Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Нарушения цитокинпродуцирующей функции мононуклеаров крови при персистентных вирусных инфекциях

На правах рукописи

Белоконь Валентина Владимировна

НАРУШЕНИЯ ЦИТОКИНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ ФУНКЦИИ МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ ПРИ ПЕРСИСТЕНТНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирском государственном медицинском университете Минздрава России

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Рязанцева

Наталья Владимировна

доктор медицинских наук, член-корр. РАМН, профессор, Заслуж. деятель науки РФ

Новицкий

Вячеслав Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Федорова

Татьяна Алексеевна

доктор медицинских наук, профессор

Жданов

Вадим Вадимович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирская государственная медицинская академия Минздрава России

Защита состоится «__» ¿-¿¿¿3*4-2005 Г.

часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, Томск, ул. Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан

в

Ученый секретарь диссертационного совета

Суханова ГА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема вирусоносительства является одной из наиболее актуальных в современной медицине. Значение патологий, обусловленных вирусами, велико, в связи с их широкой распространенностью, прогредиентным течением и развитием тяжелых осложнений [Ивашкин В.Т., 1998; Lok A.S.F., 2000; McClary Heike, 2000; Шуппан Д., 2001; Непомнящих Г.И. и соавт., 2003; Покровский В.И. и соавт., 2003; Новицкий В.В., Уразова О.И., 2004]. Вирусы гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса, обладающие способностью к длительной персистенции в макроорганизме, могут поражать многие органы и системы, вызывая латентную, острую и хроническую формы инфекции [Маянский А.Н., 1999; Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Arbutnot P., Kew M., 2001].

Персистирующие в макроорганизме вирусы в процессе эволюции приобрели множество свойств, позволяющих им длительно существовать в макроорганизме [Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991]. Причинами «ускользания» вирусов от иммунного надзора могут быть перманентная изменчивость их антигенной структуры, а также подавление индукции и реализации иммунного ответа [Ferrari С, 1998; Хаитов P.M. и соавт., 2000; Arbutnot P., 2001; Blackwell J.M., 2001]. Подавление индукции иммунного ответа может осуществляться за счет интеграции генетического материала вируса в геном клетки-хозяина, антигенной «мимикрии» вирусов, блокирования процессинга и презентации антигенов, а также накопления мутаций иммунного ускользания [Dhillon A.P., Dusheiko G.M., 1995; Lewy J.A., 1997; Pagliaro L. et al., 1999; Ивашкин В.Т. и соавт., 2000; Freeman A.G. et al., 2001]. Нарушение реализации иммунного ответа может явиться следствием сниженной реактивности Т-системы иммунитета и нарушения презентации антигенов антигенпредставляющими клетками [Апросина З.Г., Серов В.В., 2001; Wakimoto H. et al., 2003].

Одним из ведущих аспектов в патогенезе формирования персистирования вирусов является изменение цитокин-продуцирующей способности иммунокомпетентных клеток [Антонов П.В., Цинзерлинг ВА., 2001; Wakimoto Н. et al., 2003]. Цитокины, вырабатываемые Т-хелперами типа 1 (у-интерферон (y-IFN) и интерлейкин-2 (IL-2)), - принимают участие в клеточном иммунном ответе и ассоциируются с защитным антивирусным эффектом [Хаитов P.M., 2001; Kaspzak A. et al., 2004]. Недостаток продукции IL-2 способствует хронизации вирусной инфекции [Eckels D.D. et al., 1999]. В то же время

увеличение синтеза цитокинов Т-хелперами типа 2 - IL-4, -5, -9, -10, усиливающих гуморальный иммунный ответ, может приводить к трансформации заболевания в хроническую форму [Seder R.A. et al., 1998; Jia

H. et al., 2003]. Одним из ключевых цитокинов является фактор некроза

оказывающий мощное провоспалительное действие и играющий важную роль в реализации противовирусного иммунитета [Willson A.G. et al., 1997; Ягода А.В. и соавт., 2001; Приймяги Л.С. и соавт., 2002].

В связи с этим представляется актуальным исследование характера нарушения цитокин-продуцирующей способности мононуклеаров периферической крови при формировании персистирования вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса. Полученные в указанном аспекте новые знания фундаментального характера позволят, на наш взгляд, расширить представления о патогенезе персистентных вирусных инфекций, и обосновать новые, патогенетически оправданные способы ранней диагностики и коррекции дизрегуляции иммунной системы при данной патологии.

Цель исследования: установить роль дизрегуляции продукции мононуклеарами иммунорегуляторных цитокинов с

провоспалительными (IL-2, IL-6, IL-12, TNF-a) и противовоспалительными (IL-4, IL-10) эффектами в иммунопатогенезе персистентных вирусных инфекций.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

I. Установить особенности функционального и метаболического статуса лимфоцитов, цитокинпродуцирующей способности мононуклеарных лейкоцитов (y-IFN, TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12) у больных хроническим вирусным гепатитом В и С в зависимости от таксономической принадлежности возбудителя и активности патологического процесса.

2. Выявить клинико-иммунологические параллели при хроническом носительстве вируса клещевого энцефалита.

3. Дать комплексную оценку функциональных свойств лимфоцитов и способности мононуклеаров крови к продукции иммунорегуляторных цитокинов с про- и противовоспалительными эффектами при обострении и ремиссии хронической герпетической инфекции.

4. Оценить характер перестройки цитокиновой сети и межклеточных взаимодействий иммунокомпетентных клеток при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование субпопуляционного состава и функционального статуса лимфоцитов,

способности мононуклеаров периферической крови продуцировать у-И^Ы, цитокинов с провоспалительными (^-2, IL-6, IL-12, Т№-а) и противовоспалительными (^-4, IL-10) эффектами при персистентных вирусных инфекциях, вызванных различными возбудителями (вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса). Установлено, что хронизация гепатита В, С и В+С, клещевого энцефалита и герпетической инфекции сопровождается нарушениями клеточного звена иммунитета: на фоне снижения содержания NK-клеток развивается дисбаланс Т-звена системы иммунитета, проявляющийся уменьшением количества СОЗ+-, С04+-лимфоцитов и снижением иммунорегуляторного индекса Степень выраженности указанных расстройств практически не определяется видом возбудителя и активностью инфекционного процесса. При обследовании пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатитов В, С, клещевого энцефалита и простого герпеса обнаружено повышение пролиферативной активности и изменение метаболического статуса лимфоцитов периферической крови. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что при хроническом течении вирусного гепатита В, С, В+С, герпетической инфекции и носительстве антигена вируса клещевого энцефалита выражен дисбаланс продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови. Длительная персистенция вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и вируса простого герпеса сопровождается дизрегуляцией продукции иммунорегуляторных

цитокинов с провоспалительными (ТИР-а, ^-2, ^ -12) и противовоспалительными (^-4, ^-10) эффектами, что носит не только патологический, но и адаптивный характер, о чем свидетельствует типовое возрастание продукции мононуклеарами цитокинов с противовирусным и противовоспалительным эффектами.

Практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые патофизиологические аспекты хронизации инфекционного процесса при инфицировании вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения инфекционного процесса при гепатитах В, С, В+С, клещевом энцефалите, герпетической инфекции, а также патогенетически оправданных способов предупреждения и коррекции выявленных нарушений.

Положения, выносимые на защиту:

1. Персистентные вирусные инфекции характеризуются выраженной дизрегуляцией продукции иммунорегуляторных цитокинов с провоспалительными (ТГ^-а, IL-2, IL -12) и противовоспалительными (^-4, IL-10) функциями, которая носит не только патологический, но и адаптивный характер.

2. Дисбаланс иммунной системы в условиях длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса характеризуется угнетением Т-клеточного звена иммунной системы (снижение количества -лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса), сопровождающимся перестройкой внутриклеточного метаболизма лимфоцитарных клеток периферической крови и усилением пролиферативной активности Т-лимфоцитов.

3. Изменения метаболического и функционального статуса лимфоцитов периферической крови, дизрегуляция продукции цитокинов мононуклеарами крови при хроническом течении вирусного гепатита В, С, В+С слабовыраженной и умеренной степени активности, хроническом носительстве антигена вируса клещевого энцефалита с клинической и без клинической симптоматики нейроинфекции, хронической герпетической инфекцией носят однотипный характер.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на межгородской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2002), всероссийской научной конференции "Нервно-психическое утомление человека в современных условиях" (Москва, 2002), городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской библиотеки СГМУ (Томск, 2002), VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003), IV и V международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003; 2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2004), Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004).

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4) и Администрацией Томской

области по проблеме «Создание и внедрение панели молекулярно-генетических маркеров для прогнозирования течения и исходов вирусных гепатитов» (договор №136 от 23.09.2004 г.).

Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии и инфекционным болезням для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из которых 5 - в центральных рецензируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 362 источников, из которых 217 отечественных и 145 иностранных. Диссертация иллюстрирована 47 таблицами, 8 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе приведены результаты комплексного исследования функционального и метаболического статуса лимфоцитов у 189 пациентов (121 мужчина, 68 женщин в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст - 33±4 лет) с длительной персистенцией вирусов гепатитов В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса. Обследованные находились на диспансерном учете и стационарном лечении в отделении гастроэнтерологии Томской областной клинической больницы, инфекционном отделении клиник ГОУ ВПО «Сибирского государственного медицинского университета Министерства Здравоохранения Российской Федерации», медико-санитарной части «Строитель» г. Томска и ГУЗ «Томском областном центре профилактики и борьбы со СПИД и другими инфекционными заболеваниями Департамента здравоохранения Администрации Томской области».

В программу исследования были включены 118 пациентов, страдавших вирусным гепатитом В, С и В+С (по МКБ-10 рубрики В18.0 - хронический вирусный гепатит В с В18.1 - хронический вирусный гепатит В

без В18.2 - хронический вирусный гепатит С, В18.8 - другой

хронический вирусный гепатит) (таблица). До момента обследования больные не получали этиотропной противовирусной терапии. Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на выявлении синдромов гепато- и спленомегалии, холестаза и цитолиза. Верификация диагноза проводилась

Распределение обследованных пациентов в соответствии с использованными методами иммунологического, гематологического и цитохимического исследования

Группы обследованных Методы исследования

Исследование количественных показателей белой крови Исследование субпо-пуляцион-ного состава лимфоцитов периферической крови Исследование проли-феративной активности мононукле-аров периферической крови Исследование метаболического статуса лимфоцитов периферической крови Исследование продукции цитокинов мононукле-арами периферической крови

Здоровые доноры 19 19 16 26 10

Пациенты с хроническим вирусным гепатитом В слабовы-раженной степени активности 19 10 12 15 10

В умеренной степени активности 10 9 12 10 9

С слабовы-раженной степени активности 26 16 12 12 10

С умеренной степени активности 42 15 22 31 10

В+С слабовы-раженной степени активности 10 9 12 10 9

В+С умеренной степени активности 11 10 10 10 10

Пациенты с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита Без клинической симптоматики нейро-инфекции 15 10 12 10 8

С клиническими проявлениями нейро-инфекции 16 11 12 12 9

Пациенты с хронической герпетической инфекцией Стадия обострения 26 15 16 22 10

Стадия ремиссии 14 11 10 10 8

путем выявления в сыворотке крови ДНК HBV, РНК HCV (методом ПЦР), серологических маркеров HBV (HbeAg, HBsAg, анти-НВс IgM, анти-Hbcor) и HCV (анти-HCV IgG к core, С-протеину, неструктурным белкам (NS3, NS4, NS5), анти-HCV IgM). По выраженности некроза паренхимы печени и воспалительной клеточной инфильтрации определяли степень активности хронического гепатита, используя классификацию «Индекс гистологической активности» по R.J. Knodell et al. [1981].

У пациентов с хроническим вирусным гепатитом умеренной степени активности наиболее часто выявлялся астеновегетативный синдром (91%). Диспепсический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) был обнаружен у 58% пациентов. Синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) чащеобнаруживался у больных хроническим гепатитом С (68%), чем у пациентов с хроническим гепатитом В (42%) и В+С (47%). В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикально, подтверждались результатами ультразвукового исследования. У пациентов с хроническим гепатитом В умеренной степени активности синдром цитолиза выявлялся в 57% случаев, у пациентов с хроническим гепатитом С - в 78%, у больных с микст-инфекцией — в 66%.

Хронический вирусный гепатит слабовыраженной степени активности характеризовался отсутствием клинической симптоматики, ультразвуковых признаков поражения печени, нормальными значениями биохимических показателей. Астеновегетативный синдром обнаруживался у 39% пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, у 47% - с хроническим вирусным гепатитом Сиу 43% - с хроническим вирусным гепатитом В+С. Диагноз основывался на результатах обнаружения серологических и молекулярно-биологических маркеров HBV- и HCV-инфекции.

Пациенты, страдающие клещевым энцефалитом (КЭ) (по МКБ-10 рубрика А84.0), были объединены в группы на основании клинической классификации, предложенной Н.Г. Жуковой и соавт. [2000]. Верификацию диагноза проводили на основании данных эпидемиологического анамнеза (факт присасывания клеща, пребывание в эпидемическом очаге и др.), результатов лабораторного исследования (определение уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита с помощью иммуноферментного анализа, реакции непрямой гемагглютинации, обнаружение вирусной РНК методом ПЦР), а также оценки неврологического статуса.

Первую группу обследованных составили 15 пациентов с бессимптомным носительством вируса клещевого энцефалита (более 6 мес с момента инфицирования). У пациентов отсутствовали клинические симптомы заболевания, однако в крови обнаруживались РНК вируса клещевого энцефалита, а также повышенный уровень специфических антител Ig M и Ig G. Во вторую группу обследованных были включены 16 пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита с минимальными клиническими проявлениями нейроинфекции. Продолжительность заболевания у таких пациентов составляла от 8 до 30 мес. После инфицирования вирусами клещевого энцефалита у 10 больных развивалась картина лихорадочной и у 6 -стертой форм нейроинфекции. Основными клиническими проявлениями длительной персистенции вируса КЭ у таких пациентов были астеновегетативный синдром (головная боль, повышенная утомляемость) (в 96% случаев) и остаточная неврологическая симптоматика (невралгия, миалгия, локальное снижение болевой чувствительности) (у 74% обследованных больных).

В исследование были включены пациенты, страдающие хронической герпетической инфекцией (по МКБ-10 рубрики В00.1 - герпетический везикулярный дерматит, вызванный вирусом простого герпеса, В00.5 -герпетическая болезнь глаз, вызванная вирусом простого герпеса, и А60.0 -герпетические инфекции половых органов и мочеполового тракта). Диагноз устанавливали на основании клинико-эпидемиологических данных и результатов лабораторного исследования (определение антигерпетических IgM-и IgG-антител серотипов 1 и 2 с помощью иммуноферментного анализа, а также выявление ДНК вируса простого герпеса типов 1 и 2 с использованием ПЦР).

Первую группу обследованных составили 26 пациентов с хронической герпетической инфекцией в стадии обострения. Основным клиническим синдромом был астеновегетативный: 94% пациентов предъявляли жалобы на слабость, снижение работоспособности, головные боли, нарушение сна и потливость. Герпетическая сыпь у 12 пациентов была локализована вокруг рта и на губах (herpes labialis), у 8 обследованных были обнаружены герпетические поражения глаз, у 6 - генитальный герпес.

Во вторую группу обследованных были включены 14 пациентов с хронической герпетической инфекцией в стадии ремиссии. У пациентов отсутствовали клинические симптомы заболевания, однако в крови обнаруживались ДНК вируса простого герпеса, а также повышенный уровень

специфических антигерпетических антител IgM и IgG. Продолжительность межрецидивного периода у таких пациентов составляла от 2 до 17 месяцев.

Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и наркотическая зависимость.

Контрольную группу составил 41 практически здоровый донор с аналогичными характеристиками по полу и возрасту. Материалом исследования являлась венозная кровь, взятая утром натощак. Кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).

Определение общего количества лейкоцитов периферической крови и подсчет их отдельных морфологических форм проводили общепринятыми методами [Меньшиков В.В., 1987].

Выделение мононуклеаров периферической крови осуществляли с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Для получения супернатантов и количественного определения уровня цитокинов в них выделенные мононуклеары культивировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640, 10% инактивированной (при 56°С в течение 30 мин) эмбриональной телячьей сыворотки («ICN Biomedicals Inc.», США), 280 мг/л L-глутамина, 100 мг/л гентамицина, 2 мМ/л HEPES («Flow», Великобритания). Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили ФГА («Difco», Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры [Хаитов P.M. и соавт., 1995]. Продукцию мононуклеарными лейкоцитами у-интерферона, фактора некроза опухоли-а, интерлейкина-2, -4, -6, -10, -12 оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» метода [Хаитов P.M. и соавт., 2000]. Процедура выполнения иммуноферментного анализа проводилась по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Cytimmune», США; «Procon», Россия).

Пролиферативную способность лимфоцитов определяли с помощью теста бласттрансформации лимфоцитарных клеток [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Результаты теста выражали количеством неизмененных, переходных и бластных форм лимфоцитов (%) [Козинец Г.И. и соавт., 2002].

Определение -несущих

лимфоцитов проводили иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.А. и соавт., 2002] с использованием тест-систем фирмы «Dako» (Дания)

Содержание гликогена и липидов, активность неспецифической эстеразы и кислой фосфатазы в лимфоцитах оценивали цитохимическими методами исследования [Хейхоу Ф.Г., 1983; Меньшиков В.В., 1987].

Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ «Statistica for Windows» (2002, версия 6.0) фирмы «Statsoft Inc.» и пакета программ «Microsoft Exel» (2000) корпорации «Microsoft».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно современным представлениям, внедрение вируса в клетку макрооорганизма приводит в состояние готовности иммунные механизмы, направленные на ограничение и элиминацию инфекции [Маянский А.Н. и соавт., 1998; Хаитов P.M. соавт., 2000; Апросина З.Г., Серов В.В., 2001; Ивашкин В.Т., 2001]. Поэтому при формировании инфекционного процесса вирусы для обеспечения собственного выживания должны использовать пути, которые позволяют им избежать действия защитных иммунных реакций организма. Вероятность перехода вирусной инфекции в хроническую форму в значительной мере обусловлена исходным состоянием иммунной системы макроорганизма и вовлечением в патологический процесс иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 1995; Маянский А.Н., 1999].

В связи с этим наше исследование было направлено на получение новых знаний фундаментального характера о механизмах формирования персистенции вирусов, обладающих способностью к длительному пребыванию в макроорганизме. Особый интерес для нас представлял феномен взаимодействия иммунной системы человека с вирусами гепатитов В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса.

Проведенный нами детальный анализ субпопуляционного состава циркулирующих Т- и В-лимфоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом В, С и микстинфекцией (В+С), пациентов с длительным носительством вируса КЭ и хронической герпетической инфекцией убедительно доказывал факт дисбаланса стабильной в норме системы регуляторных и эффекторных клеток при персистентных вирусных инфекциях. Как показало проведенное в нашей лаборатории исследование, у больных хроническим вирусным гепатитом В и С слабовыраженной и умеренной степеней активности, а также у пациентов с длительной персистенцией вирусов КЭ и простого герпеса имело место значительное снижение содержания CD3+-лимфоцитов. Сходные данные были получены и в исследованиях других

авторов [Федорченко СВ., Лихторович С.А., 1991; Маммаев С.Н., 2002; Фридлянд И.Ф. и соавт., 2002]. Выявленная нами низкая экспрессия CD3+ -общего популяционного маркера Т-лимфоцитов - у больных хроническим вирусным гепатитом В и С слабовыраженной и умеренной степеней активности, (54,14±3,71, р<0,01; 55,88±3,48, р<0,05; 54,86±3,52, р<0,01 и 58,27±3,66, р<0,05 соответственно при норме 66,17±1,87%), пациентов с хроническим носительством вируса КЭ без клинической симптоматики (49,50±5,21, р<0,01) и с клиническими проявлениями нейроинфекции (58,33±1,07, р<0,01), пациентов с хронической герпетической инфекцией в стадии обострения (51,33± 1,67, р<0,01) и ремиссии (44,5 0± 1,93, р<0,01) может свидетельствовать о превалировании Th2 пути иммунного ответа и развитии незначительного дефицита ТЫ-лимфоцитов [Хаитов P.M., 2001; Володин Н.Н. и соавт., 2002]. Следует отметить, что сопутствующее этому значительное снижение числа СD4+-положительных лимфоцитов, также обнаруженное в нашем исследовании, может быть одной из черт Т-клеточного иммунодефицита [Володин Н.Н. и соавт., 2002; Маммаев С.Н. и соавт., 2002]. Была выявлена положительная корреляция между снижением числа СD4+-клеток и увеличением продукции Th2 цитокинов. Так, количество этих клеток коррелировало с уровнем синтеза мононуклеарами IL-10 у больных хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности (r=0,77; р<0,01) и пациентов с хроническим носительством вируса КЭ с клиническими проявлениями (r=0,70; р<0,05). В то же время число СD4+-лимфоцитов коррелировало с продукцией мононуклеарными лейкоцитами IL-6 у больных хроническим вирусным гепатитом В+С умеренной степени активности (r=0,64; р<0,05), у пациентов с хроническим носительством вируса КЭ с клиническими проявлениями нейроинфекции (r=0,75; р<0,01), а также у пациентов с хронической герпетической инфекцией в стадии обострения (r=0,83; р<0,01).

Пониженная реактивность Т-звена иммунитета при хронической вирусной инфекции может рассматриваться либо как результат нарушения представления антигена антигенпрезентирующими клетками, либо как дисфункция самих Т-клеток. На сегодняшний день не имеется достаточных данных, на основании которых можно было бы предположить факт изменения презентации антигена при HBV- и HCV-инфекции. Наиболее вероятным представляется первичное нарушение антигенспецифического Т-клеточного ответа [Ивашкин В.Т. и соавт., 2001].

Снижение величины иммунорегуляторного индекса (соотношение числа СD4+-/СD8+-лимфоцитов), выявленное в нашем исследовании,

свидетельствовало о наличии у обследованных лиц толерантности к вирусным антигенам, что способствует нарушению процесса дифферецировки В-лимфоцитов в плазматические клетки, продуцирующие иммуноглобулины, и в конечном итоге приводит к нарушению элиминации возбудителя [Левченко Е.М., 2000].

Не менее важная роль в защите организма от внутриклеточных вирусов принадлежит NK-клеткам (CD56+), принимающим участие в реакциях неспецифической цитотоксичности [Reherman В. et al., 1996; Ярилин А.А., 1999]. Активация клеток опосредована секрецией макрофагами IL-12, а также a-, (3-IFN. У больных хроническим вирусным гепатитом В слабовыраженной степени активности снижение числа лимфоцитов, несущих СD56+-маркер клеточной дифференцировки, положительно коррелировало с угнетением синтеза IL-12 (r=0,77; р<0,05). Под действием IL-12 усиливаются адгезивные свойства NK-клеток, изменяется экспрессия некоторых мембранных молекул и индуцируется синтез y-IFN [Журкина А.Т. и соавт., 2002]. Реализация функций лимфоцитов-киллеров по отношению к клеткам-мишеням во многом обусловлена экспрессией на их поверхности антигена CD56, который распознает Fc-фрагмент Ig G. Конечным результатом такого распознавания является антителозависимый клеточно-опосредованный цитолиз [Mason L.H. et al., 1994; Wallace P.K. et al., 1994].

Общеизвестно, что функционирование гуморального звена иммунитета отражают показатели системы В-лимфоцитов. Некоторые авторы отмечают активную пролиферацию В-лимфоцитов в периферической крови у больных клещевым энцефалитом [Загромов Е.Ю., 1992; Ратникова Л.И. и соавт., 2002], хроническим вирусным гепатитом В и С [Апросина З.Г. и соавт., 1994; Маммаев С.Н., 2002; Фридлянд И.Ф. и соавт., 2002]. Известно, что HCV-инфекция обладает способностью активировать и вызывать пролиферацию В-лимфоцитов, приводящих к повышенной продукции иммуноглобулинов и образованию иммунных комплексов [Серов В.В., Мухин Н.А., 2000]. Вероятно, этим объясняется выявленное в нашем исследовании увеличение относительного количества СD22+-экспрессирующих лимфоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом С, что свидетельствует об активном участии В-лимфоцитов в противовирусном иммунном ответе. Кроме того, число СD22+-клеток у больных вирусным гепатитом С слабовыраженной (r=0,82; р<0,01) и умеренной (r=0,66; р<0,05) степеней активности положительно коррелировало с увеличением продукции IL-10 - цитокина Th2 пути

иммунного ответа. Вместе с тем протективная эффективность этих клеток в условиях HCV-инфекции ограничена [Маммаев С.Н., 2002].

Таким образом, у больных с хронической персистенцией вирусов гепатита В и С, вируса клещевого энцефалита, а также у пациентов с хронической герпетической инфекцией отмечался ярко выраженный типовой дисбаланс субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови: угнетение Т-клеточного звена иммунной системы (снижение количества CD3+-, СD4+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса), а также уменьшение численности популяции СD56+-клеток.

У больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С отмечалось значительное увеличение пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови при ФГА-стимуляции, о чем свидетельствовало снижение более чем в два раза количества неизмененных и переходных форм клеток при увеличении числа бластных форм лимфоцитов. Аналогичная тенденция была обнаружена при оценке пролиферативного потенциала лимфоцитов у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией вне зависимости от клинической картины заболевания и стадии обострения инфекционного процесса.

Известно, что уровень пролиферации лимфоцитов при ФГА-стимуляции в определенной степени отражает активность иммунного ответа организма на действие вируса, т.е. эффективность иммунной защиты [Дергунова Н.Н. и соавт., 2003]. В связи с этим, усиление пролиферативной активности лимфоцитов может явиться следствием длительной персистенции вирусов в организме и постоянного контакта иммунокомпетентных клеток с антигеном. Приведенные данные позволяют констатировать факт функциональной активации Т-клеточного звена иммунитета в ответ на действие вирусов, что можно рассматривать как адаптивную реакцию иммунной системы, направленную на защиту организма от инфекции.

При исследовании ряда показателей, характеризующих метаболический статус лимфоцитарных клеток (активность неспецифической эстеразы, кислой фосфатазы, содержание гликогена и липидов), с использованием цитохимических методов исследования были обнаружены признаки перестройки метаболизма лимфоцитов в условиях длительной персистенции вирусных инфекций. Так, в лимфоцитах у больных хроническим вирусным гепатитом, с носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией была увеличена активность

неспецифической эстеразы. По данным ряда авторов, активность этого фермента - цитохимического маркера зрелости циркулирующих Т-лимфоцитов - положительно кореллирует с количеством лимфоцитов, обладающих хелперной активностью [Бажора Ю.И., Пясецкий Б.Н., 1987; Блиндарь В.Н. и соавт., 1993]. По мнению Р.В. Ленской и соавт. [1992], неспецифическая эстераза маркирует в Т-хелперах структуры, содержащие лимфокины, необходимые при взаимодействии Т-хелперов и В-лимфоцитов. Содержание липидов в лимфоцитах значительно увеличивалось у всех обследованных пациентов.

Как уже упоминалось ранее, характер иммунного ответа на вирусную инфекцию во многом определяется особенностями продукции цитокинов, которые служат организующей системой, детерминирующей комплекс патогенетических и саногенетических событий при внедрении вирусов [Симбирцев А.С., 2004]. Ключевым моментом, определяющим исход вирусной патологии, является сохранение баланса продукции цитокинов клетками иммунной системы. При этом выраженные нарушения ТЫ-ТИ2 пути иммунного ответа, характерные для большинства хронических вирусных инфекций, и, следовательно, дизрегуляция продукции и взаимодействия секретируемых цитокинов, лежат в основе патогенеза длительной вирусной персистенции. Ключевыми цитокинами, принимающими участие в реализации противовирусного иммуниетета, являются цитокины с

провоспалительными (ТОТ-а, 1Ь-2, -6, -12) и противовоспалительными (1Ь-4, -10) эффектами.

Проведенный в ходе настоящего исследования анализ цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров периферической крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса позволил констатировать факт значительного изменения продукции ключевых цитокинов, играющих важную роль в реализации противовирусного иммунитета, иммунокомпетентными клетками.

В частности, изучение особенностей синтеза мононуклеарами у

больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С выявило достоверное увеличение спонтанной продукции этого цитокина у всех обследованных пациентов. ФГА-стимулированная секреция возрастала у больных

вирусным гепатитом В и С слабовыраженной степени активности и пациентов с микст-инфекцией вне зависимости от степени активности инфекционного процесса. У пациентов с хроническим носительством вируса КЭ также

отмечалось увеличение спонтанной и ФГА-стимулированной продукции Кроме того, конституциональная продукция этого цитокина повышалась у больных хронической герпетической инфекцией. На наш взгляд, активацию синтеза мононуклеарами периферической крови следует расценивать как

положительную тенденцию, направленную на элиминацию вируса из организма (рис. 1).

Известно, что полноценность ответной реакции организма на вирусную инфекцию в значительной мере определяется достаточной продукцией Thl-лимфоцитами Как самостоятельно, так и в кооперации с другими

цитокинами участвует в активации цитотоксических процессов в

клетках, повышая резистентность организма к действию инфекционных агентов [Фрейдлин И.С., 1996; Ярилин А.А., 1999]. У пациентов с длительной вирусной персистенцией отмечалось выраженное изменение способности мононуклеаров периферической крови продуцировать Спонтанная секреция этого

цитокина снижалась у больных вирусным гепатитом С, а также В и В+С слабовыраженной степени активности. Продукция индуцированная

ФГА, угнеталась у всех больных, страдающих гепатитом. Подобные изменения были выявлены у пациентов с хроническим носительством вируса КЭ. Однако следует отметить, что способность мононуклеаров продуцировать у

пациентов с хронической герпетической инфекцией практически не изменялась (рис. 1).

Известно, что две основные группы лимфокинов, продуцируемых соответственно Th1- и Th2-лимфоцитами, оказывают положительное взаимное влияние, причем ростовыми факторами для Th1- и ТЪ2-лимфоцитов являются продуцируемые ими цитокины (соответственно IL-2 и IL-4) [Ярилин А.А., 1997; Хаитов P.M., 2001]. При этом IL-2 - основной цитокин ТЫ пути иммунного ответа - играет ключевую роль в формировании эффективной противовирусной защиты организма, активируя клеточное звено иммунитета [Симбирцев А.С., 1998; Хаитов P.M., 2001].

Оценка способности мононуклеаров секретировать IL-2 показала, что у всех пациентов с длительной персистенцией вирусов КЭ и простого герпеса снижалась ФГА-индуцированная продукция этого цитокина. У больных хроническим вирусным гепатитом В и С умеренной степени активности и В+С слабовыраженной и умеренной степеней активности ФГА-стимулированная продукция этого цитокина также оказалась достоверно сниженной. Базальный синтез IL-2 при этом не изменялся практически у всех обследованных

Спонтанная продукция ФГА-стимулиро ванная продукция

а)

Спонтанная продукция ФГА-стимулированная продукция

б)

Спонтанная продукция ФГА-стимулированная продукция

В)

□ Здоровые доноры

В Больные ХВГ В слабовыраженной степени активности

□ Больные ХВГ В умеренной степени активности

В Больные ХВГ С слабовыраженной степени активности И Больные ХВГ С умеренной степени активности В Больные ХВГ В+С слабовыраженной степени активности И Больные ХВГ В+С умеренной степени активности

В Пациенты с хроническим носительством вируса КЭ без клинической симптоматики В Пациенты с хроническим носительством вируса КЭ с клиническими проявлениями В Пациенты с хронической герпетической инфекцией в стадии обострения В Пациенты с хронической герпетической инфекцией в стадии ремиссии

Рис. 1. Спонтанная и ФГА-стимулированная продукция цитокинов мононуклеарами крови (а — IFN-y, б — TNF- а, в - IL-2) у больных с персистентными вирусными инфекциями.

пациентов и даже несколько возрастал у больных хроническим вирусным гепатитом В слабовыраженной степени активности (рис. 1).

Известно, что активация ТЫ-лимфоцитов, секретирующих IL-2, ведет к стимуляции, главным образом, функций Т-лимфоцитов и макрофагов, а также к развитию клеточного типа иммунного ответа [Хаитов P.M., 2001]. Снижение ФГА-стимулированной продукции IL-2, одного из ключевых иммунорегуляторных цитокинов, свидетельствует об истощении резервной способности иммунокомпетентных клеток синтезировать этот провоспалительный цитокин. Изменения, выявленные в ходе настоящего исследования, позволяют, на наш взгляд, констатировать факт нарушения функционирования Т-клеточного звена иммунной системы, что приводит, с одной стороны, к нарушению элиминации вируса из организма, а с другой, способствует еще большему снижению активации ТЫ пути иммунного ответа (рис. 2).

В то же время IL-4, обладая выраженными противовоспалительными свойствами, стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета, способствуя дифференцировке Th no Th2 пути иммунного ответа [Хаитов P.M., 2001]. По данным проведенного нами исследования, продукция IL-4, как спонтанная, так и ФГА-индуцированная, возрастала у всех пациентов с хроническим носительством вируса КЭ, хронической герпетической инфекцией и вирусным гепатитом В и С. У больных хроническим вирусным гепатитом В+С умеренной степени активности синтез IL-4 мононуклеарами также увеличивался (рис. 2).

Как показало проведенное исследование, у больных хроническим вирусным гепатитом В и С, а также В+С умеренной степени активности, значительно возрастала спонтанная и ФГА-стимулированная продукция IL-10. Однако синтез этого цитокина у пациентов с длительной персистенцией вируса КЭ и простого герпеса практически не изменялся (рис. 2). Анализ способности мононуклеаров периферической крови секретировать IL-6, также являющегося цитокином Th2 пути иммунного ответа, показал значительное увеличение его базальной продукции у всех обследованных пациентов с хронической персистенцией HBV и HCV, вирусов клещевого энцефалита и простого герпеса (рис. 2). Известно, что IL-6, обладающий провоспалительными свойствами, по направленности действия значительно отличается от классических провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1 [Ивашкин В.Т. и соавт., 2003]. В первую очередь это связано с тем, что IL-6, наряду с IL-10 и IL-4, является цитокином Th2 пути иммунного ответа и участвует в поддержании регуляции

Спонтанная продукция ФГА-стимулированная продукция

а)

Спонтанная продукция ФГА-стимулированная продукция

б)

Спонтанная продукция ФГА-стимулированная продукция

в)

^ктшНКДЬЛ |

Спонтанная продукция ФГА-стимулированная продукция

г)

□ Здоровые доноры

Ш Больные ХВГ В слабовыраженной степени активности

□ Больные ХВГ В умеренной степени активности

В Больные ХВГ С слабовыраженной степени активности В Больные ХВГ С умеренной степени активности В Больные ХВГ В+С слабовыраженной степени активности В Больные ХВГ В+С умеренной степени активности

В Пациенты с хроническим носительством вируса КЭ без клинической симптоматики В Пациенты с хроническим носительством вируса КЭ с клиническими проявлениями В Пациенты с хронической герпетической инфекцией в стадии обострения В Пациенты с хронической герпетической инфекцией в стадии ремиссии

Рис. 2. Спонтанная и ФГА-стимулированная продукция цитокинов мононуклеарами крови (а - ^-4, б - ^-6, в - ^-10, ^-12) у больных хроническими вирусными инфекциями.

созревания В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки [Хаитов P.M., 2001].

Анализ способности мононуклеаров периферической крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса продуцировать IL-12 выявил статистически значимое снижение ФГА-индуцированной секреции этого цитокина у всех обследованных пациентов. Базальный синтез IL-12 увеличивался лишь у больных хроническим вирусным гепатитом В+С и у пациентов с хронической герпетической инфекцией (рис. 2).

Таким образом, выявленный по итогам настоящего исследования выраженный дисбаланс продукции про- и противовоспалительных цитокинов, может быть связан как с нарушением функционирования иммунокомпетентных клеток, так и с компенсаторно-приспособительной реакцией системы иммунитета в условиях длительной вирусной персистенции.

ВЫВОДЫ

1. Длительная персистенция вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и вируса простого герпеса сопровождается увеличением конституциональной продукции мононуклеарами крови при сохраненном резервном потенциале мононуклеарных клеток к синтезу этого цитокина с противовирусным эффектом.

2. Персистентные вирусные инфекции (вирусным гепатитом В и С, носительство антигена вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) характеризуются выраженным нарушением продукции иммунорегуляторных провоспалительных IL-2, IL -12) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов.

3. Дизрегуляция иммунной системы при формировании длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса у пациентов со стертыми клиническими проявлениями инфекции носит не только патологический, но и адаптивный характер, о чем свидетельствует типовое возрастание продукции мононуклеарами цитокинов с противовирусными и противовоспалительными эффектами.

4. Длительная персистенция в организме вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса сопровождается перестройкой внутриклеточного метаболизма лимфоцитарных клеток периферической крови, приводящей к накоплению липидов, увеличению активности

неспецифической эстеразы, и усилением пролиферативной активности Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию их фитогемагглютинином.

5. Типовым нарушением иммунной системы в условиях длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса является угнетение Т-клеточного звена иммунной системы (снижение количества CD3+-, СD4+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса), а также уменьшение численности популяции СD56+-клеток.

6. Изменения цитокинподуцирующей способности мононуклеаров крови, метаболического и функционального статуса лимфоцитов периферической крови при хроническом течении вирусного гепатита В, С, В+С слабовыраженной и умеренной степени активности, хроническом носительстве антигена вируса клещевого энцефалита с клинической и без клинической симптоматики нейроинфекции, хронической герпетической инфекцией носят однотипный характер.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фагоцитоз и продукция оксида азота у больных клещевым энцефалитом и иксодовым клещевым боррелиозом / Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии: Сб. научных трудов, посвященный 150-летию чл.-корр. РАН, проф. А.С. Догеля. - Томск, 2002. - С. 212-214 (в соавт. с Новицким В.В.., Пироговой Н.П., Мельниковой А.П., Воронковой О.В., Михайловой О.В., Барминой С.Э., Козловым В.К.).

2. Изучение фагоцитарной системы периферической крови у больных клещевым энцефалитом и иксодовым клещевым боррелиозом /. Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 29-30 января 2002 года. -СПб, 2002. - С. 80-83 (в соавт. с Мельниковой А.П., Воронковой О.В., Карповой М.Р., Неруш Е.В.).

3. Фагоцитарная активность полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у больных клещевым энцефалитом / Современные аспекты биологии и медицины: Материалы городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской библиотеки СГМУ. - Томск, 2002. - С. 100 - 102 (в соавт. с Пироговой Н.П., Мельниковой А.П., Воронковой О.В., Михайловой О.В., Карповой М.Р.).

4. Оценка фагоцитарных способностей лейкоцитов периферической крови у больных клещевым энцефалитом и инфекцией-микст / Сборник научных трудов всероссийской научной конференции "Нервно-психическое утомление человека в современных условиях", Москва, 13-15 ноября 2002. - Москва, 2002. - С. 32-34 (в соавт. с Пироговой Н.П., Мельниковой А.П., Михайловой О.В., Воронковой О.В., Сюсиной Л.В., Неруш Е.В., Барминой С.Э.).

5. Хронический гепатит В: структура, метаболизм и цитогенетические особенности / Експерименальна 1 типична медицина. - 2003. - №2. - С.

64-67 (в соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Наследниковой И.О., Токаревой Н.В., Жуковой О.Б., Антошиной М.А., Миноченко Ю.В., Томсон Ю.В., Комаровой Т.С., Чечиной О.Е., Чернецкой Н.Н.).

6. Структурно-функциональные особенности плазматической мембраны лимфоцитов и эритроцитов при вирусных инфекциях / Сибирский медицинский журнал. - 2003. - Т. 18, № 3. - С. 34-38 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Паниным Л.Е., Токаревой Н.В., Новицким В.В., Наследниковой И.О., Жуковой О.Б., Антошиной М.А.).

7. Феномен хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита: возможные пути патогенеза / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 139, № 4. - С. 446-450 (в соавт. с Наследниковой И.О., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Лепехиным А.В., Антошиной М.А., Томсон Ю.В.).

8. Изменения микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов при хроническом гепатите В / Успехи современного естествознания. - 2003. -№11. - С. 89 (в соавт. с Токаревой Н.В., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Жуковой О.Б., Наследниковой И.О., Антошиной М.А., Миноченко Ю.В., Чечиной О.Е..).

9. Хронический вирусный гепатит С: структурно-метаболический и цитогенетический статус лимфоцитов / Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов, Санкт-Петербург, 29-31 окт. 2003. - СПб, 2003. - С. 268-269 (в соавт. с Наследниковой И.О., Рязанцевой Н.В., Токаревой Н.В., Жуковой О.Б., Антошиной М.А., Миноченко Ю.В., Чечиной.Е.).

10.Хронические вирусные гепатиты - актуальная проблема медико-социального значения / Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии». - Томск, 2004. - Т. 3, № 2. - С. 347 (в

соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Наследниковой И.О., Миноченко Ю.В., Насыровой Р.Ф., Чечиной О.Е., Антошиной М.А).

11. Функционально-метаболический статус лимфоцитов периферической крови у больных с длительной персистенцией вирусов / Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 15-16 апр. 2004 г - СПб, 2004. - С. 43 (в соавт. с Наследниковой И.О., Антошиной М.А., Токаревой Н.В., Томсон Ю.В., Миноченко Ю.В., Жуковой О.Б., Мельниковой А.П.).

12.Иммунорегуляторные ТЫ- и ТЪ2-цитокины при хронической инфекции, вызванной вирусами гепатитов В и С / Материалы V Международного конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», Томск, 20-21 мая 2004 г. - Томск, 2004. - С. 86-87 (в соавт. с Наследниковой И.О., Белобородовой Е.В., Антошиной М.А., Томсон Ю.В., Зверевой Е.С., Токаревой Н.В., Жуковой О.Б., Мельниковой А.П.).

13.Поверхностная архитектоника и иммунофенотипические особенности лимфоцитов при хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита / Материалы Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 5-7 окт. 2004 г. -Новосибирск, 2004. - С. 3 (в соавт. с Антошиной М.А., Наследниковой И.О., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Томсон Ю.В., Зверевой Е.С.).

14.Продукция цитокинов при хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / Материалы Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 5-7 окт. 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С. 10-11 (в соавт. с Наследниковой И.О., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Антошиной М.А., Миноченко Ю.В., Томсон Ю.В., Зверевой Е.С.).

15.Поверхностная архитектоника, функциональные особенности и метаболизм лимфоцитов периферической крови при хронической герпесвирусной инфекции / Клиническая лабораторная диагностика. -2004. - № 5. - С. 53-55 (в соавт. с Наследниковой И.А., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Ткаченко СБ., Антошиной М.А., Черновым А.С., Решетниковым В.И., Шевцовой Н.М., Миллером А.А.).

16.Молекулярные механизмы изменения продукции мононуклеарами крови при хроническом вирусном гепатите С / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - Т. 139, №

2. - С. 191-195 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Наследниковой И.О., Зимой А.П., Новицким В.В., Токаревой Н.В., Белобородовой Е.В., Антошиной М.А., Миноченко Ю.В., Томсон Ю.В., Пигузовой Е.А.).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КЭ - клещевой энцефалит

ФГА - фитогемагглютинин

ХВГ В - хронический вирусный гепатит В

ХВГ С - хронический вирусный гепатит С

ХВГ В+С - хронический вирусный гепатит В+С

CD - моноклональное антитело, распознающее поверхностный

лейкоцитарный антиген соответствующего дифференцировочного кластера

HBV - вирус гепатита В

HCV - вирус гепатита С

IFN - интерферон

IL - интерлейкин

NK - натуральные киллеры

Th - Т-хелпер

TNF - фактор некроза опухоли

Отпечатано: ООО «НИП», г. Томск, ул. Советская, 47, тел.: (382-2) 53-14-70 Заказ № 03-1005. Тираж 100 экз. Бумага 80 г/м2, А4

2 2 АПР 2005 2£3

Актуальность исследования. Проблема вирусоносительства является одной из наиболее актуальных в современной медицине. Значение патологий, обусловленных вирусами, велико, в связи с их широкой распространенностью, прогредиентным течением и развитием тяжелых осложнений [Ивашкин В.Т., 1998; Lok A.S.F., 2000; McCIary Heike, 2000; Шуппан Д., 2001; Непомнящих Г.И. и соавт., 2003; Покровский В.И. и соавт., 2003; Новицкий В.В., Уразова О.И., 2004]. Вирусы гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса, обладающие способностью к длительной 1 , персистенции в макроорганизме, могут поражать многие органы и системы, вызывая латентную, острую и хроническую формы инфекции [Маянский А.Н., 1999; Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Arbutnot P., Kew М., 2001].

Персистирующие в макроорганизме вирусы в процессе эволюции приобрели множество свойств, позволяющих им длительно существовать в макроорганизме [Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991]. Причинами «ускользания» вирусов от иммунного надзора могут быть перманентная изменчивость их антигенной структуры, а также подавление индукции и реализации иммунного ответа [Ferrari С., 1998; Хаитов P.M. и соавт., 2000; ' i Arbutnot P., 2001; Blackwell J.M., 2001]. Подавление индукции иммунного ответа может осуществляться за счет интеграции генетического материала вируса в геном клетки-хозяина, антигенной «мимикрии» вирусов, блокирования процессинга и презентации антигенов, а также накопления мутаций иммунного ускользания [Dhillon А.Р., Dusheiko G.M., 1995; Lewy J .А., 1997; Pagliaro L. et al., 1999; Ивашкин B.T. и соавт., 2000; Freeman A.G. et al., 2001]. Нарушение реализации иммунного ответа может явиться следствием сниженной реактивности Т-системы иммунитета и нарушения 1 презентации антигенов антигенпредставляющими клетками [Апросина З.Г., 1 Серов В.В., 2001; Wakimoto Н. et al., 2003].

Одним из ведущих аспектов в патогенезе формирования персистирования вирусов является изменение цитокин-продуцирующей способности иммунокомпетентных клеток [Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001; Wakimoto Н. et al., 2003]. Цитокины, вырабатываемые Т-хелперами типа 1 (у-интерферон (y-IFN) и интерлейкин-2 (IL-2)), - принимают участие в клеточном иммунном ответе и ассоциируются с защитным антивирусным эффектом [Хаитов P.M., 2001; Kaspzak A. et al., 2004]. Недостаток продукции IL-2 способствует хронизации вирусной инфекции [Eckels D.D. et al., 1999]. В то же время увеличение синтеза цитокинов Т-хелперами типа 2 - IL-4, -5, -9, I

-10, усиливающих гуморальный иммунный ответ, может приводить к; трансформации заболевания в хроническую форму [Seder R.A. et al., 1998; Jia H. et al., 2003]. Одним из ключевых цитокинов является фактор некроза опухоли-а (TNF-а), оказывающий мощное провоспалительное действие и играющий важную роль в реализации противовирусного иммунитета , [Willson A.G. et al., 1997; Ягода А.В. и соавт., 2001; Приймяги JI.C. и соавт., 2002].

В связи с этим представляется актуальным исследование характера нарушения цитокин-продуцирующей способности мононуклеаров I периферической крови при формировании персистирования вирусов гепатита! В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса. Полученные в указанном аспекте новые знания фундаментального характера позволят, на наш взгляд, расширить представления о патогенезе персистентных вирусных инфекций, и обосновать новые, патогенетически оправданные способы ранней t диагностики и коррекции дизрегуляции иммунной системы при данной патологии.

Цель исследования: установить роль дизрегуляции продукции мононуклеарами y-IFN, иммунорегуляторных цитокинов с I провоспалнтельнымн (IL-2, IL-6, IL-12, TNF-a) и противовоспалительными^ (IL-4, IL-10) эффектами в иммунопатогенезе персистентных вирусных инфекций.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: *

1. Установить особенности функционального и метаболического статуса лимфоцитов, цитокинпродуцирующей способности мононуклеарных| лейкоцитов (y-IFN, TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12) у больных хроническим вирусным гепатитом В и С в зависимости от таксономической принадлежности возбудителя и активности патологического процесса. {

2. Выявить клинико-иммунологические параллели при хроническом носительстве вируса клещевого энцефалита.

3. Дать комплексную оценку функциональных свойств лимфоцитов и способности мононуклеаров крови к продукции y-IFN, I иммунорегуляторных цитокинов с про- и противовоспалительными! эффектами при обострении и ремиссии хронической герпетической инфекции.

4. Оценить характер перестройки цитокиновой сети и межклеточных взаимодействий иммунокомпетентных клеток при длительной i персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование субпопуляционного состава и функционального статуса лимфоцитов, I способности мононуклеаров периферической крови продуцировать y-IFN J цитокинов с провоспалительными (IL-2, IL-6, IL-12, TNF-a) и противовоспалительными (IL-4, IL-10) эффектами при персистентных вирусных инфекциях, вызванных различными возбудителями (вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса). Установлено, что I хронизация гепатита В, С и В+С, клещевого энцефалита и герпетической инфекции сопровождается нарушениями клеточного звена иммунитета: на фоне снижения содержания NK-клеток развивается дисбаланс Т-звена системы иммунитета, проявляющийся уменьшением количества CD3+-, С04+-лимфоцитов и снижением иммунорегуляторного индекса^ (CD4+/CD8+). Степень выраженности указанных расстройств практически не определяется видом возбудителя и активностью инфекционного процесса. При обследовании пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатитов В, С, клещевого энцефалита и простого герпеса обнаружено повышение пролиферативной активности и изменение метаболического статуса лимфоцитов периферической крови. Получены новые данные] свидетельствующие о том, что при хроническом течении вирусного гепатита В, С, В+С, герпетической инфекции и носительстве антигена вируса клещевого энцефалита выражен дисбаланс продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови. Длительная персистенция вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и вируса простого герпеса сопровождается дизрегуляцией продукции y-IFN, иммунорегуляторных цитокинов с провоспалительными (TNF-a, IL-2, IL -12) и противовоспалительными (IL-4, IL-10) эффектами, что носит не только I патологический, но и адаптивный характер, о чем свидетельствует типовое возрастание продукции мононуклеарами цитокинов с противовирусным и противовоспалительным эффектами.

Практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые патофизиологические аспекты хронизации . инфекционного процесса при инфицировании вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения инфекционного процесса при гепатитах В, С, В+С, I клещевом энцефалите, герпетической инфекции, а также патогенетически1 оправданных способов предупреждения и коррекции выявленных нарушений.

Положения, выносимые на защиту: 1. Персистентные вирусные инфекции характеризуются выраженной 1 дизрегуляцией продукции иммунорегуляторных цитокинов с провоспалительными (TNF-a, IL-2, IL -12) и противовоспалительными

IL-4, IL-10) функциями, которая носит не только патологический, но и адаптивный характер.

2. Дисбаланс иммунной системы в условиях длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса характеризуется угнетением Т-клеточного звена иммунной системы (снижение количества CD3+-, С04+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса), сопровождающимся перестройкой внутриклеточного метаболизма лимфоцитарных клеток| периферической крови и усилением пролиферативной активности Т-лимфоцитов.

3. Изменения метаболического и функционального статуса лимфоцитов периферической крови, дизрегуляция продукции цитокинов , t мононуклеарами крови при хроническом течении вирусного гепатита В, С, В+С слабовыраженной и умеренной степени активности, хроническом носительстве антигена вируса клещевого энцефалита с клинической и без клинической симптоматики нейроинфекции, I хронической герпетической инфекцией носят однотипный характер. 1 Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на межгородской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2002), всероссийской научной конференции "Нервно-психическое утомление человека в современных , условиях" (Москва, 2002), городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской библиотеки СГМУ (Томск, 2002), VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003), IV и V международном конгрессе молодых ученых и I специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003; 2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2004), Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004).

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом, по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4) и Администрацией Томской области по проблеме «Создание и внедрение панели молекулярно-генетических маркеров для прогнозирования течения и исходов вирусных гепатитов» (договор №136 от 23.09.2004 г.).

Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии и инфекционным болезням i для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из которых 5 - в центральных рецензируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 205 страницах , машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 362 источников, из которых 217 отечественных и 145 иностранных. Диссертация иллюстрирована 47 таблицами, 8 рисунками.

166 ВЫВОДЫ:

1. Длительная персистенция вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и вируса простого герпеса сопровождается увеличением | конституциональной продукции y-IFN мононуклеарами крови при сохраненном резервном потенциале мононуклеарных клеток к синтезу этого цитокина с противовирусным эффектом.

2. Персистентные вирусные инфекции (вирусным гепатитом В и С, носительство антигена вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) характеризуются выраженным нарушением продукции иммунорегуляторных провоспалительных (TNF-a, IL-2, IL -12) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов.

3. Дизрегуляция иммунной системы при формировании длительной | персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса у пациентов со стертыми клиническими проявлениями инфекции носит не только патологический, но и адаптивный характер, о чем свидетельствует типовое возрастание продукции мононуклеарами цитокинов с противовирусными и противовоспалительными эффектами.

4. Длительная персистенция в организме вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса сопровождается перестройкой внутриклеточного метаболизма лимфоцитарных клеток | периферической крови, приводящей к накоплению липидов, увеличению активности неспецифической эстеразы, и усилением пролиферативной активности Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию их фитогемагглютинином.

5. Типовым нарушением иммунной системы в условиях длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса является угнетение Т-клеточного звена иммунной системы (снижение количества CD3+-, С04+-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса), а также уменьшение численности | популяции СБ56+-клеток.

6. Изменения цитокинподуцирующей способности мононуклеаров крови, метаболического и функционального статуса лимфоцитов периферической крови при хроническом течении вирусного гепатита В, С, В+С слабовыраженной и умеренной степени активности, хроническом носительстве антигена вируса клещевого энцефалита с клинической и без клинической симптоматики нейроинфекции, хронической герпетической инфекцией носят однотипный характер.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ |

Рассматривая проблему длительной вирусной персистенции на молекулярном и клеточном уровнях, вероятно, нельзя четко разграничить значение биологических свойств возбудителя и макрооорганизма. Благоприятный исход вирусной инфекции, с одной стороны, определяется j патогенностью штамма возбудителя, с другой, - адекватным ответом со j стороны системы иммунитета. Ключевым моментом, определяющим исход вирусной патологии, является баланс продукции цитокинов клетками

49 I иммунной системы. Не вызывает никаких сомнений, что выраженные нарушения Thl-Th2 пути иммунного ответа, характерные для большинства хронических вирусных инфекций, и, следовательно, дизрегуляция продукции и взаимодействия секретируемых цитокинов лежат в основе патогенеза | длительной вирусной персистенции. Однако роль цитокинов в механизмах ! формирования вирусной персистенции до конца не ясна. Дальнейшее и более углубленное изучение иммунофенотипического и цитокинового профиля, на наш взгляд, позволит расширить существующие на сегодняшний день представления о патогенезе персистентных вирусных инфекций и, возможно] разработать новые подходы к патогенетически оправданной терапии.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Общая характеристика клинического материала

В настоящей работе приведены результаты комплексного исследования функционального и метаболического статуса лимфоцитов у 189 пациентов (121 мужчина, 68 женщин в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст - 33±J лет) с длительной персистенцией вирусов гепатитов В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса. Обследованные находились на диспансерном учете и стационарном лечении в отделении гастроэнтерологии Томской областной клинической больницы (главный врач - Б.Т. Серых), инфекционном отделении клиник ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Минздрава Российской Федерации» (главный врач

- к.м.н. В.М. Шевелев), медико-санитарной части «Строитель» г. Томска (главный врач - В.Г. Козлов) и ГУЗ «Томский областной центр| профилактики и борьбы со СПИД и другими инфекционными заболеваниями Департамента здравоохранения Администрации Томской области» (главный врач - А.С. Чернов).

В зависимости от этиологического фактора инфекции обследованные пациенты были разделены на три группы: первую группу составили 118 больных с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, вторую - 31 пациент с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита, третью

- 40 пациентов с хронической герпетической инфекцией (табл. 3).

Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были! исключены инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и наркотическая зависимость.

Контрольную группу составил 41 практически здоровый донор с аналогичными характеристиками по полу и возрасту.