Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Иммунопатогенез персистентных вирусных инфекций

На правей рукописи

НАСЛЕДНИКОВА Ирина Олеговна

ИММУНОПАТОГЕНЕЗ ПЕРСИСТЕНТНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск-2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Новицкий Вячеслав Викторович Рязанцева Наталья Владимировна

Федорова Татьяна Сергеевна

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Лишманов Юрий Борисович

Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Ведущая организация:

ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва.

Защита состоится чАЛ 2005 г. в ^^ часов на заседании

диссертационного совета Д*208.096^01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан « 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Суханова Г. А.

ZOoyi 2 7$

О ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клинический облик многих вирусных инфекций связан с длительным присутствием возбудителя в организме. Феномен вирусной персистенции является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [Dillon А.Р., Dusheiko G.M., 1995; Ahmed R. et. Al, 1996; Porh A., 1997; Маянский A.H., 1999; Cerny A., Chisari F., 1999; Антонов П.В., Цинзер-линг B.A., 2001; Апросина З.Г., Серов В.В., 2001; Жукова О.Б. и соавт., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003]. В ее основе лежит способность вирусов закрепляться в клеточных популяциях, используя для этого разнообразные приемы - от «замораживания» собственных генов в хромосомах клетки-хозяина до агрессивного вмешательства в систему индукторов и эффекторов иммунитета [Маянский А.Н. и соавт., 1998; Антонов П.В., Цинзерлинг В .А., 2001; Непомнящих Г.И. и соавт., 2001; Львов Д.К., 2004].

Понятие «персистенция» включает различные формы длительного взаимодействия вируса с клеткой или организмом. В настоящее время принято различать: латентное персистирование - длительное бессимптомное пребывание возбудителя в организме или в клеточной системе с затрудненным выделением вируса; хроническое персистирование возбудителя, сопровождающееся периодической манифестацией процесса; и собственно персистенцию - длительное пребывание возбудителя в организме или клеточной системе с регулярным выделением вируса [Ахмадулина Н. Б., 1990; Алгол В.И., 1997; Борисов Л.Б., 2001; Покровский В.И. и соавт., 2003]. Сегодня посредством молекулярно-генетических методов исследования вполне убедительно доказана способность большинства вирусов к длительной, нередко пожизненной персистенции в инфицированном организме [Маянский А.Н., 1999; Королюк A.M., Сбойчаков В.Б., 2002; Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., 2002].

Многие вирусы, в частности вирусы гепатита В и С, иммунодефицита человека, простого герпеса, Эпштейна-Барр, клещевого энцефалита, цитомегалии, гриппа, полиомиелита, ретровирусы, аденовирусы и др., обладающие способностью длительно сохраняться в макроорганизме, могут поражать многие органы и системы, вызывая хроническую форму инфекции [Алгол В.И., 1997; Амосов А.Д., 2002; Непомнящих Г.И. и соавт., 2003; Серов В.В. и соавт., 2003; Львов Д.К., 2004]. Исследования последних лет показали, что, несмотря на достигнутые успехи в изучении молекулярно-биологических основ длительной вирусной персистенции, на сегодня не существует единой концепции патогенеза данной инфекционной патологии [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000, 2001; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Arbutnot P., Kew М., 2001].

Следует отметить, что факторы, позволяющие вирусам сохраняться в организме человека, и условия, способстлу^^ге^я^птаг^е« яческих форм бо-

ст^

БИБЛИОТЕКА

С Петербург у •8 IWHm

лезней, также остаются недостаточно изученными [Ploegh H.L., 1998; Ивашкин В.Т. и соавт., 2000, 2001; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Новицкий В.В., Ура-зова О.И., 2004]. Несмотря на индукцию вирусспецифического иммунного ответа, у большинства инфицированных лиц это не приводит к элиминации возбудителя инфекции [Маянский А.Н., 1999; Долгих В.Т., 2000; Серов В.В., Мухин H.A., 2000; Хаитов P.M., 2001; Arbutnot P., Kew М., 2001; Mazzaro С. et al., 2001; Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., 2002].

В середине прошлого столетия была сформулирована концепция, согласно которой подверженность той или иной болезни обусловлена сочетанием в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся при взаимодействии с факторами среды патологического фенотипа [Falconer D. S., 1965]. В соответствии с этим одни индивиды обладают относительной резистентностью к инфицированию вирусами, тогда как другие — подвержены развитию болезни при контакте с ее возбудителем.

Переход вирусного инфекционного заболевания в хроническую форму может быть вызван нарушением генетического контроля за иммунным ответом. На сегодняшний день картирован ряд генов, непосредственно определяющих высокую или низкую чувствительность организма к инфекционным агентам [Samuel С.Е., 1991, 2001; Stark G.R. et al., 1998; Lio D. et al., 2003; Mueller Т. et al., 2004; Ollier W.E., 2004].

По современным представлениям, генетическая детерминированность иммунного ответа макроорганизма предопределяет жизненный цикл инфекционного агента. Однако при этом нельзя не учитывать свойства вируса, действие которого направлено на модулирование защитных сил организма и «ускользание» от иммунного надзора [Петров Р.В. и соавт., 1981; Хаитов P.M., Алексеев Л.П., 1998; Ploegh H.L., 1998; Mondelli M.U., Silini Е., 1999; Петров Р.В., Хаитов P.M., 2000; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001].

Несмотря на получение новых данных фундаментального характера о механизмах персистенции вирусов, неразрешенным остаётся вопрос: вирусоноси-тельство - вариант «мирного сосуществования» возбудителя инфекции и макроорганизма либо скрытый патологический процесс? Следует признать, что единого мнения на этот счет нет. В любом случае внедрение вируса в клетку макроорганизма - прежде всего «сигнал опасности», активизирующий врожденные и адаптивные механизмы системы иммунитета, направленные на элиминацию ин-фектогена. При этом основной детерминантой патогенеза хронических перси-стентных вирусных инфекций, на наш взгляд, следует считать клеточно-опосредованный иммунитет.

Цель исследования: установить общие закономерности и особенности иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций разного генеза.

Задачи исследования:

1. Определить направленность клеточной дифференцировки и пролифератив-ный потенциал лимфоцитов периферической крови у пациентов с перси-стентными вирусными инфекциями, вызванными вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса.

2. Оценить роль дисбаланса иммунорегуляторных цитокинов в механизмах нарушения межклеточной кооперации иммуноцитов при персистентных вирусных инфекциях.

3. Дать комплексную оценку структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.

4. Выявить иммуногенетические критерии предрасположенности к хрониза-ции вирусных гепатитов и резистентности к прогрессированию заболевания. Путем определения характера распределения аллельных вариантов промо-торных регионов генов цитокинов IL2, IL4, ILIO среди лиц европеоидной популяции, а также степень их ассоциированности с уровнем продукции соответствующих цитокинов.

5. Определить клинико-иммунологические параллели при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.

Научная новизна. Впервые с привлечением комплекса современных гематологических, иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования освещены пути реализации иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций. Установлено, что изменения реагирования системы иммунитета при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса являются однонаправленными.

Показано, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией развивается дизрегуляция антигенспецифи-ческого звена системы иммунитета, проявляющаяся нарушением процессов дифференцировки лимфоцитов (уменьшение количества CD3+-, СБ4+-клеток и снижение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+)), изменение пролифера-тивной активности и апоптотического потенциала лимфоцитарных клеток периферической крови.

Установлено, что персистентные вирусные инфекции сопровождает выраженный дисбаланс продукции иммунорегуляторных цитокинов. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С, В+С, хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией отмечается значительное повышение продукции IFN-y мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. При персистентных вирусных инфекциях увеличивается секреция IL-4, DL-6 и снижается продукция TNF-a, IL-2, IL-12 моно-

нуклеарами крови. У больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С продукция IL-10 мононуклеарными лейкоцитами увеличена.

Получены новые данные, указывающие на факт дезорганизация поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови. Длительная перси-стенция вирусов гепатита В и С, а также антигенемия вируса клещевого энцефалита сопровождается структурной модификацией липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов. Изменение метаболического статуса лимфоцитов периферической крови у пациентов с пер-систентными вирусными инфекциями характеризуется увеличением содержания внутриклеточных липидов и активностью неспецифической эстеразы.

Установлено, что степень риска прогрессирования и хронизации вирусных гепатитов среди лиц европеоидной популяции ассоциирована с аллелями промо-торных регионов -330G гена IL2 и -592А гена ILIO, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена IL4. Фактором резистентности к длительной персистенции вирусов гепатита В и С является генотип С/С промоторного региона С-592А гена ILIO.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые патофизиологические, иммунологические и иммуногенетические аспекты развития персистентных вирусных инфекций. Показана значимая роль нарушений структурно-метаболического и функционального состояния лимфоцитарных клеток, цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров периферической крови в механизмах формирования персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса. Выявлены иммуногенетические факторы риска прогрессирования и резистентности к хронизации вирусных гепатитов В, С и В+С, ассоциированные с аллелями промоторных регионов генов IL2, IL4 и ILIO. Положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения патогенетических механизмов персистентных вирусных инфекций, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения инфекционного процесса при гепатитах В, С, В+С, клещевом энцефалите, герпетической инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Персистентные вирусные инфекции (хронический вирусный гепатит В, С, В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) сопровождаются угнетением Т-клеточного звена иммунитета, выраженным изменением процессов пролиферации и дифферен-цировки лимфоцитарных клеток, а также нарушением межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток.

2. Механизмы дисбаланса кооперативного взаимодействия иммуноцитов при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и

В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) сопряжены с поляризацией иммунного ответа в направлении ТЫ.

3. Персистентные вирусные инфекции сопровождаются выраженными изменениями структурно-метаболических свойств лимфоцитов периферической крови, к числу которых относятся дезорганизация поверхностной архитектоники, структурная модификация липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов, увеличение содержания липидов и активности неспецифической эстеразы в лимфоцитарных клетках.

4. Иммуногенетическим фактором предрасположенности к длительной перси-стенции вирусов гепатита В и С среди лиц европеоидной популяции является генотип С/С промоторного региона С-592А гена ILIO. Степень риска про-грессирования и хронизации вирусного гепатита В и С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена ILIO, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена EL4.

5. Общая направленность иммунопатологических расстройств (угнетение ан-тигенспецифического звена иммунного ответа, дисбаланс кооперативного взаимодействия иммуноцитов, дизрегуляция процессов пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, нарушение структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови) при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция), проявляющихся стертым клиническим течением, не определяется таксономической принадлежностью возбудителя инфекции.

Апробация и реализация работы. Результаты исследования обсуждались на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003), Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), Выездном пленуме правления Научного общества гастроэнтерологов «Новые горизонты гастроэнтерологии» (Новосибирск, 2004), Четвертом съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизре-гуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004), Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005).

Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (раздел «Патофизиология системы иммунитета», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология клетки») на лечебном, педиатрическом и фармацевтическом факультетах ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава».

Исследование выполнено в рамках Федеральной научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006 годов» по мероприятию «Развитие системы ведущих научных школ как среды генерации знаний и подготовки научно-педагогических кадров высшей квалификации. Проведение научно-исследовательских работ по приоритетным направлениям Программы» (№ РИ 112/001/158), а также при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (№ НШ-1051.2003.4) «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток при патологии» и Администрации Томской области (договор №136 от 23.09.2004) «Создание и внедрение панели молекулярно-генетических маркеров для прогнозирования течения и исхода вирусных гепатитов».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 работ, из них 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ, одна монография в соавторстве и 27 статей и тезисов в сборниках научных трудов и материалов съездов, конгрессов и конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 346 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 83 таблицами и 18 рисунками. Библиографический указатель включает 680 источников (393 - отечественных и 287 - иностранных).

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе приведены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 277 больных (168 мужчин и 109 женщин в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст - 31±3 года) с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса типов 1 и 2. Пациенты находились на диспансерном учете и стационарном лечении в отделении гастроэнтерологии Томской областной клинической больницы, инфекционном отделении клиник ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», инфекционном отделении МЛПУ медико-санитарной части «Строитель» г. Томска и ГУЗ «Томский областной центр профилактики и борьбы со СПИД и другими инфекционными заболеваниями Департамента здравоохранения Адми-

нистрации Томской области». Контрольную группу составили 80 практически здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту.

В зависимости от этиологического варианта инфекции обследованные пациенты были разделены на три группы: первую группу составили 158 больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, вторую - 79 пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита, третью - 40 пациентов с хронической герпетической инфекцией. Обследование проводилось до назначения специфической противовирусной и корригирующей терапии. Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены инфекционные заболевания другой этиологии, выраженные аутоиммунные проявления на фоне вирусной персистенции, обострение хронических воспалительных процессов, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и наркотическая зависимость.

В программу исследования были включены 158 пациентов, страдающих вирусным гепатитом В, С и В+С (по МКБ-10 рубрики В 18.0 - хронический вирусный гепатит В с дельта-антигеном, В 18.1 - хронический вирусный гепатит В без дельта-антигена, В18.2 - хронический вирусный гепатит С, В18.8 - другой хронический вирусный гепатит). Все пациенты представляли группу риска по инфицированию парентеральными вирусными гепатитами (в анамнезе были указания о лечении или удалении зубов, оперативных вмешательствах с переливанием крови и ее компонентов, сексуальных и бытовых контактах с больными хроническим вирусным гепатитом, контактах с препаратами крови и больными хроническим вирусным гепатитом у медицинских работников).

Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на выявлении синдромов гепато- и спленомегалии, холестаза, цитолиза (повышение уровня АлАТ, АсАТ в сыворотке крови), а также мезенхимально-воспалительного синдрома. Верификация диагноза проводилась на основании выявления в сыворотке крови ДНК HBV, РНК HCV (методом ПЦР), серологических маркеров HBV (HbeAg, HBsAg, анти-НВс IgM, анти-Hbcor) и HCV (анти-HCV IgG к core-, С-протеину, неструктурным бежам (NS3, NS4, NS5), анти-HCV IgM).

По выраженности некроза паренхимы печени и воспалительной клеточной инфильтрации определяли степень активности вирусного гепатита: минимальная (1-4 балла), слабовыраженная (5-8 баллов), умеренная (9-12 баллов) и высокая (13-18 баллов), оценивая выраженность качественных и количественных изменений печеночной паренхимы с помощью индекса гистологической активности (ИГА) в соответствии с классификацией R. Knodell [1981]. Давность хронического вирусного гепатита составляла от 1 года до 18 лет (в среднем 7±3 года). До момента обследования больные не получали этиотропной противовирусной терапии.

В соответствии с классификацией, принятой Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос-Анджелесе [1994], были выделены следующие клинические группы: 1) больные хроническим гепатитом В слабовыраженной степени активности - 19 человек; 2) больные хроническим гепатитом В умеренной степени активности - 16 человек; 3) больные хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности - 36 человек; 4) больные хроническим гепатитом С умеренной степени активности - 58 человек; 5) больные хроническим микст-гепатитом В+С слабовыраженной степени активности - 13 человек; 6) больные хроническим микст-гепатитом В+С умеренной степени активности - 16 человек.

По результатам генотипирования НСУ у 57% пациентов был выявлен 1Ь генотип НСУ, у остальных обследованных - генотипы 2а и За.

Анализ клинической картины у пациентов с хроническими вирусными гепатитами умеренной степени активности показал, что наиболее часто у пациентов выявлялся астеновегетативный синдром (83%). Диспепсический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) встречался у 56% пациентов. Синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) чаще обнаруживался у больных хроническим гепатитом С (52%), чем у пациентов с хроническим гепатитом В (44%) и В+С (49%). В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикаль-но, подтверждались результатами ультразвукового исследования. При анализе биохимических показателей крови ведущим был синдром цитолиза. У пациентов с хроническим гепатитом В умеренной степени активности повышение АсАТ и АлАТ отмечалось в 82% случаев, у пациентов с хроническим гепатитом С - в 68%, у больных с микст-инфекцией - в 70%.

Пациенты с хроническими вирусными гепатитами слабовыраженной степени активности характеризовались отсутствием клинической симптоматики и ультразвуковых признаков поражения печени, нормальными значениями биохимических показателей. Астеновегетативный синдром выявлялся у 52% пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, у 43% пациентов с хроническим вирусным гепатитом Сиу 65% пациентов с хроническим вирусным гепатитом В+С. Диагноз основывался на данных анамнеза, а также результатах обнаружения серологических маркеров НВУ- и НСУ-инфекции (НВв-антигена и анти-НСУ соответственно). Метод молекулярно-генетического исследования подтверждал наличие в сыворотке крови у больных ДНК НВУ и РНК НСУ.

Пациенты, страдающие клещевым энцефалитом (по МКБ-10 рубрика А84.0), были объединены в группы на основании клинической классификации, предложенной Н.Г. Жуковой и соавт. [2000]. Верификацию диагноза проводили на основании данных эпидемиологического анамнеза (факт присасывания клеща, пребывание в эпидемическом очаге и др.), результатов лабораторного исследования (определение уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита с помощью иммуноферментного анализа, реакции непрямой

гемагглютинации; обнаружение вирусной РНК методом ПЦР), а также оценки неврологического статуса.

Первую группу обследованных составили 44 пациента с бессимптомным носительством вируса клещевого энцефалита (более 6 мес с момента инфицирования). У пациентов отсутствовали клинические симптомы заболевания, однако в крови обнаруживались РНК вируса клещевого энцефалита, а также повышенный уровень специфических антител IgM и IgG. Во вторую группу обследованных были включены 35 пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита с минимальными клиническими проявлениями нейроинфекции. Продолжительность заболевания у таких пациентов составляла от 8 до 30 мес. Примечательно, что после инфицирования вирусами клещевого энцефалита у 16 больных развивалась картина лихорадочной, у 19 - стертой форм нейроинфекции. Основными клиническими проявлениями длительной персистенции вируса клещевого энцефалита у таких пациентов были астеновегетативный синдром (головная боль, повышенная утомляемость) - в 81% случаев и остаточная неврологическая симптоматика (невралгия, миалгия, локальное снижение болевой чувствительности) - у 68% обследованных пациентов.

В исследование были включены пациенты, страдающие хронической герпетической инфекцией (по МКБ-10 рубрики В00.1 - герпетический везикулярный дерматит, вызванный вирусом простого герпеса; В00.5 - герпетическая болезнь глаз, вызванная вирусом простого герпеса; А60.0 — герпетические инфекции половых органов и мочеполового тракта). Верификацию диагноза проводили на основании клинико-эпидемиологических данных, результатов лабораторного исследования (определение антигерпетических IgM- и IgG-антител сероти-пов 1 и 2 с помощью иммуноферментного анализа, а также выявление ДНК вируса простого герпеса типов 1 и 2 с использованием ПЦР).

Первую группу обследованных составили 26 пациентов с хронической герпетической инфекцией в стадии обострения. Основным клиническим синдромом был астеновегетативный: 94% пациентов предъявляли жалобы на слабость, снижение работоспособности, головные боли, нарушение сна, потливость. Герпетическая сыпь у 12 пациентов была локализована вокруг рта и на губах (herpes labialis), у 8 обследованных был обнаружен кератоконъюнктивит, у 6 -герпетические поражения гениталий. Во вторую группу обследованных были включены 14 пациентов с хронической герпетической инфекцией в стадии ремиссии. У пациентов отсутствовали клинические симптомы заболевания, при этом в крови обнаруживалась ДНК вируса простого герпеса, а также повышенный уровень специфических антигерпетических антител IgM и IgG. Продолжительность межрецидивного периода у таких пациентов составляла от 2 до 17 мес. Примечательно, что при рецидивах герпетические высыпания поражали, как правило, одни и те же участки кожи и слизистых.

У пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса и здоровых доноров проводили комплексное исследование структурных, метаболических и функциональных свойств моно-нуклеаров, а также анализ полиморфизма генов цитокинов. Распределение здоровых доноров и больных с хронической персистенцией вирусов в соответствии с использованными методами исследования представлено в табл. 1.

Материалом исследования служила стабилизированная гепарином (25 Ед/мл) венозная кровь, взятая из локтевой вены утром натощак. Определение общего количества лейкоцитов и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами. Мазки готовили из лей-коконцентрата венозной крови [Меньшиков В.В., 1987]. Для выделения лимфоцитов из крови в качестве градиента плотности использовали Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) [Гольдберг Е.Д и соавт., 1992].

Определение содержания CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD22+-, CD56+-, CD95+-несупдах лимфоцитов проводили иммуноцитохимическим методом с использованием набора реагентов фирмы «Dako» (Дания). При микроскопии идентифицировали окрашенный продукт иммуноферментной реакции, образовавшийся в местах связывания выявляемых антигенов. Положительно окрашенным считался лимфоцит, по окружности которого продукт реакции занимал не менее трети. Проводили подсчет 200 клеток, определяли процент положительно окрашенных клеток [Тотолян А.А. и соавт., 2002].

Пролиферативную активность лимфоцитарных клеток оценивали с использованием теста бластной трансформации лимфоцитов. В культуральную суспензию вносили фитогемагглютинин (ФГА) («Difco», Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры. Результаты теста выражали в процентах неизмененных, переходных и бластных форм лимфоцитов Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

Исследование поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови проводили методом сканирующей электронной микроскопии [Козинец Г.И. и соавт., 1997, 2002]. Лимфоциты фиксировали в 2,5% растворе глютарово-го альдегида, постфиксацию материала проводили в 1% растворе четырехокиси осмия и обезвоживали в серии водных растворов этилового спирта возрастающей концентрации. Дегидратированные лимфоциты наносили тонким слоем на алюминиевые подложки, препараты напыляли серебром в вакуумной установке JEE-4B («JEOL», Япония). Просмотр препаратов осуществляли в электронном микроскопе JEM-100 СХ II с растровой приставкой ASID-4D («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 20 кВ. Для получения количественной характеристики распределения морфологических форм лимфоцитов проводили подсчет не менее 100 произвольно выбранных клеток у каждого обследованного, используя при этом классификации Г.И. Козинца [1984, 2002] и Ю.А. Ровенского [1979]. Для получения электронных микрофотографий лимфоцитарных клеток выполняли фотосъемку лимфоцитарных клеток при увеличении от 4000 до 10000.

Таблица 1

Распределение здоровых допоров и больных с персистенщей вирусов гепатита, клещевого энцефалита и простого герпеса в соответствии с использованными иммуногенетическими, а также методами исследования структурных, метаболических и функциональных особенностей мононуклеаров

Группы обследованных

№ п/п Методы исследования Здоровые доноры Пациенты с хроническим вирусным гепатитом Пациенты с персистенцией вируса клещевого энцефалита Пациенты с хронической герпетической инфекцией

1 Исследование количественных показателей белой крови 53 138 79 40

2 Исследование структуры плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови 39 88 41

3 Исследование поверхностной архитектоники и ультраструктурных особенностей лимфоцитов периферической крови 10 30 13 12

4 Исследование субпопуля-ционного состава лимфоцитов периферической крови 19 69 21 26

5 Исследование пролифера-тивной активности лимфоцитов периферической крови 16 80 24 26

6 Исследование метаболического статуса лимфоцитов периферической крови 26 88 22 32

7 Исследование цитокинпро-дуцирующей способности мононуклеаров периферической крови 10 68 17 18

8 Исследование полиморфизма генов цитокинов 48 103

Исследование ультраструктуры лимфоцитов осуществляли методом трансмиссионной электронной микроскопии. Фиксированные и дегидратированные лимфоциты пропитывали смолами [Уикли И.Б., 1975]. Ультратонкие срезы толщиной 30-60 нм готовили на ультрамикротоме Ultrotome-Ш («LKB», Швеция). Полученные срезы наносили на сетки-подложки с фарфоровым покрытием и контрастировали 2% раствором уранилацетата в 50% этаноле (20-30 мин при 37°С) и цитратом свинца (от 3 до 10 мин при комнатной температуре) по Е. Reynolds [1963]. Полученные препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-100 CXII («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. В каждом случае просматривали не менее 100 лимфоцитов и методом случайной выборки проводили фотосъемку клеток при увеличении от 5200 до 54000 [Уикли И.Б., 1975; КарупуВ.Я„ 1984].

Спектрофлуориметрическое исследование плазматической мембраны лимфоцитов выполняли с использованием флуоресцентного зонда пирен («Sigma», США). Взаимодействие мембран зондом регистрировали на спек-трофлуориметре MPF-4 («Hitachi», Япония). Микровязкость липидной фазы мембраны лимфоцитов оценивали по степени эксимеризации пирена, мигрирующего в ее гидрофобном компартменте, в среде следующего состава (мМ): NaCl-145, трис-НС1-10 (рН 7,4) при длине возбуждающего света 285 и 340 нм. Определяли коэффициент эксимеризации пирена, равный отношению максимумов интенсивностей флуоресценции эксимерной формы зонда (470 нм) к мономерной (370 нм), а также I370A390 при Хв=340 нм для оценки полярности окружения молекул пирена. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофано-вых остатков белка на пирен [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980].

Для получения супернатантов выделенные мононуклеары культивировали в полной культуральной среде, состоящей из 90% RPMT-1640, 10% инактивиро-ванной эмбриональной телячьей сыворотки («ICN Biomedicals Inc.», США), 280 мг/л L-глутамина, 100 мг/л гентамицина, 2 мМ/л HEPES («Flow», Великобритания). Стандартизировали количество клеток в суспензии до 2,0x106/мл. Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили ФГА («Difco», Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуры. Клеточные суспензии в количестве 2 мл инкубировали при 37°С и 5% С02 на протяжении 24 ч [Хаитов P.M. Пинегин Б.В., 2001].

Содержание гликогена и липидов, активность неспецифической эстеразы и кислой фосфатазы оценивали цитохимическими методами исследования [Хейхоу Дж., Кваглино Д., 1983; Меньшиков В.В., 1987; Почтарь М.Е. и соавт., 2003].

Определение уровней иммунорегуляторных цитокинов (IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 и IL-12) в супернатантах проводили с использованием твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» метода. Процедуру выполнения

иммуноферментного анализа проводили по инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Ргосоп», Россия; «Cytimmune», США). Учет результатов иммуноферментого анализа проводили с помощью фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм (для IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4 и IL-6) и 490 нм (для IL-10 и IL-12). Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой.

Выделение ДНК проводили методом фенольной экстракции с помощью коммерческого набора «ВектоДНКэкстракция» («Вектор-Бест», Россия). Гено-типирование аллельных вариантов промоторных регионов генов цитокинов (Т-330G IL2, С-590Т EL4, С-592А ILIO) осуществляли методом рестрикционного анализа продуктов амплификации специфических участков генома. Амплификацию проводили путем полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров (табл. 2) и параметры температурных циклов, описанных в литературе, и учитывая применение нами амплификатора Tercik МС2 («ДНК-технология», Россия).

Таблица 2

Характеристики исследованных полиморфизмов генов цитокинов

Имя гена Полиморфизм Структура праймера Температура отжига (°C) Фермент рестрикции

IL2 T-330G 5 ' -tattcacatgttcagtgtagttct-3 ' 5'- acattagcccacacttaggt -3' 48 Mae I

IL4 С-590Т 5'- cagggagagccaatcagt-3' 5'- atgatgtccagactccaggatct -3' 57 Bsm FI

ILIO С-592А 5' - atccaagacaacactactaa -3' 5'- taaatatcctcaaagttcc -3' 54 Rsal

Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica. for Windows (2000, версия 6.0) фирмы «Statsoft Inc» и пакета программ Microsoft Excel (2003) корпорации «Microsoft». Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Колмогорова-Смирнова. Проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента, критериев Манна-Уитни и Вилкоксона [Бронштейн И.Н., 1986; Боровиков В.В., 2001].

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий х2 Пирсона и точный тест Фишера [Флейс Дж., 1989; Боровиков

В.В., 2001]. Обработка результатов генетических исследований осуществлялась с помощью критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала [Флейс Дж., 1989].

Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изучаемых параметров использовался корреляционный анализ Спирмена. Сравнение многомерных- группировок проводили с помощью дискриминантного анализа с применением алгоритма пошагового отбора информативных признаков [Бронштейн И.Н., 1986; Лакин A.B., 1989; Боровиков В.В., 2001].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В патогенезе хронических вирусных инфекций принципиальны два основных фактора: биологическая стадия жизнедеятельности вируса и характер иммунного ответа макроорганизма [Игнатьева Г.А., 1997; Ferrari С. et al., 1998; Boyer N., 2000; Ярилин A.A., 2001; Freeman A.G. et al., 2001; Gomez I. et al., 2003]. Тяжесть течения вирусной инфекции при этом обусловлена не исключительно генетической организацией вируса, а сложным комплексом взаимодействия инфекта и хозяина. Состояние иммунной системы последнего играет столь же важную роль, что и таксономическая принадлежность микроорганизма. Одним из общих условий для патогенетически значимой активации вирусов является ослабление резистентности хозяина. Впрочем, и нормально функционирующая иммунная система не только не гарантирует защиты от клинически значимой персистенции вирусов, но и непосредственно участвует в реализации ее патогенетического потенциала. Это совершенно необходимо для вирусов, которые лишены собственной цитотоксичности, формально безвредны для изолированных клеток, но обретают болезнетворность, подключая эффекторы иммунитета [Koziel М. J., 1997; Абелев Г.И., 1998; Земсков A.M. и соавт., 2001; Серов В.В., 2001; Толоконская Н.П. и соавт., 2001; Маммаев С.Н., 2002; Непомнящих Г.И. и соавт., 2002; Пименов Е.В. и соавт., 2003].

Установлено, что пусковым моментом для включения специфического иммунного ответа является взаимодействие Т-хелпера с антигенпрезентирую-щей клеткой, на поверхности которой присутствует антигенный пептид, ком-плексированный с молекулой МНС II класса [Madden D.R., 1995; Mach В. et al., 1996; Фрейдлин И.С., 1998; Хаитов P.M., 2001; Мезенцева М.В. и соавт., 2002; Пащенков М.В и соавт., 2002]. Это готовит клетку к пролиферации, лежащей в основе любых форм проявления активности лимфоцитов [Van Seventer G.A. et al., 1991; Janeway C.A., 1992; Lindsey P.S. et al., 1993; Lenshaw D.J. et al., 1996; Chambers C.A. et al., 1997; Хаитов P.M., 2000, 2001; Корочкина O.B. и соавт., 2003; Симбирцев A.C., 2004].

По мнению ряда авторов, активность Т-клеточного звена иммунитета при хронической вирусной инфекции играет крайне важную роль [Koziel М. J., 1997; Mason D. et al., 1998; Chang K.M. et al., 2001; Аммосов А.Д., 2002; Маммаев C.H. и соавт., 2002; Новицкий В.В. и соавт., 2002]. Результаты иммуноцитохимиче-ского исследования лимфоцитов у пациентов с персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса, полученные в ходе нашего исследования, носили однонаправленный характер и свидетельствовали о дефекте Т-клеточного звена иммунитета, как в количественном так и в качественном составе клеток.

Так, у больных хроническим вирусным гепатитом В слабовыраженной и умеренной степеней активности статистически значимо снижалось (по сравнению с контролем) относительное содержание зрелых СБЗ+-клеток (54,14±3,71%, р<0,05 и 54,86±3,52%, р<0,05, соответственно), абсолютное и относительное число СЭ4+-лимфоцитов (соответственно 0,42±0,11 Г/л, р<0,05 и 22,14±2,47%, р<0,01; 0,37±0,12%, р<0,01 и 20,56±2,03%, р<0,01) и натуральных киллеров (0,19±0,02 Г/л, р<0,01 и 5,57±0,61%, р<0,01; 0,34±0,02%, р<0,01 и 10,11±1,51%, р<0,05), а также иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+) (0,84±0,15, р<0,05 и 0,97±0,15, р<0,05). При анализе параметров, характеризующих субпопуляцион-ный состав лимфоцитов периферической крови, у пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита С, клещевого энцефалита и простого герпеса были выявлены изменения аналогичного характера.

Отсутствие эффективного Т-клеточного ответа у пациентов с длительной вирусной персистенцией может быть обусловлено низким уровнем репликации вируса, что вызывает низкую экспрессию HLA и других вспомогательных молекул на поверхности инфицированных клеток (ниже порога индукции Т-клеточного ответа). В частности известно, что HCV способен влиять на процесс активации CD4+-T-лимфоцитов, нарушая взаимодействие антигенпрезенти-рующих клеток с Т-лимфоцитами. В ряде исследований показана также возможность процессинга неиммуногенных фрагментов core-белка, которые нарушают распознавание соге-протеина и ингибируют активацию С04+-клеток [Bartenschlager R., Lohman V., 2000; Otsuka М. et al., 2002]. С другой стороны, дефект популяции зрелых Т-клеток и CD4+-лимфоцитов может быть опосредован развивающимся в ходе длительной персистенции дисбалансом продукции цитокинов [Arai К. et al., 1990; Павлова JI.E. и соавт, 2000; Freeman A.G. et al., 2001; Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004].

Основной результат активации Т-клеток состоит в индукции экспрессии генов ростовых факторов и их рецепторов. EL-2, являясь основным аутокринным ростовым фактором Т-лимфоцитов, обеспечивает их клональную экспансию при ответе на антиген. Распознавание специфического антигена TCR в сочетании с сопутствующими сигналами костимуляции индуцирует вступление Т-

лимфоцита в Gpфазу клеточного цикла и активацию нескольких факторов транскрипции [Мищенко В. А. и соавт., 1994; Симбирцев A.C., 1998, 2004; Eckels D.D. et al., 1999; Хаитов P.M., 2001; Корочкина O.B. и соавт., 2003; Gomez I. et al., 2003]. Контроль транскрипции гена IL-2 связан с определенными зонами 5'-области, где расположены участки связывания энхансеров транскрипции NF-АТ1, NF-kB, АР-1, egr-1. Транскрипционные факторы играют ключевую роль в регуляции экспрессии гена IL2, являющегося аутокринным ростовым фактором лимфоцитов, и а-цепи его рецептора [Симбирцев A.C., 1998, 2002, 2004; Gomez I. et al., 2003].

Установлено, что блокада экспрессии белка NF-AT, представляющего собой важнейшее звено сигнального пути регуляции экспрессии гена IL2, в Т-лимфоцитах сопровождается снижением активности промотора IL-2 и угнетением синтеза цитокина. Все сайты, находящиеся в промоторном регионе, необходимы для полноценной активации в ответ на TCR-зависимую стимуляцию лимфоцита. Полагают, что способность стимулировать экспрессию имеют все присутствующие в лимфоцитах NF-AT-белки - NF-ATI, NF-AT2, NF-AT3, NF-AT4. Причем промотор гена IL2 низко селективен в отношении типа NF-AT, инициирующего транскрипцию. Вероятно, этим объясняется отсутствие влияния на экспрессию данного интерлейкина блокады экспрессии одного из факторов NF-АТ-семейства при условии доступности NF-AT2 и /или NF-AT4 [Симбирцев A.C., 1998; Jia Н. et al., 2003.]. Однако транскрипции гена недостаточно для продукции цитокина, индукция которой нуждается в сигнале, полученном через молекулу CD28, стабилизирующую мРНК IL-2, что способствует увеличению синтеза иммунного медиатора в десятки раз. При связывании TCR и CD28 происходит кооперация сигналов посредством JNK, фосфорилирующей фактор c-jun, что является необходимым для образования АР-1. Сигнал от CD28 принимает участие в активации и другого фактора транскрипции NF-kB. Установлено, что в регуляторном участке гена IL2 локализован элемент, отвечающий на CD28-CD28RE/MFRS, с которым связывается NF-kB. Связывание CD28 ведет к активации факторов транскрипции в 3 раза, при этом продукция IL-2 активированными Т-лимфоцитами возрастает в 100 раз [Eckels D.D. et al., 1999].

Проведенное в нашей лаборатории исследование цитокинпродуцирующей функции мононуклеаров периферической крови у пациентов с длительной пер-систенцией вирусов гепатита В, С, клещевого энцефалита и простого герпеса показало, что индуцированная ФГА продукция IL-2 была достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Вполне закономерно, что угнетение стимулированной продукции IL-2 у больных хроническим вирусным гепатитом умеренной степени активности (121,11±1б,86 пг/мл) носило более выраженный характер, нежели у пациентов с гепатитом слабовыраженной степени активности (168,40±14,85 пг/мл, р<0,05). При этом у лиц с хронической герпетической инфекцией в стадии

ремиссии уровень стимулированной секреции данного цитокина оказался достоверно выше, чем у пациентов в стадии рецидива (150,50±6,00 и 122,50±6,05 пг/мл соответственно, р<0,05).

Механизмы подавления индуцированного синтеза TL-2 при персистентных вирусных инфекциях остаются недостаточно изученными. По-видимому, имеет место не один, а несколько типов ингибирования продукции данного иммуноре-гуляторного белка [Симбирцев A.C., 1998; Eckels D.D. et al., 1999]. Особенности действия, уровень продукции цитокина и его биологическая активность находятся под влиянием различных факторов: соотношения рецепторов - агонистов и антагонистов («ловушек»), связи с компонентами внеклеточного матрикса и белками плазмы, в частности с а2-макроглобулином, способствующим инактивации циркулирующего цитокина, величины pH и антиоксидантного потенциала [Ивашкин В.Т. и соавт., 2002].

Имеются сведения, например, что белковые продукты HCV могут блокировать внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов IFN и снижать секрецию IL-2 и IFN-y активированными Т-лимфоцитами. Это вызывает смещение баланса в пользу Th2, что является частью стратегии выживания вируса [Large M.K. et al., 1999]. Снижение стимулированной ФГА продукции IL-2, одного из основных ростовых факторов для Т-клеток, вероятно, способствовало истощению популяции Т-лимфоцитов.

В ходе специфического иммунного ответа Т-хелперы дифференцируются из С04+-клеток вслед за их пролиферацией. Различают три клона Т-хелперов: ThO, Thl и Th2. Стимулированные вирусной инфекцией макрофаги, продуцируя IL-12, способствуют дифференцировке ThO в Thl, отвечающие в основном за реакции клеточного иммунитета. Thl, в свою очередь, также продуцируют цито-кины, среди которых особое значение имеют IL-2 и IFN-y. IFN-y стимулирует цитотоксические Т-лимфоциты и естественные киллеры. NK-клетки также способны продуцировать IFN-y, который, в свою очередь, вновь активирует макрофаги к продукции IL-12 [Корочкина О.В. и соавт., 2003; Симбирцев A.C., 2004].

Th2 отвечают за развитие гуморального иммунитета. Дифференцировка ThO в Th2 происходит под влиянием IL-4. В то же время IL-4 подавляет продукцию DL-12, предотвращая пролиферацию Thl. Th2 отвечают за гуморальное звено иммунитета, а продуцируемые ими цитокины - IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 - принято относить к числу противовоспалительных цитокинов [Кетлинский С.А., 2002; Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003]. Вирусная инфекция и внутриклеточные паразиты активируют макрофаги к продукции IL-12 и, соответственно, дифференцировке клеток-хелперов в Thl, тогда как бактериальные антигены и аллергены - в Th2 [Кашкин К.П., 1998; Fan X.G. et al., 1998; Носик H.H., 2000; Громова Е.Г. и соавт., 2002] (рис. 1).

Обеспечение клеточных форм иммунного ответа

Обеспечение гуморальных форм иммунного ответа

Рис. 1. Механизмы межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток при персистентных вирусных инфекциях

CD4+ - Т-клетка с CD4 фенотипом, ThO, Thl, Th2 - субпопуляции Т-хелперов, IFN - интерферон, TNF - фактор некроза опухолей, GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагалъный колониестимулирующий фактор

По мнению современных авторов, нарушение баланса продукции цитокинов с превалированием медиаторов Thl либо Th2 пути иммунного ответа играет ключевую роль в иммунопатогенезе персистентных вирусных инфекций [Berto-letti A. et al., 1997; Romagnani S., 1997; Fan X.G. et al., 1998; Игнатова T.M., Серов B.B., 2001; Ивашкин B.T. и соавт., 2002; Маммаев С.Н. и соавт., 2002; Ма-салова О.В. и соавт., 2003; Приймяги JI.C. и соавт., 2003]. Сведения о преобладании цитокинов Thl или Th2 при хронических вирусных инфекциях в литературе довольно противоречивы. По некоторым данным, у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени, ассоциированных с HCV, определялась

повышенная продукция IL-4 и IL-10, низкая - IFN-y [Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004]. Как показали результаты исследования Н.П. Пироговой [2004], хроническая персистенция возбудителя клещевого энцефалита сопровождается: гиперпродукцией IL-12 и глубоким дефицитом синтеза IL-4. Небезынтересно отметить, что инфекция, вызванная HSV, характеризуется угнетением синтеза продуктов ТЫ-лимфоцитов, а именно снижением уровня IL-1 и IL-2 [Исаков В .А. и соавт., 1999; Shcheglovitova O.N., Maksianina E.V., 2004].

Как показали результаты проведенного нами исследования, у пациентов с длительной персистснцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса ФГА-индуцированная продукция IL-12, отражающая резервные возможности мононуклеарных лейкоцитов, оказалась значительно снижена. Однако базальный синтез EL-12 увеличивался лишь у больных хроническим вирусным гепатитом В+С (80,39±4,15 пг/мл при 65,80±4,44 пг/мл у здоровых доноров, р<0,05) и у пациентов с хронической герпетической инфекцией (98,79±4,23 пг/мл, рс0,01).

Нами было установлено, что длительная персистенция вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса сопровождается повышением спонтанной продукции IFN-y мононуклеарными лейкоцитами периферической крови относительно соответствующих показателей у здоровых индивидов. При этом стимулированная ФГА секреция IFN-y, свидетельствующая о резервных возможностях мононуклеаров продуцировать IFN-y, оказалась выше (чем в контроле) лишь у больных хроническим вирусным гепатитом В (385,70±47,37 пг/мл, р<0,01), В+С (372,81±37,78 пг/мл, р<0,05) и у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита (339,55±21,08 пг/мл, р<0,05).

Согласно современным представлениям, IFN-a/-ß, IFN-y,TNF-a и IL-12 принято объединять в группу антивирусных цитокинов благодаря их способности стимулировать транскрипцию DFN в инфицированной клетке, нарушать работу вирусного генома и вирусных протеинов (рис. 1). Однако экспериментальное изучение механизма действия IFN-y на вирусную репликацию в культуре клеток показало, что цитокин обладает слабым антирепликативным эффектом, блокируя самые ранние этапы репродукции вируса, снижая активность вирусной ДНК-полимеразы и других а- и ß-вирусных белков [Кирдей Е.Г., 2000; Хаитов P.M., 2001; Samuel С. Е., 2001].

С другой стороны, протективный эффект IFN-y в значительной степени обусловлен его иммуномодулирующей активностью, нежели непосредственно противовирусным действием. Роль IFN-y в противовирусном иммунном ответе связана с его активирующим влиянием на фагоцитарную активность макрофагов, прямую цитотоксичность Т-лимфоцитов, антителоопосредованный лизис инфицированных клеток макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами [Samuel С. Е., 1988,1991,2001].

В результате экспериментальных исследований в литературе накоплены весьма противоречивые сведения о синтезе IFN-7 при хронических вирусных инфекциях. По мнению одних исследователей, длительная персистенция вирусов сопровождается угнетением продукции IFN-y. При этом более значительно продукция цитокина подавлена у лиц с тяжелым течением хронического заболевания [Smith P.L. et al., 2005]. В работах ряда зарубежных ученых было продемонстрировано достоверное увеличение содержания IFN-y в сыворотке крови у больных хроническим вирусным гепатитом В и С [Eckels D.D. et al., 1999; Jia H. et al., 2003]. Однако исследованиями X.G. Fan et al. [1998] показано, что уровень IFN-y при хронической HCV-инфекции достоверно не изменялся, а при хронической инфекции, вызванной HBV, было выявлено увеличение уровня указанного цитокина в сыворотке крови. A.B. Исаковым и соавт. [1999] было продемонстрировано, что при хронической вирусной инфекции на фоне сниженного уровня сывороточного IFN отмечалась повышенная способность лейкоцитов к продукции индуцированного IFN-a/-ß и IFN-y. Однако, несмотря на активную интерферонпродуци-руюшую способность мононуклеаров, у лиц с HSV-инфекцией регулярно регистрировались рецидивы заболевания.

Полноценность ответной реакции организма на вирусную инфекцию определяется также достаточной продукцией Thl-лимфоцитами TNF-a [Фрейдлин И.С., 1996; Ярилин A.A., 1999]. У обследованных нами пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В, С и клещевого энцефалита отмечалось выраженное угнетение конституциональной и индуцированной способности мононуклеаров периферической крови продуцировать TNF-a по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров. Однако у пациентов с хронической герпетической инфекцией способность мононуклеаров секретировать "TNF-a практически не отличалась от таковой в норме [Новицкий В.В. и соавт., 2005].

Снижение продукции TNF-a — ключевого провоспалительного цитокина, обладающего выраженным противовирусным потенциалом, во многом обусловливает неэффективность иммунной защиты организма в ответ на действие инфек-та (рис. 1) [Хаитов P.M., 2001]. С одной стороны, ограничение продукции TNF-a в условиях длительной вирусной персистенции можно расценивать как реакцию системы иммунитета, направленную на предотвращение реализации проапоптоти-ческого потенциала вирусов и развития необратимого повреждения органов и тканей, обусловленного действием этого цитокина ТЫ пути. Например, показано прямое апоптозиндуцирующее действие HCV на гепатоциты. Центральную роль в индукции апоптоза этим вирусом играет его взаимодействие с рецепторными и сигналпередающими системами клетки [Буеверов А.О., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2002].

С другой стороны, известен феномен защиты от апоптоза клеток, инфицированных HSV, HIV, аденовирусами. Снижение продукции TNF-a можно расце-

нивать как способ предотвращения вирусами Fas-индуцированного апоптоза [Сепиашвили Р.И. и соавт., 2000]. «Ускользание» вирусов из-под иммунного надзора в значительной степени обусловлено их способностью нейтрализовать биологические эффекты цитокинов хозяина, воспроизводить аналоги цитокинов и цито-киновых рецепторов, а также белки, нейтрализующие действие защитных молекул [Koziel M.J., 1999; Ивашкин В.Т. и соавт., 2001].

Внутриклеточная передача эффекторного сигнала TNF-a опосредуется разнообразными мессенджерами (тирозинкиназы, серинтреонинпротеинкиназы и др.), что объясняет широкий спектр биологических эффектов данного цитоки-на. TNF-a при взаимодействии с рецептором TNF-RI, имеющим функциональную связь с каскадом сериновых каспаз, может вызывать апоптоз как инфицированных, так и не инфицированных вирусом клеток-мишеней [Seder R.A., Paul W.E., 1994; Ramadori G., Christ В., 1999]. Известно, что действие TNF-a на клетку, опосредованное TNF-RI, неоднозначно. На одни клетки основным эффектом действия TNF-a является активация транскрипционных факторов NF-kB и JNK, ведущих к индукции провоспалительных и иммуномодулирующих генов. В других клетках активация TNF-RI-рецептора ведет к запуску программированной клеточной гибели. Следует отметить, что в отличие от FasL TNF-a реже самостоятельно индуцирует апоптоз. Несмотря на это, TNF-рецептор часто становится мишенью при патологических процессах. Так, при HIV-инфекции определена усиленная экспрессия TNFRI-рецептора и его взаимосвязь с уровнем апоптоза инфицированных клеток [Zylberberg Н. et а1., 1999]. Кроме того, показано, что увеличение уровня TNF-a - индуктора программированной гибели клеток - при хронической HBV-инфекции может опосредовать усиленный апоптоз гепатоци-тов [Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Маммаев С.Н. и соавт., 2002].

Логично предположить, что еще одним из возможных механизмов снижения уровня TNF-a может быть возрастание содержания «ловушек» цитокинов, в роли которых могут выступать растворимые формы их рецептора sTNF-R. Как свидетельствуют данные, полученные ранее в нашей лаборатории, хронический вирусный гепатит С сопровождается увеличением содержания растворимого рецептора к TNF-a с молекулярной массой 55 кДа [Наследникова И.О. и соавт., 2004; Рязанцева Н.В. и соавт., 2005]. Активация лимфоцитов наряду с экспрессией мембранных рецепторов также сопровождается синтезом растворимых форм рецепторных молекул, являющихся мощными регуляторами активности цитокинов. Внеклеточные домены рецепторов при действии ферментов способны за счет ограниченного протеолиза отщепляться от поверхности клеточных мембран и связываться со свободными молекулами цитокинов вне клетки, препятствуя ассоциации цитокина с мембранными рецепторами непосредственно на клетке-мишени. Тем самым нарушается проведение сигнала и предотвращается реализация эффекта. Растворимые рецепторы могут также выполнять функцию

конкурирующих антагонистов, выступая в роли переносчиков цитокинов, защищая их от разрушения протеазами и удлиняя время существования в системном кровотоке, а также участвуя в доставке цитокинов в очаг поражения и выведении их из организма [Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; Рязанцева Н.В. и соавт., 2005].

Известно, что две основные группы лимфокинов, продуцируемых соответственно ТЫ- и Th2-лимфоцитами, оказывают положительное взаимное влияние. Причем ростовыми факторами для ТЫ- и ТЬ2-клеток являются продуцируемые ими цитокины (соответственно EL-2 и IL-4) [Ярилин A.A., 1997; Хаитов P.M., 2001]. Доказано, что, обладая выраженными контрвоспалительными свойствами, IL-4 и IL-10 стимулируют преимущественно гуморальное звено иммунитета, способствуя дифференцировке по Th2 пути иммунного ответа [Хаитов P.M., 2001].

Как показали результаты настоящего исследования, хроническое носи-тельство вирусов гепатита В, С, клещевого энцефалита и простого герпеса сопровождается значительным повышением как конституциональной продукции IL-4, так и резервных возможностей к индуцированной секреции одного из основных противовоспалительных цитокинов. Следует также учитывать и тот факт, что спонтанная и стимулированная ФГА продукция IL-10 у больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С значительно увеличивалась. Однако синтез этого цитокина у пациентов с длительной персистенцией вирусов клещевого энцефалита и простого герпеса практически не изменялся [Наследникова И.О. и соавт., 2005].

Одним из свойств HCV, сформировавшихся в результате длительной эволюции, как раз и является его способность модулировать иммунный ответ, в том числе и в пользу реакций Th2 типа во время ранней фазы заболевания, а также склонять течение инфекции в сторону ее хронизации, чем, вероятно, и объясняется феномен его длительной персистенции в макроорганизме [Мезенцева М.В. и соавт., 2002; Приймяги JI.C. и соавт., 2002; Корочкина О.В. и соавт., 2003].

При изучении продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови в ответ на соге-антиген HCV было отмечено, что у здоровых доноров в ответ на соге-антиген продуцируются цитокины ТЫ типа, тогда как у больных хроническим вирусным гепатитом С отмечается повышенная продукция IL-10. Авторы делают заключение о том, что хронический вирусный гепатит С сопровождается недостатком функции Thl типа [Fan X.G. et al., 1998; Ягода A.B., 2003]. Подтверждением этому тезису служит работа N. Kurushita et al. [1997], в которой показано, что спонтанная продукция IL-4 и IL-10 мононуклеарными клетками периферической крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени оказалась значительно выше, чем у здоровых индивидов.

Обнаруженная нами положительная корреляционная зависимость между способностью мононуклеаров продуцировать IL-4 (г=0,84, р<0,01) и IL-10 (г=0,67, р<0,05), с одной стороны, и стадией хронизации вирусного гепатита с другой, - является подтверждением того, что указанные противовоспалительные цитокины являются медиаторами процессов регенерации и фиброгенеза [Friedman S.L., 1999; Ивашкин В.Т. и соавт., 2004].

Проведенное нами исследование способности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови секретировать TL-6, также являющегося цитокином ТЫ пути иммунного ответа, позволило зарегистрировать значительное увеличение его базальной продукции у пациентов с хронической инфекцией, вызванной HBV, HCV, TBEV и HSV [Наследникова И.О. и соавт., 2005]. Кроме того, у больных хроническим вирусным гепатитом В отмечалось статистически значимое повышение и стимулированной секреции данного интерлейкина по сравнению с контролем (477,11±25,76 пг/мл, р<0,05).

TL-6, обладающий провоспалительными свойствами, по направленности действия значительно отличается от классических провоспалительных цитоки-нов TNF-a и EL-1 [Ивашкин В.Т. и соавт., 2002]. В первую очередь это связано с тем, что JL-6 наряду с IL-10 и IL-4 является цитокином Th2 пути иммунного ответа и участвует в поддержании роста и созревания B-лимфоцитов в антитело-продуцирующие клетки (рис. 1) [Хаитов P.M., 2001].

Проведенные недавно исследования показали относительное преобладание количества Th2 над числом ТЫ в воспалительных клеточных инфильтратах при хронизации вирусного гепатита С и обратное соотношение их уровней в случае выздоровления. Низкий уровень IL-1, IL-2 и TNF-a у больных хроническим вирусным гепатитом С свидетельствовал о слабом иммунном ответе, что способствовало длительной циркуляции вируса, его активной репликации и, следовательно, формированию хронических форм болезни [Буеверов А.О., 1998; Двашкин В .Т., 1998,2000; Корочкина О.В. и соавт., 2003].

Необходимо подчеркнуть, что действие цитокинов как участников сложной многофункциональной сети при ряде хронических вирусных инфекций загасит от многих причин, к числу которых относятся индивидуальные различия в гродукции иммунорегуляторных медиаторов, обусловленные рядом генетических особенностей [Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2Э02; Маммаев С.Н. и соавт., 2002; Приймяги JI.C. и соавт., 2003].

Большой интерес, на наш взгляд, представляют полученные в ходе имму-шгенетического исследования данные по распределению частот аллельных вариантов полиморфизма T-330G гена EL2 среди больных хроническим вирусным гепатитом. Так, установлено превышение частоты аллельного варианта T-330G 'ена IL2 среди пациентов с хроническим вирусным гепатитом, заключающееся в доминировании гетерозиготного варианта T/G (48,98%) над гомозиготой Т/Т

(44,90%). Степень риска дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода хронического вирусного гепатита В и С была положительно ассоциирована с T/G генотипом, в то время как хронического вирусного гепатита В+С - с G/G вариантом полиморфного региона T-330G гена IL2. Примечательно, что redoran G/G промоторного региона T-330G гена IL2 был связан с риском хронизапйи вирусного гепатита (П и Ш степень фиброза). I

Точечная замена С-590Т обусловливает повышенную по сравнению с ап-лельным вариантом -590С активность промотора и как результат этого - увеличенную экспрессию IL4 и продукцию интерлейкина [Arai N. et al., 1990; Kanemi-tsu S. et al., 1999; Пузырев В.П. и соавт., 2002]. Результаты настоящего исследования продемонстрировали положительную ассоциацию Т/Т генотипа гошА морфного участка С-590Т гена IL4, обнаруженного у 17,53% больных, с риском прогрессирования и неблагоприятного исхода хронического вирусного гепатита.' Проведенные нами исследования ассоциированности генотипа клеток продуцентов IL-4 с уровнем его спонтанной и индуцированной продукции показали, что генотип С/Т чаще выявляется среди индивидов с высоким уровнем продукции цитокина, что логично укладывается в концепцию о конкурентных отношениях ТЫ/ТЬ2-зависимых звеньев иммунитета.

Выявлено, что полиморфизм в промоторе гена ILIO имеет прогностическое значение для течения персистентных вирусных инфекций, в частности для гепатита С [Vidigal P.G. et al., 2002; Abbott W.G. et al., 2004]. Показано, что саморазрешающаяся HCV-инфекция связана с -592АА генотипом BL10, персисти-рующая инфекция - с -1082GG генотипом ILIO, а стойкий ответ на интерферо-нотерапию - с -1082GG генотипом и GCC гаплотитом ILIO. Генотип ILIO -1082АА и АТА/АТА и АСС/АСС гомозиготный гаплотип чаще всего встречались у пациентов с быстро развивающимся фиброзом, ILIO -1082 G/C генотип был связан с хронизацией инфекции, а АСС/АТА генотип - с длительной перси-стенцией HCV [Vidigal P.G. et al., 2002; Barrett S. et al., 2003; Knapp S. et al., 2003; Авдошина В.В., Коненков В.И., 2004]. Следует отметить, что среди больных хроническим вирусным гепатитом нами было выявлено преобладание гетерозиготного варианта С/А полиморфного региона гена ILIO в участке С-592А (97,09%), положительно связанного с риском дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода заболевания (OR = 9,91). Обращало на себя внимание отсутствие среди больных хроническим вирусным гепатитом лиц с гомозиготным генотипом по аллелю С.

Бесспорно, что ключевую роль в механизмах развития хронической перси-стенции вирусов играет генетически детерминированное состояние иммунной системы. Многочисленными исследованиями последних лет установлено, что структурные особенности белковых продуктов полиморфных генов цитокинов ведут к различному качеству иммунного ответа, а также к различным течению и исходу инфекции.

Лимфоциты, активированные связыванием антигена, вступают в цикл клеточного деления. Они экспрессируют новые рецепторы, позволяющие им реагировать на секретируемые другими клетками цитокины, которые служат сигналами к пролиферации, дифференцировке в клетки памяти и плазматические клетки, способные вновь активироваться при повторной встрече с антигеном [Антонова Т.В. и соавт., 1999; Фрейдлин И.С., 2001; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003]. Взаимодействуя со специфическими рецепторами поверхности лимфоцитов и активируя клетки, митоген или антиген способен индуцировать каскад биохимических изменений, определяющих дальнейшую морфофункциональную эволюцию и приводящих лимфоциты к митозу [Козинец Г.И. и соавт., 2002; РЬагак Р.Б. (Л а1., 1998].

Для уточнения представлений о функциональных свойствах лимфоцитар-ных клеток нами была проведена оценка способности лимфоцитов к бласт-трансформации при индукции митогеном ФГА. В отличие от специфического воздействия антигенов ФГА неспецифически стимулирует лимфоциты к бласт-трансформации. При взаимодействии с ФГА лимфоциты увеличиваются в раз-N ерах, в них усиливается синтез ДНК, РНК и белка, появляются многочисленные митозы [Козинец Г.И., 1997].

Как показало проведенное нами исследование, у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, хроническим носительством вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией пролиферативный потен-щал лимфоцитов периферической крови оказался достоверно выше, чем у здоровых доноров [Наследникова И.О. и соавт., 2004].

Известно, что уровень пролиферации лимфоцитов при ФГА-стимуляции в определенной степени отражает активность иммунного ответа организма на действие вируса, т.е. эффективность иммунной защиты [Дергунова Н.Н. и соавт., 2С03]. Так, ранее проведенное в нашей лаборатории исследование функциональней активности лимфоцитов при персистенции ЕВУ у детей показало, что в ост-рнй период инфекции (инфекционный мононуклеоз) ФГА-стимулированный пролиферативный потенциал лимфоцитарных клеток был снижен, однако через кесяц после инфицирования он нормализовался [Уразова О.И. и соавт., 2002; Ковицкий В.В. и соавт., 2003].

Длительная персистенция вируса - своеобразный способ его сосуществовали с клетками макроорганизма, выработанный в ходе продолжительной ко-эюлюции. В вирусинфицированных иммунокомпетентных клетках способны рнвиваться не только патологические процессы, направленные на деградацию и рирушение, но и реакции адаптации, обусловливающие выживание клеток, содержащих вирусные частицы [Авцын А.П., Шахламов В.А., 1979; РЬа1ак А. & а., 1998].

Постоянная антигенная стимуляция при длительной персистенции вирусов юсомненно приводит к активации лимфоцитов, сопровождающейся изменением

их метаболической активности. Кинетика иммунного ответа характеризуется серией взаимодействий и сменой взаимосвязей различных клеточных систем, в том числе системы внутриклеточных лимфоцитарных энзимов и субстратов, осуществляющих и регулирующих эффекторную фазу иммунного ответа [Г&гсь-тяпин Д.В., 1998; Почтарь М.Е. и соавт., 2003]. Таким образом, в условиях д)ш-тельной персистенции вирусов лимфоциты, как центральное звено иммунной системы, обеспечивая реализацию иммунного ответа, характеризуются изменением метаболической активности.

Осуществление лимфоцитами сложных и многообразных функций возможно благодаря структурным особенностям и высокой активности метабо ских процессов, обеспечивающих клетку энергией и пластическим материал' [Хейхоу Дж., КваглиноД., 1983; Гольтяпин Д.Б., 1998]. Вирусные агенты, де! ствуя как модуляторы функциональной активности лимфоцитов, прежде всю изменяют метаболизм клетки, переключая субстратный поток с одного метаб< лического пути на другой, влияя на энергетический потенциал клетки и синте тические процессы. Именно в клетке начинается формирование ответных реакций на внешнее воздействие, позволяющее составить представление об иммунной стратегии, избранной организмом [ХейхоуДж., КваглиноД., 1983; Новицкий В.В. и соавт., 2003].

Проведенное нами цитохимическое исследование лимфоцитарных клето* у пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса позволило зарегистрировать изменение метаболиз! ма лимфоцитов периферической крови. У всех обследованных нами пациенток отмечалось увеличение содержания липидов в лимфоцитах, обусловленное, ве| роятнее всего, механизмами восполнения энергопродукции клетки [Гольтяпин Д.Б., 1998]. Проведенное нами ранее цитохимическое исследование лимфоцитов периферической крови у детей с длительной персистенцией ЕВУ выявило ан< ■ логичные изменения. Характерное для развернутой клинико-гематологическо I картины инфекции (инфекционный мононуклеоз) увеличение содержания лига -дов в лимфоцитарных клетках периферической крови сохранялось и в отдале! -ный период после инфицирования [Уразова О.И. и соавт., 2001].

Вместе с тем установлено, что многие инфекционные заболевания сопр вождаются изменениями метаболизма липидов в клетках [Хейхоу Дж., Кваг; но Д., 1983; Гольтяпин Д.Б., 1998; Новицкий В.В. и соавт., 2001]. Известно, при активации лимфоцитов в результате их взаимодействия с вирусными анп генами усиливается интенсивность клеточного метаболизма. Обнаруженное нг ми увеличение содержания липидов связано, по всей видимости, с повышение! скорости их синтеза в активированных клетках вследствие увеличения энергети ческих нужд, необходимых для осуществления метаболических и пластически реакций лимфоцитов [Робинсон М.В. и соавт., 1986; Гольтяпин Д.Б., 1998; Поч тарь М.Е. и соавт., 2003].

У пациентов с хроническим вирусным гепатитом, хронической антигене-мией вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах также была значительно увеличена. С одной стороны, усиление активности неспецифической эстеразы, являющейся гидролитическим лизосомальным ферментом, могло быть связано, на наш Ьзгляд, с непосредственным влиянием вируса на активность метаболических процессов, происходящих в клетке. Повышение активности неспецифической эстеразы, обеспечивающей реакции кислого гидролиза биополимеров, процессы молекулярного обновления клетки, участие в реакциях клеточного иммунитета могут быть результатом внутриклеточной перестройки, вызванной влиянием вирусов на метаболическую активность инфицированных клеток [Гольтя-пин Д.Б., 1998]. С другой стороны, поскольку фермент локализован в лизосомах и очень мелких гранулах цитоплазмы, увеличение их числа, необходимое для реализации протеолитических реакций, могло оказаться причиной повышения активности неспецифической эстеразы в клетках. Являясь маркером лимфоци-тарной популяции, неспецифическая эстераза катализирует разрушение различных метаболитов и антигенов в клетке, принимает участие в обеспечении кил-лерной функции Т-клеток и метаболизме белков [ХейхоуДж., КваглиноД., 1983; Почтарь М.Е. и соавт., 2003].

Возможно, что именно увеличением числа лизосом объясняется и повышение активности другого лизосомального фермента - кислой фосфатазы, выявленное у больных хроническим вирусным гепатитом В+С слабовыраженной степени активности (1,78±0,14 усл. ед. при 1,14±0,04 усл. ед. у здоровых лиц, р<0,01), у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В умеренной степени активности (1,39±0,09 усл. ед., р<0,05) и при хронической герпетической инфекции в стадии ремиссии (1,77±0,08 усл. ед., р<0,001).

Известно, что стимулом к повышению активности кислой фосфатазы является иммунологическая и митогенная активация. Наиболее выраженное увеличение активности этого фермента в лимфоцитах обусловлено в первую очередь активацией В-лимфоцитов в направлении образования плазматических клеток [ХейхоуДж., КваглиноД., 1983]. В то же время, по данным ряда авторов, активность кислой фосфатазы, являющейся цитохимическим маркером зрелости циркулирующих Т-лимфоцитов, положительно коррелирует с количеством лимфоцитов, обладающих хелперной активностью [Блиндарь В.Н. и соавт., 1993; Шиффман Ф.Дж., 2000]. Неспецифическая эстераза маркирует в Т-хелперах структуры, содержащие лимфокины, необходимые при взаимодействии Т-хелперов и В-лимфоцитов [Гольтяпин Д.Б., 2003]. Кроме того, высокая активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах регистрируется при хронических диффузных поражениях печени, достигая максимума в фазу репликации НВУ-инфекции, что подтверждает полученные нами данные об увеличении ак-

тивности этого фермента при хроническом вирусном гепатите [Новицкий В.В. и соавт., 2003].

Неспецифической эстеразе и кислой фосфатазе отводят важное место в реализации саногенеза. Энзимы, как признанные маркеры лизосом, играют важную роль в реакциях бласттрансформации лимфоцитов, а также участвуют в образовании метаболитов с цитотоксическими свойствами [Гольтяпин Д.Б., 2003]. Подтверждением сказанному явились результаты проведенного нами корреляционного анализа. Так, повышение активности неспецифической эстеразы было положительно связано с увеличением числа бласттрансформированных лимфо-цитарных клеток у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В (г=0,71, р<0,01), с хроническим вирусным гепатитом С (г=0,92, р<0,001) и хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита (г=0,70, р<0,05). При этом у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В (г=0,77, р<0,01), В+С (г=0,81, р<0,01) и хронической герпетической инфекцией (г=0,69, р<0,05) увеличение активности кислой фосфатазы положительно коррелировало с увеличением числа бластных форм лимфоцитов.

Исследование наиболее чувствительных к действию инфекта клеточных структур позволяет вскрыть пути проникновения вируса в клетку, реализации и поддержания вирусного персистирования. Изменения структуры плазматической мембраны, как наиболее подверженной экзогенным воздействиям составляющей клетки, определяются патологическим действием вируса и могут являться причиной функциональной неполноценности клеток [Ровенский Ю.А., 1979; Козинец Г.И., Симоварт Ю.А., 1984; Козинец Г.И. и соавт., 1979, 2002; Новицкий В.В. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003; Токарева Н.В., 2004].

В настоящее время исследованию поверхностной архитектоники клеток системы крови уделяется большое внимание, поскольку состояние клеточной поверхности ответственно за развертывание ряда явлений, происходящих в организме как в норме, так и при патологии [Козинец Г.И., Симоварт Ю., 1984; Козинец Г.И. и соавт., 1997, 2002; Новицкий В.В. и соавт., 2003]. Установлена важная модифицирующая роль мембраны в процессах связывания лимфоцитов с различного рода антигенами (в том числе и вирусными), взаимодействия Т-, В-клеток и макрофагов в динамике формирования иммунного ответа [Е)е Нагуеп Е. а1., 1973; РоШаск А. е1 а1., 1973; Бабий И.Л., 1984; Козинец Г.И. и соавт., 2002, 2004].

Используя имеющиеся в настоящее время классификации [Ровенский Ю.А., 1979; Козинец Г.И., Симоварт Ю.А., 1984; Козинец Г.И. и соавт., 2002], мы идентифицировали следующие виды лимфоцитов: относительно гладкие клетки с правильной, округлой формой; ворсинчатые клетки с большим количеством разных по длине нитевидных отростков; лимфоциты с пузырями, имеющие на поверхности сферической формы выпячивания; лимфоцитарные клетки с

углублениями в виде «оврагов» и «щелей»; ламеллярные лимфоциты с пластинчатыми выростами в виде «оборок» и «вуалей», приподнятых над поверхностью; лимфоциты с выростами неправильной формы на поверхности; лимфоцитарные клетки со складками на поверхности; лимфоциты с комбинированным типом поверхностного микрорельефа (рис. 2).

Рис 2. Морфологические формы лимфоцитов (в соответствии с классификациями, предложенными Г И Козинцом [1984, 2002] иЮА. Ровенским [1979]) Сканирующая электронная микроскопия (а, е, ж - х 8000; б, в, д-х 6000; г, з, и- х 10000)

а - относительно гладкий лимфоцит; б - лимфоцит с микроворсинками; в - лимфоцит со сфероидными образованиями; г - лимфоцит с углублениями; д, е - ламеллярные лимфоциты; ж - лимфоцит с выростом; з - складчатый лимфоцит; и - комбинированный лимфоцит

По данным сканирующей электронной микроскопии, у больных хроническим вирусным гепатитом В статистически значимо увеличивалось содержание складчатых лимфоцитов, а также количество клеток с пузырями и выростами на

поверхности по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров, однако оказался сниженным уровень гладких лимфоцитарных клеток. Следует отметить появление комбинированных форм лимфоцитов, не обнаруженных у здоровых доноров. Аналогичные изменения распределения лимфоцитов в зависимости от категории морфологических образований на их поверхности были зарегистрированы и у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и В+С, хроническим носительством вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией [Наследникова И.О. и соавт., 2005; Новицкий В.В. и со-авт., 2005].

Следует также подчеркнуть, что кроме перечисленных выше изменений у больных хроническим вирусным гепатитом В+С было зарегистрировано статистически значимое увеличение содержания лимфоцитов с углублениями и ла-меллярным типом поверхностного микрорельефа относительно контроля. Однако у пациентов ¿"хроническим вирусным гепатитом С слабовыраженной степени активности число лимфоцитарных клеток с ламеллярной поверхностью оказалось достоверно ниже, в то время как у лиц с хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности — выше, чем в норме. Не менее примечательно, что у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита без клинической симптоматики число ворсинчатых лимфоцитов было достоверно повышено относительно соответствующих значений исследуемого параметра у здоровых лиц. При этом у лиц с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита с клиническими проявлениями нейроинфекции данный показатель, напротив, оказался достоверно ниже, чем в контроле. Кроме того, у пациентов с хронической герпетической инфекцией абсолютное и относительное содержание лимфоцитарных клеток с углублениями на поверхности как в стадии рецидива, так и в фазу ремиссии оказалось значительно выше, чем у здоровых индивидов.

Выявленный полиморфизм лимфоцитарной популяции при персистентных вирусных инфекциях может быть обусловлен, с одной стороны, изменением функциональной активности лимфоцитов [Козинец Г.И., Симоварт Ю., 1984; Робинсон М.В. и соавт., 1986], а с другой - изменением соотношения субпопуляций Т- и B-клеток, а именно снижением числа Т-лимфоцитов, для которых гладкий тип поверхности является дифференциальным признаком [Linthicum D.S. et al., 1974; Крымский Л.Д., 1976; Уразова О.И. и соавт., 2004]. Полагают, что гладкий тип поверхности имеют покоящиеся Т- и В-лимфоциты, а при активации клетки образуют многочисленные выросты [Робинсон М.В., 1986]. В настоящее время известно, что разнообразные ворсинки и выросты на иммуноком-петентных клетках выполняют роль «распознавателей» антигенов, антигенпре-зентирующих, регуляторных и эффекторных клеток [Крымский Л.Д., 1976; Phatak P.D. et al., 1998].

Было показано, что при трансмембранном проникновении в клетки-мишени оболочечных вирусов, в частности герпесвирусов, имеют место разрушение

мембранных лнпндов клетки и встраивание белков оболочки вируса в состав плазматической мембраны, неизбежно приводящие к изменению ее структурных и физико-химических свойств [Мищенко В.А. и соавт., 1994].

Рассматривая причины увеличения числа лимфоцитов с бульбарными образованиями на поверхности, вполне уместно исходить из предположения о том, что образование этих динамичных структур связано с неконтролируемым поглощением клеткой воды [Козинец Г.И. и соавт., 2002, 2004]. Существует точка зрения, согласно которой в пузырях, равно как в ворсинках, складках и ламел-лярных образованиях, может резервироваться «избыточная» клеточная поверхность (до 100 мкм2), способная обеспечить дополнительную поглощающую поверхность [Козинец Г.И., Симоварт Ю.А., 1984]. Вместе с тем известно, что топография поверхности лимфоцитов также может определяться фазой клеточного цикла [Polliak А. et al., 1973; Авцын А.П., Шахламов В.А., 1979]. Кроме того, разнообразный характер типов поверхности лимфоцитарных клеток зависит от степени их дифференцировки [Робинсон М.В. и соавт., 1986; Елисеев В.Г. и соавт., 2004].

При электронно-микроскопической визуализации ультраструктуры лимфоцитов у пациентов с персистентными вирусными инфекциями типовых морфологических изменений строения клеток обнаружено не было. Наиболее часто отмечалось увеличение количества митохондрий и появление эндовезикулярных включений и лизосом в цитоплазме лимфоцитарных клеток (рис. 3).

Рис. 3. Электронные микрофотографии лимфоцитов периферической крови пациентов с персистентными вирусными инфекциями (по данным трансмиссионной электронной микроскопии, а - х24000, б - х16000, в - х18000)

На микрофотографиях представлены наиболее характерные изменения ультраструктуры лимфоцитарных клеток- митохондрии с частично дезорганизованными кристами (а, 6, в), эндовезикулярные включения (6. в) и лизосомы (б)

Длительная внутриклеточная персистенция вирусов является не только причиной деградации инфицированных клеток, но и, вероятнее всего, способна обеспечивать системную стимуляцию и поддержание физиологической готовности иммунокомпетентных клеток к отражению вирусной агрессии. При рассмотрении патогенеза персистентных вирусных инфекций вполне закономерно сосредоточиться на исследовании структурных особенностей плазматических мембран задействованных в патологическом процессе клеточных систем, прежде всего клеток иммунной системы. Известно, что функциональная способность лимфоцитарных клеток во многом определяется характером взаимодействия множества рецепторов с лигандами, что, в свою очередь, зависит от физико-химических свойств плазматической мембраны лимфоцитов [Игнатьева Г.А., 1997; Фрейдлин И.С., 1998].

Неопровержимым считается тот факт, что нормальное функционирование плазматической мембраны зависит от ее микровязкостных свойств [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980; Болдырев A.A., 1990; Геннис Р., 1997]. Поддержание текучести мембраны на физиологическом оптимальном уровне необходимо для осуществления латеральной диффузии белковых и липидных молекул, трансмембранного флип-флоп-переноса липидов [Конев C.B., 1987].

При вирусных инфекциях происходят существенные изменения структурных и физико-химических свойств плазматических мембран иммунокомпетентных клеток [Метценко В.А. и соавт., 1994]. В результате флуоресцентного зондирования плазматической мембраны лимфоцитарных клеток липотропным зондом пирен были получены фактические данные, подтверждающие наличие выраженной дезорганизации липидной фазы мембраны лимфоцитов у больных с хроническим вирусным гепатитом и хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита [Рязанцева Н.В. и соавт., 2002,2003].

В частности, проведенное нами спектрофлуориметрическое исследование плазматической мембраны лимфоцитов позволило установить, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом отмечалось достоверное (по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров) уменьшение параметров флуоресценции I470/I370 и I470/I390 при длине волны возбуждающего света 285 нм независимо от вида вируса (В, С и микст-инфекция В+С), активности патологического процесса и стадии хронизации инфекции. Отмеченное нами у больных хроническим вирусным гепатитом снижение указанных параметров свидетельствовало о повышении микровязкости и/или снижении гидрофобного объема зоны белок-липидных контактов [Добрецов Г.Е., 1980]. Исследование спектральных характеристик взаимодействия липотропного зонда пирен с плазматической мембраной лимфоцитов у пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита без клинических проявлений (1,12±0,02 и 1,13±0,02 усл. ед. при 1,37±0,02 и 1,40±0,01 у здоровых доноров, р<0,001) и с клинической симптоматикой нейроинфекции (1,21±0,02 и 1,24±0,01 усл. ед., р<0,001) выявило

аналогичный характер изменений параметров флуоресценции зонда, что и при хроническом вирусном гепатите.

Повышение микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов может приводить к снижению активности мембраносвязанных ферментов, торможению связывания рецепторов со вторичными мессенджерами и лигандами, нарушению функциональных свойств клеток. Предполагается, что именно повышение ригидности липидного бислоя мембраны является одной из причин значительного снижения активности многих ферментов и нарушения процессов распознавания вирусных агентов при инфекционном процессе. Однако изменение микровязкостных свойств плазматической мембраны лимфоцитов при вирусных инфекциях, на наш взгляд, неспецифично для иммунокомпетентной клетки. Подтверждением этому явилось обнаружение аналогичных изменений структурных свойств плазматической мембраны эритроцитов, не представляющих собой мишень для вирусов, у больных с хроническим вирусным гепатитом и длительным носи-тельством вируса клещевого энцефалита [Панин Л.Е. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., 2004; Токарева Н.В., 2004].

Таким образом, анализ данных литературы и результаты исследований, проведенных в нашей лаборатории, свидетельствуют об изменении структурно-функциональных и метаболических свойств лимфоцитов периферической крови, являющихся мишенью для повреждающего действия многих вирусных агентов, в ходе развития инфекционного процесса.

Для выявления интегральных параметров структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов периферической крови при персистент-ных вирусных инфекциях нами был проведен дискриминантный анализ. Вначале были исследованы дискриминантные функции в четырех группах: здоровые доноры, больные хроническим вирусным гепатитом, пациенты с хроническим но-сительством вируса клещевого энцефалита и пациенты с хронической герпетической инфекцией.

Выявленные нами наиболее информативные признаки на основании статистической значимости были включены в канонические оси. Переклассификация наблюдений с использованием канонических осей дала согласованность между фактической принадлежностью к той или иной группе и предсказанной во всех 100% случаев. Следующим этапом дискриминантного анализа являлось сравнение изученных параметров в группах здоровых доноров, больных хроническим вирусным гепатитом, пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией.

Использование дискриминантного анализа позволило выделить следующие информативные переменные: количество СБЗ+, С04+, СБ56+ и С095+-клеток, иммунорегуляторный индекс (СБ4+/С08+), число бластных форм клеток в тесте бласттрансформации; ТЖ-а, 1Ь-2,1Ь-4,1Ь-6,1Ь-10 и ГЬ-12

МШШЦ продукции »деришжочадях, складчатых, бульбар-С.Летср%рг | 18 М Ш '

■ - "Ш

ных и комбинированных лимфоцитов, а также коэффициент флуоресценции 147<Лз70 при 1=285 нм. Полученные результаты указывают на общность изменений структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов периферической крови при персистентных вирусных инфекциях различного генеза (хронический вирусный гепатит В и С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция).

Рис. 4. Схема иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций

Особенности патогенеза и исход длительного, иногда пожизненного, присутствия чужеродного генетического объекта в зараженной клетке обусловлены сложным характером взаимодействия вируса с его молекулярно-генетическими и функциональными свойствами, с одной стороны, и клеток иммунной системы пациента с ее индивидуальными иммуногенетическими особенностями, - с другой (рис. 4).

В настоящее время поиск молекулярных детерминант длительной перси-стенции вирусов связан с изучением процессов межклеточной кооперации им-мунокомпетентных клеток, опосредованной цитокинами. Ключом к разгадке феномена персистенции вирусов в организме человека, по мнению современных исследователей, служит баланс влияний ТЫ и ТЬ2 типов, особенно на ранних стадиях заболевания. Одним из свойств вирусов, выработавшихся в результате коэволюции, как раз и является способность модулировать иммунный ответ в пользу реакций ТЬ2 типа во время ранней фазы заболевания и склонять течение инфекции в сторону хронизации, чем, вероятно, и объясняется феномен длительной персистенции. Выраженный дисбаланс кооперативного взаимодействия иммуноцитов, а также преимущественная активация продукции цитокинов ТЬ2 типа чреваты формированием непротективного иммунного ответа и отчасти объясняют развитие инфекции по хроническому типу. Гиперпродукция цитокинов ТЬ2 пути, в свою очередь, свидетельствует о высокой степени адаптации вирусов к действию иммунной системы макроорганизма.

Учитывая важную роль генетически детерминированной перестройки ци-токиновой сети, а также принимая во внимание значение структурно-метаболических и функциональных изменений лимфоцитов в генезе дисбаланса иммунологического равновесия при персистентных вирусных инфекциях, считаем очевидным, что дальнейшее углубленное вскрытие механизмов иммунопато-генеза длительной вирусной персистенции позволит расширить поиск потенциальных маркеров восприимчивости, тяжести течения и клинических особенностей инфекции, а также станет основой для создания современных способов предупреждения и коррекции иммунопатологических расстройств.

ВЫВОДЫ

1. Изменения реагирования системы иммунитета при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса являются однонаправленными и характеризуются угнетением антигенспецифическо-го звена иммунного ответа, дисбалансом кооперативного взаимодействия иммуноцитов, дизрегуляцией процессов пролиферации и дифференцировки иммуно-компетентных клеток, нарушением структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови.

2. Механизмы нарушения межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) обусловлены выраженным дисбалансом продукции иммунорегуляторных провоспалительных (IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-12) и противовоспалительных (IL-4, IL-6, IL-10) цитокинов.

3. Фактором, способствующим длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса, является поляризация иммунного ответа в направлении Th2, обусловленная увеличением продукции моно-нуклеарами крови IL-4, IL-6 и угнетением секреции TNF-a, IL-2, IL-12. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С продукция IL-10 моно-нуклеарными лейкоцитами периферической крови повышена. Персистентные вирусные инфекции сопровождаются гиперпродукцией IFN-y мононуклеарами крови.

4. У пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса развивается дисбаланс дифференцировки и пролиферации иммуноцитов антигенспецифического звена системы иммунитета, проявляющийся снижением относительного количества CD3+-, CD4+-клеток и иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), и усиление пролифера-тивной активности лимфоцитов. При персистентных вирусных инфекциях повышено содержание CD9 5+-экспрессирующих лимфоцитов.

5. Персистентные вирусные инфекции сопровождаются дезорганизацией поверхностной архитектоники (повышение количества лимфоцитов со складками, бульбарными образованиями и выростами на поверхности, появление клеток с комбинированной поверхностью на фоне снижения числа гладких лимфоцитов), структурной модификацией липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов и изменением метаболизма (увеличение содержания липидов и активности неспецифической эстеразы) лимфоцитарных клеток периферической крови.

6. Иммуногенетическим фактором, обладающим протективным эффектом в отношении длительной персистенции вирусов гепатита В и С среди лиц европеоидной популяции, является генотип С/С промоторного региона С-592А гена EL-10. Степень риска прогрессирования и хронизации вирусных гепатитов ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена ILIO, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена ПА

7. Общая направленность иммунопатологических расстройств при персистентных вирусных инфекциях, характеризующихся стертым клиническим течением (хронический вирусный гепатит В, С, В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция), не определяется таксономической принадлежностью возбудителя инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Апоптотическая реакция лимфоидных клеток при инфекционном мононук-леозе // Бюллетень СО РАМН. - 2001. - № 3. - С. 100-102. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П. и др.

2. Особенности течения у детей инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2001. - № 4. - С. 57-58. В соавт. с Уразовой О.И., Помогаевой А.П., Новицким В.В. и др.

3. Структурно-метаболический статус мононуклеаров периферической крови при инфекционном мононуклеозе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - № 5. - С. 571-573. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П., Горбачевой A.B.

4. Морфология апоптоза лимфоидных клеток при инфекционном мононуклеозе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Приложение 1. - С. 69-71. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П. и др.

5. Функциональная активность моноцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе и мононуклеозоподобном синдроме // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Приложение 3. — С. 62-64. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П., Ширшовой Е.В.

6. Содержание нуклеиновых кислот в лимфоцитах периферической крови при инфекционном мононуклеозе // Клиническая лабораторная диагностика. -2002. - № 1. - С. 43-44. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П., Шевцовой Н.М.

7. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе у детей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2002 - № 7. - С. 66-68. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П., Сюсиной Л.В.

8. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе у детей // Клиническая лабораторная диагностика. -

2002. - № 12. - С. 34-36. В соавт. с Уразовой О.И., Новицким В.В., Помогаевой А.П. и др.

9. Активность дегидрогеназ мононуклеаров периферической крови при инфекционном мононуклеозе у детей // Клиническая лабораторная диагностика. -

2003. - № 1. - С. 17-19. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И., Помогаевой А.П., Комаса Ю.В.

10. Хронический гепатит В: структура, метаболизм и цитогенетические особенности // Експерименальна i клпнчна медицина. - 2003. - № 2. - С. 64-67. В соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Токаревой Н.В. и др.

11. Биофизические особенности мембраны эритроцитов при хроническом носи-тельстве вируса клещевого энцефалита // Вестник Российского государствен-

нош медицинского университета. - 2003. - № 2. — Специальный выпуск: «Материалы Пироговской студенческой научной конференции» - Москва, 2003. — С. 227-228. В соавт. с Токаревой Н.В., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Жуковой О.Б.

12. ДНК-репарационная активность лимфоцитов периферической крови при хронической персистенции вируса гепатита С // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2003. - № 2. - Специальный выпуск: «Материалы Пироговской студенческой научной конференции» - Москва, 2003. - С. 167. В соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Токаревой Н.В.

13. Структурно-функциональные особенности плазматической мембраны лимфоцитов и эритроцитов при вирусных инфекциях // Сибирский медицинский журнал. - 2003. - № 3. - С. 34-38. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Паниным Л.Е., Токаревой Н.В. и др.

14. Цитогенетика лимфоцитов периферической крови у пациентов с персистен-цией вируса клещевого энцефалита // Бюллетень СО РАМН. - 2003. - № 4. — С. 32-36. В соавт. с Новицким В.В., Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В. и др.

15. Структура, метаболизм и функциональные особенности лимфоцитов периферической крови при длительной персистенции вируса Эшптейна-Барр // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - № 10. - С. 390393. В соавт. с Новицким В.В., Уразовой О.И.

16. Структурные особенности плазматической мембраны лимфоцитов при хроническом гепатите С // Успехи современного естествознания. - 2003. - № 10. -С. 100-101. В соавт. с Токаревой Н.В., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.

17. Изменение микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов при вирусном гепатите В // Успехи современного естествознания. - 2003. - № 11. -С. 89. В соавт. с Токаревой Н.В., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.

18. Хронический вирусный гепатит С: структурно-метаболический и цитогене-тический статус лимфоцитов // VI Российский съезд врачей-инфекционистов, (Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003 г.) - Санкт-Петербург, 2003. - С. 268269. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Токаревой Н.В., Жуковой О.Б. и др.

19. Поверхностный электрический заряд мембраны эритроцитов при хроническом вирусном гепатите // VI Российский съезд врачей-инфекционистов, (Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003 г.) - Санкт-Петербург, 2003. - С. 381. В соавт. с Токаревой Н.В., Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б. и др.

20. Иммунофенотипические особенности лимфоцитов при длительной вирусной персистенции // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2004. - № 2. -С. 29-30. В соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Мельниковой А.П. и др.

21. Хронические вирусные гепатиты - актуальная проблема медико-социального значения // Актуальные проблемы биологии, медицины и эколо-

гии. — Томск, 2004. - № 2. - С. 347. В соавт. с Мельниковой А.П., Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В. и др.

22. Хронический вирусный гепатит С: продукция фактора некроза опухолей альфа и его растворимого рецептора мононуклеарными лейкоцитами // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2004. - № 3. - С. 55-56. В соавт. с Зима А.П., Белобородовой Е.В., Рязанцевой Н.В. и др.

23. Поверхностная архитектоника, функциональные особенности и метаболизм лимфоцитов периферической крови при хронической герпесвирусной инфекции // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 5. - С. 53-55. В соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Антошиной М.А. и др.

24. Цитокины при хронических вирусных гепатитах // Материалы IV съезда Научного общества гастроэнтерологов России. (Москва, 11-12 февраля 2004 г.) - Москва, 2004. - С. 79. В соавт. с Новицким В.В., Белобородовой Е.В., Белобородовой Э.И. и др.

25. Изменение апоптотического потенциала лимфоцитов крови при хронических гепатитах В и С // Материалы IV съезда Научного общества гастроэнтерологов России. (Москва 11-12 февраля 2004 г.) - Москва, 2004. - С. 91. В соавт. с Жуковой О.Б., Чечиной O.E., Рязанцевой Н.В. и др.

26. Цитокинпродуцирующая способность мононуклеаров при хронических вирусных гепатитах В и С // Материалы съезда иммунологов СНГ. (Москва, июнь 2004) - Москва, 2004. - С. 127. В соавт. с Белобородовой Е.В., Белобородовой Э.И., Рязанцевой Н.В., Черногорюком Г.Э.

27. Патофизиология иммунных нарушений при хронических вирусных гепатитах // Материалы Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина». (Москва, 22-24 апреля 2004 г.) - Москва, 2004. - С. 154. В соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Радзивил Т.Т. и др.

28. Функционально-метаболический статус лимфоцитов периферической крови у больных с длительной персистенцией вирусов // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». (Санкт-Петербург, 15-16 апреля 2004 г.) - Санкт-Петербург, 2004. - С. 48-50. В соавт. с Белоконь В.В., Рязанцевой Н.В., Антошиной М.А. и др.

29. Апоптоз лимфоцитов крови у пациентов с хронической персистенцией вирусов // Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 15-16 апреля 2004 г.) -Санкт-Петербург, 2004. - С. 27-29. В соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Чечиной O.E. и др.

30. Хроническая герпесвирусная инфекция: иммунофенотипические особенности лимфоцитов // Сборник научных работ «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». (Астрахань, 1718 мая 2004 г.) - Астрахань, 2004. - С. 49-50. В соавт. с Белоконь В.В., Антошиной М.А., Рязанцевой Н.В. и др.

31. Иммунорегуляторные Thl- и ТЬ2-цитокины при хронической инфекции, вызванной вирусами гепатитов В и С // Материалы V Международного конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 20-21 мая 2004 г.) - Томск, 2004. - С. 86-87. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Белобородовой Е.В., Белоконь В.В. и др.

32. Проточная цитометрия - современный метод изучения апоптоза иммуно-компетентных клеток крови // Материалы V Международного конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 20-21 мая 24ГО4 г.) — Томск, 2004. - С. 98. В соавт. с Чечиной O.E., Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В. и Др.

33. Молекулярно-генетические механизмы дисфункции лимфоцитов крови при хронической вирусной инфекции // Всероссийская конференция «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 8-10 июня 2004 г.) - Санкт-Петербург, 2004. - С. 204-205. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Жуковой О.Б. и др.

34. Роль программируемой гибели лимфоцитов крови в патогенезе хронических HBV- и HCV-инфекций // Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 8-10 сентября 2004 г.) - Новосибирск, 2004. - С. 56. В соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.

35. Поверхностная архитектоника и иммунофенотипические особенности лимфоцитов при хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита // Материалы Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». (Новосибирск, 5-7 октября 2004 г.) - Новосибирск, 2004. -С. 3-4. В соавт. с Антошиной М.А., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.

36. Продукция цитокинов при хронической персистенции вируса клещевого энцефалита // Материалы Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». (Новосибирск, 5-7 октября 2004 г.) -Новосибирск, 2004. - С. 10-11. В соавт. с Белоконь В.В., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.

37. Молекулярно-генетические механизмы хронизации вирусной инфекции // Материалы ГП Российского конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)». (Москва, 9-12 ноября 2004 г.) - Москва, 2004. - С. 142. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Жуковой О.Б. и др.

38. Закономерности изменений цитокинпродуцирующей способности лимфоцитов при хроническом вирусном гепатите // Материалы Ш Российского конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиоло-

гия)». (Москва, 9-12 ноября 2004 г.) - Москва, 2004. - С.722. В соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б. и др.

39. Фактор некроза опухолей-а при хронических вирусных гепатитах // Материалы выездного пленума правления Научного общества гастроэнтерологов «Новые горизонты гастроэнтерологии». (Новосибирск, 23-24 ноября 2004 г.) -Новосибирск, 2004. - С. 71. В соавт. с Белобородовой Е.В., Белобородовой Э.И., Рязанцевой Н.В. и др.

40. Типовые изменения поверхностной архитектоники лимфоцитов при хронической вирусной инфекции // Цитология. - 2005. - № 2. - С. 136-140. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Антошиной М.А.

41. Молекулярные механизмы изменения продукции ФНО-а мононуклеарами крови при хроническом вирусном гепатите С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. -№ 2. - С.191-195. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Зима А.П., Новицким В.В. и др.

42. Лимфоциты при хроническом вирусном гепатите С: поверхностная архитектоника, микровязкость мембраны и функциональная активность // Бюллетень СО РАМН. - 2005 - № 3 - С. 78-82. В соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Токаревой Н.В. и др.

43. Феномен хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита: возможные пути патогенеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2005. - № 4. - С. 446-450. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Лепехиным A.B. и др.

44. Дизрегуляция клеточного звена иммунитета при хроническом вирусном гепатите // Бюллетень СО РАМН. - 2005. - №. 4+. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Белобородовой Е.В., Новицким В.В. и др.

45. Роль измененной продукции фактора некроза опухоли альфа мононуклеарами крови в механизмах модуляции апоптоза при гепатите С // Медицинская иммунология. - 2005. - № 4. - С. 43-47. В соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б.и др.

46. Фактор некроза опухолей альфа при хронических вирусных гепатитах // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблема эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». (Москва, май 2005 г.) - Москва, 2005. - С.297. В соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б. и др.

47. Изменения продукции иммунорегуляторных цитокинов мононуклеарами крови при хронической герпесвирусной инфекции // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 5 - С. 43^t5. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Зима А.П. и др.

48. Хронический вирусный гепатит С: иммунорегуляторные цитокины и хрони-зация инфекции // Клиническая медицина. - 2005. - № 9. - С. 40-44. В соавт. с Белобородовой Е.В., Рязанцевой Н.В., Белобородовой Э.И. и др.

49. Молекулярные основы противовирусной стратегии организма. - Томск, Издательство Томского университета, 2005. - 128 с. В соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

CD - поверхностный кластер дифференцировки

CTL - цитотоксические лимфоциты

EBV - вирус Эпштейна-Барр

HBV - вирус гепатита В

HCV - вирус гепатита С

HTV - вирус иммунодефицита человека

HLA - лейкоцитарные антигены человека

HSV - вирус простого герпеса

IFN - интерферон

IgE, -А, -G, -М - иммуноглобулины соответствующих классов IL - интерлейкин

МНС - главный комплекс гистосовместимости NK. - натуральные киллеры Th - Т-хелпер

TBEV - вирус клещевого энцефалита TCR - Т-клеточный рецептор TNF-a - фактор некроза опухоли-а TNFA - ген фактора некроза-а

Автор выражает глубокую признательность заведующему кафедрой инфекционных болезней ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», д.м.н., профессору A.B. Лепехину, заведующей кафедрой терапии ФУВ и ППС ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», д.м.н., профессору Э.И. Белобородовой, заведующему ЦНИЛ ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», д.м.н., профессору А.Н. Байкову, главному врачу ГУЗ «Томский областной центр профилактики и борьбы со СПИД и другими инфекционными заболеваниями Департамента здравоохранения Администрации Томской обласщ» A.C. Чернову, руководителю диагностической лаборатории ГУЗ «Томский областной центр профилактики и борьбы со СПИД и другими инфекционными заболеваниями Департамента здравоохранения Администрации Томской области», к.м.н. В.И. Решетникову, ассистенту кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», к.м.н. Е.В. Белобородовой, врачу-гепатологу отделения гастроэнтерологии Томской областной клинической больницы Л.Е. Дунаевой, заведующей отделом гематологии ЦНИЛ ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», с.н.с., к.м.н. Н.М. Шевцовой, с.н.с. ФГУП НПО «Вирион», к.т.н. A.A. Миллеру за проявленный интерес к работе, ценные теоретические и методические советы, а также за помощь в организации проведения исследований.

Отпечатано: ООО «Графика» г.Томск, ул. Беленца, 17. т.526-515,51-09-59 лиц. ПД № 12-0061, выд. 27.02.01 Тираж 120 экз. Заказ 3850. Подписано в печать 11.11.05

125 5 94

РНБ Русский фонд

2006-4 29810

Актуальность проблемы. Клинический облик многих вирусных инфекций связан с длительным присутствием возбудителя в организме. Феномен вирусной персистенции является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [Dillon А.Р., Dusheiko G.M., 1995; Ahmed R. et. al, 1996; Porh A., 1997; Маянский A.H., 1999; Cerny A., Chisari F., 1999; Антонов П.В., Цинзерлинг B.A., 2001; Апросина З.Г., Серов В.В., 2001; Жукова О.Б. и соавт., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003]. В ее основе лежит способность вирусов закрепляться в клеточных популяциях, используя для этого разнообразные приемы - от «замораживания» собственных генов в хромосомах клетки-хозяина до агрессивного вмешательства в систему индукторов и эффекторов иммунитета [Маянский А.Н. и соавт., 1998; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001; Непомнящих Г.И. и соавт., 2003; Львов Д.К., 2004].

Понятие «персистенция» включает различные формы длительного взаимодействия вируса с клеткой или организмом. В настоящее время принято различать: латентное персистирование - длительное бессимптомное пребывание возбудителя в организме или в клеточной системе с затрудненным выделением вируса; хроническое персистирование возбудителя, сопровождающееся периодической манифестацией процесса; и собственно персистенцию - длительное пребывание возбудителя в организме или клеточной системе с регулярным выделением вируса [Ахмадулина Н. Б., 1990; Алгол В.И., 1997; Борисов Л.Б., 2001; Покровский В.И. и соавт., 2003]. Сегодня посредством молекулярно-генетических методов исследования вполне убедительно доказана способность большинства вирусов к длительной, нередко пожизненной персистенции в инфицированном организме [Маянский А.Н., 1999; Королюк A.M., Сбойчаков В.Б., 2002; Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., 2002].

Многие вирусы, в частности вирусы гепатита В и С, иммунодефицита человека, простого герпеса, Эпштейна-Барр, клещевого энцефалита, цитомегалии, гриппа, полиомиелита, ретровирусы, аденовирусы и др., обладающие способностью длительно сохраняться в макроорганизме, могут поражать различные органы и системы, вызывая хроническую форму инфекции [Алгол В.И., 1997; Аммосов А.Д., 2002; Непомнящих Г.И. и соавт., 2003; Серов В.В. и соавт., 2003; Львов Д.К., 2004]. Исследования последних лет показали, что, несмотря на достигнутые успехи в изучении молекулярно-биологических основ длительной вирусной персистенции, на сегодня не существует единой концепции патогенеза данной инфекционной патологии [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000, 2001; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Arbutnot P., Kew М., 2001].

Следует отметить, что факторы, позволяющие вирусам сохраняться в организме человека, и условия, способствующие развитию хронических форм болезней, также остаются недостаточно изученными [Ploegh H.L., 1998; Ивашкин В.Т. и соавт., 2000, 2001; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001; Новицкий В.В., Уразова О.И., 2004]. Несмотря на индукцию вирусспецифического иммунного ответа, у большинства инфицированных лиц это не приводит к элиминации возбудителя инфекции [Маянский А.Н., 1999; Долгих В.Т., 2000; Серов В.В., Мухин H.A., 2000; Хаитов P.M., 2001; Arbutnot P., Kew М., 2001; Mazzaro С. et al., 2001; Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П., 2002].

В середине прошлого столетия была сформулирована концепция, согласно которой подверженность той или иной болезни обусловлена сочетанием в генотипе индивида определенных аллельных вариантов генов, формирующих неблагоприятный наследственный фон, реализующийся при взаимодействии с факторами среды патологического фенотипа [Falconer D. S., 1965]. В соответствии с этим одни индивиды обладают относительной резистентностью к инфицированию вирусами, тогда как другие -подвержены развитию болезни при контакте с ее возбудителем. Переход вирусного инфекционного заболевания в хроническую форму может быть вызван нарушением генетического контроля за иммунным ответом. На сегодняшний день картирован ряд генов, непосредственно определяющих высокую или низкую чувствительность организма к инфекционным агентам [Samuel С.Е., 1991, 2001; Stark G.R. et al., 1998; Lio D. et al., 2003; Mueller Т. et al., 2004; Ollier W.E., 2004].

По современным представлениям, генетическая детерминированность иммунного ответа макроорганизма предопределяет жизненный цикл инфекционного агента. Однако при этом нельзя не учитывать свойства вируса, действие которого направлено на модулирование защитных сил организма и «ускользание» от иммунного надзора [Петров Р.В. и соавт., 1981; Хаитов P.M., Алексеев Л.П., 1998; Ploegh H.L., 1998; Mondelli M.U., Silini Е., 1999; Петров Р.В., Хаитов P.M., 2000; Игнатова Т.М., Серов В.В., 2001].

Несмотря на получение новых данных фундаментального характера о механизмах персистенции вирусов, неразрешенным остаётся вопрос: вирусоносительство - вариант «мирного сосуществования» возбудителя инфекции и макроорганизма либо скрытый патологический процесс? Следует признать, что единого мнения на этот счет нет. В любом случае внедрение вируса в клетку макроорганизма - прежде всего «сигнал опасности», активизирующий врожденные и адаптивные механизмы системы иммунитета, направленные на элиминацию инфектогена. При этом основной детерминантой патогенеза хронических персистентных вирусных инфекций, на наш взгляд, следует считать клеточно-опосредованный иммунитет.

Цель исследования: установить общие закономерности и особенности иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций разного генеза.

Задачи исследования: 1. Определить направленность клеточной дифференцировки и пролиферативный потенциал лимфоцитов периферической крови у пациентов с персистентными вирусными инфекциями, вызванными вирусами гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса. и

2. Оценить роль дисбаланса иммунорегуляторных цитокинов в механизмах нарушения межклеточной кооперации иммуноцитов при персистентных вирусных инфекциях.

3. Дать комплексную оценку структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.

4. Выявить иммуногенетические критерии предрасположенности к хронизации вирусных гепатитов и резистентности к прогрессированию заболевания путем определения характера распределения аллельных вариантов промоторных регионов генов цитокинов IL2, IL4, ILIO среди лиц европеоидной популяции, а также степени их ассоциированности с уровнем продукции соответствующих цитокинов.

5. Определить клинико-иммунологические параллели при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса.

Научная новизна. Впервые с привлечением комплекса современных гематологических, иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования освещены пути реализации иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций. Установлено, что изменения реагирования системы иммунитета при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса являются однонаправленными.

Показано, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией развивается дизрегуляция антигенспецифического звена системы иммунитета, проявляющаяся нарушением процессов дифференцировки лимфоцитов (уменьшение количества CD3+-, СБ4+-клеток и снижение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+)), изменением пролиферативной активности и апоптотического потенциала лимфоцитарных клеток периферической крови.

Установлено, что персистентные вирусные инфекции сопровождает выраженный дисбаланс продукции иммунорегуляторных цитокинов. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С, В+С, хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита и хронической герпетической инфекцией отмечается значительное повышение продукции IFN-y мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. При персистентных вирусных инфекциях увеличивается секреция IL-4, IL-6 и снижается продукция TNF-a, IL-2, IL-12 мононуклеарами крови. У больных хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С продукция IL-10 мононуклеарными лейкоцитами увеличена.

Получены новые данные, указывающие на факт дезорганизации поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови. Длительная персистенция вирусов гепатита В и С, а также антигенемия вируса клещевого энцефалита сопровождается структурной модификацией липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов. Изменение метаболического статуса лимфоцитов периферической крови у пациентов с персистентными вирусными инфекциями характеризуется увеличением содержания внутриклеточных липидов и активностью неспецифической эстеразы.

Установлено, что степень риска прогрессирования и хронизации вирусных гепатитов среди лиц европеоидной популяции ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена ILIO, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена IL4. Фактором резистентности к длительной персистенции вирусов гепатита В и С является генотип С/С промоторного региона С-592А гена ILIO.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые патофизиологические, иммунологические и иммуногенетические аспекты развития персистентных вирусных инфекций. Показана значимая роль нарушений структурнометаболического и функционального состояния лимфоцитарных клеток, цитокинпродуцирующей способности мононуклеаров периферической крови в механизмах формирования персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса. Выявлены иммуногенетические факторы риска прогрессирования и резистентности к хронизации вирусных гепатитов В, С и В+С, ассоциированные с аллелями промоторных регионов генов IL2, IL4 и ILIO. Положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения патогенетических механизмов персистентных вирусных инфекций, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения инфекционного процесса при гепатитах В, С, В+С, клещевом энцефалите, герпетической инфекции.

Положения, выносимые на защиту:

1. Персистентные вирусные инфекции (хронический вирусный гепатит В, С, В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) сопровождаются угнетением Т-клеточного звена иммунитета, выраженным изменением процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитарных клеток, а также нарушением межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток.

2. Механизмы дисбаланса кооперативного взаимодействия иммуноцитов при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) сопряжены с поляризацией иммунного ответа в направлении Th2.

3. Персистентные вирусные инфекции сопровождаются выраженными изменениями структурно-метаболических свойств лимфоцитов периферической крови, к числу которых относятся дезорганизация поверхностной архитектоники, структурная модификация липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов, увеличение содержания липидов и активности неспецифической эстеразы в лимфоцитарных клетках.

4. Иммуногенетическим фактором предрасположенности к длительной персистенции вирусов гепатита В и С среди лиц европеоидной популяции является генотип С/С промоторного региона С-592А гена ILIO. Степень риска прогрессировать и хронизации вирусного гепатита В и С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена ILIO, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена IL4.

5. Общая направленность иммунопатологических расстройств (угнетение антигенспецифического звена иммунного ответа, дисбаланс кооперативного взаимодействия иммуноцитов, дизрегуляция процессов пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, нарушение структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови) при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция), проявляющихся стертым клиническим течением, не определяется таксономической принадлежностью возбудителя инфекции.

Апробация и реализация работы. Результаты исследования обсуждались на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003), Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), Выездном пленуме правления Научного общества гастроэнтерологов «Новые горизонты гастроэнтерологии» (Новосибирск, 2004), Четвертом съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004), II Всемирном конгрессе по аллергологии и иммунологии (Москва, 2004 г.), Второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005).

Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (раздел «Патофизиология системы иммунитета», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология клетки») на лечебном, педиатрическом и фармацевтическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Исследование выполнено в рамках Федеральной научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006 годов» по мероприятию «Развитие системы ведущих научных школ как среды генерации знаний и подготовки научно-педагогических кадров высшей квалификации. Проведение научно-исследовательских работ по приоритетным направлениям Программы» (№ РИ 112/001/158), а также при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (№ НШ-1051.2003.4) «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток при патологии» и Администрации Томской области (договор №136 от 23.09.2004) «Создание и внедрение панели молекулярно-генетических маркеров для прогнозирования течения и исхода вирусных гепатитов».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 работ, из них 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ, одна монография в соавторстве и 27 статей и тезисов в сборниках научных трудов и материалов съездов, конгрессов и конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 83 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель включает 633 источника (354 - отечественных и 279 - иностранных).

ВЫВОДЫ

1. Изменения реагирования системы иммунитета при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита, простого герпеса являются однонаправленными и характеризуются угнетением антигенспецифического звена иммунного ответа, дисбалансом кооперативного взаимодействия иммуноцитов, дизрегуляцией процессов пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, нарушением структурно-метаболических и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови.

2. Механизмы нарушения межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток при персистентных вирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С и В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция) обусловлены выраженным дисбалансом продукции иммунорегуляторных провоспалительных (IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-12) и противовоспалительных (IL-4, IL-6, IL-10) цитокинов.

3. Фактором, способствующим длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса, является поляризация иммунного ответа в направлении Tli2, обусловленная увеличением продукции мононуклеарами крови IL-4, IL-6 и угнетением секреции TNF-a, IL-2, IL-12. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С продукция IL-10 мононуклеарными лейкоцитами периферической крови повышена. Персистентные вирусные инфекции сопровождаются гиперпродукцией IFN-y мононуклеарами крови.

4. У пациентов с длительной персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса развивается дисбаланс дифференцировки и пролиферации иммуноцитов антигенспецифического звена системы иммунитета, проявляющийся снижением относительного количества CD3+-, СБ4+-клеток и иммунорегуляторного индекса

CD4+/CD8+), и усиление пролиферативной активности лимфоцитов. При персистентных вирусных инфекциях повышено содержание CD95+-экспрессирующих лимфоцитов.

5. Персистентные вирусные инфекции сопровождаются дезорганизацией поверхностной архитектоники (повышение количества лимфоцитов со складками, бульбарными образованиями и выростами на поверхности, появление клеток с комбинированной поверхностью на фоне снижения числа гладких лимфоцитов), структурной модификацией липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в области белок-липидных контактов и изменением метаболизма (увеличение содержания липидов и активности неспецифической эстеразы) лимфоцитарных клеток периферической крови.

6. Иммуногенетическим фактором, обладающим протективным эффектом в отношении длительной персистенции вирусов гепатита В и С среди лиц европеоидной популяции, является генотип С/С промоторного региона С-592А гена ILIO. Степень риска прогрессирования и хронизации вирусных гепатитов ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592А гена ILIO, а также с Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена IL4.

7. Общая направленность иммунопатологических расстройств при персистентных вирусных инфекциях, характеризующихся стертым клиническим течением (хронический вирусный гепатит В, С, В+С, хроническая антигенемия вируса клещевого энцефалита, хроническая герпетическая инфекция), не определяется таксономической принадлежностью возбудителя инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клинический облик многих вирусных инфекций связан с персистенцией - длительным присутствием возбудителя в организме. Сегодня посредством иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов исследования вполне убедительно доказана способность большинства вирусов к длительной, нередко пожизненной персистенции в инфицированном организме. В основе персистенции лежит способность вирусов закрепляться в клеточных популяциях, используя для этого разнообразные приемы - от «замораживания» собственных генов в хромосомах клетки-хозяина до агрессивного вмешательства в систему индукторов и эффекторов иммунитета.

В ходе эволюции вирусы, способные к индукции персистентных вирусных инфекций, выработали различные стратегии выживания и борьбы с противодействующей им иммунной системой макроорганизма. Современные авторы приводят многочисленные примеры вирусных факторов с действием, сходным с влиянием цитокинов, их рецепторов, трансдукторов внутриклеточных сигналов, а также различных факторов, способных нарушать процессинг и презентацию вирусных антигенов. I

Особенности патогенеза и исход длительного, иногда пожизненного, присутствия чужеродного генетического объекта в зараженной клетке обусловлены сложным характером взаимодействия вируса с его молекулярно-генетическими и функциональными свойствами, с одной стороны, и клеток иммунной системы пациента с ее индивидуальными иммуногенетическими особенностями, - с другой. В связи с этим мы не случайно сфокусировали внимание на взаимоотношениях вирусов с лимфоцитами, поскольку именно от них зависят судьба инфицированных клеток и исход длительной персистенции инфекта.

Интерес исследователей к состоянию лимфоцитов при изучении механизмов длительной вирусной персистенции объясняется значительной ролью структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитарных клеток в процессе формирования противовирусной стратегии организма. Использование комплекса современных методических подходов позволило выявить у пациентов с длительной персистенцией вирусов, независимо от длительности и характера течения инфекционного процесса, а также таксономической принадлежности возбудителя инфекции (вирусы гепатита В и С, клещевого энцефалита и простого герпеса), изменения структуры, метаболизма и функций лимфоцитарных клеток. Определялись отчетливые признаки дезорганизации поверхностной архитектоники, структурной модификации липидной фазы плазматической мембраны в гидрофобном ее компартменте в области белок-липидных контактов, повышение пролиферативной активности, а также изменение метаболического статуса лимфоцитов периферической крови. В условиях длительной персистенции инфекта в макроорганизме изменения структурно-метаболического и функционального статуса иммунокомпетентных клеток, на наш взгляд, носили не только вирусиндуцированный, но и адаптивный характер.

Вместе с тем в настоящее время поиск молекулярных детерминант длительной персистенции вирусов связан с изучением процессов межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток, опосредованной цитокинами. Ключом к разгадке феномена персистенции вирусов в организме человека, по мнению современных исследователей, служит баланс влияний ТЫ и ТЬ2 типов, особенно на ранних стадиях заболевания. Одним из свойств вирусов, выработавшихся в результате коэволюции, как раз и является способность модулировать иммунный ответ в пользу реакций ТЬ2 типа во время ранней фазы заболевания и склонять течение инфекции в сторону хронизации, чем, вероятно, и объясняется феномен длительной персистенции. В ряду подобных работ находится исследование, проведенное в нашей лаборатории. В частности, были полученны фактические данные, свидетельствующие о том, что персистентные вирусные инфекции сопровождаются изменением баланса в системе иммунорегуляторных цитокинов. Выраженный дисбаланс кооперативного взаимодействия иммуноцитов, а также преимущественная активация продукции цитокинов ТЪ2 типа чреваты формированием непротективного иммунного ответа и отчасти объясняют развитие инфекции по хроническому типу. Гиперпродукция цитокинов ТЫ пути, в свою очередь, свидельствует о высокой степени адаптации вирусов к действию иммунной системы макроорганизма.

Бесспорно, что ключевую роль в механизмах развития хронической персистенции вирусов играет генетически детерминированное состояние иммунной системы. Многочисленными исследованиями последних лет установлено, что структурные особенности белковых продуктов полиморфных генов цитокинов ведут к различному качеству иммунного ответа, а также к различным течению и исходу инфекции. Проведенное нами иммуногенетическое исследование позволило установить, что степень риска прогрессирования и хронизации вирусных гепатитов была ассоциирована с аллелями промоторных регионов -ЗЗОв гена 1Ь2 и -592А гена 1Ы0, а также с

Т/Т генотипом полиморфного участка С-590Т гена IL4. Фактором резистентности к длительной персистенции вирусов гепатита В и С оказался генотип С/С промоторного региона С-592А гена ILIO.

Учитывая важную роль генетически детерминированной перестройки цитокиновой сети, а также принимая во внимание значение структурно-метаболических и функциональных изменений лимфоцитов в генезе дисбаланса иммунологического равновесия при персистентных вирусных инфекциях, считаем очевидным, что дальнейшее углубленное вскрытие механизмов иммунопатогенеза длительной вирусной персистенции позволит расширить возможности для поиска потенциальных маркеров восприимчивости, тяжести течения и клинических особенностей инфекции, а также для создания современных способов предупреждения и коррекции иммунопатологических расстройств.