Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Научное обоснование механизма развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на основе молекулярно-генетических исследований

На правах рукописи

004618583

ЗВЕРЕВ СЕРГЕЙ ЯКОВЛЕВИЧ

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА РАЗВИТИЯ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.02.02 - Эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

16 т 7П1о

Пермь 2010

004618583

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

Бобков Алексей Филиппович \- доктор биологических наук, профессор НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва Фельдблюм Ирина Викторовна - доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», г. Пермь

Официальные оппоненты:

Слободенюк Александр Владимирович - доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», г. Екатеринбург

Зверев Виталий Васильевич - доктор биологических наук, профессор, академик РАМН, директор НИИ вакцин и сывороток РАМН, г. Москва Мартынов Юрий Васильевич - доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет», г. Москва

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Москва

Защита диссертации состоится «22» декабря 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.067.04 при ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26.

Автореферат разослан «/^» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Сандакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Успешная борьба с любой инфекционной патологией, в том числе и с ВИЧ-инфекцией, во многом определяется правильностью эпидемиологической диагностики с выявлением факторов, детерминирующих заболеваемость. Одним из ведущих факторов развития эпидемического процесса является биологический, представленный взаимодействием популяций микро- и макроорганизмов. Этот фактор в основном и определяет внутренние механизмы развития инфекционной заболеваемости [Беляков В.Д., 1983]. Достижения в области молекулярно-генетических методов исследований применительно к нуждам эпидемиологии позволили получить более полные характеристики популяций паразита и хозяина, изучить особенности их взаимодействия, улучшить эпидемиологическую диагностику, включая дифференциацию путей передачи возбудителя инфекции [Ряпис Л.А. с соавт., 2003; Яковлев А.А. с соавт., 2003; Фролов А.Ф., 2005; Марьяндышев А.О. с соавт., 2007]. Такого рода исследования проведены в эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов, инфекции НТЬУ-1/2 [Бобкова М.Р., 2002], клещевого энцефалита [Злобин В.И. с соавт., 2007], энтеровирусных инфекций [Лукашев А.Н. с соавт., 2008]. Активно проводятся молекулярно-ге-нетические исследования и при ВИЧ-инфекции.

Многочисленными исследованиями различных авторов установлено, что среди лиц, инфицированных ВИЧ-1, основным фактором риска заражения которых являлось внутривенное употребление наркотиков, в России, большинстве республик бывшего СССР и многих странах Восточной Европы в основном циркулируют вирусы трех разных подтипов, но наиболее широкое распространение получил вариант ВИЧ-1 подтипа А [Бобков А.Ф. с соавт., 1998, 1999, 2000; 1лр-шасИ А. е1 а1., 1997; ЬикаэЬоу УУ & а1„ 1998, 1999; ИаЬаЮу А.А. й а1., 2002; Бобкова М.Р. 2002; КигЬапоу Б. е! а1., 2003; Ханина Т.А., 2003; ВоЫсоу А. а1., 2004; Казеннова Е.В., 2005; Гришечкин А.Е. с соавт., 2006; Казеннова Е.В. с соавт., 2008].

Однако в недавних работах [ЯоисНпзки N. й а1., 2004; Суханова А.Л. с соавт., 2005] было продемонстрировано, что популяция вирусов подтипа А, циркулирующих на территории России, гетерогенна:

широкое распространение получили варианты ВИЧ-1, содержащие характеристические замены в 77-м кодоне (V77I) протеазы и в 62-м положении обратной транскриптазы (A62V). Эти замены были описаны в литературе как вторичные мутации устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам ферментов, применяющихся для высокоактивной антиретрови-русной терапии [Shirasaka Т. et al., 1995; Iversen А.К. et al., 1996].

Существующие литературные данные демонстрируют распространение [Ладная Н.Н., 2000; Бобков А.Ф. с соавт., 2001; Казенно-ва Е.В. с соавт., 2004; Троценко О.Е., 2005; Гришечкин А.Е. с соавт., 2006; Турбина Г.И. с соавт., 2007] и генетическую изменчивость [Бобкова М.Р., 2002; Ханина Т.А., 2003; Казеннова Е.В., 2005] подтипов ВИЧ-1 на территории России в целом или в отдельных субъектах Российской Федерации в определенные периоды времени. Детального же изучения распространения вариантов ВИЧ-1 среди инфицированных лиц и изучения их динамической генетической изменчивости на различных этапах развития эпидемического процесса с момента регистрации первого случая заболевания в сопоставлении с характером проявлений эпидемического процесса не проводилось, хотя этот вопрос представляет несомненный научно-практический интерес.

Начиная с 1996 года в литературе стали появляться сообщения об устойчивости некоторых людей к заражению ВИЧ-1, обусловленной их генетическими особенностями. Приводились данные, что мутации в генах различных хемокиновых рецепторов, используемых вирусом в качестве корецепторов при проникновении в клетку, влияют на вероятность заражения. Первой обнаруженной мутацией была делеция в гене CCR5. Установлено, что люди, гомозиготные по этой делеции, обладают повышенной устойчивостью к заражению ВИЧ-1 [Dean М. et al., 1996; Liu R. et al., 1996]. Позднее появились сообщения о других мутациях, потенциально способных влиять на вероятность заражения. Однако данные о возможной роли большинства мутаций в инфицировании ВИЧ-1 (за исключением мутации в гене CCR5) носят противоречивый характер, а связь между сочетаниями мутаций в разных генах хемокиновых рецепторов и возможностью инфицирования ВИЧ-1 изучена недостаточно. Кроме того, как правило, все включенные в исследования пациенты 4

были инфицированы подтипом В ВИЧ-1 либо в результате половых контактов, либо через контаминированную вирусом донорскую кровь или ее компоненты [Wilkinson D.A. et al., 1998; Salkovitz J.R. et al., 2001]. В связи с этим представляло интерес выяснить возможное влияние мутаций в генах хемокиновой системы или их сочетаний на вероятность заражения лиц, практикующих внутривенное применение психоактивных веществ, наиболее распространенным в России подтипом А ВИЧ-1.

В качестве психотропных веществ, используемых потребителями инъекционных наркотиков (ПИН), на территории России в основном используются героин и получаемый кустарным способом жидкий опийсодержащий экстракт маковой соломки (так называемая «ханка»). Вероятность заражения ВИЧ-1 наркопотребителей при использовании этих веществ существует при условии использования общих шприцев или игл, в которых остаются небольшие количества крови, а также при применении общей емкости для их промывания, что достаточно часто встречается в практике наркопотребления среди ПИН [Покровский В.В., Савченко И. А., 1998]. Кроме того, нередки ситуации, когда наркопотребители контролируют качество готового для инъекционного использования психотропного вещества по отсутствию гемолиза добавленной в него цельной крови. При условии попадания в кустарно изготовленный препарат крови инфицированного раствор наркотика становится контаминированным ВИЧ. Однако практически не изучено, как влияют готовые для инъекционного введения героин и «ханка» на инфекционность вируса, как долго они сохраняют ее и как в этих условиях реализуется механизм заражения.

В связи с вышеизложенным представляет несомненный интерес изучение проявлений эпидемического процесса ВИЧ-инфекции во взаимосвязи с его биологическим фактором с использованием мо-лекулярно-генетических методов исследований.

Цель работы - обосновать механизм развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на основе молекулярно-генетических данных по характеристике его паразитарной системы и дать рекомендации по оптимизации системы эпидемиологического надзора.

Задачи исследования

1. Изучить проявления эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края за 1988-2008 гг.

2. Определить подтипы вариантов ВИЧ-1, выделенных на территории Пермского края в различные периоды развития эпидемического процесса и в разных группах риска инфицирования. Изучить их генетическую изменчивость в области C2-V3 gpl20 гена env.

3. Изучить риск инфицирования подтипом IDU-A ВИЧ-1 лиц, практикующих внутривенное введение психоактивных веществ, в зависимости от мутаций генов хемокиновых рецепторов CCR 5, CCR 2 и их сочетаний.

4. Выявить основные факторы риска, способствующие заражению при внутривенном употреблении психоактивных веществ. Изучить действие растворов героина и «ханки» на инфекционность ВИЧ-1, исследовать их влияние на размножение вируса в условиях in vitro.

5. Оценить возможность использования молекулярно-генети-ческих исследований по определению подтипа вируса для слежения за развитием эпидемического процесса на территории и расшифровки отдельных эпидемических очагов ВИЧ-инфекции.

6. Обосновать механизм развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции и оценить значение молекулярно-генетических исследований в системе эпидемиологического надзора. Дать рекомендации по совершенствованию эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

Научная новизна

Впервые проведен анализ проявлений эпидемического процесса ВИЧ-инфекции в многолетней динамике в сопоставлении с генетической характеристикой возбудителя инфекции. Получены приоритетные данные о распространении генетических вариантов ВИЧ-1 в отдельно взятом субъекте Российской Федерации на протяжении 20-летнего периода при различных типах эпидемического процесса.

Впервые изучена паразитарная система эпидемического процесса ВИЧ-инфекции, его биологический фактор: популяции микроорганизма и макроорганизма во взаимодействии друг с другом. На основании данных молекулярно-генетических исследований по выявлению мутаций или их сочетаний в генах хемокиновых рецепторов CCR5 6

и СС112 установлен риск инфицирования вирусом иммунодефицита человека 1-го типа потребителей инъекционных наркотиков.

Впервые получены данные о влиянии вида наркотического средства, используемого внутривенно потребителями психоактивных веществ, на механизм заражения при ВИЧ-инфекции. Доказано сохранение инфекционности вируса в растворах героина и «ханки» в течение длительного времени.

Впервые показана возможность использования данных молеку-лярно-генетических исследований по определению вторичных мутаций устойчивости вируса в качестве дополнительного объективного инструмента в эпидемиологической диагностике при обследовании эпидемических очагов ВИЧ-инфекции.

Научно-практическая значимость работы

Разработанные подходы и полученные данные позволят оптимизировать систему эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

Для оптимизации информационной подсистемы рекомендовано внедрить молекулярно-генетический мониторинг с целью слежения за циркулирующими вариантами ВИЧ-1 и изучения динамики их генетической изменчивости, для оценки устойчивости популяции к инфицированию.

Для повышения качества эпидемиологической диагностики в рамках диагностической подсистемы рекомендовано использовать результаты молекулярно-генетического мониторинга при работе в очагах ВИЧ-инфекции для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очагов.

Определение ро1-генотипа вируса по наличию/отсутствию мутаций У77—>1/А62—»-V у лиц, инфицированных подтипом ГОи-А ВИЧ-1, дает дополнительную объективную информацию, позволяющую осуществлять качественную эпидемиологическую диагностику в очагах инфекции.

Полученные результаты о длительном сохранении инфекционных свойств ВИЧ-1 в растворах героина и «ханки» могут быть использованы для информационно-просветительской работы среди населения, особенно среди потребителей инъекционных наркотиков.

Положения, выносимые на защиту

1. Развитие эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края в 1988-2008 гг. было обусловлено преимущественной циркуляцией на территории варианта вируса с генотипом gagA/envA (ГОИ-А) ВИЧ-1. Заражение этим вариантом происходило при реализации парентерального, гетеросексуального и вертикального путей передачи, за исключением полового в популяции мужчин, имеющих секс с мужчинами. Генетическая изменчивость области С2-УЗ §р120 гена епу вирусов этого варианта была различной в отдельные периоды развития эпидемического процесса, характеризующегося разной интенсивностью.

2. На риск инфицирования ВИЧ-1 варианта Ши-А подтипа А при парентеральном пути передачи среди потребителей инъекционных наркотиков оказывают влияние гомозиготное состояние аллеля СС115Д32 и сочетание мутантных аллелей СС115Д32 и СС112-641 в гетерозиготном состоянии на фоне полиморфного варианта ССЯ5-59029А/ССЯ5-59029А.

3. Интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции среди потребителей инъекционных наркотиков зависит от вида используемого ими психоактивного вещества и определяется различным влиянием кустарно приготовленных героина и «ханки» на инфекци-онность и репликацию ВИЧ-1.

4. Использование молекулярно-генетических методов исследования для изучения биологического фактора эпидемического процесса в системе эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией позволяет оптимизировать эпидемиологическую диагностику в части слежения за ходом развития эпидемического процесса на территории (дифференциация завозных случаев) и расшифровки эпидемических очагов с определением источника возбудителя инфекции, путей и факторов инфицирования и уровня восприимчивости контактных лиц.

Внедрение в практику. Результаты исследований внедрены в практику работы ГУЗ «Пермский краевой Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями».

Материалы исследований использовались при разработке методических рекомендаций «Новые технологии в организации эпидемио-

логического надзора за ВИЧ-инфекцией в условиях наркозависимого типа эпидемического процесса» (Ч. 2. - Пермь, 2002. - 38 е.), которые были внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений Пермского края.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами и интернами на кафедре эпидемиологии, а также включены в программы последипломного образования врачей-эпидемиологов на ФПК и ППС ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава.

Апробация работы и публикации

Диссертационная работа апробирована на заседании научного координационного совета по проблемам общественного здоровья и санитарно-эпидемиологического обеспечения населения ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на научно-практической конференции «ВИЧ-инфекция и вирусные гепатиты с парентеральным механизмом заражения: эпидемиология, профилактика, диагностика, клиника, лечение» (Суздаль, 2001); научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции/СПИДа в Приволжском федеральном округе» (Ижевск, 2003); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); научной сессии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е.А. Вагнера (2007); заседании Пермского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2007). Результаты работы были представлены на XIII, XIV, XV и XVI Международных конференциях по СПИДу в Дурбане (2000), Барселоне (2002), Бангкоке (2004) и Торонто (2006), а также на VIII и X Европейских конференциях по клиническим аспектам и лечению ВИЧ-инфекции в Афинах (2001) и Дублине (2005).

По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 12 в журналах, включенных в перечень рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата медицинских наук.

Личный вклад автора. Участие автора заключалось в генерации идеи исследования, формировании цели и задач. Самостоятельно проведены лабораторные исследования, анализ и интерпретация полученных результатов

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 286 наименований, в том числе 60 отечественных и 226 зарубежных авторов. Работа содержит 21 таблицу, иллюстрирована 35 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Исследование проведено на базе кафедры эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФПК и ППС ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Росздрава» и Государственного учреждения здравоохранения «Пермский краевой Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями». Работа выполнена с использованием эпидемиологических (описательно-оценочных, аналитических, экспериментальных), серологических, молекулярно-генетических и статистических методов исследования.

Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости ВИЧ-инфекцией за 1988-2008 гг. проведен по данным официальной регистрации и базы данных персонифицированного учета ВИЧ-инфицированных ГУЗ «ПКЦ СПИД и ИЗ». В многолетней динамике изучены интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции в различных половозрастных и социальных группах населения. Оценка путей заражения ВИЧ населения Пермского края проведена на основании анализа 7 772 карт эпидемиологического обследования очагов ВИЧ-инфекции с расчетом экстенсивных (доля в структуре путей передачи) и интенсивных (частота реализации) показателей. 10

Изучение влияния героина и «ханки» на инфекционность и реп-ликативные свойства ВИЧ-1 проведено в условиях эксперимента с использованием Т-клеточной линии человека МТ-4 и лабораторного штамма вируса ВИЧ-1/ШВ. Растворы героина, «ханки» или дистиллированной воды смешивали с равным объемом культуральной жидкости, содержащей вирус (107,3 ИД50/МЛ). Через определенные интервалы времени отбирали аликвоты и выявляли в них титр вируса методом конечных разведений. Для определения влияния психотропных веществ на размножение ВИЧ-1 клетки инкубировали с вирусом, затем добавляли раствор психотропного вещества. Через определенные промежутки времени клетки осаждали, отбирали над осадочную жидкость и выявляли в ней титр вируса методом конечных разведений. Эксперименты по изучению влияния героина и «ханки» на инфекционность и репликативные свойства ВИЧ-1 проводились совместно с доктором биологических наук JI.M. Селимовой.

Для определения подтипов ВИЧ-1, циркулирующих в различные периоды развития эпидемического процесса и в разных группах риска инфицирования, были получены образцы крови у 2 430 инфицированных пациентов с их информированного согласия. Установление подтипа вируса проводилось несколькими методами.

Серологические исследования у лиц, употреблявших наркотики внутривенно, для определения подтипов envA и envB проводились методом ИФА с использованием подтипспецифических пептидов, гомологичных основному нейтрализующему эпитопу gpl20 ВИЧ-1 -PI (RKSIHIGPGRAFYATGD), реагирующего с сыворотками инфицированных подтипом В, и Р2 (RTSVRIGPGQVFYKTGD), реагирующего с сыворотками, полученными от пациентов, инфицированных вариантами вируса подтипа A [Cheingsong-Popov R., et al., 1994].

При использовании молекулярно-генетических методов для определения подтипов ВИЧ-1 по генам gag и env проводили гнездовой вариант ПЦР с последующим анализом амплифицированных фрагментов провирусной ДНК методом сравнительной оценки электрофоре-тической подвижности гетеродуплексов (heteroduplex mobility assay, НМА). Для амплификации области гена env ВИЧ-1, кодирующей gpl20, использовали две пары праймеров: ED3/ED14 и ES7/ES8 для первого и второго раундов соответственно [Delwart Е. et al., 1993].

Фрагменты ДНК, соответствующие области гена gag, амплифици-ровали с использованием праймеров HIG777/HIP202 и HIgagl584/gl7 для первого и второго раундов соответственно (Heyndrickx L. et al., 2000).

Оценку результатов НМА проводили, сравнивая электрофорети-ческую подвижность гетеродуплексов, образованных в результате отжига амплифицированных фрагментов анализируемого образца, с продуктами ПЦР стандартов (референс-штаммов) ВИЧ-1 подтипов А-Н [Delwart Е. et al., 1993; Heyndrickx L. et al., 2000]. Степень генетического родства молекул ДНК, участвующих в гибридизации, оценивали по расстоянию от старта (подвижности) гетеродуплексов.

Кроме того, для определения подтипов gagA и gagB ВИЧ-1, циркулирующих в популяции ПИН, использовали метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (restriction fragments length polymorphism, RFLP). Вариантом этого метода является гидролиз предварительно амплифицированного фрагмента провирусной ДНК энодо-нуклеазами HincII и Dral. Фрагменты ДНК гена gag амплифицирова-ли с использованием праймеров G1/G2 и G3/G4 для первого и второго раундов соответственно. В последовательности области gag вариантов ВИЧ-1 подтипа В, выделенных от ПИН в России, обнаружен сайт для эндонуклеазы HincII, гидролизующий его на два фрагмента размером 95 и 340 пар нуклеотидов. Данный сайт отсутствует в анализируемой области у вариантов ВИЧ-1 gagB, циркулирующих среди наркоманов Западной Европы и мужчин, имеющих секс с мужчинами (man who have sex with man, MSM). Аналогичный сайт есть и в последовательности той же области gag вариантов ВИЧ-1 подтипа А, но в другой позиции, и при гидролизе этим ферментом образуются фрагменты 129 и 306 пар нуклеотидов. Кроме того, у вирусов с генотипом gagBenvB в gag-фрагменте имеется сайт нарезания для фермента/Зга/, отсутствующий у вариантов gagA ВИЧ-1.

Для выявления мутаций гена pol фрагменты ДНК, соответствующие области, кодирующей протеазу, и области, кодирующей обратную транскриптазу (ОТ), амплифицировали гнездовым методом ПЦР и анализировали методом RFLP. При амплификации области, кодирующей протеазу, использовали праймеры #F2217/#R2569 и #F2249/#R2564 для первого и второго раундов соответственно. Амплификация кодирующей ОТ области проведена с праймерами #F2484/#R3027 и #F2593/#R2923 [Суханова А.Л., 2006]. 12

Выявление мутации V77—>1 в протеазе проводили гидролизом амплифицированного фрагмента эндонуклеазой Vsp I. При наличии мутации происходило специфическое нарезание амплифицированного фрагмента размером 3 16 пар нуклеотидов (п.н.) на фрагменты 230 п.н. и 86 п.н.

Для обнаружения мутации А62—>V в ОТ использовали эндонуклеазу Psi I, которая при наличии анализируемой мутации гидролизовала ам-плифицируемый фрагмент размером 331 п.н. на фрагменты 144 и 187 п.н.

Генетическую изменчивость области C2-V3 гена env изучали путем определения нуклеотидных последовательностей указанной области генома непосредственно после амплификации с последующим проведением филогенетического анализа. Для определения последовательностей обеих цепей ДНК использовали коммерческий набор dRhodamin Terminator Cycle Sequecing Kit (Perkin Elmer, Великобритания) и автоматический секвенатор ABI Prism 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Великобритания). Нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью программ Editview 1.0.1 (Macintosh,США) и Chromas 1.45. Для дальнейшего сравнения 5'-»3' и 3'—>5' последовательностей, построения алайнментов использовали программу BioEdit 7.0.1.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью метода «ближайших соседей». Достоверность установленных филогенетических связей оценивали методом «bootstrap» при 100 независимых построениях каждого филогенетического древа. Генетические дистанции между нуклеотидными последовательностями рассчитывали по двухпараметрическому методу Kimura [Kimura M., 1980] и умножали на коэффициент 100. Все операции производили с использованием программы MEGA 3.1 (Arizona State University, CHIA).

Оценка риска инфицирования ВИЧ-1 потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) проведена в исследовании «случай-контроль» во время вспышки в г. Лысьве на группе лиц, имеющих одинаковые условия для заражения. Группу «случай» (п=75) составили ПИН, подвергавшиеся частой экспозиции к вирусу вследствие достоверно известного совместного внутривенного употребления наркотиков с инфицированными пациентами, но оставшиеся неинфицированны-ми ВИЧ. Две контрольные группы составили ВИЧ-инфицированные

13

ПИН, имеющие одинаковые факторы риска заражения с пациентами группы «случай» (п=114) и не подвергавшиеся риску заражения здоровые доноры крови (п=186). Для всех групп были определены ал-лельные состояния мутаций CCR5A32, CCR2-64I и полиморфизма CCR5-59029A/G.

Детекция мутации CCR5A32 проводилась методом ПЦР. Присутствие мутантного аллеля оценивали по появлению меньшего фрагмента, размером 157 п.н., который выявлялся либо одновременно с фрагментом дикого типа (гетерозиготное состояние аллеля), либо без него (гомозиготное состояние).

В случае мутации CCR2-64I и полиморфизма CCR5-59029A/G, представляющих собой точечную замену одного нуклеотида на другой, полученные фрагменты ПЦР подвергались гидролизу специфическими эндонуклеазами, вносящими и не вносящими разрыв в зависимости от наличия/отсутствия замены. В случае мутации CCR2-64I использовалась эндонуклеаза Fok I, а полиморфизма CCR5-59029A/G - Mh I*.

Все исследования влияния героина и «ханки» на инфекционность и репликативные свойства ВИЧ-1, определения подтипов вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди инфицированных лиц Пермского края, их генетической изменчивости и выявления мутаций генов хемокино-вых рецепторов проведены в лаборатории вирусов лейкозов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ «Basic Statistics» и «Nonparametric Statistics» из пакета STATISTICA (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Первую программу использовали при описании массивов количественных данных (для расчета среднего значения, медианы распределения, стандартного отклонения). Вторая программа применялась для определения статистической достоверности полученных отличий. Для оценки использовались критерий Колмогорова-Смирнова, t-критерий Стьюдента, од-

*

Результаты исследований анализа состояния аллелей генов, детерминирующих восприимчивость к ВИЧ-1, в геноме человека были получены в сотрудничестве с кандидатом биологических наук Г.С. Рябовым, у которого соискатель был научным руководителем диссертационной работы. 14

носторонний критерий Фишера. Критический уровень значимости нулевой гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты и их обсуждение. В процессе ретроспективного эпидемиологического анализа заболеваемости ВИЧ-инфекцией в Пермском крае, проведенного за 20 лет, начиная с первого, зарегистрированного в 1988 году случая, выделено четыре периода, отличающихся особенностями динамики, половозрастного распределения, спецификой путей передачи и генетической характеристикой вирусов, циркулирующих среди инфицированных.

В течение первого периода (1988-1996 гг.) регистрируемая заболеваемость была спорадической, ВИЧ-инфекция была выявлена лишь у 7 граждан России (рис. 1.).

------.-• ™ " " ™ ™ ™ " о

1988 1989 1993 1994 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Годы

Рис. 1. Многолетняя динамика заболеваемости ВИЧ-инфекцией в Пермском крае (1988-2008 гг.)

Заражение в этот период происходило в основном половым (как гетеро-, так и гомосексуальным) путем. Из 7 выявленных случаев 6 были завозными и лишь 1 - внутритерриториального распространения. Вирусы, которыми были инфицированы эти пациенты, относились к подтипам В, Б и в ВИЧ-1. Высокий уровень генетических различий области С2-УЗ яр 120 гена ет был выявлен у вирусов подтипов В и в, которыми были инфицированы эпидемиологически не связанные

пациенты. Вирусы же подтипа D, полученные у пациентов одного эпидемического очага, оказались близкими в указанной области генома.

Таким образом, в условиях гетерогенности возбудителя (цирку-ляциии трех подтипов ВИЧ-1) и низкой степени распространения вируса, характерного для полового пути передачи, эпидемический процесс ВИЧ-инфекции в Пермском крае на начальном этапе его развития характеризовался низкой интенсивностью.

Активизация эпидемического процесса ВИЧ-инфекции в течение второго периода (1997-2001 гг.) проявилась резким подъемом заболеваемости среди лиц мужского пола в возрасте 18-25 лет и была обусловлена попаданием вируса в популяцию ПИН Пермского края, сопровождавшимся стремительным его распространением парентеральным путем передачи при инъекционном способе введения наркотиков, на долю которого приходилось 92,4%. Показатель частоты реализации парентерального пути передачи в этот период увеличился с 0,60 на 100 тыс. населения в 1997 году до 54,59 на 100 тыс. населения в 2001 году (р<0,05). Все вышеперечисленные проявления эпидемического процесса относятся к признакам наркозависимого типа эпидемического процесса ВИЧ-инфекции [Покровский В.В. с соавт., 1998; Зверев В.В., Саранков Ю.А., 1999; Остапович A.B., 2005; Фельдблюм И.В. с соавт., 2006] и свидетельствовали о его формировании в этот период на территории Пермского края.

Изучение и оценка популяции микроорганизма как составляющей биологического фактора эпидемического процесса были проведены на основе результатов определения подтипов ВИЧ-1 у 1 660 пациентов, диагноз у которых был установлен в 1997-2001 гг. Полученные данные демонстрировали распространение в крае четырех подтипов вируса. Среди ПИН выявлены вирусы вариантов IDU-A, IDU-B и циркулирующая рекомбинантная форма CRF03AB ВИЧ-1, инфицирование при половых контактах происходило подтипом В ВИЧ-1. Однако наибольшее распространение в Пермском крае (1640/1660; 98,8%), как и в целом по России, получил вирус подтипа А (табл. 1). Свидетельством того, что доминирующий в крае вариант ВИЧ-1 аналогичен вирусам, наиболее распространенным среди ПИН в Российской Федерации и большинстве республик бывшего СССР, явились результаты филогенетического анализа, показавшие высокую степень гомологии об-16

ласти С2-УЗ 120 гена епу вариантов Ш11-А пермских образцов и последовательностей вирусов того же варианта ВИЧ-1 инфицированных городов Москвы и Иркутска, а также украинских и казахстанских пациентов. Преобладание среди инфицированных пациентов Пермского края именно варианта ШЫ-А ВИЧ-1, как и установленное ранее во многих субъектах федерации и в России в целом [ВоЬкоу А. й а!., 1998; Бобков А.Ф. с соавт., 2002; Казеннова Е.В., 2005], объясняется тем, что именно этот подтип вируса выступил в роли «эффекта основателя» и обеспечил его дальнейшее эпидемическое распространение парентеральным путем после завоза на территорию края из других регионов (Украина, Ростов-на-Дону, Тюмень, Тверь, Екатеринбург) в 1997-1999 гг. Предположение о том, что этот вариант ВИЧ-1 обладает какими-то биологическими свойствами, обеспечивающими ему преимущество для эпидемического распространения, по сравнению с другими подтипами, лишено оснований, поскольку в исследовании Т.А. Ханиной [Ханина Т.А., 2003] было показано, что варианты Юи-А и СЯРОЗАВ ВИЧ-1, изолированные от ПИН, обладают двойным тропизмом и могут использовать для проникновения в клетку как СС115-, так и СХСЯ4- рецепторы.

Таблица 1

Распространение подтипов ВИЧ-1 у инфицированных пациентов Пермского края в различные периоды развития эпидемического процесса

Годы В 0 С дадА/епуА (Юи-А) дадВ/епуВ (юи-в) дадА/ет/В (С1^03_АВ)

1988-1996 п=7 3 (43%) 2 (28,5%) 2 (28,5%) — — —

1997-2001 п=1 660 2 (0,1%) — — 1 640 (98,8%) 3 (0,2%) 15 (0,9%)

2002-2004 п-696 1 (0,2%) — — 693 (99,5%) — 2 (0,3%)

2005-2008 п=67 — — — 67 (100%) — —

ИТОГО п=2 430 6 (0,24%) 2 (0,12%) 2 (0,12%) 2 400 (98,7%) 3 (0,12%) 17 (0,7%)

Примечание: п - количество проанализированных образцов в течение указанного периода. В скобках указана доля в % от общего количества проанализированных образцов.

Произошедшее в третьем периоде (2002-2004 гг.) снижение активности эпидемического процесса было обусловлено достоверным уменьшением роли парентерального и возрастанием роли гетеросексуального пути передачи за счет значительного вовлечения в эпидемический процесс женщин 18-25 лет, что привело к активизации вертикального пути передачи вируса. Дифференцированный анализ показателей частот реализации парентерального и полового путей инфицирования для мужчин и женщин позволил нам установить их неравнозначность по тендерному признаку. Если в предыдущем периоде ведущим путем заражения как для мужчин, так и для женщин был парентеральный, связанный с внутривенным введением наркотиков, то в 2002-2004 гг. этот путь передачи, по-прежнему, оставался ведущим у мужчин, в то время как женщины чаще инфицировались при гетеросексуальных контактах (рис. 2, рис. 3).

82,63

90 1

80 -

X

к

г 70 -

й

^

2

60

о

2

н

о 50 -

о

св 40 -

I

я

н

о

н 30

о

я

3*

20 -

10

0

-н _ тг ^ О

1996 1997 1998

1999 2000 2001 Я парентеральный

2002 2003 2004 2005 2006

□ половой

2007 2008

Рис. 2. Частота реализации парентерального и полового путей передачи ВИЧ среди мужчин в Пермском крае (1996-2008 гг.)

■ парентеральный □половой

Рис. 3. Частота реализации парентерального и полового путей передачи ВИЧ-инфекции среди женщин в Пермском крае (1996-2008 гг.)

Все эти проявления относятся к признакам смешанного типа эпидемического процесса ВИЧ-инфекции [Фельдблюм И.В. с соавт., 2006]. Одной из возможных причин снижения заболеваемости в условиях смешанного типа эпидемического процесса стало увеличение роли гетеросексуального, менее активного, пути передачи, при котором распространение ВИЧ происходит медленнее, чем при парентеральном, когда вирус попадает непосредственно в кровь, минуя неспецифические факторы резистентности макроорганизма [Маз1го Т.О. е1 а!., 1998; Покровский В.В. с соавт., 2000]. Однако нельзя исключать влияния каких-то других, не изученных нами, причин снижения заболеваемости в 2002-2004 гг.

Вирусная популяция в этот период характеризовалась продолжающимся доминированием подтипа Ши-А ВИЧ-1 (см. табл. 1). Однако в условиях сменившегося типа эпидемического процесса произошел выход этого варианта вируса из строго специализированной для него группы риска (ПИН) в общую популяцию: вирусы подтипа gagA/envA обнаружены у лиц, заразившихся при гетеросексуальных контактах, у доноров и реципиентов крови, ребенка с перинатальным риском по ВИЧ-инфекции (табл. 2).

Таблица 2

Распределение подтипов ВИЧ-1, выявленных у пациентов Пермского края, в различных группах риска

Группа риска В 0 дадА/епуА (Юи-А) дадВ/егшВ (юи - В) дадА/егшВ (СЯР03„АВ)

ПИИ п=2 215 — — — 2199 (99,3%) — 16

Гетеросексуальные контакты п=205 1 2 1 197 (96%) 3 1

Мужчины, имеющие секс с мужчинами п=5 5 (100%) — — — — —

Перинатальный контакт п=1 — — — 1 (100%) — —

Контакт в нозокомиальном очаге П=1 — — 1 — — —

Доноры и реципиенты крови п=3 — — — 3 (100%) — —

Примечанием- количество проанализированных образцов в указанной группе рис ка. В скобках указана доля в % от общего количества проанализированных образцов.

Единственной группой риска, в которой не выявлено проникновения доминирующего в крае варианта ВИЧ-1, была популяция МЭМ.

Последовавшая активизация эпидемического процесса в четвертом периоде (2005-2008 гг.) происходила в условиях сохраняющегося смешанного типа эпидемического процесса. Вместе с тем в этот период произошло достоверное (р<0,05) увеличение показателя частоты реализации парентерального, связанного с внутривенным введением наркотиков, пути передачи как среди мужчин, так и среди женщин.

Данное обстоятельство явилось одной из причин, обусловивших активизацию эпидемического процесса и увеличение его интенсивности. В четвертом периоде у инфицированных лиц мы обнаруживали только вирусы Ю13-А ВИЧ-1.

Для изучения уровня генетической изменчивости вируса, получившего наибольшее распространение среди инфицированных пациентов края, был проведен филогенетический анализ области, кодирующей последовательность С2-УЗ gpl20 гена ет, вариантов Ши-А у 35 эпидемиологически не связанных лиц, инфицирование которых произошло как в результате внутривенного употребления психотропных ве-20

ществ, так и при гетеросексуальных контактах с ПИН во втором, третьем и четвёртом периодах развития эпидемического процесса. Филогенетический анализ последовательностей, полученных у этих 35 пациентов, показал, что на филогенетическом древе все последовательности в 99% формируют одну ветвь, принадлежащую подтипу А ВИЧ-1 (рис. 4).

г ■ PRM-97-259

■ PRM -97-260 PRM-01-700

■ PRM-01-703

■ PRM-97-196 f PRM-01-701

PRM-01-712 I PRM-97-187 PRM-01-711 PRM-01-705 г— ■ PRM-98-420

П-■ PRM-98-421

PRM -98-392

■ PRM-98-382 PRM-98-426

• consensus IDU-A I PRM-01-704 PRM-01-710 I PRM-01-713 — С PRM-01-714

■ PRM-01-715 PRM-08-033

-< PRM-08-036

-♦ PRM-04-1185

--♦ PRM-04-1191

♦ PRM-04-1195

♦ PRM-04-1192

Рис. 4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей области C2-V3 др120 гена env ВИЧ-1, выделенных у 35 инфицированных подтипом IDU-A пациентов Пермского края. Анализ проводили методом ближайших соседей программы MEGA. Цифры над основными ветвями древа указывают частоту появления данных последовательностей на одной ветви при проведении 100 независимых построений.

Последовательности: ■ - 1997-1998 гг., Ш - 2001 е., ♦-2004е.,

- 2008 г.,

- консенсусная последовательность

99

PRM-08-140 PRM-08-035 PRM-08-080 PRM-08-026 PRM-08-142

-♦PRM -04-1194

— ♦PRM-04-1189 PRM-08-103 PRM-08-041 SF170A А

--U455

- JRCSF

99

О

MN

В

Кроме того, последовательности, полученные у пациентов, выявленных в 1997-1998 гг. и в 2001 году, располагаются ближе к консен-сусной последовательности гена env ВИЧ-1 подтипа IDU-A, полученной при анализе 134 последовательностей пациентов с различных территорий России и стран Восточной Европы [Казеннова Е.В., 2005], чем последовательности пациентов, выявленных в 2004 и 2008 гг.

Более того, анализ генетической изменчивости показал, что генетические дистанции последовательностей пациентов, инфицированных в 2004 и 2008 гг., достоверно (р<0,001) выше соответствующих значений, полученных у последовательностей пациентов, зарегистрированных в 1997-1998 гг. и 2001 г. (табл. 3).

Таблица 3

Генетическая изменчивость участка гена env, кодирующего область C2-V3 gp 120, вариантов ВИЧ-1 подтипа IDU-А, выявленных у пациентов на территории Пермского края в разные годы развития эпидемического процесса

Годы Кол-во образцов Среднее значение генетических дистанций, % Абсолютный минимум-максимум генетических различий

1997-1998 9 2,27±0,53 0,00-5,42

2001 11 0,86+0,30 0,00-2,87

2004 6 12,51+1,42* 7,62-15,64

2008 9 9,30+1,14* 3,29-12,40

Примечание *-значения достоверно (р<0,001) выше значений 1997-1998 гг. и2001 г.

Из представленных данных (см. табл. 3) также видно, что по мере развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории края происходили изменения генетической вариабельности участка гена ет, кодирующего область С2-УЗ яр 120, вариантов ВИЧ-1 подтипа ГОТ_1-А. Сопоставление интенсивности эпидемического процесса и вариабельности исследованной области генома показало, что резкий подъем заболеваемости во втором периоде развития эпидемического процесса (1997-2001 гг.) при наркозависимом типе сопровождался незначительным снижением генетической изменчивости указанной области генома ВИЧ-1 (рис. 5). При снижении же заболеваемости, заре-22

гистрированном в третьем периоде (2002-2004 гг.) в условиях смешанного типа эпидемического процесса, произошло весомое, статистически достоверное увеличение вариабельности участка С2-УЗ гена еп\\ Произошедшему увеличению интенсивности эпидемического процесса и новому возрастанию роли парентерального, связанного с внутривенным употреблением наркотиков, пути передачи при сохраняющемся смешанном его типе в четвертом периоде (2005-2008 гг.) соответствовало незначительное, в определенной степени схожее между последовательностями 1997-1998 гг. и 2001 г., снижение генетической изменчивости.

1997-1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

среднее значение генетических дистанций области C2-V3 заболеваемость на 100 тыс. населения

ч х s

О

Рис. 5. Интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции и вариабельность области C2-V3 др120 гена env вирусов варианта IDU-A ВИЧ-1, доминирующего на территории Пермского края (1997-2008 гг.)

При изучении изменчивости гена pol вирусов подтипа А было установлено, что в Пермском крае происходит одновременная циркуляция четырех его вариантов, отличающихся наличием/отсутствием вторичных мутаций устойчивости к антиретровирусным препаратам (табл. 4).

Таблица 4

Распространение мутаций гена pol подтипа IDU-A ВИЧ-1, выявленных среди инфицированных пациентов Пермского края в разные периоды развития эпидемического процесса

Период Wt MutV77l MutA62V Mlitv77l/A62v

II (1997-2001 гг.) п=54 26 (48%) 15(28%) 6(11%) 7 (13%)

III (2002-2004 гг.) п=38 4 (10%) 27 (71%) — 7 (19%)

IV (2005-2008 гг.) п=6 1 (17%) 5(83%) — —

ИТОГО п=98 31 (32%) 47 (48%) 6 (6%) 14 (14%)

Примечанием - количество проанализированных образцов за указанный период времени; \У1- «дикий тип»; МЩу771- вариант, имеющий только указанную мутацию в протеазе; МШдбгу-вариант, имеющий только указанную мутацию в обратной транскриптазе; МиКчть'дыу - вариант, имеющий обе мутации. В скобках указан % от общего количества проанализированных образцов пациентов, выявленных за указанный период времени.

Во втором периоде развития эпидемического процесса в крае преимущественно происходила циркуляция «дикого» типа вируса, не имеющего изученных мутаций, что объясняется большим количеством завозных случаев ВИЧ-инфекции в Пермский край из различных областей Украины и Тюменской области, где этот вариант широко распространен [Суханова А.Л., 2006]. В третьем и четвертом периодах (2002-2008 гг.), как и в целом за анализируемый период, преобладающее распространение получил вариант ГО11-А МЩу77Ь несущий мутацию в 77-м кодоне протеазы вируса.

При многих нозологиях для характеристики биологического фактора эпидемического процесса исследования проводятся односторонне, с изолированным изучением либо генетической изменчивости инфекционного агента, либо влияющих на восприимчивость наследственных особенностей человека без их сопоставления с проявлениями эпидемического процесса. Нами была проведена оценка инфицирования доминирующим в крае и большинстве территорий России подтипом ГОИ-А ВИЧ-1 при парентеральном, наиболее распространенном, пути передачи среди потребителей инъекционных наркотиков на модели вспышки ВИЧ-инфекции в г. Лысьве Пермского края в 1999-2000 гг.

Вспышка ВИЧ-инфекции в г. Лысьве затронула только одну группу риска - ПИН. Среди их половых партнеров, не употребляющих наркотики, не было выявлено ни одного случая инфицирования. Единственным психотропным препаратом, инъекционно используемым ПИН в Лысьве, был кустарно изготавливаемый раствор «ханки». В результате проведения ПИН определенных манипуляций получался некоторый объем наркотика, который употреблялся из одной емкости группой лиц, состоящей, как правило, из 4-5 человек. При этом «культура потребления наркотиков» среди ПИН в Лысьве была на низком уровне: для введения наркотического вещества несколькими ПИН часто использовался один шприц или одна игла. Однако подобные группы не были постоянными, напротив, их состав менялся, поэтому можно было предположить потенциальную возможность совместного употребления наркотиков любыми двумя ПИН в городе.

Под совместным употреблением наркотиков в настоящем исследовании подразумевалось наличие у ПИН хотя бы одного из перечисленных ниже поведенческих факторов эпидемиологического риска: а) использование одного общего шприца или иглы для внутривенного введения наркотических веществ; б) распределение готовых для употребления наркотиков из общей емкости; в) промывание использованных шприцев или игл в одной общей емкости с целью их дальнейшего применения; г) использование цельной крови для контроля качества (по отсутствию гемолиза) кустарно приготовленного раствора наркотика. Таким образом, совместное употребление наркотиков являлось групповой акцией, сопровождавшейся высоким риском инфицирования ВИЧ при условии, что хотя бы один из ее участников являлся инфицированным. Все остальные ПИН, «контактируя» с ним, подвергались риску заражения.

Группу наблюдения (лица, подвергавшиеся риску заражения, но оставшиеся неинфицированными) составили 75 человек, из них 50 (66,7%) - мужчин и 25 (33,3%) - женщин. Средний возраст составлял 23,8 года, с варьированием от 16 до 46 лет. Распределение ПИН группы наблюдения по возрасту оказалось неоднородным и представляло собой скорее две отдельные выборки. Первую составляли лица, возраст кото-

рых лежит в промежутке от 16 до 26 лет (54 человека), характер возрастного распределения в этой подгруппе был близок к нормальному. Вторая, состоящая из ПИН, возраст которых лежит в промежутке от 27 до 46 лет (21 человек), не имела сходства с каким бы то ни было известным распределением. Возрастной состав ПИН в группе наблюдения отличался от такового в группе ВИЧ-инфицированных ПИН. Результаты сравнения показали, что в подгруппе от 16 до 26 лет возрастное распределение было сопоставимо с группой контроля ВИЧ-инфицированных ПИН. Однако ПИН, составляющие вторую подгруппу группы наблюдения (от 27 до 46 лет), не имели «аналогов» по возрасту среди ВИЧ-инфицированных, за исключением одного 31-летнего пациента. В связи с этим логично было предположить, что и риски инфицирования ВИЧ лиц второй подгруппы отличались вследствие различий в их поведенческих характеристиках, и прежде всего в «культуре потребления наркотиков». В силу вышеизложенного последующий анализ результатов исследования проводился в разрезе подгрупп.

В подгруппе «до 27 лет» было 37 (68,5%) мужчин и 17 (31,5%) женщин. Подгруппу «после 27 лет» составили 13 (61,9%) мужчин и 8 (38,1%) женщин.

Среди лиц, оставшихся неинфицированными (группа наблюдения), был обнаружен высокий процент гомозиготных состояний мутации СС115Д32, достигающий 5,5% по группе в целом, который возрастал до 7,6% в подгруппе «до 27 лет». В наибольшей степени гомозиготное состояние мутации было обнаружено среди лиц первой, более молодой по возрасту подгруппы, оставшихся не инфицированными ПИН. Этот факт, по-видимому, подтверждает предположение о том, что поведенческие реакции лиц именно первой подгруппы характеризовались наибольшим риском заражения ВИЧ. Отсутствие во второй подгруппе лиц с гомозиготным генотипом по мутации ССЯ5А32, вероятно, свидетельствует о том, что эта подгруппа подвергалась значительно меньшему риску заражения ВИЧ. Поэтому в дальнейшем при сравнении с контрольными группами были использованы результаты исследования лиц до 27 лет и группы ПИН, оставшихся неинфицированными в целом.

В группу контроля вошли 38 пациентов, заразившихся ВИЧ при парентеральном введении «ханки» совместно с лицами из группы наблюдения. Однако в связи с небольшим объемом данной выборки эта группа была дополнена 76 инфицированными ПИН, выявленными в других административных территориях Пермского края в период с 1997 по 1999 г., которые заразились при употреблении «ханки» парентеральным путем. Таким образом, общее количество группы ВИЧ-инфицированных ПИН составило 114 человек, из них 71 (62,3%) -мужчины, 43 (37,7%) - женщины. Средний возраст составлял 21 год, с колебаниями от 16 до 32 лет. Все пациенты этой группы были инфицированы вариантом Юи-А ВИЧ-1.

Отобранная группа доноров состояла из 186 человек без хронических заболеваний и не находящихся в близком родстве. Из них 116 (62,4%) мужчин и 70 (37,6%) женщин. Возраст доноров - от 18 до 55 лет, средний возраст составил 28 лет.

При сравнении частот встречаемости изучаемых мутаций в исследуемых группах было установлено, что значения частот ССЯ2-641 и варианта ССЯ5-59029А/0 для всех исследованных групп были практически одинаковы. Однако при сравнении частот встречаемости мутации ССИ5А32 значение, полученное в группе здоровых доноров (0,100), было достоверно меньше (р<0,05) аналогичного в подгруппе неинфицированных ПИН до 27 лет (0,179). Тем не менее рассмотрение аллельных состояний мутаций (табл. 5) показало, что в основном разница обусловлена гомозиготным генотипом мутации, в то время как число гетерозиготных состояний в обеих выборках примерно одинаково (18,9% для здоровых доноров и 20,8% для подгруппы «до 27 лет»). Генотип ССК5А32/СС115Д32 присутствует во всех группах, за исключением ВИЧ-инфицированных ПИН.

Таблица 5

Аллельные состояния мутаций ССК5А32, ССК2-641 и полиморфизма СС115-59029АЮ в группах доноров, ВИЧ-инфицированных ПИН и ПИН, оставшихся неинфицированными

«Дикий» тип* Гетерозигота Гомозигота

Мутация Доноры вич- инфицирован-ные ПИН Неинфи-цирован-ные ПИН В т.ч. неинфи-цирован-ныеПИН ДО 27 лет Доноры ВИЧ-инфицированные ПИН Неинфи-цирован-ные ПИН В т.ч. неинфи-цирован-ные ПИН ДО 27 пет Доноры вич- инфицирован-ные ПИН Неинфи-цирован-ные ПИН В т.ч. неинфи-цирован-ные ПИН ДО 27 лет

ССР?5А32 145 (80,6%) 80 (79,2%) 56 (76,7%) 38 (71,7%) 34 (18,9%) 21 (20,8%) 13 (17,8%) 11 (20,8%) 1 (0,6%) 0 4 (5,5%) 4 (7,6%)

СС1*5-59029МЗ 62 (35,4%) 35 (36,8%) 33 (47,8%) 21 (43,8%) 86 (49,1%) 45 (47,4%) 30 (43,5%) 22 (45,8%) 27 (15,4%) 15 (15,8%) 6 (8,7%) 5 (10,4%)

СС(32-641 135 (76,7%) 73 (79,3%) 50 (75,8%) 33 (72,3%) 40 (22,7%) 17 (18,5%) 16 (24,2%) 13 (27,7%) 1 (0,6%) 2 (2,2%) 0 0

Примечание: * - под «диким» типом в случае полиморфизма СС Н.5-59029А/О подразумевается генотип СХЖ5-59029А/ СС115-59029А

Последующий анализ данных показал, что статистически достоверными являются только отличия по количеству носителей гомозиготных состояний мутации ССЯ5Л32. Данные, характеризующие степень отличия между исследуемыми группами для гомозиготных состояний этой мутации, приведены в табл. 6.

Таблица 6

Результаты сравнительного анализа числа лиц, имеющих гомозиготный генотип ССИ5А32, в группах доноров, ВИЧ-инфицированных ПИН и ПИН, оставшихся иеипфицировапными

Сравниваемые группы ВИЧ-инфицированные ПИН (п=101) Доноры (п=180) Неинфицированные ПИН (п=73) Неинфицированные ПИН до 27 пет (п=53)

ВИЧ-инфицированные ПИН (п=101)

Доноры (п=180) 0(0%)/1(0,6%) р=0,64

Неинфицированные ПИН (п=73) 0(0%)/4(5,5%) р=0,029 1(0,6%)/4(5,5%) р=0,025

Неинфицированные ПИН до 27 лет (п=53) 0(0%)/4(7,6%) р=0,013 1(0,6%)/4{7,6%) р=0,011 4(5,5%)/4(7,6%) р=0,45

Примечание: в таблицах 6 и 8 оценивается статистическая достоверность разницы числа лиц, имеющих гомозиготный генотип ССК5Д32/ССЯ5Д32 и гаплотип Я5А/К2А, в исследуемых группах. В каждой ячейке таблицы количества таких лиц в группах соотнесены друг с другом как А(%)/Б(%) (где А и Б - абсолютные значения лиц-носителей соответствующего аллельного состояния в группах по вертикали и горизонтали соответственно), в следующей строке дано значение р, рассчитанное по критерию Фишера, оценивающее достоверность различия в группах; п - объем выборки.

Как следует из представленных в таблице данных, различия, полученные для лиц, имеющих гомозиготное состояние мутации ССЯ5Д32, в группах неинфицированных ПИН и остальных исследуемых группах статистически достоверны. Это означает, что гомозиготный генотип С.СЯ5Д32/ССК5Д32 обеспечивает резистентные свойства при риске инфицирования парентеральным, (при внутривенном использовании наркотиков) путем передачи ГОИ-А варианта ВИЧ-1.

Кроме частот встречаемости мутаций ССЯ5А32, ССЯ2-641 и полиморфизма ССН.5-59029ААЗ и их аллельных состояний, были проанализированы гаплотипы, образованные сочетаниями аллелей СС115Д32 и ССЯ2-641 с полиморфизмом ССК5-59029АЛЗ (табл. 7).

Таблица 7

Распределение гаплотипов, образованных мутациями ССЯ5Л32, ССЯ2-641 и полиморфизмом ССЯ5-59029А/С, в группах доноров, ВИЧ-инфицированных ПИН и ПИН, оставшихся неинфицированными

Гаплотип ВИЧ-инфицированные ПИН Доноры Неинфициро-ванные ПИН Неинфицированные ПИН до 27 лет

ЯОА/Ш 14 (15,7%) 24 (13,7%) 12(18,5%) 5 (10,9%)

РЮА/гаС 23 (25,8%) 52 (29,7%) 20 (30,8%) 14 (30,4%)

ИХЖГС 15(16,9%) 27 (15,4%) 6 (9,2%) 5 (10,9%)

9(10,1%) 15 (8,6%) 3 (4,6%) 2 (4,4%)

1?5ШК; 8 (9%) 16 (9,1%) 4 (6,1%) 3 (6,5%)

10(11%) 20 (11,4%) 6 (9,2%) , 4 (8,7%)

шт. 10(11%) 18 (10,3%) 6 (9,2%) 5 (10,9%)

1?5А/[?2А 0 2(1,1%) 4 (6,1%) 4 (8,7%)

0 1 (0,6%) 4 (6,1%) 4 (8,7%)

Итого п=89 п=175 п=65 п=46

Примечание:!! - объем выборки

Как видно из таблицы, некоторые из полученных процентных соотношений варьируются в исследуемых группах достаточно сильно. Однако при поиске гаплотипа, обладающего протективными свойствами, необходимо учитывать, что его распределение в отношении генетически обусловленного отбора при возможном заражении в ряду от ВИЧ-инфицированных (группы, не выдержавшей отбора) через группу здоровых доноров (не подвергавшихся отбору) к группе неин-фицированных ПИН (группа, созданная отбором) и к ее наиболее генетически устойчивой части, должно расти. Именно такое направление наблюдается в случае гомозиготного состояния мутации ССЯ5А32

(гаплотип R5A/R5A), которое отсутствует у ВИЧ-инфицированных, составляет 0,6% в группе здоровых доноров и достигает 5,5% и 7,6% в группах неинфицированных ПИН. Однако дальнейший анализ представленных в таблице значений показывает, что существует еще одна комбинация мутантных аллелей, распределенная аналогичным образом. Это гаплотип R5A/R2A (совокупность мутаций CCR5A32 и CCR2-64I в гетерозиготном состоянии на фоне полиморфного варианта CCR5-59029A/CCR5-59029A). Он отсутствует в группе ВИЧ-инфицированных, составляет 1,1% в группе здоровых доноров и достигает 6,1% и 8,7% в группе неинфицированных в целом и подгруппе «до 27 лет» соответственно.

Статистические значения, характеризующие степень отличия, приведены в табл. 8.

Таблица 8

Результаты сравнительного анализа числа лиц, имеющих гаплотип Я5А/Я2А, в группах доноров, ВИЧ-инфицированных ПИН и ПИН, оставшихся неинфицированными

Сравниваемые группы ВИЧ-инфицированные ПИН (п=89) Доноры (п=173) Неинфицированные ПИН (п=65) Неинфицированные ПИН до 27 лет (п=46)

ВИЧ-инфицированные ПИН (п=89)

Доноры (п=173) 0(0%)/2(1,2%) р=0,43

Неинфицированные ПИН (п=65) 0(0%)/4(6,2%) р=0,030 2(1,2%)/4(6,2%) р=0,049

Неинфицированные ПИН до 27 лет (п=46) 0(0%)/4(8,7%) р=0,012 2(1,2%)/4(8,7%) р=0,019 4(6,2%)/4(8,7%) р=0,44

Как следует из данных таблицы, полученные различия в частотах встречаемости гаплотипа R5A/R2A среди неинфицированных ПИН и в остальных исследуемых группах статистически достоверны. Таким образом, гаплотип R5A/R2A, так же как и гаплотип

R5A/R5A, обеспечивает высокий уровень устойчивости при парентеральном, связанном с внутривенным введением наркотиков, пути передачи варианта 1DU-A ВИЧ-1.

Следующим этапом выполнения данной работы явилась эпидемиологическая оценка готовых к использованию кустарно изготавливаемых растворов героина и «ханки» как факторов передачи вируса при парентеральном, связанном с их инъекционным введением, пути передачи. Причиной проведения этих исследований послужили данные исследований по эпидемиологической оценке распространенности наркомании и её влияния на заболеваемость ВИЧ-инфекцией в г. Перми, свидетельствовавшие о том, что распространенность ВИЧ-инфекции среди ПИН зависит от вида используемого наркотика и способа его применения [Фельблюм И.В. с соавт., 2002; Наумов О.Ю., 2004]. Так, резкий рост числа инфицированных ВИЧ ПИН в 20002001 гг. был детерминирован достоверным увеличением числа наркопотребителей, использующих инъекционный способ введения синтетического героина.

В качестве психотропных веществ, применяемых ПИН для внутривенного введения на территории Пермского края, в основном использовались получаемый кустарным способом жидкий опийсодер-жащий экстракт маковой соломки (так называемая «ханка») и героин.

При проведении эпидемиологических расследований было установлено, что способы получения готовых к использованию растворов этих наркотиков значительно различаются. Если приобретаемый ПИН героин в виде порошка доводится до готовности к внутривенному введению простым растворением при нагревании, то технологический процесс получения «ханки» при экстракции из маковой соломки достаточно длителен и требует набора определенных химических веществ и кипячения.

Сравнение многолетней динамики заболеваемости ВИЧ-инфекцией в двух административных территориях Пермского края, идентичных по основным проявлениям эпидемического процесса (ведущий путь передачи, равная доля ПИН в структуре заболевших, сопоставимость по возрастной и социальной структурам), но различающихся между собой по виду используемого наркотика для инъекционного введения, показало значительные отличия в ее показателях.

При сравнении интенсивности эпидемического процесса среди ВИЧ-инфицированных ПИН на указанных территориях за период 24 месяца было установлено, что заболеваемость ВИЧ-инфекцией в г. Краснокам-ске, где ПИН в качестве наркотика используют героин, значительно (1=7,58) выше таковой в г. Лысьве, где наркопотребители в качестве психотропного вещества используют «ханку» (рис. 6).

Месяцы

~г. Лысьва («ханка») г. Краснокамск (героин)

Рис. 6. Интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территориях с использованием ПИН различных видов инъекционных наркотиков

Все это свидетельствовало о том, что вид используемого ПИН инъекционного наркотика с учетом технологии его приготовления оказывает существенное влияние на интенсивность эпидемического процесса. Данная гипотеза была подтверждена в условиях эксперимента по изучению стабильности ВИЧ-1 в жидких препаратах героина и «ханки» и их влияния на репликативные свойства вируса в условиях in vitro с использованием чувствительной к вирусу культуры клеток.

Изучение стабильности ВИЧ-1 в препаратах героина проводили при его концентрации 25 мкг/мл, поскольку эта концентрация обычно используется ПИН при его внутривенном введении. Полученные

результаты с использованием Т-клеточной линии человека МТ-4 и лабораторного штамма ВИЧ-1 ЯП В показали, что вирус оставался инфекционным в растворе героина при комнатной температуре в течение 20 дней (табл. 9).

Таблица 9 Выживаемость ВИЧ-1/IIIВ в растворе героина с концентрацией 25 мкг/мл при комнатной температуре

Схема обработки вируса Исходный титр ВИЧ-1 (Ig ИД50/МЛ) Титр вируса (1д И Дм/мл) после инкубации с раствором героина по прошествии периода времени

0 часов 16 часов Здня 8 дней 20 дней 41 день

1-я 7,3 5,7 5,3 4,0 3,0 1,4 —

2-я 7,3 н.о 6,8 5,3 4,2 н.о —

3-я 7,3 6,8 : 6,7 5,1 4,1 н.о —

4-я 7,3 7,3 7,0 6,0 4,7 2,0 —

Примечание: схемы обработки вируса: 1 -я - вирус инкубировали с героином в течение определенного времени, а затем определяли его титр {\ц ИД50 /мл); 2-я - вирус инкубировали вводе, героин добавляли при определении титра вируса; 3-я - вирус инкубировали в воде, при определении титра вируса героин не добавляли; 4-я - контрольный препарат вируса, н.о -не определяли.

Для изучения влияния героина на вирусную репликацию ВИЧ-1 проведена серия опытов с различной плотностью клеточной культуры и разными дозами вируса. При плотности клеточной суспензии 2х105 клеток/мл и менее и концентрации ВИЧ-1 по белку р24 0,5 нг/мл в присутствии героина наблюдалось ускорение репликации вируса на 3-й день после заражения. При более высоких значениях плотности клеточной суспензии (3-4x105 клеток/мл) или концентрации вируса (5 нг/мл, р24) данный эффект отмечен не был.

Выявленный эффект ускорения репликации вируса, по-видимому, связан с тем, что опиаты, в том числе и героин, способны воздействовать на Т-клетки человека, активируя их через специфические опиатные рецепторы [БЬаГег Б.А. е1 а1., 1994; воукгаропя Р. е1 а1., 1998; 8т§Ьа1 Р.С. й а1., 1999]. Можно предположить, что такая активация героином определенных типов клеток приводит к повышению уровня

их чувствительности к вирусу и/или увеличению скорости его репликации на ранних стадиях инфекции. Данное предположение может играть важную эпидемиологическую роль в случаях, когда заражение ПИН при парентеральном пути передачи происходит относительно низкими дозами ВИЧ.

Проведенные аналогичные исследования относительно «ханки» показали, что в растворе этого наркотика инфекционная активность штамма ВИЧ-1/Ш В сохраняется при комнатной температуре в течение 8 дней (рис. 7).

Дни наблюдения после заражения

Рис. 7. Выживаемость ВИЧ-1/111В в растворе «ханки»: 1 - вирус с раствором «ханки» в соотношении 1:1; 2 - вирус с дистиллированной водой в соотношении 1:1; 3 - контрольный препарат вируса

При этом раствор «ханки» снижал титр вируса в 10 раз сразу после его добавления в вируссодержащую среду. В экспериментах по изучению влияния этого наркотика на вирусную репликацию каких-либо эффектов в наших условиях выявлено не было. Несмотря на то, что героин и «ханка» как психотропные вещества относятся к одной группе опиатов, значительные различия в технологии получения готового для инъекционного использования раствора, вероятно, ока-

зывают существенное влияние на сохранение инфекционных свойств и способность к репликации ВИЧ-1 в условиях in vitro.

Полученные данные о сохранении инфекционного ВИЧ-1 в растворах героина и «ханки» в течение длительного периода времени, а также влиянии героина на репликативные свойства вируса в условиях in vitro показали возможность инфицирования ПИН при парентеральном, связанном с инъекционным использованием этих наркотических веществ, пути передачи и свидетельствуют об их важной эпидемиологической роли как факторов передачи вируса в условиях как наркозависимого, так и смешанного типов эпидемического процесса ВИЧ-инфекции.

Полученные в ходе молекулярно-генетических исследований данные о циркулирующих среди инфицированных пациентов Пермского края вариантах ВИЧ-1 были использованы как дополнительные источники информации в эпидемиологической диагностике. Это позволяло нам подтверждать или опровергать данные, полученные при проведении эпидемиологического обследования очагов ВИЧ-инфекции, о возможном источнике возбудителя инфекции, пути инфицирования и месте инфицирования при завозных случаях.

Так, у семи первых ВИЧ-инфицированных, выявленных в начальный период развития эпидемического процесса в 1988-1996 гг., определенные подтипы В, D и G ВИЧ-1 объективно подтверждали данные о возможном месте и пути инфицирования, полученные при сборе эпидемиологического анамнеза. Более того, выявленная низкая генетическая изменчивость гена env у двух инфицированных подтипом D пациентов подтверждала данные об их эпидемиологической связи.

В дальнейшем, при формировании в Пермском крае наркозависимого типа эпидемического процесса, результаты молекулярно-генетических исследований при выявлении единичных случаев ВИЧ-инфекции позволяли подтверждать завозные случаи. Например, последние были подтверждены у пациентов, инфицированных вирусами варианта IDU-A ВИЧ-1, из Украины, Тюменской области и г. Ростова-на-Дону, а у пациента, инфицированного вирусом варианта IDU-B ВИЧ-1, - из Польши.

В ходе последующего распространения ВИЧ в Пермском крае данные, получаемые при эпидемиологических расследованиях возникающих очагов ВИЧ-инфекции, позволяли формулировать гипотезы

о механизме развития эпидемического процесса. Так, при проведении эпидемиологического расследования случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в Перми с января 1997 по август 1998 года, была получена информация, позволившая выявить множественный эпидемический очаг с 7 случаями заболевания. Установление факта инфицирования всех пациентов этого очага рекомбинантным вариантом СКРОЗАВ ВИЧ-1 подтверждало факт завоза данного варианта вируса в Пермь и дальнейшего его распространения, а также инфицирование источника возбудителя инфекции данного эпидемического очага в г. Калининграде, где среди инфицированных ПИН циркулирует именно этот вариант ВИЧ-1 [ВоЬкоу А. е1 а1., 1998]. Аналогичным образом были подтверждены эпидемиологиические данные в другом множественном очаге, связанном с завозом варианта ГО11-А ВИЧ-1 с территории Украины.

В ходе дальнейшего распространения ВИЧ в крае стали возникать вспышки ВИЧ-инфекции с несколькими десятками инфицированных. Первой зарегистрированной была вспышка в г. Лысьве. В декабре 1998 и январе 1999 г. были выявлены два первых случая ВИЧ-инфекции у пациентов № 59 и № 62. При проведении эпидемиологического расследования установлено, что вероятным местом их инфицирования был г. Тверь, где они употребляли психотропные вещества инъекционным способом совместно с местными жителями в период прохождения службы в рядах Российской Армии с ноября 1996 по ноябрь 1998 г. После возвращения в Лысьву пациент № 62, продолжая внутривенное употребление психоактивных веществ, явился источником возбудителя инфекции еще для двух человек (пациенты № 77 и № 84). Распространение ВИЧ в городе продолжалось, и к концу ноября 2000 года общее количество зарегистрированных лиц с ВИЧ-инфекцией составило 72. Результаты эпидемиологического обследования очагов показали, что, по меньшей мере, у 60 пациентов был один и тот же источник возбудителя инфекции. Установление факта инфицирования 59 пациентов вариантом ГО11-А ВИЧ-1 подтвердило завоз вируса из Твери, где этот вариант получил широкое применение [Бобков А.Ф. с соавт., 2000], и его дальнейшее распространение среди ПИН в г. Лысьве при реализации парентерального пути передачи.

Таким образом, при проведении эпидемиологических расследований эпидемических очагов и вспышек ВИЧ-инфекции наличие молекулярно-генетических данных о подтипе вируса, которым инфицированы пациенты этих очагов, позволяет точно устанавливать источник возбудителя инфекции и эпидемиологические связи между входящими в состав очага лицами.

На фоне лавинообразного распространения ВИЧ-1 среди ПИН Пермского края во втором периоде развития эпидемического процесса данные молекулярно-генетических исследований в некоторых случаях подтверждали эпидемиологические данные о спорадических случаях, связанных с половым путем передачи. Так, выявление вирусов подтипа В ВИЧ-1 у мужчины, являвшегося М8М, и женщины, инфицировавшейся гетеросексуальным путем, подтвердило завоз этих вариантов из Москвы и Италии.

Особую ценность для эпидемиологической диагностики при работе в эпидемических очагах, связанных с распространением подтипа А, представляет определение /;о/-геногипа вируса. Так, эпидемиологическим расследованием вспышки ВИЧ-инфекции в г. Горнозавод-ске с количеством заразившихся 25 человек было установлено, что ее возникновение могло произойти вследствие двух независимых завозов вируса из г. Санкт-Петербурга и г. Лысьвы. Результаты генотипиро-вания вирусов у пациентов из Горнозаводска свидетельствовали о варианте ГОи-А ВИЧ-1. Это подтверждало эпидемиологические данные о двух независимых завозах вируса, так как данный вариант ВИЧ-1 широко распространен в г. Санкт-Петербурге [ЬикавЬоу V. й а1., 1998], а вспышка ВИЧ-инфекции в г. Лысьве, как показали наши исследования, также была вызвана этим вариантом вируса. Однако определение ро/-генотипа вирусов у пациентов Горнозаводска и Лысьвы опровергли выдвинутую на основании эпидемиологического расследования гипотезу о возникновении вспышки в Горнозаводске вследствие двух независимых завозов вируса. Полученные данные дали веские основания утверждать, что вспышка ВИЧ-инфекции в г. Горнозаводске была вызвана завозом вируса из г. Санкт-Петербурга, поскольку все пациенты г. Горнозаводска были инфицированы вариантом Ши~А «дикого» типа, в то время как вспышка ВИЧ-инфекции в г. Лысьве была обусловлена вариантом Ш11-А МиН^л-

Определение ро/-генотипов вариантов ГОи-А ВИЧ-1 у инфицированных пациентов Пермского края позволило также провести анализ их распространения на некоторых его административных территориях. Полученные результаты в большинстве случаев также подтверждали данные, установленные в ходе эпидемиологических расследований в очагах ВИЧ-инфекции. Так, обнаруженное превалирование варианта вируса ГОИ-А М1Ну?7[/Аб2\' среди инфицированных в г. Березники, по-видимому, было связано с установленным в ходе эпидемиологического расследования завозом и дальнейшим распространением вируса из Свердловской области, где этот вариант ВИЧ-1 встречается довольно часто [Суханова А.Л., 2006].

Проведенные нами исследования и полученные результаты позволяют рекомендовать внедрение молекулярно-генетических исследований в существующую систему эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией. В информационной подсистеме в дополнение к серологическому мониторингу логично добавить молекулярно-генети-ческий, который позволит осуществлять динамическое слежение за циркулирующими вариантами вируса и уровнем их генетической изменчивости. Использование результатов молекулярно-генетичес-кого мониторинга в диагностической подсистеме обеспечит более качественную эпидемиологическую диагностику как в отдельных эпидемических очагах, так и на территории в целом.

ВЫВОДЫ

1. В многолетней динамике развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края установлено 4 периода. В 1988-1996 гг. заболеваемость носила спорадический характер, а заражение происходило преимущественно половым (как гомо-, так и гетеросексуальным) путем. В 1997-2001 гг. произошло резкое увеличение интенсивности эпидемического процесса, обусловленное стремительным распространением вируса среди потребителей инъекционных наркотиков, что привело к формированию наркозависимого типа эпидемического процесса. Снижение заболеваемости в 2002-2004 гг. было обусловлено возрастанием роли гетеросексуального, менее активного, пути передачи среди женщин и снижением внутривенного

потребления наркотиков среди мужчин, что привело к формированию смешанного типа эпидемического процесса. Последовавший рост заболеваемости (2005-2008 гг.) при сохранившемся смешанном типе эпидемического процесса обусловлен активизацией и парентерального, связанного с внутривенным введением наркотиков, и гетеросексуального путей передачи.

2. Основная роль в развитии эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края в 1988-2008 гг. принадлежала варианту вируса с генотипом gagA/envA (ГО 11-А) ВИЧ-1, суммарная доля которого в этиологической структуре составила 98,7%. Заражение этим вариантом ВИЧ-1 происходило при реализации всех путей передачи, за исключением полового в популяции мужчин, имеющих секс с мужчинами, где циркулировал ВИЧ-1 подтипа В.

3. Генетическая изменчивость наиболее вариабельного участка генома ВИЧ-1 - области С2-УЗ gpl20 гена ет вирусов варианта ГОИ-А, выделенных у пациентов в период низкой интенсивности и при смешанном типе эпидемического процесса достоверно (р<0,001) выше таковой у вирусов, выделенных у пациентов при высокой интенсивности и наркозависимом типе эпидемического процесса.

4. Популяция вирусов доминирующего в Пермском крае варианта ГОи-А ВИЧ-1 гетерогенна: происходит одновременная циркуляция четырех его /?о/-генотипов, отличающихся по наличию/отсутствию вторичных мутаций устойчивости У77—>1 в протеазе и А62—>У в обратной транскриптазе гена ро1 у никогда не леченых пациентов. Три из них имеют мутантныеро1-генотипы: М 11^771 с мутацией в протеазе, М1йдб2У с мутацией в обратной транскриптазе, Ми1у771/Аб2У с обеими мутациями и четвертый, не имеющим мутаций, «дикого» типа. Данные о /зо/-генотипе варианта ГОИ-А ВИЧ-1, которым инфицированы пациенты, могут быть использованы как дополнительный объективный инструмент при проведении эпидемиологических обследований очагов ВИЧ-инфекции.

5. Различная восприимчивость потребителей инъекционных наркотиков к ВИЧ-1 варианта ГОи-А подтипа А при парентеральном, связанном с инъекционным употреблением психотропных веществ, пути передачи генетически детерминирована, определяется гомозиготным состоянием аллеля ССЯ5А32 и сочетанием мутантных аллелей

CCR5A32 и CCR2-64I в гетерозиготном состоянии на фоне полиморфного варианта CCR5-59029A/CCR5-59029A.

6. В условиях эксперимента доказано, что лабораторный штамм ВИЧ-1/III В в растворе героина с концентрацией 25 мкг/мл, обычно используемой потребителями инъекционных наркотиков внутривенно, сохраняет свою инфекционность при комнатной температуре в течение 20 дней. При низких инфекционных дозах вируса и пониженной плотности клеток в присутствии героина происходит незначительное увеличение скорости размножения вируса.

7. Инфекционные свойства лабораторного штамма ВИЧ-1/III В в растворе «ханки» сохраняются в течение 8 дней при комнатной температуре. В отличие от героина «ханка» не оказывает какого-либо влияния на вирусную репликацию.

8. Более высокая интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции среди потребителей инъекционных наркотиков на территориях, где наркопотребление связано с героином, по сравнению с территориями, где потребители инъекционных наркотиков используют «ханку», обусловлена различным влиянием героина и «ханки» на инфекционность ВИЧ-1.

9. Данные молекулярно-генетических исследований по определению генотипа ВИЧ-1 могут быть использованы при обследовании эпидемических очагов ВИЧ-инфекции для уточнения источника возбудителя инфекции и путей передачи, а также для выявления завозных случаев ВИЧ-инфекции с других территорий.

10. Полученные результаты относительно возможностей использования молекулярно-генетических исследований для оценки биологического и социального факторов эпидемического процесса явились основанием для внедрения их в информационную и диагностическую подсистемы существующей системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. An HIV type 1 epidemic among injecting drug users in the former Soviet Union caused by a homogeneous subtype A strain / A. Bobkov, R. Cheing-song-Popov, L. Selimova; N. Ladnaya, E. Kazennova, A. Kravchenko, E. Fe-dotov, S. Saukhat, S. Zverev, V. Pokrovsky, J. Weber И AIDS Research and Hum. Retroviruses.-1997.-Vol. 13.-№14.-P. 1195-1201.

2. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ ¡А. Ф. Бобков, В.В. Покровский, Л.М Селимова, Н.Н. Ладная, Е.В. Казеннова, М.Р. Бобкова, Т.А. Ханша, А. В. Кравченко, О.Г. Юрт, С.Р. Саухат, С.Я. Зверев, Э.А. Федотов, О.Ф. Момот,

A.Н. Колесник, Е.Н. Переходченко, Р. Чейнгсонг-Попов, Д. Вебер И Вопросы вирусологии. - 1998. - № 6. - С. 253-256.

3. HIV testing of population Perm's region in Russia / S. Zverev,

B. Krendel, A. Lukina, P. Luzin //12-th World Conference on AIDS. - Geneva, Switserland, 1998. - Abstract № 60090.

4. HIV-1-infection among injecting drug users consuming artificial drugs / G. Yurganova, E. Ivanovo, S. Zverev II 7-th European Conference on Clinical Aspects and Treatment of HIV-Infection. - Lisbon, Portugal, 1999.-Printed only, 1135.

5. Эпидемиологическая и генетическая характеристика первых 40 случаев ВИЧ-инфекции на территории Пермской области / А. Ф. Бобков,

C.Я. Зверев, М.Р. Бобкова, В.Л. Ocmauieea. Л.А. Красникова, В.В. Зубри-ков, В.В. Жалнин, Е.В. Казеннова, Т.А. Ханина, Л.Е. Костина, Б.Ю. Крендель, Э.С. Иванова, Г.А. Юрганова, П.М. Лузин, В.В. Покровский // Вопросы вирусологии. - 2000. - № 4. - С. 18-21.

6. Dynamics of the HIV-1 genetic subtypes distribution in Perm region of Russia: a longitudinal study of all HIV-1 infections in 1988-1999 / S. Zverev, E. V. Kazennova, T.A. Khanina, M.R. Bobkova, L.M. Selimova, L.A. Krasnikova, P.M. Luzin, A.F. Bobkov // XIII International AIDS Conference. - Durban, South Africa, 2000. - Abstract MoPeC2487.

7. Генетический полиморфизм и ВИЧ-инфекция: генотип CCR5A32/CCR5A32 обеспечивает высокий уровень устойчивости при парентеральной передаче вируса / Г.С. Рябов, Е.В. Казеннова, С.ЯЗверев, В.В. Покровский, А.Ф. Бобков II Материалы научно-практической конференции «ВИЧ-инфекция и вирусные гепатиты с парентеральным механизмом заражения: эпидемиология, профилактика, диагностика, клиника, лечение». - Суздаль, 2001. - С. 50-51.

8. Влияние препарата, содержащего героин, на инфекционность вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) IN VITRO / Л.М. Селимова, Т.А. Ханина, Е.В. Казеннова, С.Я. Зверев, В.В. Покровский, А.Ф. Бобков II Материалы научно-практической конференции

«ВИЧ-инфекция и вирусные гепатиты с парентеральным механизмом заражения: эпидемиология, профилактика, диагностика, клиника, лечение». - Суздаль, 2001. - С. 53-54.

9. The homozigous CCR5A32 genotype accounts for high résistance of some injecting drug users (IDUs) to HIV-1 infection / G.S. Ryabov, E.V. Kazennova, S.Ya. Zverev, V.V. Pokrovsky, A.F. Bobkov, J.N. Weber II 8-th European Conférence on Clinical Aspects and Treatment of HIV-infection. - Athens, Greece, 2001. - Abstract P31.

10. Новые технологии в организации эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией в условиях наркозависимого типа эпидемического процесса: метод, рекомендации. Ч. 2. / И.В. Фелъдблюм, Н.В. Исаева, И.П. Корюкина, КМ. Хафизов, П.М. Лузин, С.Я. Зверев, О.Ю. Наумов, А.С. Сбоев, М.Ю. Девятков, В.Г. Коровка, А.Н. Чайковский, А.В. Остапович. - Пермь, 2002. - 38 с.

11. Вспышка ВИЧ-инфекции в г. Лысьва Пермской области: Гомозиготный генотип CCR5A32/CCR5A32 обеспечивает высокий уровень устойчивости при парентеральной передаче вируса / Г.С. Рябов, Е.В. Казеннова, Л.Б. Корепанова, Е.А. Мальцева, В.В Жалнин, Л.А. Красникова, С.Я. Зверев, В.В. Покровский, А.Ф. Бобков, Дж. Н. Вебер II Вопросы вирусологии. - 2002. - № 4. - С. 13-16.

12. Влияние препарата, содержащего героин, на инфекцион-ность вируса иммунодефицита человека типа 1 in vitro / Л.M. Сели-мова, Т.А. Ханина, Е.В. Казеннова, С.Я. Зверев, В.В. Покровский, А. Ф. Бобков II Вопросы вирусологии. - 2002. - № 5. - С. 16-20.

13. Distribution of HIV-1 genetic subtypes among HIV-infected individuals in prisons in Russia I E.V. Kazennova, A.F. Bobkov, T.A. Khanina, E.V. Matveeva, S.Ya. Zverev, V.V. Pokrovsky // XIV International AIDS Conférence. -Barcelona, Spain, 2002. - Abstract С 10868.

14. Влияние наркотических веществ, изготавливаемых кустарным способом, на инфекционную активность ВИЧ-1 / Л. М. Селимова, Т.А. Ханина, С.Я. Зверев, В.В. Покровский, А.Ф. Бобков, Е.Н. Бобков, А.В. Рылъков // Вопросы вирусологии. - 2003. - № 6. - С. 21-25.

15. Парентеральная передача ВИЧ-1 среди потребителей инъекционных наркотиков: роль полиморфизма в генах CCR5, CCR2 и SDF1 / Г.С. Рябов, Е.В. Казеннова, С.Я. Зверев, А.Ф. Бобков И Материалы конференции «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». - М., 2004. - С. 94

16. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции на территории Пермской области в 1999-2002 гг. / С.Я. Зверев, Ю.И. Аликина, АЛ. Суханова, Е.В. Казеннова, Р.Г. Гибадулш, КМ. Ха-физов, А.Ф. Бобков, В.В. Покровский II Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - № 4. - С. 12-16.

17. Characterization of HIV-1 genetic subtypes among IDUs in Perm region of Russia / Y.I. Alikina, A.L. Sukhanova, R.G. Gibadulin, E.V. Ka-zennova, S. Ya. Zverev, V. V. Pokrovsky, A.F. Bobkov II XV International AIDS Conference. - Bangkok, Thailand, 2004. - Abstract MoPeC3413.

18. The role CCR5delta32, CCR2-641 and CCR5-59029A/G alleles in HIV-1 parenteral transmission among IDUs in Russia / G.S. Ryabov, E.V. Kazennova, S.Ya. Zverev, V.V. Pokrovsky, A.F. Bobkov, J.N. Weber I I XV International AIDS Conference. - Bangkok, Thailand, 2004. - Abstract WePeA5616.

19. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Пермской области, 1996-2004 гг. / Ю.И. Аликина,

A.JI. Суханова, С.Я. Зверев, Е.В. Казеннова, Р.Г. Гибадулин, М.Р. Бобко-ва, Н.И. Рудинский, В. В. Покровский, А.Ф. Бобков П Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». - Суздаль, 2005.

20. Биологические свойства вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди наркоманов на территории России / Т. А. Ханина, JI.M. Селгшова, Е.В. Казеннова, А.Ф. Бобков, М.Р. Бобкова, В.В. Покровский, С.Я. Зверев, Р. Браганза, К. Николсон, Д. Вебер II Вопросы вирусологии. -2005.-№4.-С. 24-28.

21. Аутоиммунность к CD4 у ВИЧ-инфицированных в России / Л.Ф. Лидеман, Е.В. Казеннова, Г.Ф. Денисова, В.М. Стаханова, С.Я. Зверев, Р.А. Гибадулин, А. Ф. Бобков II Вопросы вирусологии -2005,-№5.-С. 15-19.

22. Полиморфизм области генома, кодирующей протеазу и обратную транскриптазу, вариантов ВИЧ-1 подтипа А, распространенных на территории СНГ / А.Л. Суханова, Н.И. Рудинский, Е.В. Богословская, А.И. Круглова, Л.Ю. Башкирова, Г.М. Цыганова, Г.А. Шипу-лин, Е.В. Казеннова, Ю.И. Аликина, С.Я. Зверев, А.Е. Гришечкин,

B.В. Покровский, MP. Бобкова, А.Ф. Бобков // Молекулярная биология. - 2005. - Т. 39. -№ 6. - С. 1063-1071.

23. Human Immunodeficiency Virus type 1 in illicit-drug solutions used intravenously retains infectivity / A.F. Bobkov, L.M. Selimova, T.A. Khanina, S.Ya. Zverev, V.V. Pokrovsky, J.N. Weber, E.N. Bobkov, A. V. Rylkov И J. of Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43. - №4. - P. 1937-1939.

24. Simultaneous spread of four subtype A HIV-1 variants among IDUs in Perm Region of Russia / S. Zverev, Y. Alikina, A. Sukhanova, E. Kazeimova, N. Roudinsky, M. Bobkova, V. Pokrovsky, A. Bobkov II X European AIDS Conference. - Dublin, Ireland, 2005. - Abstract PE 17.2/1.

25. Два варианта субтипа А ВИЧ-1 в Пермской области / Ю.И. Аликина, A.JI. Суханова, С.Я. Зверев, Е.В. Казеннова, Р. Г. Гиба-дулин, М.Р. Бобкова, И. И. Рудинский, В.М. Михайлович, А.Ф. Бобков // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2006. - № 1. - С. 39-43.

26. Secondary resistance mutations V77I and A62V of subtype A HIV-1 testing for epidemiological diagnosis / S. Zverev, Y. Alikina, A. Sukhanova, E. Kazennova, R. Gibadulin, M. Bobkova, A. Bobkov II XVI International AIDS Conference. - Toronto, Canada, 2006. - Abstract MOPE0459.

27. Intrapatient polymorphism of protease gene in IDU-A HIV-1 / I. Lapovok, A. Sukhanova, J. Alikina, S. Zverev, E. Kazennova, M. Bobkova II XVI International AIDS Conference. - Toronto, Canada, 2006. -Abstract CDA0114.

28. Развитие эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края, 1988-2005 гг. / С.Я. Зверев, И.В. Фельдблюм, Ю.И. Аликина, A.JI. Суханова, Е.В. Казеннова, М.Р. Бобкова, А.Ф. Бобков Н Материалы IX съезда ВНПОЭМП. - М., 2007. - Т. 1. - С. 57.

29. Молекулярно-эпидемиологические аспекты распространения ВИЧ-инфекции в Пермском крае / И.В. Фельдблюм, С.Я. Зверев, А.В. Остапович, Ю.И. Аликина, А.Л. Суханова, Е.В. Казеннова, А.Е. Гришечкин, М.Р. Бобкова, А.Ф. Бобков II Микробиол. - 2007. -№2.-С. 18-24.

30. Распространение вирусов иммунодефицита человека первого типа в Пермском крае / С.Я. Зверев, Ю.И. Аликина, Е.В. Казеннова, М.Р. Бобкова, А.Ф. Бобков II Материалы научно-практической конференции, посвященной 65-летию кафедры эпидемиологии Нижегородской государственной медицинской академии «Современные проблемы эпидемиологии». - Н. Новгород, 2007. - С. 217-222,

31. Характеристика паразитарной системы эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края / С.Я. Зверев, КВ. Фелъдблюм, А.Ф. Бобков II Материалы научной сессии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. ЕЛ. Вагнера». - 2007. - С. 108-110.

32. Четыре варианта подтипа А вируса иммунодефицита человека 1-го типа в Пермском крае / СЛ. Зверев, Ю.И. Аликина, А.Л. Суханова, Е.В. Казеннова, М.Р. Бобкова, КВ. Фелъдблюм, А.Ф. Бобков // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 2(22). -С. 451-452.

Автор выражает глубокую благодарность и искреннюю признательность доктору биологических наук, профессору (Алексею Филип-

повичу Бобкову| и доктору медицинских наук, профессору Ирине Вик-

торовне Фельдблюм за постоянное внимание, научные консультации, всестороннюю помощь и поддержку при выполнении диссертации, знания, полученные при совместной работе.

Особую благодарность автор выражает:

коллективу лаборатории вирусов лейкозов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (руководитель д.б.н. М.Р. Бобкова), и, в первую очередь, д.б.н. Е.В. Казеиновой, д.б.н. JIM. Селимовой, к.б.н. Т.А. Ханиной, к.б.н. А.Л. Сухановой за предоставление возможности проведения исследований, участие и поддержку при их проведении и обсуждении;

коллективу Государственного учреждения здравоохранения «Пермский краевой Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», в особенности K.M. Хафизову, П.М. Лузину, Г.А. Юргановой, Р.Г. Гибадулину, к.м.н. Э.С. Ивановой, Д.В. Шмагину, всему коллективу диагностической лаборатории и лично Ю.И. Аликиной и Б.Ю. Кренделю - за дружескую поддержку, понимание и помощь;

руководителям консультативно-диагностических центров по ВИЧ-инфекции на территориях Пермского края: Л.Б. Корепановой (г. Лысь-ва), О.В. Плотниковой (г. Краснокамск), С.Л. Беловой (г. Березники) и В.Г. Драбич (г. Горнозаводск) - за огромную помощь в организации и сборе материалов для исследований.

На правах рукописи

ЗВЕРЕВ СЕРГЕЙ ЯКОВЛЕВИЧ

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА РАЗВИТИЯ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.02.02 - Эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских паук

Подписано в печать 13.10.2010 Формат 69x90/16. Усл. печ. л.2. Тираж 100 экз. Заказ № 600

Отпечатано в издательско-полиграфическом комплексе «ОТ и ДО» 614094, г. Пермь, ул. Овчинникова, 19, тел. (342)224-47-47

Эпидемическая ситуация по ВИЧ-инфекции в Российской Федерации остается напряженной, несмотря на произошедшее в 2002 — 2004 гг. снижение количества вновь регистрируемых случаев заболевания. По данным Федерального Научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИД на 31.12.2009 года в России официально зарегистрировано 529 353 случая ВИЧ-инфекции. Прогноз развития эпидемии этого заболевания для нашей страны остается крайне неблагоприятным. Отсутствие до настоящего времени препаратов для специфической профилактики, дорогостоящее лечение и социально-экономические последствия дают веские основания считать борьбу с ВИЧ-инфекцией одной из приоритетных задач здравоохранения [33, 34,48].

Успешная борьба с любой инфекционной патологией, в том числе и с ВИЧ-инфекцией, во многом определяется правильностью эпидемиологической диагностики- с выявлением факторов, детерминирующих заболеваемость. Одним из ведущих факторов развития эпидемического процесса является биологический, представленный взаимодействием популяций' микро- и макроорганизмов. Этот фактор в основном и определяет внутренние механизмы развития инфекционной заболеваемости [3]. Достижения в области использования моле-кулярно-генетических методов исследований применительно к нуждам эпидемиологии позволили получить более полные характеристики популяций паразита и хозяина, изучить особенности их взаимодействия, улучшить эпидемиологическую диагностику, включая дифференциацию путей передачи, возбудителя инфекции [51, 60, 58, 31]. Такого рода исследования проведены в эпидемиологии парентеральных вирусных гепатитов, инфекции НТЬУ—1/2 [5], клещевого энцефалита [18], энтеровирусных инфекций [29]. Активно проводятся молекулярно-генетические исследования и в отношении ВИЧ-инфекции.

Многочисленными исследованиями различных авторов установлено, что среди лиц, инфицированных ВИЧ-1, основным фактором риска заражения которых являлось внутривенное употребление наркотиков; в России, большинстве республик бывшего СССР и многих странах Восточной Европы в основном циркулируют вирусы трех разных подтипов, но наиболее широкое распространение получил вариант ВИЧ-1 подтипа А [9, 10, 11, 12, 180, 181, 199, 4, 163, 59, 79, 80, 22, 23, 15].

Однако в недавних работах [238, 52] было продемонстрировано, что популяция вирусов подтипа А, циркулирующих на территории России, гетерогенна: широкое распространение получили варианты ВИЧ-1, содержащие характеристические замены в 77-м кодоне (V77I) протеазы и в 62-м положении обратной транскриптазы (A62V). Эти замены были описаны в литературе как вторичные мутации устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам ферментов, применяющимся для высокоактивной антиретровирусной терапии [253, 149].

Существующие литературные данные демонстрируют распространение [26, 27, 11, 23, 54, 15, 55, 180] и генетическую изменчивость [5, 59, 22] подтипов ВИЧ-1 на территории России в целом или в отдельных субъектах Российской Федерации в определенные периоды времени. Детального же изучения' распространения вариантов ВИЧ-1 среди инфицированных лиц и изучения их динамической генетической изменчивости на различных этапах развития эпидемического процесса с момента регистрации первого случая заболевания в сопоставлении с характером проявлений эпидемического процесса не проводилось, хотя этот вопрос представляет несомненный научно-практический интерес.

Начиная с 1996 года в литературе стали появляться сообщения об устойчивости некоторых людей к заражению ВИЧ-1, обусловленной их генетическими особенностями. Приводились данные, что мутации в генах различных хемокиновых рецепторов, используемых вирусом в качестве корецепторов при проникновении в клетку, влияют на вероятность заражения. Первой обнаруженной мутацией была делеция в гене CCR5. Установлено, что люди, гомозиготные по этой делеции, обладают повышенной устойчивостью к заражению ВИЧ-1 [108, 175]. Позднее появились сообщения о других мутациях, потенциально способных влиять на вероятность заражения. Однако данные о возможной роли большинства мутаций в инфицировании ВИЧ-1 (за исключением мутации в гене СС115) носят противоречивый характер, а связь между сочетаниями мутаций в разных генах хемокиновых рецепторов и возможностью инфицирования ВИЧ-1 изучена недостаточно. Кроме того, как правило, все включенные в исследования пациенты были инфицированы ВИЧ-1 подтипа В либо в результате половых контактов, либо через контаминированную вирусом донорскую кровь или ее компоненты [277, 242]. В связи с этим представляло интерес выяснить возможное влияние мутаций в генах хемокиновой системы или их сочетаний на вероятность заражения лиц, практикующих внутривенное применение психоактивных веществ, наиболее распространенным в России ВИЧ-1 варианта ГО11-А подтипа А.

В качестве психотропных веществ, используемых потребителями инъекционных наркотиков, на территории России в основном используются героин и получаемый кустарным способом жидкий опийсодержащий экстракт маковой соломки (так называемая «ханка»). Вероятность заражения ВИЧ-1 наркопотребителей при использовании этих веществ существует при условии использования общих шприцев или игл, в которых остаются небольшие количества крови, а также при применении общей емкости для их промывания, что достаточно часто встречается в практике наркопотребления среди ПИН [43]. Кроме того, нередки ситуации, когда наркопотребители контролируют качество готового для инъекционного использования психотропного вещества по отсутствию гемолиза добавленной в него цельной крови. При условии попадания в кустарно изготовленный препарат крови инфицированного раствор наркотика становится кон-таминированным ВИЧ. Однако практически не изучено, как влияют готовые для инъекционного введения героин и «ханка» на инфекционность вируса, как долго они сохраняют ее и как в этих условиях реализуется механизм заражения.

В связи с вышеизложенным представляет несомненный интерес изучение проявлений эпидемического процесса ВИЧ-инфекции во взаимосвязи с его биологическим фактором с использованием молекулярно-генетических методов исследований.

Цель исследования

Обосновать механизм развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на основе молекулярно-генетических данных по характеристике его паразитарной системы и дать рекомендации по оптимизации системы эпидемиологического надзора.

Задачи исследования:

1. Изучить проявления эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края за 1988 - 2008 гг.

2. Определить подтипы вариантов ВИЧ-1, выделенных на территории Пермского края в различные периоды развития эпидемического процесса и в разных группах риска инфицирования. Изучить их генетическую изменчивость в области C2-V3 gpl20 гена env.

3. Изучить риск инфицирования вариантом IDU-A подтипа А ВИЧ-1 лиц, практикующих внутривенное введение психоактивных веществ в зависимости от мутаций генов хемокиновых рецепторов CCR 5, CCR 2 и их сочетаний.

4. Выявить основные факторы риска, способствующие реализации механизма заражения при внутривенном употреблении психоактивных веществ. Изучить действие растворов героина и «ханки» на инфекционность ВИЧ-1, исследовать их влияние на размножение вируса в условиях in vitro.

5. Оценить возможность использования молекулярно-генетических исследований по определению подтипа вируса для слежения за развитием эпидемического процесса на территории и расшифровки отдельных эпидемических очагов ВИЧ-инфекции.

6. Обосновать механизм развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции и оценить значение молекулярно-генетических исследований в системе эпидемиологического надзора. Дать рекомендации по совершенствованию эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

Научная новизна работы Впервые проведен анализ проявлений эпидемического процесса ВИЧ-инфекции в многолетней динамике в сопоставлении с генетической характеристикой возбудителя инфекции. Получены приоритетные данные о распространении генетических вариантов ВИЧ-1 в отдельно взятом субъекте Российской Федерации на протяжении 20-летнего периода при различных типах эпидемического процесса.

Впервые изучена паразитарная система эпидемического процесса ВИЧ-инфекции, его биологический фактор: популяции микроорганизма и макроорганизма во взаимодействии друг с другом. На основании данных молекулярно-генетических исследований по выявлению мутаций или их сочетаний в генах хемокиновых рецепторов ССЫ5 и ССЫ2 установлен риск инфицирования вирусом иммунодефицита человека 1-го типа потребителей инъекционных наркотиков.

Впервые получены данные о влиянии вида наркотического средства, используемого внутривенно потребителями психоактивных веществ, на механизм заражения при ВИЧ-инфекции. Доказано сохранение инфекционности вируса в растворах героина и «ханки» в течение длительного времени.

Впервые показана возможность использования данных молекулярно-генетических исследований по определению вторичных мутаций устойчивости вируса в качестве дополнительного объективного инструмента в эпидемиологической диагностике при обследовании эпидемических очагов ВИЧ-инфекции.

Практическая значимость

Разработанные подходы и полученные данные позволят оптимизировать систему эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

Для оптимизации информационной подсистемы рекомендовано внедрить молекулярно-генетический мониторинг с целью слежения за циркулирующими вариантами ВИЧ-1 и изучения динамики их генетической изменчивости, для оценки устойчивости популяции к инфицированию.

Для повышения качества эпидемиологической диагностики в рамках диагностической подсистемы рекомендовано использовать результаты молеку-лярно-генетического мониторинга при работе в очагах ВИЧ-инфекции для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очагов.

Определение ро/-генотипа вируса по наличию/отсутствию мутаций У77—»1/А62—>У у лиц, инфицированных подтипом ГОИ-А ВИЧ-1, дает дополнительную объективную информацию, позволяющую осуществлять качественную эпидемиологическую диагностику в очагах инфекции.

Полученные результаты о длительном сохранении инфекционных свойств ВИЧ-1 в растворах героина и «ханки» могут быть использованы для информационно-просветительской работы среди населения, особенно среди потребителей инъекционных наркотиков.

Внедрение в практику

Результаты исследований внедрены в практику работы ГУЗ «Пермский краевой Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями».

Материалы исследований использовались при разработке методических рекомендаций «Новые технологии в организации эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией в условиях наркозависимого типа эпидемического процесса» (Ч. 2. — Пермь, 2002. — 38 е.), которые были внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений Пермского края.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами и интернами на кафедре эпидемиологии, а также включены в программы последипломного образования врачей-эпидемиологов на ФПК и ППС ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Развитие эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края в 1988 - 2008 гг. было обусловлено преимущественной циркуляцией варианта ВИЧ-1 с генотипом gagA/envA (ГОЦ-А). Заражение этим вариантом происходило при реализации парентерального, гетеросексуального и вертикального путей передачи, за исключением полового в популяции мужчин, имеющих секс с мужчинами. Генетическая изменчивость области С2 — УЗ gpl20 гена епу вирусов этого варианта была различной в отдельные периоды развития эпидемического процесса, характеризующегося разной интенсивностью.

2. На риск инфицирования ВИЧ-1 варианта ГОЦ-А при парентеральном пути передачи среди потребителей инъекционных наркотиков оказывают влияние гомозиготное состояние аллеля ССГ15Л32 и сочетание мутантных аллелей ССЫ5Д32 и СС112-641 в гетерозиготном состоянии на фоне полиморфного варианта ССЯ5-59029А/ССК5-59029А.

3. Интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции среди потребителей инъекционных наркотиков зависит от вида используемого ими психоактивного вещества и определяется различным влиянием кустарно приготовленных героина и "ханки" на инфекционность и репликацию ВИЧ-1.

4. Использование молекулярно-генетических методов исследования для изучения биологического фактора эпидемического процесса в системе эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией позволяет оптимизировать эпидемиологическую диагностику в части слежения за ходом развития эпидемического процесса на территории (дифференциация завозных случаев) и расшифровки эпидемических очагов с определением источника возбудителя инфекции, путей и факторов инфицирования и уровня восприимчивости контактных лиц.

ВЫВОДЫ.

1. В многолетней динамике развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края установлено 4 периода. В 1988 - 1996 гг. заболеваемость носила спорадический характер, а заражение происходило преимущественно половым, как гомо-, так и гетеросексуальным, путем. В 1997 - 2001 гг. произошло резкое увеличение интенсивности эпидемического процесса, обусловленное стремительным распространением вируса среди потребителей инъекционных наркотиков, что привело к формированию наркозависимого типа эпидемического процесса. Снижение заболеваемости в 2002 - 2004 гг. было обусловлено возрастанием роли гетеросексуального, менее активного, пути передачи среди женщин и снижением внутривенного потребления наркотиков среди мужчин, что привело к формированию смешанного типа эпидемического процесса. Последовавший рост заболеваемости (2005 - 2008 гг.) при сохранившемся смешанном типе эпидемического процесса обусловлен активизацией и парентерального, связанного с внутривенным введением наркотиков, и гетеросексуального путей передачи.

2. Основная роль в развитии эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории Пермского края в 1988 - 2008 гг. принадлежала варианту вируса с генотипом gagA/envA (ГОи-А) ВИЧ-1, суммарная доля которого в этиологической структуре составила 98,7%. Заражение этим вариантом ВИЧ-1 происходило при реализации всех путей передачи, за исключением полового в популяции мужчин, имеющих секс с мужчинами, где циркулировал ВИЧ-1 подтипа В.

3. Генетическая изменчивость наиболее вариабельного участка генома ВИЧ-1 - области С2 - УЗ gpl20 гена епу вирусов варианта Юи~А, выделенных у пациентов в период низкой интенсивности и смешанном типе эпидемического процесса достоверно (р < 0,001) выше таковой у вирусов, выделенных у пациентов при высокой интенсивности и наркозависимом типе эпидемического процесса.

4. Популяция вирусов доминирующего в Пермском крае ВИЧ-1 варианта ТРЦ-А гетерогенна: происходит одновременная циркуляция четырех его ро1-генотипов, отличающихся по наличию/отсутствию вторичных мутаций устойчивости N11—в протеазе и А62—>У в обратной транскриптазе гена ро1 у никогда не леченых пациентов. Три из них имеют мутантные /?с>/-генотипы: Ми^л с мутацией в протеазе, Ми^зу, с мутацией в обратной транскриптазе, Ми^ттуАбгу с обеими мутациями и четвертый, не имеющим мутаций, дикого типа. Данные о /^/-генотипе ВИЧ-1 варианта ГОИ-А, которым инфицированы пациенты, могут быть использованы как дополнительный объективный инструмент при проведении эпидемиологических обследований очагов ВИЧ-инфекции.

5. Различная восприимчивость потребителей инъекционных наркотиков ю ВИЧ-1 варианта ГОЦ-А при парентеральном, связанном с инъекционным употреблением психотропных веществ, пути передачи генетически детерминирована и определяется гомозиготным состоянием аллеля ССК5Д32 и сочетанием мутантных аллелей ССЯ5Д32 и ССК2-641 в гетерозиготном состоянии на фоне полиморфного варианта ССК5-59029А/СС115-59029А.

6. В условиях эксперимента доказано, что лабораторный штамм ВИЧ-1/ III В в растворе героина с концентрацией 25 мкг/мл, обычно используемой потребителями инъекционных наркотиков внутривенно, сохраняет инфекцион-ность при комнатной температуре в течение 20 дней. При низких инфекционных дозах вируса и пониженной плотности клеток в присутствии героина происходит незначительное увеличение скорости размножения вируса.

7. Инфекционные свойства лабораторного штамма ВИЧ-1/ III В в растворе «ханки» сохраняются в течение 8 дней при комнатной температуре. В отличие от героина, «ханка» не оказывает какого-либо влияния на вирусную репликацию.

8. Более высокая интенсивность эпидемического процесса ВИЧ-инфекции среди ПИН на территориях, где наркопотребление связано с героином, по сравнению с территориями, где потребители инъекционных наркотиков используют «ханку», обусловлена различным влиянием героина и «ханки» на ин-фекционность ВИЧ-1.

9. Данные молекулярно-генетических исследований по определению генотипа ВИЧ-1 могут быть дополнительно использованы при обследовании эпидемических очагов ВИЧ-инфекции для уточнения источника возбудителя инфекции и путей передачи, а также для выявления завозных случаев ВИЧ-инфекции с других территорий.

10. Полученные результаты по возможностям использования молекулярно-генетических исследований для оценки биологического и социального факторов эпидемического процесса явились основанием для внедрения их в информационную и диагностическую подсистемы существующей системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.