецов С.О., Самохин М.В., Харчевникова Н.В. Прогнозирование контрпродуктивных свойств химических соединений на основе узорных структур: сравнительный анализ подходов.// Автоматическое порождение гипотез в интеллектуальных системах/под ред. В.Г. Финна - М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», 2009. - С.351-378.

26. Kharchevnikova N.V., Zholdakova Z.I., Krasovsky G.N., Dyachkov P.N. Theoretical study of the biodégradation of polychlorinated biphenyls. //Fresenius environmental bulletin. -1994. -Vol. 3. - N 7, p.422-427.

27. Borodina Y. V. Rudik A. V., Filimonov D. A. Dmitriev, A.V. BlinovaV.G., Kharchevnikova N.V., Poroikov V.V. A new statistical approach to predicting aromatic hydroxylation site. Comparison with model-based approaches.// J. Chemical Information and Computation Sciences, 2004,- V.44 . - P. 1998-2009.

28. D'yachkov P.N., Kharchevnikova N.V., Kuznetsov A.V., Dmitriev, A.V., Poroikov V.V. Quantum chemical simulation of cytochrome P450 catalyzed aromatic oxidation: Metabolism,

toxicity, and biodégradation of benzene derivatives. 11 International Journal of Quantum Chemistry.-2007. - Vol. 107. - № 13, p. 2454-247.

29. D'yachkov P.N., Kharchevnikova N.V., Zholdakova Z.I., Fjodorova N., Novich M., Vrachko M. Quantum Chemical Metabolism-Based Simulation of Carcinogenic Potency of Benzene Derivatives.//lnternational Journal of Quantum Chemistry.-2010. - Vol. 110. - P. 14021411.

30. Харчевникова H.B., Максин M.В., Добрынин Д А., Жолдакова З.И. Прогноз канцерогенное™ полициклических углеводородов с использованием автоматизированной системы, основанной на совмещении квантово-химических расчетов и логико-комбинаторного ДСМ-метода. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды/ Под ред. Ю.А.Рахманина - М., 2002.

31. Харчевникова Н.В., Жолдакова З.И. Сравнительная оценка методов прогноза канцерогенной активности полициклических ароматических углеводородов и их производных./ /Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды. / Под. ред. Ю.А.Рахманина. - Москва, 2005. - С.79-97.

32. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В., Кустова Е.В., Синицына О.О. Прогноз токсичности и опасности в проблеме единого эколого-гигиенического нормирования веществ в окружающей среде. // Экология человека. - 1996. - № 3, с. 16-21.

33. Харчевникова Н.В., Дьячков П.Н. Изучение токсического действия полигалогенированных бифенилов в рамках метода МО JIKAO и оксеноидной модели. X Всесоюзное совещание по квантовой химии Тезисы докладов. Казань, 1991 г., с. 167.

34. Г.Н.Красовский Г.Н., Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В., Герасимов И.В., Воронин

B.М. Методологические основы развития банка данных по токсичности о опасности веществ в воде Материалы международной конференции "Безопасность окружающей среды: медицинские, экологические и правовые аспекты", Пермь, 22-24 сентября 1992 г..- Пермь, 1992. - С.12-14.

35. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Зависимости структура-активность с учетом биотрансформации ксенобиотиков в организме. I Съезд токсикологов. Тезисы докладов. -Москва, 17-20 ноября 1998 г. -М.,1998. - С.123.

36. Kharchevnikova N.V. Theoretical Approaches to the Prognosis of Metabolism and Toxicity of Aromatic Amines. - 12th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships "Molecular Modeling and Prediction of Bioactivity". - Copenhagen, Denmark, August23-28, 1998,- Copenhagen, 1998.-P. 149.

37. Zholdakova Z.I., Kharchevnikova N.V. Theoretical Approaches to the Prognosis of Toxicity of Aromatic Amines.- 2-nd V.A.Fock All-Russian School (conference) on Quantum and Computation Chemistry. Abstracts of KBX 2000, 31 January - 4 February 2000, - Novgorod the Great. - P.41.

38. Zholdakova Z.I., Kharchevnikova N.V. Prediction of the Hazard of Chemicals with Regard to Metabolism.- Toxicology Letters, Sup. 1/116, 2000. - Abstracts of EUROTOX 2000, 1720 September 2000, London. - London, 2000. - P. 17.

39. Харчевникова H.B., Жолдакова З.И. Теоретическое изучение метгемоглобинобразования под действием ароматических аминов: роль катион-радикалов метаболитов N-фенилгидроксиламинов. Тезисы XVIII Всероссийского симпозиума по химической кинетике. - Московская обл., 14-18 февраля 2000 г.- М., 2000. - С.58.

40. Харчевникова Н.В., Жолдакова З.И., Журков B.C. Изучение связи механизмов биотрансформации и генотоксичности галогенсодержащих алифатических соединений методами квантовой химии. Второй (четвертый) Российский съезд медицинских генетиков, г.Курск, 17-19 мая 2000 г., - Курск, 2000. - С.352.

41. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Критерии и принципы пересмотра ПДК веществ в объектах окружающей среды. Тезисы докладов 4-го Международного Конгресса «Вода: экология и технология. ЭКВАТЕК-2000», Москва, 30 мая - 2 июня 2000 г.- М., 2000,.-

C. 749.

42. Жолдакова З.И., Синицына О.О., Харчевникова Н.В. Методические основы коррекции пороговых и безвредных уровней химических веществ при комплексном нормировании и оценке риска.// Оценка риска влияния факторов окружающей среды на здоровье: проблемы и пути их решения: Материалы пленума Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ, Москва, 20-21 декабря 2001 г.-М.,2001.-С. 53-55.

43. Жолдакова З.И., Синицына О.О., Харчевникова Н.В. Научные основы единого эколого-гигиенического нормирования химических веществ в окружающей среде.// Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды./ Под ред. Ю.А.Рахманина. - М., 2001. - С. 104-121.

44. Kharchevnikova N.V.,.Zholdakova Z.I Prediction of the Hazard and the Mode of Toxic Action in the Series of Aliphatic and Aromatic Amines. Toxicology Letters, 2002, Vol.135, Suppl. 1, Abstracts of EUROTOX 2002. - P. 167.

45. Харчевникова H.B., Максин M.B., Добрынин Д.А, Жолдакова З.И. Прогноз канцерогенности полициклических углеводородов с использованием автоматизированной системы, основанной на совмещении квантовохимических расчетов и логико-комбинаторного ДСМ-метода. //Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды./ Под ред. Ю.А.Рахманина - М., 2002.

46. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В., Максин М.В. Система прогноза токсичности и опасности химических веществ, основанная на совместном использовании методов вычислительной химии и логико-комбинаторного анализа. Тезисы докладов 2-го Съезда токсикологов России. Москва, 10-13 ноября 2003 г.- М.: Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Минздрава России. 2003,- С. 279-280.

47. Рудик A.B., Бородина Ю.В., Дмитриев A.B., Филимонов Д.А., Харчевникова Н.В. Поройков В.В., Блинова В.Г Компьютерный прогноз биотрансформации по структуре химических соединений.// Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 19 - 23 апреля 2004 г.. - М., 2004. - С. 891.

48. Харчевникова Н.В., Жолдакова З.И. Прогноз канцерогенности полициклических ароматических углеводородов с использованием версии логико-комбинаторной ДСМ системы. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы оценки риска здоровью населения России от воздействия факторов окружающей среды", 20-22 октября 2004 г., г. Москва - С. 212-215.

49. Харчевникова Н.В., Жолдакова З.И. Сравнительная оценка методов прогноза канцерогенной активности полициклических ароматических углеводородов и их производных.// Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды./ Под ред. Ю.А.Рахманина, Москва, 2005 , с.79-97.

50. Харчевникова Н.В., Жолдакова З.И. Соотношение между генотоксичностью, промоторной активностью, определяющейся связыванием с AHR-рецептором, и квантово-химическими параметрами в ряду полициклических ароматических углеводородов. Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки: Материалы Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ, Москва, 22-23 декабря 2005 г. - М., 2005. - С.299-301.

51. Дмитриев A.B., Харчевникова Н.В., Рудик A.B., Поройков В.В. Разработка метода для предсказания региоселективности изоформы ЗА4 цитохрома Р450. Материалы XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 12-16 апреля 2005 г. -М., 2005. - С. 750.

52. Kharchevnikova N., Zholdakova Z., Maksin M., Samohin M., Kuznetsov S. Prediction of the chronic toxicity and carcinogenicity in the series of halogenated aliphatic hydrocarbons using logical-combinatorial and quantum-chemical methods.// SETAC Europe 17th Annual Meeting, 2024 May 2007, Porto, Portugal. - Abstract Book. - Porto, 2007. - P. 139.

53. D'yachkov P.N., Kharchevnikova N.V., Dmitriev A.V., Kuznetsov A.V., Poroikov V.V. Quantum chemical simulation of cytochrome P450 catalyzed aromatic oxidation: Metabolism, toxicity, and biodégradation of benzene derivatives.// Materials of Fourth International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources" (CMTPI-2007), Moscow (Russia), September 1-5, 2007. - Moscow. - 2007. - p. 93.

54. Харчевникова H.B., Жолдакова З.И. «Прогноз токсичности галогензамещенных полициклических ароматических углеводородов.// Сборник материалов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 14-18 апреля 2008 г.- М., 2008.- С. 758.

55. Харчевникова Н.В. Прогноз токсичности и канцерогенное™ химических веществ с использованием ДСМ метода автоматического порождения гипотез и квантовохимических расчетов//Вестник Российской Военно-медицинской Академии,- 2008.- №3(23). Приложение I. Материалы Второго Санкт-Петербургского международного экологического форума, 1-4 июля 2008, Санкт-Петербург. - С. 152.

56. Kharchevnikova N.V., Zholdakova Z.I. Prediction of aryl hydrocarbon receptor (AHR) binding affinity for PAHs, azaarenes and their halogenated derivatives.// Materials of 1 lIh Seminar "New Trends in chemical toxicology", Scientific Advisory Committee of the International Science and Technology Center (ISTC), 22-25 September 2008, Moscow. - P.61.

57. Dyachkov P.N., Kharchevnikova N.V., Zholdakova Z.I., Fjodorova N., Novich M., and Vrachko M. Quantum chemical simulation of cytochrome P450 catalyzed oxidation and carcinogenic potency of benzene derivatives. Materials of 1 llh Seminar "New Trends in chemical toxicology", Scientific Advisory Committee of the International Science and Technology Center (ISTC), 22-25 September 2008, Moscow. - P.26.

58. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Прогноз безопасных уровней канцерогенов в воде на основе классификации канцерогенной опасности.// III Съезд токсикологов. Тезисы докладов. - Москва, 2-5 декабря 2008 г. - М.,2008. - С.118-119.

59. Дьячков П.Н., Харчевникова Н.В., Федорова Н., Нович М., Врачко М. Зависимость канцерогенности замещенных бензолов от природы заместителей// Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 6-10 апреля 2009 года,- М., 2009. - С. 623.

60. Харчевникова Н.В., Блинова В.Г., Добрынин Д.А., Федорова Н., Нович М., Врачко М. «Интеллектуальный анализ канцерогенности химических соединений с помощью стратегий метода, основанного на логике Джона Стюарта Милля» // Сборник материалов (тезисы докладов) XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 12-16 апреля 2010 г. - M., 2010. - С. 738.

61. Харчевникова Н.В., Жолдакова З.И. Модель для прогноза канцерогенности производных бензола на основе квантово-химического рассмотрения.// Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей среды в целях сохранения здоровья человека: Материалы объединенного пленума научных советов Российской Федерации по экологии человека и гигиене окружающей среды и по медико-экологическим проблемам здоровья работающих, Москва, 15-16 декабря 2010 г. - М., 2010. - С.197-199.

62. Жолдакова З.И., Харчевникова Н.В. Классификация для прогноза порядка величины безопасных уровней в воде веществ по канцерогенному эффекту. // Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей среды в целях сохранения здоровья человека: Материалы объединенного пленума научных советов Российской Федерации по экологии человека и гигиене окружающей среды и по медико-экологическим проблемам здоровья работающих, Москва, 15-16 декабря 2010 г. - М., 2010. - С.90-91.

Список использованных сокращений.

КССА-количественные соотношения структура-активность;

ПД, МНД - пороговая, максимальная недействующая доза при поступлении вещества

с водой;

LD50 - среднесмертельная доза вещества;

NOAEL - уровень не обнаруживаемого вредного эффекта;

RfD - референтная доза (US ЕРА);

МАИР -международное агентство по изучению рака;

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды;

ГСС - галогенсодержащие соединения;

ЕВзмо- высшая заполненная молекулярная орбиталь;

Ецсмо - нижняя свободная молекулярная орбиталь;

Erp - разность граничных орбиталей, энергетическая щель, определяется как

-(Евзмо - Ецсмо);

ДЕт1П - для замещенного бензола минимальная разность энергий ареноксидных интермедиатов и исходного соединения;

ДЕКатион, - разность энергий триолкарбокатиона и диолэпоксида ПАУ, рассчитанная методом Хюккеля;

ДЕСС - тот же параметр, рассчитанный полуэмпирическим методом с полной оптимизацией геометрии;

Л(ДН() - разность теплот образования продукта реакции (интермедиата, радикала) и исходного соединения

ДН# -энтальпия активации реакции

TD50- доза, соответствующая вероятности образования злокачественных опухолей у 50% животных с учетом образования опухолей у контрольных животных, при ежедневном введении в течение всей жизни животных

LTD jo - нижний 95%-ный доверительный уровень дозы, соответствующей вероятности образования злокачественных опухолей у 10% животных, с учетом образования опухолей у контрольных животных, при ежедневном введении в течение всей жизни животных.

ДСМ- Джон Стюарт Милль, метод ДСМ основан на логике, разработанной этим ученым.

Заказ № 05-П/05/2011 Подписано в печать 03.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,5

- ч\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

) I www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru